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 Proyecto: Cultivos celulares primarios: Obtención y desarrollo de un cultivo de neuronas embrionarias in vitro Sesión 2 Lugar: Laboratorio de Prácticas de Biología Celular, Campus de Rabanales, Edif. Severo Ochoa Objetivos detallados •
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Obtención de un cultivo primario de neuronas a partir de los hemisferios cerebrales de un embrión de pollo de 7 días de incubación. Comprender los pasos del procedimiento y el fundamento de los procedimientos empleados. Observar al microscopio invertido las células recién dispersadas del tejido extirpado. Realizar una siembra de células para iniciar su desarrollo in vitro. Recursos y consumibles necesarios Material de estudio Huevos embrionados o fecundados de 7 días de desarrollo o incubación. Equipamiento, pequeño material y material fungible Ø Laboratorio de prácticas con Cabina de flujo Laminar, baño termostatizado, centrífuga y Microscopio invertido. Ø Material estéril: material de disección, viales, pipetas Pasteur desechables, pipeta de vidrio, placas de cultivo, filtros de 20 y 50-­‐100 micras de diámetro, placas de petri de vidrio, tubos cónicos, etc. Ø Pipetas automáticas de precisión, guantes. Ø Soluciones y medios Ø Medio completo de cultivo (con suero) Ø Medio nutritivo completo Ø Solución de Hank glucosada Ø poli-­‐L-­‐lisina, tripsina Ø alcohol 70º, agua estéril Documentación para el alumno Ø Protocolos y guías detalladas con la descripción ordenada de los procedimientos a practicar y el correspondiente fundamento teórico. Ø Cuaderno de laboratorio con preguntas concretas y espacios destinados anotaciones de observaciones, resultados, conclusiones. Actividades a desarrollar 1. La sesión se inicia con la explicación razonada del procedimiento a desarrollar que constituye la parte central del Proyecto. Se darán las indicaciones técnicas detalladas para alcanzar satisfactoriamente los objetivos de esta experiencia. 2. Se realizará el revestimiento de las placas con el polímero poli-­‐L-­‐lisina. 3. Se llevará a cabo la extracción del embrión y su lavado, en condiciones de esterilidad. 4. Se extirparán los hemisferios cerebrales y se iniciará su lavado, a continuación se trocearán y seguidamente se dispersarán ligera y suavemente. 5. Se llevará a cabo la dispersión enzimática mediante la incubación de los fragmentos de tejido en una solución de tripsina y a continuación se procederá a su dispersión mecánica mediante aspiraciones reiteradas con ayuda de una pipeta Pasteur al objeto de obtener una suspensión celular. Durante el procedimiento, las células se lavarán al objeto de eliminar restos de tripsina mediante diferentes centrifugaciones. 6. Se realizará un filtrado y/o decantación del material dispersado para eliminar agregados (filtos de 50-­‐100 micras de tamaño de poro). 7. Finalmente, se procederá a la siembra del cultivo celular y se trasladan las placas de cultivo al incubador de CO2 para que se inicie su desarrollo in vitro. 8. Se observará la suspensión de células recién sembradas en el microscopio invertido. Resultados esperados de la sesión Ø El alumnado aprenderá el manejo práctico de tejidos y células así como la manipulación de diversos equipamiento de laboratorio: centrífuga, microscopio invertido, incubador de CO2 . Asimismo, se habituará a la manipulación de material biológico en condiciones de esterilidad (cabina de flujo laminar) Ø Observará células vivas recién disociadas y anotará con sencillos dibujos lo observado. Ø Logrará nuevas habilidades y competencias de utilidad e importancia en la Investigación en Biología.