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V Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica
XVI Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica
VI Jornadas Científicas de Biomedicina y
Biotecnología Molecular
Clave: 35100
AISLAMIENTO DE RNA TOTAL
TEJIDOS DE Bromelia haemisphaerica
DE
DIFERENTES
San Martín Azócar, Alejandra; Anaya Sosa, Irasema; Muñoz
Sánchez, José Luis
DIRECCIÓN DE LOS AUTORES
Departamento de Bioquímica, ENCB, IPN. Prolongación Carpio y Plan de Ayala, 11340,
México D.F. 052-55-57296000, ext 62323.
CORREO ELECTRÓNICO
[email protected]
Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C. P. 02090, México, D. F.
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INTRODUCCIÓN
Las enzimas proteolíticas de origen vegetal son utilizadas en numerosas industrias: en los
procesos de fabricación de cerveza, en la elaboración de ablandadores de carne, en la
producción de hidrolizados proteínicos, en la formulación de productos farmacéuticos
diversos, entre otros (Briones y col. 1994).
La hemisfericina es una enzima proteolítica polimórfica y cisteínica que fue aislada del
jugo de los frutos de Bromelia hemisphaerica: especie silvestre mexicana que crece
principalmente en las entidades de Morelos, Guerrero y Estado de México. Esta proteinasa
está constituida por nueve formas moleculares, cada una con actividad esterolítica y
caseinolítica. La enzima tiene componentes aniónicos, catiónicos y neutros (Hernández et
al., 1983, Cruz y Victoria et al., 1974, Garduño et al., 1974). La hemisfericina tiene un
grupo tiol, presente en el sito activo como es el caso de la bromelaína y la pinguinaína, dos
otras proteasas de bromeliaceae (Ochoa et al., 1987).
Briones et al. (1994), reportan que han estudiado mediante análisis electroforéticos el
efecto de la hemisfericina en la modificación de las proteínas miofibrilares del músculo de
bovino. Los resultados preliminares mostraron que esta enzima produce una hidrólisis más
moderada y selectiva que las proteínas miofibrilares que la producida por papaína, enzima
de uso muy difundido en la elaboración de emolientes comerciales de carnes. Esta origina
una hidrólisis indiscriminada, transformando rápidamente las proteínas a compuestos de
bajo peso molecular. Aparentemente, la característica polimórfica de la hemisfericina le
confiere una mayor selectividad y/o especificidad en la modificación de las diferentes
proteínas miofibrilares, semejante al efecto de las catepsinas: las proteinasas polimórficas
endógenas del músculo, responsables del ablandamiento posterior a la muerte de la carne de
bovino.
El objetivo es aislar el RNA total a partir de diferentes tejidos de Bromelia hemisphaerica,
y determinar de cual de los tres tejidos es más conveniente obtener el RNA.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Se obtuvo RNA total a partir de plantas recién germinadas, de pulpa de fruto y de hijuelos
de Bromelia hemisphaerica.
a.- Aislamiento de RNA total a partir de plantas recién germinadas y a partir de
pulpa de fruto de Bromelia hemisphaerica
Se utilizó en juego comercial Aqua Pure Isolation Kit (Bio-Rad):
- Lisis de la célula
Se agregaron 5-10 mg de tejido congelado o fresco a un tubo de microcentrifuga de 1.5 mL
que contenía 300 µL de solución de lisis de RNA. Se trituró el tejido congelado en
nitrógeno líquido con un mortero de porcelana. El tejido se mantuvo congelado hasta
agregarlo a la solución de lisis. Se homogeneizó rápidamente.
- Precipitación de proteína-DNA
Se agregaron 100 µL de solución precipitadora de proteína-DNA, se invirtió el tubo 10
veces y se colocó en baño de hielo por 5 min. Se centrifugó a 13,000-16,000xg por 3 min.
- Precipitación de RNA
Se pipeteó el sobrenadante que contienía el RNA en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL
que contenía 300 µL de isopropanol 100%. Se mezcló la muestra por inversión 20-30 veces
y luego se centrifugó a 13,000-16,000xg en una mircocentrífuga por 3 min. Se quitó el
sobrenadante. Se agregaron 300 µL de etanol 70% y se invirtió el tubo muchas veces para
lavar la pastilla de RNA y se centrifugó a 13,000-16,000xg por 1 min. Se quitó
cuidadosamente el etanol. Se dejó secar al aire 10-15 min.
- Hidratación del RNA
Se agregaron 50 µL de solución de hidratación de RNA, se incubó por 30 min en hielo.
Antes de usar, se mezcló la muestra en Vortex por 5 segundos y se dio un pulso. Se pipeteó
repetidas veces para asegurar una mezcla adecuada. La muestra de RNA purificado se
almacenó a -70 °C.
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b.- Aislamiento de RNA total a partir de hijuelo de Bromelia hemisphaerica
No fue posible obtener RNA total a partir de los hijuelos de la planta utilizando el juego
comercial Aqua Pure Isolation Kit (Bio-Rad), por lo que se trabajó utilizando el reactivo
Trizol. Se homogeneizaron 2 g del tejido de hijuelos de Bromelia hemisphaerica en 10 mL
del reactivo TRIZOL en un Potter, se centrifugó a 12,000xg por 10 min a una temperatura
de 8-10°C. El sobrenadante se incubo por un lapso de 5 min a 15-30°C, para permitir la
disociación completa de las nucleoproteínas, se añadieron 2 mL de cloroformo, se taparon
los tubos, se agitaron vigorosamente con la mano durante 15 s y se incubaron por 2 min a
una temperatura de 15-30°C, se centrifugó a 12,000xg durante 15 min a 2-8°C; después de
centrifugar se observaron 3 fases, la capa acuosa se transfirió a un tubo limpio, se mezcló
con 5 mL de alcohol isopropílico, se incubó por 10 min a 15-30°C y se centrifugó a no más
de 12,000xg durante 10 min a 2-8°C. Se eliminó el sobrenadante y se lavó el RNA
precipitado una vez con 10 mL de etanol 75%, se mezcla usando un Vórtex y se centrifugó
a no más de 7,500xg durante 5 min a 2-8°C. Para finalizar el procedimiento, se secó
parcialmente el RNA. Se disolvió el RNA en 1 mL de agua libre de RNasa pasando la
solución varias veces a través de una pipeta. La muestra de RNA purificado se almacenó a
-70 °C.
c.- Electroforesis en gel de agarosa de RNA
Se preparó la agarosa utilizando un 1% de agarosa y 0.5% de formaldehído en regulador
TBE 0.5X; en el pozo se colocaron 25 µL de muestra de RNA con 5 µL de azul de
bromofenol. Se desarrolló la electroforesis a 80V y luego se retiró el gel y se colocó en una
solución con bromuro de etidio, después de 15 min el gel se enjuagó y se expuso a luz
ultravioleta para observar las bandas de RNA.
d.- Cuantificación del RNA total
Se leyó la absorbancia a 260 nm y se calculó la concentración de RNA total con la
siguiente ecuación:
RNAtotal (µg/mL) = A260 x 40 x dilución x volumen (µL)
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RESULTADOS
Para analizar la integridad del RNA obtenido, se realizó una electroforesis en gel de
agarosa (1%) para muestras del RNA total obtenidas de plantas recién germinadas (Figura
1) y de pulpa de fruto (Figura 2) y de hojas de hijuelos (Figura 3), de Bromelia
hemisphaerica, en las cuales se observan tres bandas para cada muestra, correspondientes a
RNAs ribosomales 28S, 18S y 5.8S, característicos de eucariontes; sus tamaños son de
1.7x106, 6x106 y 5x104 Da. Entre las bandas se aprecia el mRNA.
1
2
28S
18S
5.8S
Figura 1: Electroforesis en gel de agarosa de RNA total de plantas recién germinadas
Bromelia hemisphaerica. Carriles 1 y 2: dos repeticiones de extracción de RNA.
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1
2
28S
18S
5.8S
Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa de RNA total de pulpa de fruto Bromelia
hemisphaerica. Carriles 1 y 2: dos repeticiones de extracción de RNA.
1
2
28S
18S
5.8S
Figura 3: Electroforesis en gel de agarosa de RNA total de hijuelos Bromelia
hemisphaerica. Carriles 1 y 2: dos repeticiones de extracción de RNA.
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Para el caso de las plantas recién germinadas de Bromelia hemisphaerica se obtuvieron
concentraciones de RNA total 4.64 y 3.20 µg/mL, para la pulpa de fruto los resultados
fueron de 9.39 y 8.78 µg/mL, mientras que para las hojas del hijuelo los resultados fueron
de de 3.66 y 5.02 µg/mL.
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DISCUSIÓN
Las electroforesis en agarosa (1%) muestran mayor integridad del RNA de las muestras
obtenidas de las plantas recién germinadas y de las muestras de pulpa de fruto (Figuras 2 y
3) respecto al aislado a partir de hojas del hijuelo de Bromelia hemisphaerica (Figura 1),
observándose más claramente las bandas de rRNA propias de las células eucariontes.
Al comparar las concentraciones de RNA de las tres muestras, se obtuvo la mayor
concentración para el caso del RNA obtenido de la pulpa de fruto, mientras que la
concentración más baja fue para el caso de las hojas de los hijuelos.
Probablemente, la diferencia en los resultados obtenidos para pulpa de fruto comparados
con los de las plantas recién germinadas y las hojas de los hijuelos, se deban a la mayor
facilidad de extracción de RNA total a partir de las células de la pulpa porque el tejido es el
más blando de los tres, lo cual permite trabajar con menor cantidad de muestra, menor
tiempo de proceso y menor manipulación de la muestra. Esto permitiría reducir las
posibilidades de daño del RNA mientras se está llevando a cabo el proceso de aislamiento.
Mientras que las hojas de los hijuelos fueron muy difíciles de moler, en la primera etapa de
aislamiento, lo cual podría sugerir que no se logró romper lo suficiente las células para
permitir la extracción del RNA total.
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CONCLUSIONES
Es posible obtener RNA total, tanto a partir de hojas de hijuelos, de Bromelia
hemisphaerica, así como de plantas nuevas de 2 meses de vida y de pulpa del fruto de la
planta; sin embargo, se logró una mayor concentración y mejor integridad para el caso del
RNA total obtenido a partir de la pulpa del fruto de la planta.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Briones-Martínez, H., Cruz y Victoria, MªT., Oliver-Salvador, MªC. y Cortes-Vazquez,
MªI. 1994. Preparaciones enzimáticas de interés industrial con proteinasas de plantas
mexicanas. Información tecnológoca. Vol. 5 Nº1. 29-38.
2. Cruz y Victoria, M.T., Oliver, M. del C., del Castillo, l.M y Castañeda-Agulló, M.
1974. Proteinasas de plantas mexicanas I. Determinación de pesos moleculares de
proteinasas cisteínicas por concentración de grupos tioles. Rev. Lat. de Quim. 5. 18-25.
3. Hernández, A., Rodríguez, R., Cruz y Victoria, M. y del Castillo, L. 1983. Proteinasas
de plantas mexicanas IX. Estructura, relaciones y taxonomía. Rev. Latinoamer. Quím.
14(2):95.
4. Garduño, R., Soriano, M., Chávez, E., Cruz y Victoria, M.T., del Castillo, L.M. y
Castañeda-Agulló, M. 1974. Proteinasas de plantas mexicanas II. Puntos isoeléctricos y
caracterización de formas moleculares múltiples en enzimas de bromeliaceas. Rev.
Latinoamer. Quím. 5. 243-248.
5. Ochoa, N., Agundis, C. Córdoba, F. 1987. Isolation and partial characterization of
Bromelia hemisphaerica protease by affinity chromatography. Prep. Biochem. 17 (4).
337-47.
REFERENCIAS INFORMÁTICAS
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