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En busca de tests genéticos más simples: el HRM Joaquín Royo Cárcamo Dpto. Biología Celular y Genética. Universidad de Alcalá Muchas veces habremos leído que un gen causa una cierta enfermedad. En realidad lo correcto sería decir que el causante es una variante de ese gen, por lo general debido a que funciona de modo defectuoso. A las variantes de los genes se les llama alelos y el objetivo de los tests genéticos es determinar si entre las dos copias de cada gen que cada uno tenemos nos ha tocado en suerte cargar con algún alelo que pueda causar problemas. Como estos tests suelen tener que hacerse en muchos individuos siempre se busca a la hora de diseñarlos compatibilizar la fiabilidad con el uso de técnicas simples y económicas. Aquí vamos a presentar la conocida como análisis por HRM (“High-Resolution Melting”) que utilizamos en nuestro grupo del Departamento de Biología Celular y Genética de la UAH en un aparato RotorGeneQ (Qiagen). El HRM se basa en que el DNA está formado por dos cadenas (por eso se dice que es un dúplex) unidas por enlaces cuya fuerza depende de su secuencia. Recordemos que hay cuatro componentes en el DNA: A, G, C y T, que pueden aparecer en cualquier orden (la secuencia de ese DNA) pero que siempre se unen mediante enlaces de A o G en una cadena con T o C, respectivamente, en la otra. Esos enlaces pueden romperse simplemente subiendo la temperatura hasta unos 90-95ºC, entonces las cadenas se separan por completo y se dice que el DNA está desnaturalizado. Si luego bajamos la temperatura podrán volver a unirse las cadenas para tornar al dúplex de partida: el DNA ha renaturalizado. En el HRM se sube poco a poco la temperatura mientras se mide con precisión el proceso de desnaturalización que tiene lugar. Al calentar aparecen pequeñas burbujas entre las cadenas que con el aumento de temperatura van creciendo y juntándose hasta acabar separándolas por completo. Por tanto, la proporción de zona desnaturalizada en cada molécula aumentará al subir la temperatura y lo importante es que el modo en que eso ocurra variará con su secuencia. Para poder seguir el proceso de desnaturalización mientras tiene lugar se añade a la muestra un compuesto de los conocidos como fluróforos, que cuando se iluminan con luz de un determinado color son capaces de emitir luz de otro diferente (fluorescen). Los fluróforos empleados en HRM sólo se unen al DNA dúplex y sólo así unidos emiten una intensa fluorescencia. En consecuencia, a medida que avance el proceso de desnaturalización serán menores el número de esas moléculas unidas al DNA y la fluorescencia que produzcan. Para usar la técnica del HRM hay que empezar por separar el gen que nos interesa de los otros miles del genoma. Para eso sirve el PCR, una técnica de uso corriente en los laboratorios de biología molecular que nos permite no sólo encontrar la aguja del gen en el pajar del genoma sino también producir muchas copias de ella. Con el PCR se amplifica una pequeña región (alrededor de 100 pb) en torno a un punto donde difieran los alelos a reconocer, basta con que contenga un único cambio en la secuencia de nucleótidos: lo que se conoce como un SNP. Todas las moléculas obtenidas en el PCR, en el que ya se incluye el fluoróforo que servirá luego para seguir el HRM, serán iguales si el individuo portaba únicamente un alelo, es decir, si era homocigótico, pero de dos tipos diferentes si el individuo tenía dos alelos distintos, era heterocigótico. A continuación se someten las muestras a un ciclo rápido de desnaturalización y renaturalización de modo que nada cambia con las procedentes de individuos homocigóticos. Pero en las de un heterocigoto aparecerá, aparte de los dos tipos preexistentes de moléculas correspondientes a cada alelo, un tercero nuevo formado por una cadena de un alelo y otra del otro: un heterodúplex. Recordemos que en este heterodúplex habrá una posición, la correspondiente al SNP, en la que la secuencia de ambas hebras será diferente: eso afectará bastante a su comportamiento en el HRM. Se pasa entonces al HRM ya anteriormente descrito. Es importante destacar, por tratarse de una de las grandes ventajas de esta técnica, que todo el proceso, desde el PCR hasta el HRM, tiene lugar ininterrumpidamente dentro de la misma máquina y en los mismos tubos, lo que agiliza el proceso y evita errores o contaminaciones. Convenientemente procesadas por un programa informático, las gráficas de cambio de fluorescencia con la temperatura tendrán formas claramente diferentes para el caso de moléculas procedentes de ambos alelos o del heterodúplex que surge de un individuo heterocigoto. El análisis se facilita notablemente si se incluyen muestras control que contengan cada uno de los alelos del gen que se quieren identificar y con las que comparar los resultados. En nuestro aparato pueden analizarse de esta forma hasta 100 muestras simultáneamente en menos de 3 horas. Como demostración de su potencial hemos empleado esta técnica para determinar la presencia del alelo normal o del Leyden del factor V de coagulación sanguínea y del alelo normal o del 20210G>A de la protrombina (ambos factores de riesgo para la trombosis venosa) en muestras obtenidas en prácticas de laboratorio de las licenciaturas de Medicina y Biología de la UAH (Fig. 1). También hemos comprobado que las muestras control correspondiente a cada alelo pueden obtenerse desde DNA clonado en bacterias mediante técnicas convencionales de ingeniería genética, lo que permite disponer de cantidades ilimitadas de cualquier alelo, por raro que sea en la población a analizar. Indicar por último que el HRM se puede usar no sólo en tests genéticos sino también para localizar dónde está una mutación en el genoma o para identificar regiones metiladas relacionadas con fenómenos epigenéticos. SNP WT G C WT A T m G T heterodúplex m het Fig. 1 Resultado de un análisis de HRM en que se puede distinguir claramente el comportamiento del DNA procedente de individuos homocigotos (WT y m) y heterocigotos (het) para los alelos normal y mutante de la protrombina. Las muestras control para cada caso son las trazadas con líneas de puntos, el resto vienen de individuos humanos. El heterocigoto identificado en este análisis está señalado con una punta de flecha. En el esquema se muestra el SNP que distingue ambos alelos y la distorsión en el heterodúplex obtenido tras la desnaturalización/renaturalización del producto del PCR en un individuo heterocigoto.