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Laboratorio 4:
Tinción de microorganismos
Biol 3725L
Repaso de diluciones
1 ml
0.1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
9 ml
1 / 10
10-1
99 ml
1 / 100
10-3
9 .9ml
0.1/ 10
1/ 100
10-5
9 ml
1/10
10-6
9 ml
1/10
10-7
1 ml
1 ml
0.1 ml
1 ml
¿Cuántas colonias viables
tengo?
1. Escojo el plato que tenga
entre 25 – 250 UFC.
2. Utilizo la fórmula de:
UFC * (1/factor de
dilución)
10-8
TMTC
10-6
265 UFC
10-7
25 UFC
2 UFC
Reportar datos:
1. Placas con estriado: obtuvo o no colonias discretas
2. Dilución en serie: reporte UFC/mL para las tres placas
utilizadas en su sub-grupo (incluya los cálculos)
Objetivos
• Conocer el mecanismo básico y ventajas de una
tinción.
• Aprender conceptos básicos relacionados a:
•
•
•
•
•
Proceso de preparación de un frotis
Tinción Gram
Tinción Ácido-Resistente
Tinción de Esporas
Tinción de Cápsula (negativa).
• Identificar características en las bacterias en estudio
en base a las diferentes tinciones.
Tinciones de microorganismos
• Tinción Gram (práctica)
• Tinción de Cápsulas - Tinción Negativa (práctica)
• Tinción de Esporas (práctica)
• Tinción Ácido-Resistente (teoría)
• Tinción de flagelos (teoría)
Morfología y agrupación de
bacterias
Ya se han discutido métodos
de clasificación por morfología
y medios de cultivo.
Ahora utilizaremos tinciones
con el fin de poder seguir
caracterizando a las bacterias.
Espiroquetas
Coco
Bacilo
Morfología y agrupación de bacterias:
Tinción
• La tinción es una de las técnicas más utilizadas en los
laboratorios de microbiología para clasificar microorganismos.
• El tinte es un compuesto orgánico que le da contraste a la
célula.
• cromógeno (solvente orgánico que le provee las
propiedades de color)
• auxócromo (grupo químico que se ioniza con el cromógeno
y forma sales que se pegan a las fibras y tejidos).
• La adhesión del tinte va a depender de la carga que posea.
Tinción
Tipos de Tinciones
• Simple
• Tamaño, arreglo
y forma
• Un solo tinte
• Directa
• Tiñe bacteria
• Negativa
• tiñe el fondo
pero no a la
bacteria
•Diferencial
•Separar y clasificar
los microorganismos
observados de
acuerdo a sus
características
•Más de un tinte
•Ejemplos:
Tinción Gram y Ácido
resistente
• Específica
•Para identificar
estructuras:
•Ejemplos: Tinción
de flagelos,
cápsulas y esporas.
Tinción simple: un solo tinte , afinidad por carga con componentes
de la superficie de la célula
Ejemplo : azul de metileno
(+)
(-)
(-) (-)
(-)
(-)
(-)
(-)
methylene blue
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-) (-)
Tinción diferencial: permite detectar tipos distintos de células
Azul-Violeta
Rojo
Pasos de la
Tinción Gram
Cristal violeta (1
minuto)
Lavar con agua (Streptococcus sp.)
Yodo (1 minuto)
Lavar con agua
Alcohol etílico al
95% (20 segundos)
Lavar con agua
Safranina (1 minuto)
Lavar con agua
Secar con bibolous
paper
Gram+= azul-violeta,
Gram – = rojo
(Escherichia coli)
Desventajas de técnicas de
tinción:
• requieren fijar la muestra
con calor: (células mueren)
• calor + químicos pueden
distorsionar la forma original
de las células
Tinción Gram
• Tinte primario- Cristal Violeta (CV), tiñe la bacteria
color violeta.
• Agente mordante- Yodo, forma un complejo insoluble
con CV. Ayuda a adherir el tinte a la célula. Ayuda a
resistir la decoloración.
• Agente decolorizante- alcohol etílico al 95%, sirve
como solvente de lípidos y agente deshidratante de
proteínas. Remueve el cristal violeta.
• Contratinte- Safranina, tiñe de rojo la bacteria.
Resultados - Tinción Gram
Gram Negativo
Gram Positivo
Su pared celular contiene una
capa gruesa de
peptidoglicano
Gram +
Reacción se basa en la
diferencia en la composición
química de la pared bacteriana.
Gram Su pared celular contiene una
capa fina de peptidoglicano
Pared celular procariota
Peptidoglicano: polímero de dos azúcares modificadas (N-acetil glucosamina
y N-acetil ácido murámico ) y tetrapéptidos
enlace β, 1-4
G
M
G
G
G
M
G
M
4
3
M
M
M
G
G = N-acetil glucosamina
M = N-acetil ácido murámico (mureína)
M
G
M
G
tetrapéptido (4 amino ácidos)
M
Pared celular procariota
G
M
M
G
G
M
M
M
G
G
M
G
G
G
M
M
G
M
M
M
G
G
M
G
G
G
M
M
G
M
M
M
G
G
M
G
G
G
M
M
G
M
G
M
G
G
M
M
M
M
G
M
M
M
G
G
M
M
G
G
M
M
G
G
M
M
G
M
Tinción Gram
Fundamento
• Membrana externa de las Gram –
• es soluble en solventes orgánicos como el alcohol
• la capa de peptidoglicano es demasiado delgada como para
retener el complejo cristal violeta/yodo que se formó
• por lo que va perdiéndose el color azul-violeta.
• Las Gram + no tienen su capa susceptible a la acción
de solventes orgánicos
• se deshidratan los poros y se cierran
• reteniéndose el complejo cristal violeta/yodo y por
consiguiente el color azul-violeta.
Preparación de la muestra para
proceso de Tinción
Preparación de frotis:
Limpiar la laminilla con papel de
lentes.
Prepara el frotis
Medio líquido- solo se coloca una
porción del cultivo con el “loop” en
la laminilla.
Medio sólido- se coloca una gotita
de agua destilada en la laminilla y
se diluye la porción de cultivo en
ella. Se esparce bien.
Secar a temperatura ambiente
Fijación por calor
Tinción Gram
Laminilla
Control positivo
Gram + (Bacillus cereus)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Desconocido
Control negativo
Gram – (E. coli)
Cubrir frotis con tinte cristal violeta (1 minuto).
Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte.
Cubrir frotis con yodo (1 minuto).
Enjuague con agua destilada.
Enjuague la laminilla con alcohol etílico 95% (no exceder los 30 seg).
Enjuague la laminilla con agua destilada.
Cubrir frotis con tinte safranina (1 minuto).
Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte.
Secar laminillas con papel “bibulous” para remover el exceso de agua.
Secuencia de reacciones
Tinción de Cápsulas
• Cápsula- estructura gelatinosa secretada por algunas
bacterias
• capas de polisacáridos o proteínas que revisten el exterior
de un bacteria
• Función: adherencia y formación de biopelículas (capas de
crecimiento bacteriano) y protección contra fagocitosis
(macrófagos, sistema inmunológico)
• La cápsula se compone de polisacáridos, glicoproteínas
y polipéptidos.
• La mayoría de las cápsulas están compuestas de
polisacáridos, por lo que son solubles en agua.
Tinción de Cápsulas
cápsula
Tinción de Cápsulas
Tinte primario- Cristal Violeta 1%- tiñe todo el frotis color oscuro
Decolorante y Contratinte- Sulfato de Cobre 20%-se usa para enjuagar el
tinte primario
No se enjuaga con agua porque la cápsula es soluble en agua función de decolorante
El CuSO4 es absorbido en el material de la cápsula que ha sido
decolorada - función de contratinte.
La cápsula aparece azul clara en un fondo oscuro.
Tinción de Cápsulas
• Preparación de un frotis cargado (“heavy”).
• Dejar secar a temperatura ambiente.
• Cristal violeta 1% (5-7 minutos).
• Enjuagar con CuSO4
• Secar con “bibulous paper”
• Cryptococccus laurentii
Tinción de Cápsulas
Tinción simple-negativa
• La tinción se logra mediante una mezcla del tinte y el cultivo
de bacteria.
• El tinte utilizado es “ India Ink” (Se puede utilizar también
eosina o nigrosina).
• Se le conoce como efecto de cielo estrellado.
Efecto de Cielo estrellado
Tinción de Cápsulas
Tinción simple-negativa
• Célula vegetativa- forma metabólicamente activa = bacterias.
• Esporas- forma metabólicamente inactiva y altamente
resistente.
• Los miembros del género anaerobio Clostridium y del género
aerobio Bacillus pueden existir metabólicamente activos o
inactivos.
Formación de esporas como
método de sobrevivencia
En condiciones
ambientales hostiles
ocurre esporogénesis la
cual forma la endospora.
En condiciones
ambientales favorables,
ocurre germinación, lo cual
forma la célula vegetativa
(bacteria).
Formación de esporas como
método de sobrevivencia
Endosporas
• La esporogénesis y la germinación no son medios de
reproducción, son mecanismos de supervivencia de
la célula.
• La composición química de la bacteria la hace
resistente a:
•
•
•
•
•
Calor extremo o excesivo
Congelación
Radiación
Desecación
Agentes químicos
Tinción de Esporas
• Tinte primario- Verde Malaquita, requiere calor para la
penetración de este tinte.
• Agente decolorante- Agua, remueve el exceso de tinte, decolora la
célula vegetativa.
• Contratinte- Safranina, tiñe las células vegetativas.
• Note: De obtener una coloración roja al final del proceso de tinción
observando bajo el microscopio, solo se puede determinar que se
tienen células vegetativas. No se puede concluir que es Gram -, eso
sería otro procedimiento a realizar si se quisiera determinar si es
Gram + o -.
Tinción de Esporas
Parrilla de
metal
“Beaker”
Agua
Laminilla con
frotis
1. Cubrir frotis con tinte verde malaquita y
permita que el colorante humee, pero no
hierva.
2. Espere 5 minutos. Si durante los 5 minutos
el tinte se seca añada más tinte.
3. Enjuague la laminilla con agua destilada.
4. Coloque tinte safranina (30 seg).
Hot Plate
5. Seque la laminilla en papel “bibulous”.
6. Observe y dibuje la coloración, morfología y
arreglo de las bacterias bajo el microscopio.
Resultado
Bacillus cereus
Espora (color
verde)
Célula vegetativa (color rojo)
Tinción Ácido-Resistente
• Las familias Mycobacteriae
y Nocardiaceae son ácido
resistente.
• Los microorganismos ácidoresistentes se caracterizan
por tener una pared celular
gruesa de cera (lipoidal) que
contiene ácido micólico.
Tinción Ácido-Resistente
• Tinte primario- Carbolfucsina-tinte rojo fenólico (5%).
Puede penetrar la pared celular de las micobacterias.
• Agente decolorizante- alcohol ácido
(3% HCl +95% alcohol etílico).
• Contratinte-Azul de metileno- se utiliza para teñir de azul
las bacterias que quedaron incoloras.
• Los organismos que son decolorados por el alcohol ácido
no son ácido resistente.
• Azules: no son ácido resistentes (no tienen ácido micólico en la
pared)
Tinción Ácido-Resistente
Mycobacterium tuberculosis
Observar laminillas!!!
Tinción de flagelos
• Tipo de tinción en la que se pueden visualizar el (los) flagelo(s).
• Utiliza 2 tintes:
• Ácido tánico (agente mordante: engruesa los flagelos)
• Rosalina (colorante que los define)
Mobiluncus spp.
Resumen resultados de tinciones
Tinción Gram (estructura de pared celular)
Tinción de esporas
Tinción de cápsula
Recapitulación
• ¿Cuál es la diferencia entre una tinción simple y una
diferencial?
• ¿Qué tipo de tinción es la Gram?
• ¿Cuál es el fundamento?
• Reactivos utilizados en la tinción Gram
• ¿Qué otro tipo de tinciones puede mencionar?
• ¿Cuales son algunas limitaciones de las tinciones?