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 Proyecto: Cultivos celulares primarios: Obtención y desarrollo de un cultivo de neuronas embrionarias in vitro Área temática: Biología Celular Facultad/ Departamento Universitario donde se desarrollará el proyecto: Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología Equipo científico •
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Antonio Jesús Martínez Fuentes ([email protected]) -­‐ Profesor responsable Mª Isabel Burón Romero ([email protected]) -­‐ Profesora colaboradora Mª Trinidad Gavilán Plaza ([email protected]) -­‐ Profesora colaboradora José Luis Santander Bardají ([email protected]) -­‐ Profesor colaborador María Carmen Vázquez Borrego ([email protected]) -­‐ Becaria Predoctoral-­‐
Personal de Apoyo Objetivo principal del Proyecto Mediante la realización de este proyecto se pretende que el alumnado conozca los requerimientos, métodos y aplicaciones de la experimentación con cultivos de células eucariotas (neuronas) in vitro como una de las técnicas básicas de investigación en diferentes disciplinas científicas genéricamente denominadas Biociencias (Biología, Bioquímica, Medicina, etc.). Este objetivo se encuadra dentro de los objetivos principales de las enseñanzas de la ESO y Bachillerato como son: 1) Conocer y aplicar los métodos para identificar los problemas científicos. 2) Concebir el conocimiento científico como un saber integrado. Los objetivos científicos genéricos son los siguientes: Ø Conocer los requerimientos de las células vivas para mantener y preservar sus características fisiológicas, metabólicas y genéticas in vitro. Ø Conocer el equipamiento, metodología y buenas prácticas de un laboratorio científico de cultivos celulares. Ø Realizar un diseño experimental completo con obtención de resultados y elaboración de un informe final, como aplicación concreta del Método Científico. Descripción de la actividad y participación de los alumnos Durante el desarrollo del Proyecto el alumnado observará y manipulará células vivas y se acercará a la realidad de la investigación en Biología, Bioquímica, Medicina, etc. Este proyecto se podrá llevar a cabo en 4 sesiones que se detallan a continuación y en las que previamente, el profesorado explicará los fundamentos teóricos, planteará interrogantes al alumnado como punto de partida, y le inducirá a la deducción, a asumir resoluciones y concluir lo aprendido y experimentado por sí mismo, alcanzando así un aprendizaje de tipo constructivo. En todo momento se observarán y cumplirán las normas de seguridad habituales en los laboratorios de prácticas de alumnos y se darán normas precisas para la manipulación. No obstante, ninguno de los productos o utensilios a utilizar por el alumno en el presente proyecto presenta peligrosidad así como tampoco serán requeridas habilidades o competencias previas para el desarrollo de las sesiones. SESIÓN 1 Esta sesión se iniciará con una visita al laboratorio de cultivos de Investigación del Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología donde se describirán las áreas del mismo: zona de preparación de material, zona de lavado, zona de manipulación estéril (sala blanca), zona de conservación en frío (salas frigoríficas, congeladores de -­‐20ºC, -­‐80ºC y contenedores de nitrógeno líquido) y almacén de material específico de cultivos. A continuación el alumnado trabajará en el laboratorio de prácticas donde encontrará un puesto de trabajo con el material necesario para la obtención y mantenimiento in vitro de un cultivo primario, y que empleará en las siguientes sesiones. El alumnado deberá manipular este material (puntas de pipeta, viales plásticos, pipetas, pinzas y tijeras, recipientes de cristal, etc.) para su esterilización en horno o autoclave según las explicaciones e instrucciones del profesorado. Para ello, clasificará el material según el procedimiento de esterilización a emplear así como preparará filtros para la esterilización de soluciones líquidas. Para finalizar esta sesión, el alumnado preparará el medio de cultivo en condiciones de esterilidad (Cabina de flujo). Para ello, cada alumno recibirá un medio nutritivo estéril al que deberá complementar mediante la adición de diferentes alícuotas (antibiótico, L-­‐glutamina, etc.) y que empleará en las siguientes sesiones. SESIÓN 2 Esta sesión se iniciará con la explicación razonada del procedimiento a desarrollar que constituye la parte central de este Proyecto. Se darán indicaciones técnicas detalladas con objeto de alcanzar satisfactoriamente los objetivos de la experiencia. Así, y brevemente, cada alumno/a llevará a cabo la extracción del embrión de pollo en condiciones de esterilizad, extirpará sus hemisferios que someterá a un proceso enzimático y mecánico con objeto de obtener una suspensión celular. Durante este proceso, se llevarán a cabo diferentes centrifugaciones y filtraciones al objeto de eliminar restos celulares y agregaciones y obtener una población enriquecida en neuronas. Finalmente, se realizará la siembra de la suspensión celular en placas de cultivo, se observará al microscopio óptico invertido y se trasladará al incubador de CO2 para que se inicie su desarrollo in vitro. SESIÓN 3 En esta sesión, y una vez transcurridas 24 horas de cultivo, se recogerán las placas del incubador y se observarán al microscopio invertido prestando especial atención al color del medio de cultivo, a la densidad celular, a su aspecto y morfología como método básico para determinar posibles contaminaciones microbianas (bacterias, etc.). El alumnado realizará sus correspondientes anotaciones y dibujos en un cuaderno de laboratorio sobre su identificación de los tipos celulares adherentes (fibroblastos y células de glía) distinguiendo las neuronas en base a su característica morfología. Asimismo, también observará células en suspensión así como la de agregados y otras formaciones que deberán ser interpretadas con las explicaciones previas del profesorado. La sesión continuará mediante la realización de un subcultivo que consistirá en el levantamiento de las células adherentes, el recuento de su número así como la viabilidad de las mismas (test de exclusión del colorante azul tripán). Para ello, las células se incubarán con una solución enzimática (tripsina) y la suspensión celular resultante se aislará mediante centrifugación y posterior lavado con solución de Hank. Con objeto de determinar el número o densidad celular así como el porcentaje de células vivas (viabilidad), una alícuota de la solución celular se cargará en una cámara de Neubauer o hemocitómetro. Los resultados obtenidos, serán anotados en el cuaderno de laboratorio. SESIÓN 4 El/la alumno/a transferirá los datos de su cuaderno de laboratorio al documento resumen del Proyecto. Éste tendrá formato único y contendrá los fundamentos teóricos, los procedimientos y las técnicas, etc. y deberá ser completado de manera individualizada rellenando los aparatados que se indique. Durante esta sesión se recapitularán las sesiones anteriores, aclararán las dudas que aún pudieran persistir y se discutirán los aspectos de mayor interés del proyecto. Por último se realizarán los cálculos para expresar correctamente los parámetros cuantificados como resultados de la experiencia. En todo momento se estimulará la capacidad crítica, la reflexión, y el trabajo colaborativo. Asimismo, de proporcionará al alumnado diversos recursos (fuentes de internet, libros o documentos) para que en el futuro, pueda no solo aplicar lo aprendido sino ampliar y usar su experiencia de manera que el Proyecto realizado sea un conocimiento sostenible. Referencias recomendadas Libros de Biología Celular Ø La célula de Cooper. Ed Marbán, Sexta Edición 2014 y anteriores Contenidos básicos de Biología (recursos en la red) Ø http://www.educaweb.com/curso/desarrollo-­‐tecnicas-­‐cultivo-­‐celulares-­‐263684/ Ø http://www.ite.educacion.es/profesores/asignaturas/biologia_y_geologia/ Ø http://www.biologia.arizona.edu/ Enlaces con contenidos en español sobre Cultivos celulares Ø http://www.ub.edu/biocel/?lang=es. Ø http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?P=Aplicacion_Cultivos_Celulares&opc=intro
duccion Enlaces sobre partes y uso del microscopio, buenas prácticas en el laboratorio Ø http://escuela2punto0.educarex.es/Ciencias/Biologia_Geologia/Laboratorios_Virtuale
s_Biologia_Geologia/Microscopio_Virtual/ Ø http://www.biologia.edu.ar/microscopia/microscopia1.htm Descripción de la sesión de presentación de resultados de los proyectos Durante esta sesión, el alumnado que haya realizado el Proyecto titulado "Cultivos celulares primarios: obtención y desarrollo de un cultivo de neuronas embrionarias in vitro" presentará al resto de participantes en el Campus, los resultados e impresiones obtenidos una presentación preferiblemente en formato powerpoint en el aula interactiva de la Facultad de Ciencias. Para ello, el alumnado pondrá en antecedentes la temática del proyecto (introducción), reflejará los objetivos perseguidos, los materiales y métodos empleados, los resultados obtenidos y los esperados para finalmente hacer una relación de las conclusiones. Seguidamente, responderá las preguntan que puedan surgirle al resto de compañeros que han desarrollado los otros 3 proyectos del Campus. Proyecto: Cultivos celulares primarios: Obtención y desarrollo de un cultivo de neuronas embrionarias in vitro Sesión 1 Lugar: Laboratorio de Prácticas de Biología Celular, Campus de Rabanales, Edif. Severo Ochoa Objetivos detallados •
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Conocer las áreas del Laboratorio de cultivos y las buenas prácticas del mismo. Conocer el planteamiento experimental y los pasos a desarrollar en el Proyecto y la justificación de cada uno de los procedimientos a seguir. Comprender los requerimientos que necesita la célula para mantenerse viva fuera del organismo: composición del medio, parámetros físicos, condiciones especiales. Conocer y practicar los métodos de esterilización del material del laboratorio de cultivos: calor seco, calor húmedo y filtración. Recursos y consumibles necesarios Equipamiento, pequeño material y material fungible Ø Laboratorio de prácticas con Cabina de flujo Laminar. Ø Autoclave, Horno Pasteur, Filtros. Ø Material para la esterilización de los utensilios: algodón, cintas de seguridad, filtros, papel de aluminio, botes de cristal para autoclave, material de disección, etc. Ø Medio nutritivo (RPMI o DMEM) comercial. Ø Pipetas de cristal, pipetas estériles desechables, puntas desechables, viales, tubos cónicos, pipetas automáticas de precisión, guantes. Soluciones y medios Ø
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Suero fetal bovino, Solución de Hank, y glucosa concentrada Stocks de glutamina, antibióticos-­‐antimicóticos Agua destilada, soluciones tampón, bicarbonato concentrado, alcohol 70º. Documentación para el alumno Ø Protocolos y guías detalladas con la descripción ordenada de los procedimientos a practicar y el correspondiente fundamento teórico. Ø Cuaderno de laboratorio con preguntas concretas y espacios destinados anotaciones de observaciones, resultados, conclusiones. Actividades a desarrollar El grupo de alumnos trabajará guiado en todo momento con uno o dos profesores. Se cumplirán las normas de seguridad habituales en los laboratorios de prácticas de alumnos y se darán normas precisas para la manipulación. No obstante, ninguno de los productos o utensilios a utilizar por el alumno en el presente proyecto presenta peligrosidad. 1. La sesión se inicia con una visita al laboratorio de cultivos de Investigación donde se describirán las áreas del mismo: zona preparativa, zona de lavado, zona de manipulación estéril (sala blanca), zona de conservación en frío (salas frigoríficas, congeladores de -­‐20ºC, -­‐80ºC y contenedores de nitrógeno líquido) y almacén de material específico de cultivos. 2. A continuación el alumno trabajará en el laboratorio de prácticas donde tiene un puesto de trabajo en la mesa de laboratorio. Cada puesto tiene todo lo necesario para que desarrolle el trabajo de forma individual. Cuando sea necesario trabajará en esterilidad en la Cabina de flujo laminar. 2.1. El alumnado preparará todo el material necesario para su esterilización en autoclave y en Horno de acuerdo a las instrucciones y explicación del profesor. Todo este material será el que empleará en la siguiente sesión de obtención del cultivo celular (puntas de pipeta, viales plásticos, pipetas, pinzas y tijeras, recipientes de cristal , etc.) 2.2. Clasificará el material de acuerdo al tipo de esterilización. 2.3. Montará un filtro reutilizable, insertándole la membrana filtrante. 3. Preparará el medio de cultivo en condiciones de esterilidad (Cabina de flujo). Para ello cada alumno tiene un medio nutritivo estéril al que debe añadirle varias alícuotas (antibiótico-­‐antimicótico, L-­‐glutamina, etc.) para completarlo de manera que quede preparado para su uso en la siguiente sesión de laboratorio. Resultados esperados de la sesión Ø El alumnado terminará con una visión clara y general del proyecto a desarrollar, los diferentes pasos a llevar a cabo casa día, así como el objetivo final. Ø S le transmitirá y comprenderá la necesidad de una adecuada preparación del material, previo a la experimentación. Ø Aprenderá cuales son los requisitos nutritivos de la célula para su cultivo (vivir) in vitro. Ø Completará las anotaciones del cuaderno de laboratorio. Proyecto: Cultivos celulares primarios: Obtención y desarrollo de un cultivo de neuronas embrionarias in vitro Sesión 2 Lugar: Laboratorio de Prácticas de Biología Celular, Campus de Rabanales, Edif. Severo Ochoa Objetivos detallados •
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Obtención de un cultivo primario de neuronas a partir de los hemisferios cerebrales de un embrión de pollo de 7 días de incubación. Comprender los pasos del procedimiento y el fundamento de los procedimientos empleados. Observar al microscopio invertido las células recién dispersadas del tejido extirpado. Realizar una siembra de células para iniciar su desarrollo in vitro. Recursos y consumibles necesarios Material de estudio Huevos embrionados o fecundados de 7 días de desarrollo o incubación. Equipamiento, pequeño material y material fungible Ø Laboratorio de prácticas con Cabina de flujo Laminar, baño termostatizado, centrífuga y Microscopio invertido. Ø Material estéril: material de disección, viales, pipetas Pasteur desechables, pipeta de vidrio, placas de cultivo, filtros de 20 y 50-­‐100 micras de diámetro, placas de petri de vidrio, tubos cónicos, etc. Ø Pipetas automáticas de precisión, guantes. Ø Soluciones y medios Ø Medio completo de cultivo (con suero) Ø Medio nutritivo completo Ø Solución de Hank glucosada Ø poli-­‐L-­‐lisina, tripsina Ø alcohol 70º, agua estéril Documentación para el alumno Ø Protocolos y guías detalladas con la descripción ordenada de los procedimientos a practicar y el correspondiente fundamento teórico. Ø Cuaderno de laboratorio con preguntas concretas y espacios destinados anotaciones de observaciones, resultados, conclusiones. Actividades a desarrollar 1. La sesión se inicia con la explicación razonada del procedimiento a desarrollar que constituye la parte central del Proyecto. Se darán las indicaciones técnicas detalladas para alcanzar satisfactoriamente los objetivos de esta experiencia. 2. Se realizará el revestimiento de las placas con el polímero poli-­‐L-­‐lisina. 3. Se llevará a cabo la extracción del embrión y su lavado, en condiciones de esterilidad. 4. Se extirparán los hemisferios cerebrales y se iniciará su lavado, a continuación se trocearán y seguidamente se dispersarán ligera y suavemente. 5. Se llevará a cabo la dispersión enzimática mediante la incubación de los fragmentos de tejido en una solución de tripsina y a continuación se procederá a su dispersión mecánica mediante aspiraciones reiteradas con ayuda de una pipeta Pasteur al objeto de obtener una suspensión celular. Durante el procedimiento, las células se lavarán al objeto de eliminar restos de tripsina mediante diferentes centrifugaciones. 6. Se realizará un filtrado y/o decantación del material dispersado para eliminar agregados (filtos de 50-­‐100 micras de tamaño de poro). 7. Finalmente, se procederá a la siembra del cultivo celular y se trasladan las placas de cultivo al incubador de CO2 para que se inicie su desarrollo in vitro. 8. Se observará la suspensión de células recién sembradas en el microscopio invertido. Resultados esperados de la sesión Ø El alumnado aprenderá el manejo práctico de tejidos y células así como la manipulación de diversos equipamiento de laboratorio: centrífuga, microscopio invertido, incubador de CO2 . Asimismo, se habituará a la manipulación de material biológico en condiciones de esterilidad (cabina de flujo laminar) Ø Observará células vivas recién disociadas y anotará con sencillos dibujos lo observado. Ø Logrará nuevas habilidades y competencias de utilidad e importancia en la Investigación en Biología. Proyecto: Cultivos celulares primarios: Obtención y desarrollo de un cultivo de neuronas embrionarias in vitro Sesión 3 Lugar: Laboratorio de Prácticas de Biología Celular, Campus de Rabanales, Edif. Severo Ochoa Objetivos detallados •
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Realizar una observación comparativa del cultivo celular tras 24h de incubación y obtener conclusiones. Obtener y cuantificar los resultados de la experiencia. Aprender métodos de recuento celular y determinación de viabilidad y/o actividad celular Aprender el método de mantenimiento del cultivo celular. Recursos y consumibles necesarios Material de estudio Cultivos celulares primarios de 24 horas de incubación. Equipamiento, pequeño material y material fungible Ø Laboratorio de prácticas con Cabina de flujo Laminar, baño termostatizado, centrífuga y Microscopio invertido. Ø Material estéril: viales, pipetas Pasteur desechables, pipeta de vidrio, placas de cultivo, cubre y portaobjetos. Ø Pipetas automáticas de precisión, guantes. Ø Cámara de Neubauer. Soluciones y medios Ø
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Medio completo de cultivo (con suero). Solución de Hank suplementada con glucosa. Tripsina. Azul tripán (colorante vital). Alcohol 70º, agua estéril. Documentación para el alumno Ø Protocolos y guías detalladas con la descripción ordenada de los procedimientos a practicar y el correspondiente fundamento teórico. Ø Cuaderno de laboratorio con preguntas concretas y espacios destinados anotaciones de observaciones, resultados, conclusiones. Actividades a desarrollar 1. En primer lugar se recogerán las placas de cultivo del incubador de CO2, pasadas 24 horas de su siembra, y se observará el color del medio de cultivo, densidad y aspecto macroscópico como método básico para determinar posibles contaminaciones microbianas. 2. Se observará el cultivo al microscopio invertido y se harán las anotaciones y dibujos correspondientes en el cuaderno de laboratorio. 3. Se identificarán los tipos celulares adherentes (fibroblastos y glía) distinguiéndolos de las neuronas según sus características morfológicas. Se observarán las células en suspensión y la presencia de agregados y otras formaciones que deberán ser interpretadas con las explicaciones del profesor. 4. Se procederá al lavado del cultivo y al levantamiento de las células adherentes para realizar el subcultivo, el recuento y el test de viabilidad. Para el subcultivo, las células se incubarán en presencia de tripsina y seguidamente se lavarán con solución de Hank por centrifugación. 5. Una alícuota de la suspensión celular resultante se aplicará sobre la cámara de Neubauer y servirá para determinar, mediante su observación al microscopio, los siguientes parámetros: -­‐ el número de células o densidad celular y -­‐ el porcentaje de células vivas o viabilidad mediante el test de azul tripán. 6. Siguiendo las indicaciones del profesor, se realizará el recuento de células vivas y muertas para una muestra significativa de la población celular, resultados que se anotarán en el cuaderno de laboratorio. Resultados esperados de la sesión Ø El alumno realizará una valoración cualitativa y cuantitativa de sus resultados. Ø Aprenderá un método sencillo de cuantificación del número de células de una suspensión celular problema. Ø Aprenderá un método de tinción de células in vivo (coloración vital o coloración de exclusión). Proyecto: Cultivos celulares primarios: Obtención y desarrollo de un cultivo de neuronas embrionarias in vitro Sesión 4 Lugar: Aula-­‐Seminario del Departamento de Biología Celular. Objetivos detallados •
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Revisar, resumir, y afianzar lo aprendido en las experiencias de laboratorio. Sacar conclusiones y elaborar individualmente un informe final del proyecto que contenga: fundamentos teóricos, procedimientos, resultados, discusión, conclusiones y una valoración personal de la experiencia desarrollada. Tener un documento resumen del Proyecto elaborado con el material proporcionado (guías, protocolos, resúmenes), los resultados y anotaciones del cuaderno de laboratorio. Crear un ambiente de debate, intercambio de ideas, y exposición de las valoraciones de la experiencia en el proyecto. Recursos y consumibles necesarios Ø Sitio web con la documentación y material utilizado a lo largo del proyecto por profesores y alumnos: archivos, colección de videos, enlaces, etc. Ø Documento digital, resumen del proyecto, donde el alumno debe incluir sus resultados, anotaciones, dibujos, etc. Ø Sala de ordenadores Ø Impresoras, Encuadernadora Actividades a desarrollar 1. El alumno pasará todos sus datos del cuaderno de laboratorio al documento resumen del Proyecto. Se trataría de un formato único para todos, que contiene los fundamentos teóricos, procedimientos y técnicas etc. y que debe ser completado de forma individualizada rellenando los apartados que se indiquen. 2. Durante la sesión se aclararán las dudas que persistan y se discutirán aspectos de interés del proyecto 3. Se realizarán los cálculos para expresar correctamente los parámetros cuantificados como resultados de la experiencia. 4. Se estimulará la capacidad crítica, la reflexión, y el trabajo colaborativo. 5. Se proporcionará al alumno una selección de fuentes de internet, libros o documentos para que pueda en el futuro aplicar todo lo aprendido, ampliar, y usar esta experiencia, de modo que el Proyecto realizado sea un conocimiento sostenible. Resultados esperados de la sesión Se espera que el alumno sea capaz de ordenar la información recibida e integrar los conocimientos adquiridos. Además, se espera que elabore sus propias conclusiones sobre lo aprendido y emita una valoración de la experiencia. Todo el proyecto realizado por el alumno quedará resumido en un documento personalizado por él mismo y que conservará consigo.