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Virus
¾ Complejos de Ácidos nucleicos + Proteínas
¾ Capacidad de multiplicación en células vivas
¾ Parásitos intracelulares obligados
¾ Genoma reducido: codifica funciones que no pueden adaptar
de sus células huésped
¾ Estructura extracelular: virión o partícula viral
¾ Estable fuera de la célula
¾ Desensamblado rápido intracelular
¾ Diversidad en tamaño, estructura y organización genómica
1
Propiedades de Virus y Microorganismos
<300nm
Crecim.en
medio de cult
Fision binaria
DNA y RNA
Genoma infec
Ribosomas
Metabolismo
Sensibilidad
Antibiot.
BACTERIA
MYCOPLAS
RICKETTS.
CHLAMYD.
VIRUS
+
+
+
-
+/+
+
+
-
+
+
-
+/+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/-
-
+
+
+
+
-
2
Tamaño
3
Estructura y Composición
• Cubierta Proteica = Cápside
– Formada por muchas copias de un número pequeño de proteínas
virales unidas por uniones no covalentes
• Genoma (información genética)
– Ácido nucleico (ARN, ADN)
• Envoltura Lipídica Adquirida de la célula huésped
(algunos virus)
4
Viroides, Virusoides y Priones
• Viroides
–
–
–
–
Patógenos de plantas
RNAsc circular (240 a 400nt)
No codificantes
Replicación en nucleolo (RNA pol DNA dep celular)
• Virusoides
– RNA satélite encapsulado por proteínas codificadas por virus
Helper
– No codificantes
– Replicación citoplasmática (RNA pol RNA dep cel)
• Priones
– Proteínas infecciosas
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Origen de los virus
¾ Teoría RegresivaÆ Formas degeneradas de parásitos
intracelulares
¾ Origen a partir de componentes celulares (RNAs o DNAs)
¾ Transposones
¾ Retrotransposones
¾ RNA replicativos
¾ Origen independiente y coevolución con las moléculas más
primitivas autorreplicativas
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Clasificación virus
• Morfología del virión
• Tamaño
• Simetría
• Envoltura
7
Simetría del Virión
8
Simetría del virión
ADENOVIRUS
VIRUS MOSAICO DEL TABACO
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Clasificación virus
• Morfología del virión
• Tamaño
• Simetría
• Envoltura
• Tipo de ácido nucleico
• ARN (sc o dc)
• ADN (sc o dc)
• Estrategia Replicativa
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Estrategias
Replicativas
Clasificación de Baltimore
11
Clasificación de Virus Animales
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Propagación de virus
-aislamiento
Propagación
Objetivo
-producción de vacunas
-estudios bioquímicos
•Células en cultivo
•Huevos embrionados
•Animales de laboratorio
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Alteraciones en células infectadas
Efecto
citopático
•Lisis
•Fusión células
•Transformación
Cuantificación
•Placas (UFP)
•Focos fluorescentes
•Transformación
•Conteo de partículas por M.E.
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Ciclo Infectivo: producción de virus
Virus
PFU
(Unidades
formadoras
de placa)
tiempo
15
Ciclo Infectivo
1) ENTRADA
2) DES-ENSAMBLADO
3) MULTIPLICACIÓN VIRAL
Producción de proteínas y
ácidos nucleicos
4) ENSAMBLADO
5) LIBERACIÓN
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1) ENTRADA
• ADSORCIÓN Æ Unión del virus a la superficie celular (sin gasto de energia)
Receptores virales
(determinan qué células son
susceptibles)
Específicos
Ampliamente
distribuidos
•Proteínas
•Carbohidratos
•Glicolípidos
•Receptor de acetilcolina (rabia)
•CD4 linfocitos T (HIV)
•Ácido Siálico (Influenza)
•Heparan Sulfato (herpesvirus)
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Receptores virales en linfocitos T para HIV
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•
PENETRACIÓN
¾ Fusión con Membrana Plasmática (virus con
envoltura)
• Péptido fusogénico
herpes, paramyxovirus, retrovirus, etc
¾ Endocitosis mediada por receptor
• Péptido fusogénico (virus con env)
Influenza
• Lísis endosoma (virus sin env)
Adenovirus
¾ Translocación
picornavirus
¾ Formación de poros en la pared celular
bacteriofagos
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HIV
-Adsorción: Unión a receptor y
coreceptor
-Penetración: Fusión con membrana
plasmática (péptido fusogénico)
Influenza virus
-Absorción: unión a glicoproteínas
con ácido siálico
-Penetración por endocitosis
-Liberación dependiente de
acidificación, por fusión con
membrana de la vesícula (péptido
fusogénico)
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2) DESENSAMBLADO y TRANSPORTE AL SITIO
INTRACELULAR CORRECTO
(membrana, endosoma, citoplasma, poro nuclear)
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3) MULTIPLICACIÓN VIRAL Æ Producción de Proteínas
y ácidos nucleicos virales
¾Transcripción Æ RNAm
¾TraducciónÆ Apropiación del aparato de traducción de
célula huésped. Síntesis de proteínas estructurales y no
estructurales
• Degradación del ARNm celular
• Competencia por el aparato de traducción
• Cambio de especificidad del aparato de traducción
¾ReplicaciónÆ Estrategias Replicativas
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•4) ENSAMBLADO
• 5) LIBERACIÓN
• Acumulación en citoplasma o
núcleoÆ Lisis
• Brotación (virus con envoltura)
– Membrana Plasmática
– Membranas Internas
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24
VIRUS CON GENOMA
DE ARN
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26
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Picornavirus
•RNA + (7.2- 8.4 kb)
•Sin envoltura
•Virión: 60 copias de 4
proteínas de cápside.
•Replicación en citoplasma
•Entrada: decapsidación en
membrana plasmática
•Salida por lisis celular
Ej: poliovirus, hepatitis A virus,
rinovirus, aftosa virus.
- Cápside (VP1, VP2, VP3 y
Proteínas
VP4)
estructurales
- VPg
- Actividad proteolítica
Proteínas no
estructurales - RNA Polimerasa dep de
RNA
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Picornavirus
Ciclo infectivo
29
30
Flavivirus
•RNA + (10,5kb) 5’CAP sin PolyA
•Con envoltura (esféricos)
•Replicación en citoplasma
•Traducción a una única
poliproteína clivada por proteasas
•Ensamblado por brotación en
vesículas citoplasmáticas
•Salida por lisis celular
•Fiebre amarilla
•Dengue
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INFLUENZA (Orthomyxovirus)
•RNA – segmentado (6-8 segmentos, 10-13.6 kb
totales) sin polyA
•Virión: pleomórfico, nucleocápside con simetría
helicoidal
•3 RNA pol asociadas a cada segmento
•Con envoltura
•Entrada por endocitosis
•Replicación y transcripción en núcleo
•Ensamblado y liberación en membrana
plasmática
Influenza virus (A, B, C)
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Influenza
Ciclo Infectivo
Péptido fusogénico en proteína HA,
activado por clivaje.
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•Transcripción y replicación en Núcleo
•RNA polimerasa (transcriptasa) empaquetada en virión
•Procesamiento de RNA mensajeros
•RNAm con Cap (clivado de ARN mensajeros celulares) y polyA
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Virus de la Rabia
•RNA – no segmentado (13-16 kb) no
polyA
•Virión: nucleocápside con simetría
helicoidal
•Con envoltura
•Entrada: fusión a membrana plasmática
•Replicación citoplasmática
•RNA polimerasa en virión
•Ensamblado y liberación en membrana
plasmática
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37
Virus Rabia
Ciclo infectivo
38
39
Retrovirus
•RNA + (homodímero, 7-11
kb), Cap y poly A
•Virión: nucleocápside
helicoidal rodeada por
cápside icosaédrica
•Con envoltura
•Replicación en núcleo
•Entrada: fusión con
membrana plasmática
40
Retrovirus
Ciclo infectivo
41
Virus ADN
42
Replicación Nuclear
Virus ADN
Replicación
citoplasmática
Virus
DNA dc
mRNA
Proteínas
inmediatas
tempranas
mRNA
Proteínas
tempranas
mRNA
Proteínas
tardías
DNAdc
Progenie
Virus
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HERPESVIRUS
•Genoma ADN dc linear (124-235kb)
•Virión: nucleocápside icosaedrica. Más de 30
proteínas estructurales
•Con envoltura
•Entrada por fusión a membrana
•Replicación en núcleo (80 genes)
•Ensamblado en membrana nuclear
•Liberación de viriones por transporte de vesículas
por citoplasma y fusión con membrana plasmática.
•Ej: Herpes simplex, varicela-zoster virus, EpsteinBarr virus
44
45
Herpesvirus
Ciclo infectivo
Fase Temprana (antes de síntesis de DNA)
Expresión de genes inmediatos tempranos y tempranos:
- Proteínas reguladoras de la expresión y/o RNA polimerasa
- Alteración de célula huésped
- DNA polimerasa
Fase Tardía
Expresión de genes tardíos:
- Replicación del ADN
- Transcripción Tardía Æ genes que codifican
proteínas estructurales
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47
POXVIRUS
•Genoma de ADN dc linear (covalentemente
cerrado) (130-375kb)
•Codifica 150-300 proteínas
•Virión: Complejo. Aproximadamente 100
proteínas
•Replicación y transcripción en citoplasma
•RNA polimerasa y Enzimas modificadoras de
transcriptos en virión
•ADN polimerasa propia
•Ensamblado en citoplasma. Liberación de
viriones por brotación (con envoltura) o por lisis
celular (desnudos)
Ej: Variola virus, vaccinia virus,
moluscum contagiosum
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Genoma: genes precedidos por promotores que regulan su
expresión temporalmente Æ 3 tipos de genes
Genes Tempranos
Proteínas no estructurales:
modificación del DNA, RNA y
proteínas
Genes Intermedios
Replicación y regulación de la
expresión
Genes Tardíos
Proteínas estructurales
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VIRUS DE PLANTAS
- Las superficies externas de las plantas están constituidas por
capas protectivas de cera y pectina y cada célula esta rodeada
de una gruesa pared de celulosa.
- La entrada a la célula requiere de un vector (bacteria,
nematodo, insectos, hongos) o daño mecánico de la pared
celular.
- Transmisión entre plantas: semilla, injerto, vectores,
mecánica
- Propagación dentro de la planta: plasmodesmata +
proteínas virales de movimiento asociadas.
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PLANTAS RESISTENTES A VIRUS
Naturales: Factores de resistencia que limitan la transmisión del
virus en la planta y evitan la infección sistémica
Plantas Transgénicas: expresión de proteínas o ARN que
inhiben la decapsidacion o expresión de proteínas virales
(proteínas virales (replicasas, proteínas de movimiento), ARN
antisentido, ARN catalíticos, etc)
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Isométricos: Tobacco necrosis virus, genero Necrovirus
(partículas de 26 nm de diámetro)
Forma de bastón: 20-25 nm de diámetro y 100 a 300 nm de
largo. Tobacco mosaic virus, genero Tobamovirus (particulas
de 300 nm de largo) (RNAsc)
Filamentosos: usualmente 12 nm de diámetro y hasta 1000
nm de largo. Potato virus Y, genero Potyvirus (partículas de
740 nm de largo)
Geminados: partículas isométricas gemelas de alrededor de
30 x 18 nm. Familia Geminiviridae ampliamente distribuídas
en cultivos de regiones tropicales. Maize streak virus, género
Mastrevirus. (DNA)
Baciliformes: hasta 30 nm x 300 nm. Cocoa swollen shoot
virus, genero Badnavirus (28 x 130 nm)
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BACTERIOFAGOS
50 x 106 bacteriófagos /ml de agua de mar y
cantidad equivalente en suelos
Se estiman 1031 bacteriófagos en la Tierra
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Bacteriófagos con Genoma de DNA dc
• LÍTICOS : T1 ÆT7
– Se multiplican en Bacterias y matan la célula por lisis al final de su
ciclo de vida
• Virión complejo: cabeza icosaédrica, cola y fibras
• DNA dc linear : 40.000 – 170.000 pb
• LISOGÉNICOS (Atemperados)
– Alternativamente pueden multiplicarse vía ciclo lítico o entrar en
un estado quiescente en la célula donde la mayor parte de los
genes no se expresan (lisogénicos)
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Fagos Líticos
Fago T7
• Virión
– cabeza icosaédrica, cola corta
– DNAdc linear 40.000pb
– Genoma 97% codificante
• Expresión génica
– Genes inmediatos tempranos (RNA polimerasa del huésped):
» Proteína inhibitoria del sistema de restricción de la célula huésped
» RNA polimerasa T7
» Inhibición de RNA polimerasa de la célula huésped
– Genes tempranos y tardíos (T7 RNA polimerasa)
» Replicación del genoma (T7 DNA polimerasa)
» Proteínas estructurales y ensamblado
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Fagos Líticos
• Replicación del Fago T7
– Origen de replicación único
– formación de concatémeros
– monómeros Æ endonucleasa específica
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Uso de algunas características del
fago T7 en Biología Molecular
¾ DNA polimerasa T7 Æ Enzima Sequenase (secuenciación de DNA)
¾RNA polimerasa T7 + promotor específicoÆ Vectores de expresión procariota
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Fagos Líticos
FagoT4
Virión Complejo (43 proteínas)
-Cabeza icosaédrica
-vaina
-cuello
-placa basal
-fibras de la cola
-DNAdc linear 170.000pb
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Fagos Líticos
ENTRADA Fago T4
-Adhesión a lipopolisacáridos de superficie
-Inyección del material genético
Infección viral Æ Degradación
masiva del DNA de la célula huesped
(nucleasas)
Protección del DNA viral: base
modificada
5 hidroximetilcitosina , con grupos
hidroxilo glicosilados (DNA resistente a
endonucleasas)
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Fagos Líticos
Infección del fago T4
Expresión génica en 3 fases (RNA pol de célula huésped + proteínas virales)
1er fase Æ RNA pol celular
2nda fase Æ RNA pol celular + proteínas virales regulatorias
3ra fase Æ RNA pol celular + nuevo factor sigma
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Bacteriófagos con Genoma a RNAsc (+)
•
•
•
•
Icosaédricos
Pequeños 26nm
Infectan células F+ (pili)
Regulación de la expresión por estructura secundaria del RNA
– MS2 (E.coli)Æ Genoma de RNA + : 3500nt
5`
lisis
Prot de maduración cubierta
replicasa
3`
RNA genómico cad+ (RNAm)
62
Mapa genético y
proceso de
multiplicación del
virus MS2
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Bacteriófagos Icosaédricos con Genoma a DNA sc
• Fago ϕX174
•
•
•
•
DNA sc circular
5300 nt
1er DNA secuenciado totalmente
25nm Icosaédrico
DNAsc
Enz.celulares
genoma
DNAsc
RF
DNAdc
Replicación
(circulo rodante)
transcripción
traducción
Proteínas
virales
ensamblado
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Fagos Líticos
Terapia con Bacteriófagos
Uso de Bacteriófagos en reemplazo o junto con antibióticos
– Ventajas
• Multiplicación dependiente de la presencia de bacteria blanco
• No tóxicos
• Específicos (rango estrecho de huésped) Æ no causan daño a la
flora normal
• Selección de fagos con receptor involucrado en virulencia
– Desventajas
• EspecíficosÆ hay que conocer previamente el agente infectivo
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Fagos Lisogénicos
•FAGOS LISOGÉNICOS (Atemperados)
– Fago Lambda o lamboides
» Inserción del genoma en sitios específicos del cromosoma del
huésped
– Fago Mu
» Inserción del genoma en cualquier parte del cromosoma del
huésped
» Transposición
– Fago P1
» Profago no integrado
» Mantenimiento como plásmido
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Fagos Lisogénicos
Fago lambda
•Cabeza icosaédrica
•Cola
•1 única fibra
•Genoma de ADNdc de 48.000pb
•Extremos del genoma sc complementarios (extremos cos)Æ Circularización del genoma al
ingresar a la célula y señales de empaquetamiento
•Adsorción por unión a receptor: transportador maltosa
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Fagos Lisogénicos
Fago Lambda
Eventos que llevan a la Lisogenia:
-Circularización del genoma
-Recombinación sitio específica (sitios att)
-Represión de la expresión del genoma del fago
Æ Expresión de Proteína represora
Fin Lisogenia (Inducción del
profago):
-Destrucción de Proteína represora
(Señal: condiciones adversas de crecimiento
de las bacterias)
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Fagos Lisogénicos
Establecimiento de la Lisogenia o Ciclo Lítico
Genes inmediatos tempranos = N y Cro
Genes tempranos N, Cro, CII, CIII, CI
Genes tardíos: Replicación, proteínas
estructurales y lisis
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Fagos Lisogénicos
Usos en Biología Molecular del fago Lambda
•
Bibliotecas Genómicas
•
Bibliotecas de Expresión
•
Cósmidos
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Cósmidos
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Fagos Lisogénicos
Genotipo y Fenotipo de Bacterias Lisogénicas
¾ Diversificación genómica (E.coli)
¾ Transmisión horizontal de factores de virulencia
ÆTransformación de cepas no patógenas en patógenas
Factores de virulencia localizados en genomas de bacteriófagos
lisogénicos
Æ codifican Proteínas que proveen a la bacteria mecanismos de:
¾Invasión de células huésped
¾Evitar defensas inmunes del huésped
¾Daño a células del huésped
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Ejemplos de toxinas codificadas en bacteriófagos
lisogénicos
•
Toxina colérica (ctxAB) Æ CTXΦ (Vibrio colera)
•
Toxina diftérica (tox) Æ β-phage (Corynebacterium diphteriae)
•
Shiga toxina (stx1, 2) Æ H-19B (E.coli)
Inducción del profago Æ Multiplicación del virus (ciclo lítico)
¾ Aumento del número de copias del gen
(Replicación)
¾Regulación positiva de la expresión
Aumento de producción
de toxina
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Bacteriófagos Filamentosos
DNA sc
•
M13, f1, fd (E.coli)
•
•
•
•
Simetría helicoidal
DNA sc circular
Infectan células F+
Liberación de la célula sin lísis Æ ensamblado a nivel de membrana citoplasmática
acoplado a transporte
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RF
DNAdc
Replicación
(circulo rodante)
Enz.
celulares
genoma
DNAsc
transcripción
traducción
Proteínas
virales
Copias del
genoma
DNAsc
Ensamblado en la
membrana y
translocación
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Usos en Biología Molecular de los Fagos Filamentosos
•
Vectores de clonado y secuenciación
Producción de DNA simple cadena
Células infectadas mantenidas en cultivo
Espacio intergénico que puede reemplazarse por DNA
exógeno
•
Bibliotecas de Péptidos
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Usos de virus en Biología Molecular
¾ Vectores de clonado
– Secuenciación (M13)
– Bibliotecas (fago lambda, cósmidos)
¾ Bibliotecas
– Genómicas
– Expresión
– Péptidos (Fd)
¾ Vectores de Expresión
– Baculovirus
– Vaccinia
¾ Terapia Génica
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Terapia Génica
• Virus como vectores para transferencia de genes
– Blanco principal Enfermedades monogénicas
Æ reemplazo de genes alterados
» Fibrosis quística (CFTR)
» Factores de coagulación
» Deficiencias en adenosin-desaminasa (inmunoincompetencia)
Aplicación “ex vivo” o “in vivo”
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Virus usados en terapia génica
¾ Retrovirus
–
–
–
–
–
MLV (virus de leucemia murina)Ævirus defectivos incompetentes en replicación
Integración en el genoma de la célula huéspedÆ expresión a largo plazo
Infectividad limitada a células en división
Capacidad para gen exógeno limitada (8 Kb)
Inactivación por complemento
¾ Adenovirus
–
–
–
–
Sin integraciónÆ Expresión transiente
Virus delecionados incompetentes para replicación
Capacidad 7.5 Kb
Receptores ubicuos
¾ Virus asociados a adenovirus
– Integración en sitios específicos del genoma
– Amplio rango de células blanco
– No asociado a enfermedades
¾ Herpesvirus, Vaccinia, Syndbis virus
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