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XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico
ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DEL GEN NIK1 DE Mycosphaerella fijiensis
CULTIVADO EN PRESENCIA DE MANCOZEB Y SORBITOL.
José
Ignacio
Laines
Hidalgo
Instituto
Tecnológico
Superior
de
los
Ríos,
[email protected]. Asesor Dr. Ignacio Rodrigo Islas Flores; Centro de Investigación
Científica de Yucatán A.C., Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas. [email protected]
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El plátano es un alimento fundamental para la población dado su gran aporte nutricional y
su amplia disponibilidad a lo largo del año. Su comercialización genera importantes
ingresos y fuentes de empleo a los países productores. Desafortunadamente, el cultivo de
plátano es atacado por diversas enfermedades, la más devastadora es conocida como la
Sigatoka negra y su agente causal es el hongo ascomiceto Mycosphaerella fijiensis. Este
fitopatógeno se reproduce tanto sexual como asexualmente, característica que le confiere
alta variabilidad genética y rápida generación de resistencia contra diferentes fungicidas.
Se ha descrito que la agresividad así como la resistencia de Mycosphaerella fijiensis a los
fungicidas es el resultado, al menos en parte, de la expresión de genes cuyos productos
están asociados a la neutralización y transporte de compuestos tóxicos o con factores de
repuesta al estrés osmótico; tal es el caso del gen NIK1, el cual codifica a una histidina
cinasa perteneciente a la familia III. Estudios recientes en Aspergillus fumigatus han
descrito que el gen NIK1 está involucrado en la respuesta al estrés osmótico causado por
diversos agentes químicos y fungicidas y dado que en M. fijiensis se tiene poca
información acerca del comportamiento del gen NIK1 ante tales condiciones. El objetivo
de este trabajo fue analizar la expresión del gen NIK1 cuando M. fijiensis se expone a
concentraciones crecientes de Mancozeb, un fungicida de tipo preventivo o de Sorbitol,
un agente osmótico.
METODOLOGÍA
El tratamiento osmótico se indujo adicionando concentraciones de 2%, 4% 6% y 8% de
Sorbitol y Mancozeb, ambas condiciones en medio de cultivo líquido Papa Dextrosa
(PDB). Cada concentración se realizó por triplicado. La conductividad en el medio
conteniendo las diferentes concentraciones de Sorbitol o Mancozeb se determinó con un
conductímetro Hanna.
La inducción de la expresión del gen NIK1 en M. fijiensis se realizó en matraces
individuales conteniendo 20 mL de medio de cultivo PDB y 4% de Sorbitol o 10 mg/L de
Mancozeb. Cada matraz se inoculó con 0.2 g de micelio de M. fijiensis de 10 días de edad
y se mantuvo en agitación a 75 rpm x min. El micelio se colectó a los 0, 15, 30 y 60 minutos
después de la inoculación en los matraces. El micelio se filtró en embudo Buchner estéril
y se almacenó en nitrógeno líquido.
El RNA se extrajo del micelio colectado de cada tratamiento por medio de trizol y siguiendo
las instrucciones del vendedor (Invitrogen). El RNA se cuantificó en un Nanodrop 2000.
Dos microlitros y medio (2.5 uL) fueron tratados con DNAsa I por 15 minutos a temperatura
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ambiente. La calidad e integridad del RNA se verificó en geles desnaturalizantes de 1.4%
de agarosa-formaldehido.
La síntesis de cDNA se realizó utilizando la transcriptasa reversa superScript III, siguiendo
las indicaciones del proveedor (Invitrogen). Para la síntesis del cDNA se utilizaron 5 uL de
RNA previamente tratado con DNAsa I. La síntesis se realizó a 50 °C por 60 min. La
cantidad de cDNa sintetizado en la reacción de transcripción reversa se cuantificó en
Nanodrop 2000.
El análisis de la expresión del gen NIK1 se realizó por medio de la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) de punto final partiendo de 100 ng de cDNa y oligonucleótidos
específicos para el gen NIK1. El tamaño del producto esperado es de 530 pb. Los
productos de la reacción de PCR se analizaron en geles de 1% de agarosa y se
fotodocumentaron utilizando un GelDoc (BioRad).
RESULTADOS
La conductividad en los medios adicionados con el Mancozeb aumentó desde 3.183 mSc
en los matraces conteniendo 2% del compuesto hasta 7.650 mSc en matraces que
contenían 8% del fungicida. En lo que respecta al sorbitol, la conductividad fluctúo muy
poco conforme aumento la concentración del agente osmótico en el medio de cultivo. Por
ejemplo, en los matraces conteniendo 2% de sorbitol la conductividad fue de 7.769 mSc y
en los matraces conteniendo 6% del compuesto la conductividad solo alcanzó valores de
8.060 mSc (Tabla 1).
Tabla1. Conductividad osmótica del Sorbitol y del Mancozeb
Condición
Porcentaje
concentración
Mancozeb
Sorbitol
2%
4%
6%
8%
2%
4%
6%
8%
0.125 g
0.250 g
0.375 g
0.500 g
2g
4g
6g
8g
Conductividad
(mS)
3.183 ± 0.085
5.083 ± 0.146
6.650 ± 0.123
7.650 ± 0.05
7.760 ± 0.128
8.130 ± 0.012
8.060 ± 0.004
7.360 ± 0.016
El análisis de la expresión del gen NIK1 en M. fijiensis expuesto a Mancozeb o Sorbitol
mostró que desde el inicio de los tratamientos, el gen NIK1 muestra transcripción (tiempo
cero). No obstante, en el tratamiento con sorbitol, NIK1 tiene su máxima expresión
después de 15 minutos de exposición y entre los 30 y 60 minutos sus niveles de expresión
disminuyen aunque no al nivel de los observados al tiempo cero del tratamiento. En
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contraste, la expresión de NIK1 se abatió en su totalidad 60 minutos después de que M.
fijiensis se expuso a en el tratamiento con 10 mg/L de Mancozeb (Fig 1).
RT-PCR
Fig. 1 Expresión del gen NIK1 en condiciones de Sorbitol o Mancozeb.
CONCLUSIONES
La expresión del gen NIK1 en M. fijiensis responde de manera sostenida al tratamiento
con Sorbitol, resultado que sugiere que este gen puede estar involucrado en la respuesta
del hongo a tal condición. En contraste, el fungicida Mancozeb abate la expresión de NIK1,
hecho que puede tener dos interpretaciones. La primera posibilidad es que NIK1 en M.
fijiensis no medie la percepción del fungicida Mancozeb. La otra posibilidad es que el
fungicida Mancozeb al ser un agente multisitio afecte de manera directa a los factores que
regulan la expresión del gen NIK1 y por ello en el tratamiento con este compuesto se
observó el abatimiento de sus transcritos después de los 30 minutos de tratamiento.
Ambas posibilidades deben ser demostradas o rechazadas en experimentos posteriores.
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Agosto 2014