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Virus ¾ Complejos de Ácidos nucleicos + Proteínas ¾ Capacidad de multiplicación en células vivas ¾ Parásitos intracelulares obligados ¾ Genoma reducido: codifica funciones que no pueden adaptar de sus células huésped ¾ Diversidad en tamaño, estructura y organización genómica 1 Propiedades de Virus y Microorganismos <300nm Crecim.en medio de cult Fision binaria DNA y RNA Genoma infec Ribosomas Metabolismo Sensibilidad Antibiot. BACTERIA MYCOPLAS RICKETTS. CHLAMYD. VIRUS + + + - +/+ + + - + + - +/+ + - + + + + + + + + + +/- - + + + + - 2 Tamaño 3 Estructura y Composición ¾Estructura extracelular: virión o partícula viral ¾Estable fuera de la célula ¾Desensamblado rápido intracelular • Cubierta Proteica = Cápside – Formada por muchas copias de un número pequeño de proteínas virales unidas por uniones no covalentes • Genoma (información genética) – Ácido nucleico (ARN, ADN) • Envoltura Lipídica Adquirida de la célula huésped (algunos virus) 4 Viroides, Virusoides y Priones • Viroides – – – – • Patógenos de plantas RNAsc circular (240 a 400nt) No codificantes Replicación en nucleolo (RNA pol DNA dep celular) Virusoides – RNA satélite encapsulado por proteínas codificadas por virus Helper – No codificantes – Replicación citoplasmática (RNA pol RNA dep cel) • Priones – Proteínas infecciosas 5 Origen de los virus ¾ Teoría RegresivaÆ Formas degeneradas de parásitos intracelulares ¾ Origen a partir de componentes celulares (RNAs o DNAs) ¾ Transposones ¾ Retrotransposones ¾ RNA replicativos ¾ Origen independiente y coevolución con las moléculas más primitivas autorreplicativas 6 Clasificación virus • Morfología del virión • Tamaño • Simetría • Envoltura • Tipo de ácido nucleico • ARN (sc o dc) • ADN (sc o dc) • Estrategia Replicativa 7 Simetría del Virión 8 Simetría del virión ADENOVIRUS VIRUS MOSAICO DEL TABACO 9 Virus animales 10 Clasificación virus • Morfología del virión • Tamaño • Simetría • Envoltura • Tipo de ácido nucleico • ARN (sc o dc) • ADN (sc o dc) • Estrategia Replicativa 11 Estrategias Replicativas Clasificación de Baltimore 12 Clasificación de Virus Animales 13 Propagación de virus -aislamiento Propagación Objetivo -producción de vacunas -estudios bioquímicos •Células en cultivo •Huevos embrionados •Animales de laboratorio 14 Alteraciones en células infectadas Efecto citopático •Lisis •Fusión células •Transformación Cuantificación •Placas (UFP) •Focos fluorescentes •Transformación •Conteo de partículas por M.E. 15 Ciclo Infectivo: producción de virus Virus PFU (Unidades formadoras de placa) tiempo 16 Ciclo Infectivo 1) ENTRADA 2) DES-ENSAMBLADO 3) MULTIPLICACIÓN VIRAL Producción de proteínas y ácidos nucleicos 4) ENSAMBLADO 5) LIBERACIÓN 17 1) ENTRADA • ADSORCIÓN Æ Unión del virus a la superficie celular (sin gasto de energia) Receptores virales (determinan qué células son susceptibles) Específicos Ampliamente distribuidos •Proteínas •Carbohidratos •Glicolípidos •Receptor de acetilcolina (rabia) •CD4 linfocitos T (HIV) •Ácido Siálico (Influenza) •Heparan Sulfato (herpesvirus) 18 Receptores virales en linfocitos T para HIV 19 • PENETRACIÓN ¾ Fusión con Membrana Plasmática (virus con envoltura) • Péptido fusogénico herpes, paramyxovirus, retrovirus, etc ¾ Endocitosis mediada por receptor • Péptido fusogénico (virus con env) Influenza • Lísis endosoma (virus sin env) Adenovirus ¾ Translocación picornavirus ¾ Formación de poros en la pared celular bacteriofagos 20 HIV -Adsorción: Unión a receptor y coreceptor -Penetración: Fusión con membrana plasmática (péptido fusogénico) Influenza virus -Absorción: unión a glicoproteínas con ácido siálico -Penetración por endocitosis -Liberación dependiente de acidificación, por fusión con membrana de la vesícula (péptido fusogénico) 21 2) DESENSAMBLADO y TRANSPORTE AL SITIO INTRACELULAR CORRECTO (membrana, endosoma, citoplasma, poro nuclear) 22 3) MULTIPLICACIÓN VIRAL Æ Producción de Proteínas y ácidos nucleicos virales ¾Transcripción Æ RNAm ¾TraducciónÆ Apropiación del aparato de traducción de célula huésped. Síntesis de proteínas estructurales y no estructurales • Degradación del ARNm celular • Competencia por el aparato de traducción • Cambio de especificidad del aparato de traducción ¾ReplicaciónÆ Estrategias Replicativas 23 •4) ENSAMBLADO • 5) LIBERACIÓN • Acumulación en citoplasma o núcleoÆ Lisis • Brotación (virus con envoltura) – Membrana Plasmática – Membranas Internas 24 25 VIRUS CON GENOMA DE ARN 26 27 28 Picornavirus •RNA + (7.2- 8.4 kb) •Sin envoltura •Virión: 60 copias de 4 proteínas de cápside. •Replicación en citoplasma •Entrada: decapsidación en membrana plasmática •Salida por lisis celular Ej: poliovirus, hepatitis A virus, rinovirus, aftosa virus. - Cápside (VP1, VP2, VP3 y Proteínas VP4) estructurales - VPg - Actividad proteolítica Proteínas no estructurales - RNA Polimerasa dep de RNA 29 Picornavirus Ciclo infectivo 30 31 Flavivirus •RNA + (10,5kb) 5’CAP sin PolyA •Con envoltura (esféricos) •Replicación en citoplasma •Traducción a una única poliproteína clivada por proteasas •Ensamblado por brotación en vesículas citoplasmáticas •Salida por lisis celular •Fiebre amarilla •Dengue 32 33 INFLUENZA (Orthomyxovirus) •RNA – segmentado (6-8 segmentos, 10-13.6 kb totales) sin polyA •Virión: pleomórfico, nucleocápside con simetría helicoidal •3 RNA pol asociadas a cada segmento •Con envoltura •Entrada por endocitosis •Replicación y transcripción en núcleo •Ensamblado y liberación en membrana plasmática Influenza virus (A, B, C) 34 Influenza Ciclo Infectivo Péptido fusogénico en proteína HA, activado por clivaje. 35 •Transcripción y replicación en Núcleo •RNA polimerasa (transcriptasa) empaquetada en virión •Procesamiento de RNA mensajeros •RNAm con Cap (clivado de ARN mensajeros celulares) y polyA 36 NEURAMINIDASA Rol importante en la transmisión del virus en el huesped ¾Tamiflu (oseltamivir) Inhibidores de neuraminidasa ¾Relenza (Zanamivir) Modo de acción Æ inhibidor competitivo del ácido siálico Inhibe neuraminidasa (liberación de virus de la célula huesped) 37 Virus de la Rabia •RNA – no segmentado (13-16 kb) no polyA •Virión: nucleocápside con simetría helicoidal •Con envoltura •Entrada: fusión a membrana plasmática •Replicación citoplasmática •RNA polimerasa en virión •Ensamblado y liberación en membrana plasmática 38 39 Virus Rabia Ciclo infectivo 40 41 Retrovirus •RNA + (homodímero, 7-11 kb), Cap y poly A •Virión: nucleocápside helicoidal rodeada por cápside icosaédrica •Con envoltura •Replicación en núcleo •Entrada: fusión con membrana plasmática •Virión: RNA genómico, RT, Integrasa, Proteasa, tRNA 42 Retrovirus Ciclo infectivo 43 HIV (Retrovirus, lentivirus) 44 HIV: Terapia ¾ Nucleósidos Inhibidores de la Transcriptasa Reversa (NRTIs): Análogos de nucleósidos ¾ No-Nucleósidos Inhibidores de la Transcriptasa Reversa (NNRTIs): bloquean la transcriptasa reversa por unión a la enzima. ¾ Inhibidores de Proteasa ¾ Inhibidores de Fusión: interfiere con la unión, fusión y entrada del virión HIV. ¾ Inhibidores de Integrasa: bloquean la acción de la integrasa. ¾ Antagonistas de CCR5 unión al co-receptor CCR5 de células CD4+. Bloquea la unión del HIV a su receptor. 45 Virus ADN 46 Replicación Nuclear Pueden utilizar enzimas transcripcionales del huesped Replicación citoplasmática Proteínas involucradas en la transcripción y replicación virales Virus ADN Virus DNA dc mRNA Proteínas inmediatas tempranas mRNA Proteínas tempranas mRNA Proteínas tardías DNAdc Progenie Virus 47 Genoma: genes precedidos por promotores que regulan su expresión temporalmente Æ 3 tipos de genes Genes Tempranos Proteínas no estructurales: modificación del DNA, RNA celular y proteínas regulatorias de la expresión Genes Intermedios Replicación y regulación de la expresión Genes Tardíos Proteínas estructurales 48 HERPESVIRUS •Genoma ADN dc linear (124-235kb) •Virión: nucleocápside icosaedrica. Más de 30 proteínas estructurales •Con envoltura •Entrada por fusión a membrana •Replicación en núcleo (80 genes) •Ensamblado en membrana nuclear •Liberación de viriones por transporte de vesículas por citoplasma y fusión con membrana plasmática. •Ej: Herpes simplex, varicela-zoster virus, EpsteinBarr virus 49 50 Herpesvirus Ciclo infectivo Fase Temprana (antes de síntesis de DNA) Expresión de genes inmediatos tempranos y tempranos: - Proteínas reguladoras de la expresión y/o RNA polimerasa - Alteración de célula huésped - DNA polimerasa Fase Tardía Expresión de genes tardíos: - Replicación del ADN - Transcripción Tardía Æ genes que codifican proteínas estructurales 51 52 POXVIRUS •Genoma de ADN dc linear (covalentemente cerrado) (130-375kb) •Codifica 150-300 proteínas •Virión: Complejo. Aproximadamente 100 proteínas •Replicación y transcripción en citoplasma •RNA polimerasa y Enzimas modificadoras de ARNm en virión •ADN polimerasa propia •Ensamblado en citoplasma. Liberación de viriones por brotación (con envoltura) o por lisis celular (desnudos) Ej: Variola virus, vaccinia virus, moluscum contagiosum 53 GENOMAS VIRALES INFECTIVOS: A partir del genoma desnudo del virus (sin proteínas) introducido en una célula huesped adecuada (permisiva) se producen nuevas partículas virales GENOMAS VIRALES NO INFECTIVOS: Requieren de proteínas virales para la producción de nuevas partículas virales 54 VIRUS DE PLANTAS - Superficies externas de las plantas: capas protectivas de cera y pectina, cada célula rodeada de una gruesa pared de celulosa. - Entrada del virus a la célula requiere de un vector (bacteria, nematodo, insectos, hongos) o daño mecánico de la pared celular. - Transmisión entre plantas: semilla, injerto, vectores, mecánica - Propagación dentro de la planta: plasmodesmata + proteínas virales de movimiento asociadas. 55 PLANTAS RESISTENTES A VIRUS Naturales: Factores de resistencia que limitan la transmisión del virus en la planta y evitan la infección sistémica Plantas Transgénicas: expresión de proteínas o ARN que inhiben la decapsidacion o expresión de proteínas virales (proteínas virales (replicasas, proteínas de movimiento), ARN antisentido, ARN catalíticos, etc) 56 Isométricos: Tobacco necrosis virus, genero Necrovirus (partículas de 26 nm de diámetro) Forma de bastón: 20-25 nm de diámetro y 100 a 300 nm de largo. Tobacco mosaic virus, genero Tobamovirus (particulas de 300 nm de largo) (RNAsc) Filamentosos: usualmente 12 nm de diámetro y hasta 1000 nm de largo. Potato virus Y, genero Potyvirus (partículas de 740 nm de largo) Geminados: partículas isométricas gemelas de alrededor de 30 x 18 nm. Familia Geminiviridae ampliamente distribuídas en cultivos de regiones tropicales. Maize streak virus, género Mastrevirus. (DNA) Baciliformes: hasta 30 nm x 300 nm. Cocoa swollen shoot virus, genero Badnavirus (28 x 130 nm) 57 Vectores Virales para expresión de proteínas en Plantas Expresión de Proteínas Heterólogas en Plantas: Biofactorías Vectores Virales: Expresión en grandes cantidades No hay modificación del genoma de la planta Virus con genoma a ARN+ TMV CPMV PVX 58 a) Virus completo + Gen que codifica para Proteína de interés bajo control de promotor viral b) Vector Viral modificado + Agrobacterium Æ expresión del ARN viral 59 Terapia Génica • Introducción de genes en células de un organismo para prevenir o combatir una enfermedad. • Reemplazo de genes alterados • Inactivación de un gen alterado • Introducción de un nuevo gen – Blanco principal Enfermedades monogénicas » Fibrosis quística (CFTR) » Factores de coagulación » Deficiencias en adenosin-desaminasa (inmuno-incompetencia) Vectores de transferencia de genes: Virales o no virales Aplicación “ex vivo” o “in vivo” 60 61 62 •Virus como vectores para transferencia de genes 63 AAV: Virus adeno asociados Integración en sitios específicos del genoma Amplio rango de células blanco No asociado a enfermedades Organización genómica de virus adenoasociados Producción de vectores AAV recombinantes 64 Adenovirus Sin integraciónÆ Expresión transiente Virus delecionados incompetentes para replicación Capacidad 7.5 Kb Receptores ubicuos Organización genómica de Adenovirus 65 Retrovirus MLV (virus de leucemia murina)Ævirus defectivos incompetentes en replicación Integración en el genoma de la célula huéspedÆ expresión a largo plazo Infectividad limitada a células en división Capacidad para gen exógeno limitada (8 Kb) Organización genómica de retrovirus Producción de vectores retrovirales recombinantes 66 Retrovirus 67 68 BACTERIOFAGOS 50 x 106 bacteriófagos /ml de agua de mar y cantidad equivalente en suelos Se estiman 1031 bacteriófagos en la Tierra 69 70 Bacteriófagos con Genoma de DNA dc • LÍTICOS : T1 ÆT7 – Se multiplican en Bacterias y matan la célula por lisis al final de su ciclo de vida • Virión complejo: cabeza icosaédrica, cola y fibras • DNA dc linear : 40.000 – 170.000 pb • LISOGÉNICOS (Atemperados) – Alternativamente pueden multiplicarse vía ciclo lítico o entrar en un estado quiescente en la célula donde la mayor parte de los genes no se expresan (lisogénicos) 71 Fagos Líticos Fago T7 • Virión – cabeza icosaédrica, cola corta – DNAdc linear 40.000pb – Genoma 97% codificante • Expresión génica – Genes inmediatos tempranos (RNA polimerasa del huésped): » Proteína inhibitoria del sistema de restricción de la célula huésped » RNA polimerasa T7 » Inhibición de RNA polimerasa de la célula huésped – Genes tempranos y tardíos (T7 RNA polimerasa) » Replicación del genoma (T7 DNA polimerasa) » Proteínas estructurales y ensamblado 72 Uso de algunas características del fago T7 en Biología Molecular ¾ DNA polimerasa T7 Æ Enzima Sequenase (secuenciación de DNA) ¾RNA polimerasa T7 + promotor específicoÆ Vectores de expresión procariota 73 Fagos Líticos FagoT4 Virión Complejo (43 proteínas) -Cabeza icosaédrica -vaina -cuello -placa basal -fibras de la cola -DNAdc linear 170.000pb 74 Fagos Líticos ENTRADA Fago T4 -Adhesión a lipopolisacáridos de superficie -Inyección del material genético Infección viral Æ Degradación masiva del DNA de la célula huesped (nucleasas) Protección del DNA viral: base modificada 5 hidroximetilcitosina , con grupos hidroxilo glicosilados (DNA resistente a endonucleasas) 75 Fagos Líticos Infección del fago T4 Expresión génica en 3 fases (RNA pol de célula huésped + proteínas virales) 1er fase Æ RNA pol celular 2nda fase Æ RNA pol celular + proteínas virales regulatorias 3ra fase Æ RNA pol celular + nuevo factor sigma 76 Bacteriófagos con Genoma a RNAsc (+) • • • • Icosaédricos Pequeños 26nm Infectan células F+ (pili) Regulación de la expresión por estructura secundaria del RNA – MS2 (E.coli)Æ Genoma de RNA + : 3500nt 5` lisis Prot de maduración cubierta replicasa 3` RNA genómico cad+ (RNAm) 77 Mapa genético y proceso de multiplicación del virus MS2 78 Bacteriófagos Icosaédricos con Genoma a DNA sc • Fago ϕX174 • • • • DNA sc circular 5300 nt 1er DNA secuenciado totalmente 25nm Icosaédrico DNAsc Enz.celulares genoma DNAsc RF DNAdc Replicación (circulo rodante) transcripción traducción Proteínas virales ensamblado 79 Fagos Líticos Terapia con Bacteriófagos Uso de Bacteriófagos en reemplazo o junto con antibióticos – Ventajas • Multiplicación dependiente de la presencia de bacteria blanco • No tóxicos • Específicos (rango estrecho de huésped) Æ no causan daño a la flora normal • Selección de fagos con receptor involucrado en virulencia – Desventajas • EspecíficosÆ hay que conocer previamente el agente infectivo 80 Fagos Lisogénicos •FAGOS LISOGÉNICOS (Atemperados) – Fago Lambda o lamboides » Inserción del genoma en sitios específicos del cromosoma del huésped – Fago Mu » Inserción del genoma en cualquier parte del cromosoma del huésped » Transposición – Fago P1 » Profago no integrado » Mantenimiento como plásmido 81 Fagos Lisogénicos Fago lambda •Cabeza icosaédrica •Cola •1 única fibra •Genoma de ADNdc de 48.000pb •Extremos del genoma sc complementarios (extremos cos)Æ Circularización del genoma al ingresar a la célula y señales de empaquetamiento •Adsorción por unión a receptor: transportador maltosa 82 Fagos Lisogénicos Fago Lambda Eventos que llevan a la Lisogenia: -Circularización del genoma -Recombinación sitio específica (sitios att) -Represión de la expresión del genoma del fago Æ Expresión de Proteína represora Fin Lisogenia (Inducción del profago): -Destrucción de Proteína represora (Señal: condiciones adversas de crecimiento de las bacterias) 83 Fagos Lisogénicos Establecimiento de la Lisogenia o Ciclo Lítico Genes inmediatos tempranos = N y Cro Genes tempranos N, Cro, CII, CIII, CI Genes tardíos: Replicación, proteínas estructurales y lisis 84 Fagos Lisogénicos Usos en Biología Molecular del fago Lambda • Bibliotecas Genómicas • Bibliotecas de Expresión • Cósmidos 85 Cósmidos 86 Fagos Lisogénicos Genotipo y Fenotipo de Bacterias Lisogénicas ¾ Diversificación genómica (E.coli) ¾ Transmisión horizontal de factores de virulencia ÆTransformación de cepas no patógenas en patógenas Factores de virulencia localizados en genomas de bacteriófagos lisogénicos Æ codifican Proteínas que proveen a la bacteria mecanismos de: ¾Invasión de células huésped ¾Evitar defensas inmunes del huésped ¾Daño a células del huésped 87 Ejemplos de toxinas codificadas en bacteriófagos lisogénicos • Toxina colérica (ctxAB) Æ CTXΦ (Vibrio colera) • Toxina diftérica (tox) Æ β-phage (Corynebacterium diphteriae) • Shiga toxina (stx1, 2) Æ H-19B (E.coli) Inducción del profago Æ Multiplicación del virus (ciclo lítico) ¾ Aumento del número de copias del gen (Replicación) ¾Regulación positiva de la expresión Aumento de producción de toxina 88 Bacteriófagos Filamentosos DNA sc • M13, f1, fd (E.coli) • • • • Simetría helicoidal DNA sc circular Infectan células F+ Liberación de la célula sin lísis Æ ensamblado a nivel de membrana citoplasmática acoplado a transporte 89 RF DNAdc Replicación (circulo rodante) Enz. celulares genoma DNAsc transcripción traducción Proteínas virales Copias del genoma DNAsc Ensamblado en la membrana y translocación 90 Usos en Biología Molecular de los Fagos Filamentosos • Vectores de clonado y secuenciación Producción de DNA simple cadena Células infectadas mantenidas en cultivo Espacio intergénico que puede reemplazarse por DNA exógeno • Bibliotecas de Péptidos 91 Usos de virus en Biología Molecular ¾ Vectores de clonado – Secuenciación (M13) – Bibliotecas (fago lambda, cósmidos) ¾ Bibliotecas – Genómicas – Expresión – Péptidos (Fd) ¾ Vectores de Expresión – Baculovirus – Vaccinia ¾ Terapia Génica 92 BACULOVIRUS 93
