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SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION
MAESTRIA EN CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS
HIDROLIZADOS DE LAS PROTEINAS DE ALFALFA DESHIDRATADAS
CON PROTEASAS COMBINADAS
CLAVE 20060878
DIRECTORA DEL PROYECTO: M. en C. Maria Teresa Cruz Y Victoria
IMPORTANCIA DE LOS HIDROLIZADOS PROTEICOS
Son un importante ingrediente en sistemas de alimentos por el
mejoramiento de la textura, sabor y la fortificación nutricia.
Mejoran las propiedades funcionales del alimento.
♣ Se utilizan debido a su fácil absorción intestinal.
♣ Usados como suplementos alimenticios por ser hipoalergénicos.
♣ Cubren parte y/o la totalidad de los aminoácidos en el ser humano.
ENZIMAS PROTEOLÍTICAS
♣ Hemisfericina. Es una enzima de origen vegetal obtenida del jugo del fruto
de la planta Bromelia hemisphaerica. Es una enzima proteolítica
polimórfica (9 componentes) Tiene un peso molecular 23,400 Da. Su
contenido de glicina es mayor a otras enzimas proteolíticas (Cruz Y
Victoria,1993).
♣ HT-Proteolític. Es una enzima proteolítica, obtenida del microorganismo
Bacillus subtilis. Es una endopeptidasa altamente específica, es activa en un
intervalo de pH de 6.5-8.0 y temperatura de 45-55 ºC. Es usada en la
industria de la panificación, especialmente en la industria galletera, debido
a que es activa en las proteínas del gluten (Monterrubio, 2004).
♣ Pepsina. Es una proteasa ácida del estómago, PM = 33,000 Da, compuesta
por 321 residuos de aminoácidos. La pepsina es relativamente estable entre
un pH de 1.0 y 5.5. Provoca la degradación de prácticamente todas las
proteínas, muestra una amplia especificidad para los enlaces peptídicos,
favoreciéndose los adyacentes a aminoácidos aromáticos. Es usada en la
precipitación de la caseína coagulada (Reed, 1975).
JUSTIFICACION
™ Los hidrolizados de proteína pueden aplicarse en los productos para
consumidores con necesidades específicas de suplementos de proteína: en
personas de edad avanzada, nutrición de deportistas y dietas para el control
de peso. También se pueden emplear en combinación con productos
alimenticios para incrementar su valor nutritivo.
™ La alfalfa, es uno de los productos agrícolas más importantes de México,
cada año su volumen de producción supera al arroz, fríjol, jitomate, maíz,
soya, y trigo, debido a que no hay estudios de hidrolizados de proteínas de
alfalfa. Por lo que este trabajo pretende utilizar la alfalfa para la obtención
de hidrolizados empleando sistemas enzimáticos, ya que son una fuente de
proteína no convencional y muy económica
OBJETIVO GENERAL
Obtener hidrolizados enzimáticos de proteínas de alfalfa (Medicago sativa L), con
sistemas enzimáticos simples y combinados (hemisfericina, HT-proteolític y
pepsina).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtener concentrados proteicos de alfalfa.
Determinar la actividad enzimática de invertasa, α-amilasa, lipasa, lisozima
y proteasa, en los extractos de alfalfa.
Establecer las condiciones de concentración de enzima y tiempo de reacción
para cada uno de los sistemas enzimáticos, para alcanzar el mayor
porcentaje de hidrólisis.
Determinar el grado de hidrólisis con diferentes sistemas enzimáticos
(hemisfericina, HT-proteolític y pepsina).
Determinar la concentración de triptófano, metionina y lisina disponible en
los hidrolizados obtenidos.
Evaluar la digestibilidad in vitro de los hidrolizados y concentrados de
proteína.
DESARROLLO EXPERIMENTAL GENERAL
Alfalfa (Medicago sativa L.)
Alfalfa fresca
Alfalfa seca
(temperatura ambiente)
Digestibilidad in vitro
(Método de Hsu)
Molienda
Concentrados proteicos
Extractos
Harina integral
Determinación
de proteína
Actividad proteolítica con HTproteolític y hemisfericina, en
función del tiempo de reacción y
concentración de enzima
Determinación de enzimas:
invertasa, α-amilasa, lipasa,
lizosima y proteasa
Hidrólisis enzimática
Determinación del grado
de hidrólisis (Método de
Hale)
Modificaciones hasta obtener un
alto grado de hidrólisis
Sistemas enzimáticos: HT-proteolític,
hemisferisina, pepsina y combinaciones
Determinación del peso de
péptidos por electroforesis
Digestibilidad in vitro
(Método de Hsu)
Determinación de algunos
aminoácidos importantes
Metionina
(Método de Mc Carthy y
Sullivan modificado por
Gayte)
Triptófano
(Método de Spies Chambers)
Lisina disponible
(Método de carpenter)
RESULTADOS
ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS
EXTRACTOS
ENZIMA
Proteína (μg/mL)
a
Invertasa
α -amilasab
c
Lipasa
d
Lizosima
Proteasae
1er extracto
NaCl 0.5 N
1613
2do extracto
NaCl 0.5 N
522
3er extracto
NaCl 0.5 N
222
2412
12,181
2876
Proteína
total
2,357
Actividad
total
17,469
2323
8805
6224
17,352
416
527
2525
3,468
3120
2220
8880
14,220
26.4
34
195
255
a UI
Unidades de invertasa: μg de glucosa liberada/mg proteínahh
b UM
Unidades de maltosa: μg de maltosa transformados/mg proteínahh
c UL
Unidades de lipasa: mmoles de sustrato transformado/mg proteínahh
d UL
Unidades de lisozima: UL/mg proteínahh
e UT
Unidades de actividad proteolítica: μg de tirosina/mg proteínahh
RESULTADOS
.
OBTENCIÓN DE CONCENTRADOS PROTEÍCOS
.
PRUEBA 7
Material
Alfalfa Fresca
1er Extracto
2do Extracto
3er Extracto
Extracto total
pH
Cantidad
6.5
6.54
6.8
6.77
200 g
350 mL
300 mL
260 mL
910 mL
4.19 g
Floculo seco
Material
% Rendimiento de
Extracción
NaOH 0.0175N
añadido
NaOH 10N p/ajuste de
pH 9.0
21. 76
840 mL
1 mL
HCl 5N p/ajuste de
5.5 mL
pH 4.0
Características del producto:
Olor
característico
Color
verde olivo
%
% Proteína Peso seco Proteína (g)
Humedad (base seca)
(g)
(base seca)
Alfalfa fresca
81.39
26.8
37.22
9.97
Floculo seco
5.93
55.29
3.94
2.17
RESULTADOS
.
OBTENCIÓN DE CONCENTRADOS PROTEÍCOS
.
PRUEBA 7
Material
Alfalfa Fresca
1er Extracto
2do Extracto
3er Extracto
Extracto total
pH
Cantidad
6.5
6.54
6.8
6.77
200 g
350 mL
300 mL
260 mL
910 mL
% Rendimiento de
Extracción
NaOH 0.0175N
añadido
NaOH 10N p/ajuste de
pH 9.0
840 mL
1 mL
HCl 5N p/ajuste de
5.5 mL
pH 4.0
Características del producto:
Olor
característico
Color
verde olivo
4.19 g
Floculo seco
21. 76
%
% Proteína Peso seco Proteína (g)
Humedad (base seca)
(g)
(base seca)
Material
Alfalfa fresca
81.39
26.8
37.22
9.97
Floculo seco
5.93
55.29
3.94
2.17
Grado de hidrólisis de la enzima HT-Proteolític en concentrado
proteico y harina integral de alfalfa.
30
25
20
GH (%) 15
10
5
0
24
48
72
tiempo (horas)
Concentrado de proteína
Harina integral
Condiciones de reacción:
Concentración de la enzima HT-Proteolític:150 μg/mL.
Concentración del sustrato: 1%
pH: 7.6 y T: 35 ºC
HIDRÓLISIS CON ENZIMAS COMBINADAS
Grado de hidrólisis de los sistema enzimático HT-Proteolític-Pepsina y
Hemisfericina-Pepsina, en CPA y HIA temperatura de 45 ºC.
Condiciones de reacción:
Concentración de la enzima: HTProteolític 150 μg/mL–Pepsina
200 y 400 μg/mL; Hemisfericina
100 μg/mL y Pepsina 200
μg/mL.
60
GH (%)
55.4
40
46.22
20
0
Concentado de
Harina integral
proteína
HT-Proteolític 150 μg/mL + Pepsina 200 μg/mL
HT-Proteolític 150 μg/mL + Pepsina 400 μg/mL
60
Concentración del sustrato: 1%;
pH: 7.6; T: 45 ºC.
Tiempo de reacción: HTProteolític: 24 horas; Pepsina: 8
horas.
GH (%)
57.7
40
43.77
20
0
Concentado de
proteína
Harina integral
Hemisfericina 100 μg/mL + Pepsina 200 μg/mL
Conclusiones.
La invertasa, fue la que presentó mayor actividad, en los extractos, comparada con las
otras enzimas determinadas, la segunda de las siguientes enzimas α-amilasa, lisozima,
lipasa y proteasa.
El concentrado proteíco con mayor rendimiento de extracción fue el de la prueba 7 con
21.8% y un contenido de proteína de 55.29%.
La concentración de la enzima HT-Proteolitic empleada para determinar el grado de
hidrólisis, utilizando como sustrato proteína de alfalfa y harina de alfalfa integral es de
150 μg/mL.
La concentración de la enzima hemisfericina, empleada para determinar el grado de
hidrólisis, utilizando como sustrato proteína de alfalfa y harina de alfalfa integral es de
100 y 300 μg/mL respectivamente.
BIBLIOGRAFIA
♣ Bolton J. L. 1962. Alfalfa, botany, cultivation and utilization. Intercience
Publishers, Inc. London. 354-355.
♣ Del Pozo I. M. 1983. La alfalfa, su cultivo y aprovechamiento. Editorial
Mundi-Prensa. Madrid-España. 23-65.
♣ Hale, M. B. 1969.Relative activities of commercially-available enzymes in
the hydrolysis of fish protein. Food Technology. 23: 107-110.
♣ Bray W. J. and Humpheries c. 1979. Preparation of white leaf protein
concentate usig polyanionic floculant. J. Sci. Food. Agric. 30, 171-176.
♣ Parada Arias B. E. 1968. " Extracción de proteínas vegetales para el
alimento humano", Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto
Politécnico Nacional. Tesis de Licenciatura. México.
♣ Carpenter K. J., 1960. The estimation on available lysine in animal protein
foods.
♣ J. Biochem. 77, 604-610.
♣ Clark, Jr., J. M., 1964. Experimental Biochemistry. W.H. Freeman and
Company. Sn. Francisco and London.
♣ Cravioto R. O., Massieu H., Guzman J.G., y Calvo de la Torre J. 1945. La
ciencia moderna. Composición de los alimentos mexicanos. Revista
hispanoamericana de ciencias puras y aplicadas.
♣ Cruz Y Victoria T., 1993. Aislamiento y caracterización parcial de la
enzima proteolítica Hemisfericina, obtenida de Bromelia hemisphaerica,
Tesis de Maestría. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto
Politécnico Nacional, México.