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Segundo informe técnico trimestral del ciclo 2013-2014
Instituto Politécnico Nacional
CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO
INTEGRAL REGIONAL. UNIDAD SINALOA
CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA AGRÍCOLA
Informe trimestral (septiembre-noviembre 2013)
Proyecto: Validación de microorganismos nativos de suelos del norte de
Sinaloa para el control de Fusarium en el cultivo del maíz.
Responsables del informe:
 Dr. Ignacio E. Maldonado Mendoza
 MC Juan Carlos Martínez Álvarez
 MC Glenda Lizárraga Sánchez
 MC Karla Yeriana Leyva Madrigal
 MC Alejandro Miguel Figueroa López
Guasave, Sinaloa, México. Diciembre 24, 2013.
1.1. Colecta y procesamiento de los datos obtenidos de la segunda prueba de
validación en el ciclo 2012-2013 con B. cereus en campo.
Se encuentra en proceso el análisis de aflatoxinas y fumonisinas, así como se está realizando el
análisis microbiológico en el grano colectado en este experimento. La molienda del grano en
preparación para la medición de toxinas ha sido ya realizada y las muestras secas han sido
almacenadas a 4°C para su análisis. Se ha realizado la compra de los kits para la detección de
aflatoxinas y fumonisinas los cuales llegaron en la primera quincena de septiembre y serán
realizadas en el transcurso del segundo trimestre. Los datos de estos análisis se llevarán a cabo
y se incluirán en el siguiente informe trimestral.
2.1. Realizar pruebas de antagonismo con B. cereus, B. megaterium y B. subtilis sobre los
diferentes grupos de patogenicidad de los aislados de F. verticillioides, F. nygamai y F.
thapsinum.
La metodología para realizar este ensayo en pruebas en sólido estaba montada en cajas de
Petri de 10 cm de diámetro, pero introducimos una variante que es realizar los ensayos en cajas
multicelda de 24 pozos. Esto nos permite reducir espacios y ahorrar tiempo. La técnica se
estandarizó en el primer trimestre en estas placas. En el primer trimestre se definió
definitivamente que las especies presentes en campo que pertenecen al complejo Giberella
fujikuroi son cuatro, no tres como pensábamos con aterioridad: Fusarium verticillioides, F.
thapsinum, F. nygamai y una cuarta con la representación de dos aislados F. andiyazii. Debido a
esto este trimestre se decidió incluir estos aislados para evaluar el efecto sobre todos los
aislados con los dos mejores antagonistas que tuvieron mejor efecto en campo.
Dos aislados bacterianos Bacillus megaterium: B5 y Bacillus cereus: B25 se incluyeron y se
realiza la evaluación. A la fecha los experimentos se encuentran en desarrollo y en el siguiente
trimestre se presentarán los resultados finales del análisis de las pruebas de antagonismo.
Debido a que los hongos tienen diferente velocidad de crecimiento, se evalúan desde las 48 h
hasta los 7 días post-inoculación en estas placas y se toma un registro fotográfico diario para
analizar posteriormente. Los resultados obtenidos ya están siendo procesados y en el siguiente
semestre se presentarán los resultados del análisis.
1
3.1. Colocación de una prueba de validación en campo en tres diferentes lotes empleando
el formulado en polvo de B. cereus.
A pesar de que la prueba se realizará en diciembre, se ha iniciado con el laboreo de los lotes,
muestreos de suelos, análisis microbiológicos para conocer el inóculo inicial de posible
infestación con Fusarium, se han identificado tres posibles lotes, aún no se tiene la localización
exacta ya que los productores cooperantes poseen más de un lote posible por lo que esto se
definirá en base a los resultados de análisis de los suelos. Del mismo modo se están preparando
varios lotes de formulado en polvo para poder tener suficiente inóculo para las pruebas en
campo programadas a iniciar en diciembre.
5.1. Finalizar experimentos de optimización de factores del cultivo para la producción de
esporas en un fermentador de 3 L.
En este trimestre continuamos con la experimentación a nivel matraz para escalar a fermentador
de 3 L. Se están repitiendo algunos experimentos para obtener el resultado más robusto en
matraces de 500 mL. Se decidió al inicio de este trimestre que la mejor estrategia para averiguar
que componentes del medio son significativos para la esporulación realizar un diseño factorial
fraccionado. Los resultados se muestran a continuación. Abajo se presenta una tabla (Tabla 1)
en la que se muestran los resultados variando una serie de factores en los que se empleó el
medio de esporulación moviendo la cantidad de almidón de maíz se variaron en un diseño
factorial para conocer cuál era la mejor combinación de estos factores. Cada uno de los
experimentos se realizó por triplicado, además se repitieron en dos experimentos
independientes encontrándose los mismos resultados en cada experimento independiente.
En la siguiente tabla (Tabla 2) se presentan los factores que influyen más en la producción de
esporas. Los resultados nos muestran valores de 0.3 a 5.88 x 109 UFC/mL con este diseño. En
las siguientes tablas se muestran los mejores factores que influyen sobre la producción de
esporas empleando el medio de producción de esporas.
2
TABLA 1. Resultados del diseño factorial para encontrar la mejor combinación en factores
nutricionales para la producción de esporas.
CORR.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
1
1
-1
1
1
-1
-1
-1
-1
1
-1
1
B
1
-1
1
-1
1
-1
-1
1
1
-1
-1
1
C
-1
1
1
-1
1
1
-1
1
-1
1
-1
-1
D
-1
1
-1
-1
-1
-1
-1
1
1
1
1
1
E
-1
-1
1
1
-1
1
-1
-1
1
1
-1
1
F
1
1
1
-1
-1
1
-1
-1
-1
-1
1
1
G
-1
1
1
1
1
-1
-1
-1
1
-1
1
-1
H
1
1
-1
1
-1
1
-1
1
1
-1
-1
-1
I
1
-1
-1
-1
1
1
-1
-1
1
1
1
-1
J
-1
-1
-1
1
1
1
-1
1
-1
-1
1
1
K
1
-1
1
1
-1
-1
-1
1
-1
1
1
-1
Esporas 1 × 109
3.36 ± 0.12
2.30 ± 0.32
0.93 ± 0.02
1.49 ± 0.05
2.90 ± 0.14
0.56 ± 0.06
0.32 ± 0.03
0.54 ± 0.05
0.51 ± 0.04
4.23 ± 0.40
2.60 ± 0.16
5.88 ± 0.37
Tabla 2. Factores nutricionales probados para eficientizar la esporulación de Bacillus cereus.
FACTOR
A
B
C
D
E
F
G
Peptona
Extracto de levadura
ZnSO4
H
MnCl2
I
J
FeSO4
K
Var ficticia 02
Almidón de maíz
Var ficticia 01
KCl
MgSO4 ·7H2O
Ca (NO3)2
En la Tabla 3 se presentan los componentes que fueron optimizados en un subsecuente
experimento con el medio de esporulación.
3
Tabla 3. Componentes evaluados en el medio de esporulación.
MEDIO DSM
A
B
C
D
Peptona
Extracto de levadura
KCl
MgSO4 7H2O
E
MnCl2
F
G
FeSO4
Ca (NO3)2
Los resultados de la Tabla 4 muestran los factores más influyentes en la esporulación de B.
cereus.
Tabla 4. Diseño empleado y resultados obtenidos en cantidad de esporas por mL.
CORR.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
-1
-1
1
1
-1
1
0
0
1
0
-1
0
B
1
1
1
-1
-1
1
0
0
-1
0
-1
0
C
-1
1
-1
1
-1
1
0
0
-1
0
1
0
D
-1
-1
1
-1
1
1
0
0
-1
0
1
0
E
1
-1
-1
1
1
1
0
0
-1
0
-1
0
F
-1
1
-1
-1
1
1
0
0
1
0
-1
0
G
1
-1
-1
-1
-1
1
0
0
1
0
1
0
Esporas 1 × 10
8
4.2 ± 0.2
1.1 ± 0.1
2.3 ± 0.08
0.7 ± 0.02
3.3 ± 0.14
1.8 ± 0.08
6.0 ± 0.4
6.3 ± 0.5
2.4 ± 0.04
6.1 ± 0.1
0.8 ± 0.02
6.2 ± 0.3
El resultado del análisis estadístico muestra que existe correlación con los siguientes factores: el
KCl y la peptona tienen un efecto negativo y el extracto de levadura, cloruro de manganeso y
nitrato de calcio tienen un efecto positivo. Lo que falta realizar en el diseño es la optimización a
4
través de una serie de experimentos denominados diseño compuesto central rotable que permite
afinar a detalle la cantidad de los componentes a utilizar en cada medio para obtener de manera
repetitiva la misma cantidad de esporas en cada experimento independiente a realizar.
5.2. Evaluación de viabilidad y vida de anaquel del formulado en polvo en base a esporas
de B. cereus.
Se ha continuado con la evaluación del primer formulado en polvo y se ha encontrado que
después de seis meses el producto permanece viable en aproximadamente 80% tal como se
midió al día que se inició con el formulado, su actividad biológica se ha monitoreado en
experimentos in vitro (en caja de Petri) en ensayos de antagonismo, además de probar su
viabilidad en el invernadero en el ciclo pasado (reportado en el informe final ciclo 2012-2013)
5.5. Elucidar el mecanismo de antagonismo empleado por B. cereus sobre F.
verticillioides.
En esta etapa se ha avanzado en definir metodologías. A final del ciclo anterior surgió la duda de
que el aislado fuera un endófito del maíz, ya que aparentemente acompaña el cultivo a lo largo
5
de su ciclo de vida, por lo que diseñamos un experimento para probar esto. Lo mismo en cuanto
a los mecanismos diseñamos una metodología para probar que las quitinasas que produce el
hongo son la principal causa de que la bacteria sea capaz de antagonizar al hongo.
Figura 1. Efecto del crecimiento de B. cereus en un medio PDA sobre la inhibición del
crecimiento de F. verticillioides para analizar la producción de quitinasas. Las tres cajas de la
parte superior son repeticiones del reto de la bacteria contra el hongo. Las dos cajas de la parte
inferior de la fotografía son controles del hongo creciendo solo.
En este trabajo se evalúa la expresión de los genes implicados en la producción de quitinasas y
se estudiará si existe una respuesta a un cultivo de Fusarium verticillioides in vitro. Para esto se
analizó la base de datos KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) donde están
reportados los genomas secuenciados de Bacillus cereus como se muestra en la Tabla 5.
6
Tabla 5. Genomas de B. cereus secuenciados y el número de genes para quitinasas reportados.
Cepa
Bacillus cereus ATCC
14579
No.
Acceso
Genes
de
NCBI
Kegg
Quitinasas
Gene ID
T00127
2
1202782
1206070
Bacillus cereus E33L
T00198
2
3026756
3026561
Bacillus cereus 03BB102
T00869
2
7690219
7691618
Bacillus cereus 10987
T00162
2
2552209
270804
Bacillus cereus AH820
T00814
2
7188574
7192193
Los genomas de Bacillus cereus analizados presentaron dos genes de quitinasas cada uno
(Tabla 5). Se localizó la secuencia de los genes y se realizó un alineamiento con el programa
MEGA 5 y se buscaron los sitios conservados para diseñar oligonucleótidos y amplificar los
genes para usarlos por medio del análisis de PCR en tiempo real. El diseño de los
oligonucleótidos se realizó en dos regiones conservadas de cada gen, para esto cada gen se
dividió en dos secciones y se buscaron oligos para amplificar dos veces el mismo gen, en la
sección 1 y en la sección 2.
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Figura 6. Esquema del gen 2 de la quitinasa de Bacillus cereus localizado en el genoma,
separado en dos secciones (de acuerdo a la región codificante de la proteína codificada por el
gen de la quitinasa, región amino- y carboxi- terminal) para el diseño de oligonucleótidos.
Debido a variaciones de uno a dos nucleótidos entre las secuencias en las regiones
conservadas, se diseñaron oligonucleótidos para cada secuencia, en la figura 2 se observa un
esquema del gen de 1083 pb que codifica para una quitinasa de Bacillus cereus y se encuentra
separado en dos secciones, en la sección 1 se observa el oligo 15f el cual es complemento del
reverso 17r, de igual forma el 16f es complemento de 18r; los cuales usados en reacciones de
PCR independientes dan un fragmento aproximado de 115pb. En la sección dos de este mismo
gen, se muestran los oligonucleótidos 19f que funcionan con el reverso 20r y 21r, amplificando
un fragmento de 136pb.
Figura 2. En el gel se muestran las amplificaciones con los oligos 9F/10R, el cual se diseñó en la
sección dos del gen 1, 15F/18R diseñados en la sección 1 del gen 2 y los oligos 19F/21R
diseñados en la sección 2 del gen 2. F2C/C primers que amplifican un fragmento de cerca 1.5
Kb del 16S rDNA se utilizaron como control positivo de la reacción.
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La Figura 2 muestra las amplificaciones de los fragmentos de ADN con los oligos diseñados
para realizar los análisis de PCR en tiempo real. Como se mencionó anteriormente los oligos
9F/10R, amplifican un fragmento aproximado de 119 pb, de acuerdo con los análisis in silico
realizados para el diseño de oligonucleótidos, este es el tamaño esperado para este fragmento.
También se muestran los amplicones para los oligos 15F/18R y 19F/21R los cuales amplifican
fragmentos de un tamaño aproximado de 115 y 136 pb en la sección 1 y 2 del segundo gen
respectivamente. Estos resultados se usarán para a continuación montar la metodología y medir
la expresión de los genes de quitinasas en los experimentos donde se reta a la bacteria con el
hongo como se muestra en la Figura 1. Con la detección de estos genes se iniciará con la
medición de la expresión en respuesta al crecimiento de F. verticillioides en un cultivo dual en
cajas Petri.
Para respondernos a la pregunta si la bacteria es un endófito del maíz, se usó WGA Alexa Fluor
para visualizar la bacteria en raíces de plantas de maíz de dos semanas de crecimiento
inoculadas con el aislado Bacillus cereus B25, de igual forma en un experimento por separado
se inoculó con F. verticillioides y se visualizaron los dos microorganismos por separado
utilizando microscopía confocal laser.
Se sembraron plantas en suelo estéril en experimentos separados, se colocaron seis plantas
inoculadas con el aislado B25 y se colocaron seis plantas inoculadas con F. verticillioides.
Después de dos semanas se colectaron las plantas y se realizaron cortes de las raíces, se tomó
muestras de la cofia, raíces secundarias y raíces cercanas al tallo.
Se realizaron montajes de tres muestras por planta tomando la zona apical de las raíces, cortes
en la zona media de las raíces y cortes en la zona cercana al tallo. En la figura 3A se observa
fluorescencia en la zona media de la raíz, posiblemente sea debido a la colonización de las
bacterias en la raíz, esto se tiene que corroborar con una técnica mas específica como la
hibridación in situ. La cual tiene como principio utilizar una sonda específica para la bacteria
acoplada a un marcador fluorescente. En la figura 3B se pueden observar las estructuras
fúngicas, como conidios e hifas, colonizando la raíz. En ambos casos los organismos parecen
estar localizados en la región de tejido vascular de la raíz.
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Con esto podemos inferir que ambos microorganismos son endófitos, pero si nos enfocamos en
la bacteria, esta puede producir quitinasas que pueden ayudar a controlar al patógeno ó a
prevenir una enfermedad si la bacteria coloniza primero.
Se pretenden realizar más ensayos para estudiar esta asociación de manera tripartita
(hongo/bacteria/planta), y poder inferir inicialmente si ambos organismos (hongo y bacteria) colocalizan en el mismo nicho dentro de la planta y de ahí ayudarnos a entender el modo de acción
de esta bacteria en contra de F. verticillioides.
Figura 3. Tinción con WGA en raíces de plántulas de maíz. A) posible colonización de canales
vasculares por parte de Bacillus cereus B25. B) Se observa colonización de F verticillioides en lo
puede ser un canal vascular, se observan microconidos e hifas colonizando la raíz.
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