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LIBRO DE ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
Y ENZIMAS
PARA PROFESORES DE ENSEÑAÑZA MEDIA
INDICE
Pág. 2 - 3
Introducción. Objetivos del curso. Conceptos fundamentales.
Programa de Clases y Experimentos
4 -5
Apoyo teórico y actividades sesiones 1y 2: estructura de proteínas
7 -17
KIT para la construcción de modelos topológicos de proteínas
18 -24
Apoyo teórico y actividades sesión 3: Efecto del pH sobre la
solubilidad de una proteína. Determinación del Punto Isoeléctrico
(pI) de la caseína.
25 - 28
Apoyo teórico y actividades sesiones 4 y 5: Introducción
29 - 31
Determinación de la actividad de la enzima β-galactosidasa y
efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad.
32 - 34
Efecto de la concentración de enzima y de inhibidores sobre la
actividad de la
β-galactosidasa.
34 -35
ot
1
INTRODUCCION
Entre las condiciones fundamentales para la vida hay acuerdo en que una de ellas es
llevar a cabo de manera eficiente y selectiva las reacciones químicas necesarias para la
mantención de la vida. Para que dichas reacciones químicas, que son en general muy
lentas, ocurran en una escala de tiempo compatible con la vida, se requiere de
catalizadores que aceleren la velocidad de las reacciones. Los catalizadores biológicos
son las enzimas, que, con excepción de un grupo pequeño de RNA catalíticos
denominados ribozimas, son proteínas.
Las proteínas median prácticamente todos los procesos que tienen lugar en la célula, por
lo que presentan una gran diversidad de funciones: las proteínas forman parte de las
hormonas, anticuerpos, fibras musculares, plumas, antibióticos, transportadores, enzimas,
receptores, entre otras.
Son las macromoléculas más abundantes y están presentes en todas las células y en
cada parte de ellas. Más aún, son el instrumento molecular a través del cual la
información genética es expresada. Las proteínas de todos los organismos, desde los
más simples a los más complejos, están construidas en base a los mismos 20
aminoácidos que se unen entre sí a través del enlace peptídico, para dar origen tanto a la
estructura lineal (estructura primaria) como tridimensional (estructura terciara). A partir de
diferentes secuencias y número de aminoácidos, los diferentes organismos construyen
una diversidad de proteínas con diferentes funciones.
Conocer la estructura y las propiedades de las proteínas es entonces determinante para
entender las numerosas funciones que ellas realizan, incluyendo la catálisis.
1. Objetivos del curso
Objetivo general
Contribuir al mejoramiento de la enseñanza-aprendizaje de los procesos de catálisis que
ocurren en los seres vivos. Por otra parte, dado que los catalizadores biológicos son
estructuralmente proteínas, profundizar en el conocimiento de la estructura y propiedades
de las proteínas, haciendo énfasis en la relación estructura-función. Ello se logrará
mediante la capacitación teórica y práctica de profesores de biología de educación media
en cuatro conceptos fundamentales de esta área de la biología mediante el acceso a
materiales y equipamiento para que los profesores puedan compartir sus experiencias con
sus alumnos usando el enfoque indagatorio.
Objetivos específicos
1) Profundizar y asimilar el concepto básico de que los organismos vivos deben llevar
a cabo de manera eficiente y selectiva las reacciones químicas necesarias para
su vida.
2) Comprender que para que dichas reacciones químicas, que son en general muy
lentas, ocurran en una escala de tiempo compatible con la vida, se requiere de
catalizadores (enzimas) que aceleren la velocidad de las reacciones.
3) Entender que la estructura y propiedades de las proteínas son determinantes para
la función catalítica (enzimática).
4) Conocer la estructura y propiedades de los aminoácidos que forman parte de las
proteínas.
2
5) Conocer la estructura de las proteínas, sus propiedades y algunos métodos de
estudio.
6) Comprender la relación estructura – función en proteínas y la diversidad de las
funciones de ellas.
7) Conocer los fundamentos teóricos y las leyes de la espectrofotometría y
aplicarlos a la medición de la actividad de una enzima.
8) Comprender las bases del proceso de catálisis y las diversas propiedades de las
enzimas.
9) Entregar a los profesores que se capacitan en el curso la posibilidad de transmitir a
sus alumnos la comprensión de los conceptos básicos de esta área mediante la
experimentación directa que da cuenta de esos conceptos.
Los objetivos descritos anteriormente se enmarcan en el contexto de cuatro principios
fundamentales para el tema de Estructura de Proteínas y Enzimas:
CONCEPTOS FUNDAMENTALES
1. La adquisición de la estructura tridimensional de las proteínas está definida
por la secuencia de aminoácidos, codificada en el DNA, las propiedades
fisicoquímicas de los aminoácidos y su interacción con el entorno.
2. La función viene determinada por la estructura. La complejidad y
variabilidad estructural y evolutiva de las proteínas permite una gran
diversidad de funciones.
3. Las enzimas son catalizadores biológicos que aceleran la velocidad de las
reacciones bioquímicas a temperatura y pH fisiológicos.
4. Las enzimas son específicas y su actividad puede ser regulada a varios
niveles.
3
Programa del Curso de Estructura de Proteínas y Enzimas
Facultad de Ciencias y Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la
Universidad de Chile y Facultad de
de la Pontificia Universidad Católica de Chile
11 al 15 de Enero de 2016
CLASES
Bienvenida
Clase 1
11 Enero
Profesor MAURICIO BAÉZ
* Repaso de algunos conceptos fundamentales de la química:
tipos de enlaces, interacciones débiles, estructura del agua,
pH, pK
Clase 2
11 Enero
Profesor MAURICIO BAÉZ
* Estructura de aminoácidos y proteínas. Propiedades físicoquímicas. Conceptos fundamentales.
Clase 3
12 de Enero
Profesor RICARDO CABRERA
*Proteínas: organización estructural jerárquica clásica.
Conceptos de dominio y agregados macromoleculares
Profesor CHRISTIAN A. M. WILSON
* Compactación de la proteína: plegamiento. Desnaturación y
renaturación. Concepto de chaperonas. Plegamiento al
interior de la célula.
Clase 4
12 de Enero
Clase 5
13 de Enero
Clase 6
13 de Enero
Profesor NELSON BARRERA
* Diversidad estructural. Relación estructura – función.
* Sitios y superficies de reconocimiento. Mutaciones en el
contexto estructural
Profesora VICTORIA GUIXÉ
* Enzimas como catalizadores biológicos y su participación
en vías metabólicas. Catálisis: conceptos de velocidad,
energía libre, energía de activación, estado de transición.
* Aspectos termodinámicos y cinéticos. Curva de progreso.
Clase 7
14 de Enero
Profesora VICTORIA GUIXÉ
* Factores que afectan la velocidad de reacciones
catalizadas por enzimas: pH, temperatura, concentración
de metabolitos y de enzima. Coenzimas.
* Proteínas de extremófilos.
Clase 8
14 de Enero
Profesora ANA PRELLER
* Localización intracelular de las enzimas. Vías
metabólicas y enzimas.
* Complejos multienzimáticos. Mecanismos que regulan
la cantidad y la actividad de las enzimas.
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ACTIVIDADES PRÁCTICAS
Día 1
1.
Construcción
de
estructuras
de
aminoácidos y de proteínas usando kits de
piezas plásticas.
2. ¿?
Día 2
1.Visualización
de
estructuras
en
el
computador.
2. Efecto del pH en la solubilidad de proteínas.
Determinación del punto isoeléctrico.
Día 3
1. Medición de la actividad de una enzima.
2. Efecto de la temperatura, del pH y de la
concentración de la enzima sobre la actividad.
Día 4
1. Efecto de la concentración de enzima y de
inhibidores sobre la actividad.
Día 5
*Prueba de evaluación
* Taller de evaluación
* Discusión de resultados de las actividades
Prácticas
* Discusión de posibles aplicaciones de los
Conceptos del área
Dr. Mauricio Báez y
Cabrera.
Estudiantes de posgrado
Ricardo
Dr. Mauricio Báez. Dr. Ricardo Cabrera,
Dr. Christian A.M. Wilson
Estudiantes de posgrado
Dra. Victoria Guixé y Dra. Ana Preller
Estudiantes de posgrado
Dra. Victoria Guixé y Dra. Ana Preller
Estudiantes de posgrado
J.E. Allende
Mauricio Báez
Nelson Barrera
Ricardo Cabrera
Victoria Guixé
Ana Preller
Christian A. M. Wilson
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Dr.
SOPORTES TEÓRICOS Y PROTOCOLOS DE TRABAJOS PRÁCTICOS
6
APOYO TEORICO PARA SESION 1
Introducción a la estructura de proteínas y aminoácidos.
Las proteínas son macromoléculas (moléculas muy grandes) formadas por una
cadena de moléculas más pequeñas, los aminoácidos. Las proteínas son las principales
responsables de realizar las funciones biológicas, y es la estructura o forma de las
mismas la que determina su función. Los aminoácidos son moléculas que contienen un
grupo carboxilo (-COOH) y un grupo amino (-NH2) libres, más una cadena lateral (R)
característica. Para formar las proteínas los aminoácidos se unen entre sí, mediante lo
que se denomina el enlace peptídico. Éste se forma entre el grupo amino de un
aminoácido y el carboxilo de otro, dando como resultado un enlace covalente CO-NH.
Este enlace se conoce como amida.
Existen aproximadamente 20 aminoácidos distintos componiendo las proteínas.
Éstos se pueden clasificar en función de las características de su cadena lateral R en:
• Hidrofóbicos: Aquellos no afines al agua.
• Polares: Aquellos afines al agua capaces de formar puentes de hidrógeno.
• Con carga o iónicos: Con carga positiva o negativa a pH fisiológico.
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La figura superior muestra los 20 aminoácidos que conforman las proteínas clasificados según la
polaridad de su cadena lateral. Para familiarizarse con la estructura tridimensional de cada uno de
los aminoácidos Ud. puede utilizar un programa de visualización de proteínas. Existen varios
programas para visualizar estructuras de proteínas. Entre los más populares se encuentran el
"VMD" (visual molecular Dynamics; http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/) y el DeepView-SwissPdbViewer http://spdbv.vital-it.ch/). En este taller usaremos el programa VMD.
En la carpeta denominada “aminoácidos” hay 20 archivos que corresponden a la
estructura de cada uno de ellos. Por ejemplo el archivo “alanine.pdb” contiene la
estructura de alanina (ALA o A). Para observar la estructura de alanina abra el programa
VMD. “Visual molecular Dynamics”
1. Inicialización del VMD: Ejecute desde el Menú Inicio de Windows el programa VMD.
Si todo anduvo bien deberían aparecer 3 ventanas. La ventana VMD Main, es la ventana
de control del programa, y funciona como cualquier programa de Windows. La ventana
VMD OpenGL Display es donde se representa la proteína y la otra es una consola de
texto. Esto es lo que Ud debería observar:
2. Abrir el archivo con la estructura. Para cargar la estructura de un aminoácido en el
software VMD, abrimos VMD-MAIN: File-New Molecule- Aparece una nueva ventana que
nos permite buscar los archivos. Escoja un aminoácido de la carpeta aminoácidos y lo
abrimos con los comandos open y luego load. Si todo anduvo bien aparecerá la proteína
representada en la ventana VMD OpenGL Display. En la figura 3A se muestra la
estructura de la alanina del archivo “alanine.pdb”.
A
B
C
Figura 3.
8
3. Manejo de “VMD Display”: La molécula de un aminoácido aparecerá inicialmente
representada por “Lineas” (Figura 3A). Cada línea representa una unión covalente entre
dos átomos que están en los extremos. Carbono es Cian (o celeste-verdoso),
Nitrógeno es Azul, Oxigeno es Rojo, Hidrogeno es blanco. Ud. puede mover la
molécula en el espacio para tener una idea de su forma tridimensional. Esto se realiza
mediante el mouse (botón derecho mueve respecto al centro, botón izquierdo rota
respecto al centro) y las teclas: R= modo rotación, T= modo traslación, C= centrar la
rotación/traslación. Pruebe los tres modos de movimiento.
4. Representaciones de moléculas. El programa VMD permite “mostrar” los átomos y
las moléculas de diferentes maneras y también colores. Para cambiar la representación
del aminoácido vaya al menú principal y selecciones Graphics y luego en el menú
desplegable Representations. Esto abrirá un nuevo panel “Graphical Representations”
(Figura 4).
Figura 4. Panel. “Graphical Representations”
Menú desplegable para cambiar
representación.
Menú desplegable para cambiar de
color.
Menú desplegable para cambio de
representación.
El menú Graphical Representations es muy importante porque permite manejar
la representación de la molécula mediante “Drawing method” y su color mediante
“Coloring method” (Figura 4). Para representar moléculas pequeñas como aminoácidos
se suele utilizar las representaciones denominadas como “lines”, “bonds” o “CPK”
“VDW”. Estas representaciones las puede cambiar en el cuadro de “Drawing Method”.
Pruebe estas diferentes conformaciones y rote el aminoácido. En la Figura 3A se muestra
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como ejemplo la alanina en “lines” (Figura 3A) como “CPK” (Figura 3 B) y VDW (Figura
3C). De las tres representaciones la que mejor representa la “realidad” de la molécula es
VDW (Figura 3C). La representación de VMD indica el volumen aproximado que ocupan
los electrones en los átomos constituyentes de la molécula. Este volumen no puede ser
traspasado por otro átomo y define el acercamiento máximo que pueden tener dos
moléculas y por lo tanto el impedimento estérico.
Ejercicios.
a) Escoja un aminoácido y muéstrelo como CPK e identifique los átomos que lo
componen. Si no recuerda el código de colores puede presionar la tecla “cero” y haga
click sobre el átomo cuya identidad quiere conocer. La identidad del átomo aparecerá en
la consola.
b) ¿Qué información extra se obtiene en la representación tridimensional respecto a la
representación bidimensional de la figura 1?
c) ¿Puede identificar la cadena lateral, el grupo amino y carboxilo del aminoácido
escogido ? Tip: ubique el carbono α.
d) ¿Cuál es el estado de ionización de los grupos amino y carboxilo?
e) ¿Cuál es la geometría del carbono α?
f) ¿Cuál es la geometría del carbono del grupo carboxilo?
g) ¿Que tipo de aminoácido está observando, D o L?. Para eso puede ayudarse de la
regla de CORN. Esta regla dice que si Ud orienta el hidrogeno del carbono α mirando
hacia Ud, el grupo carboxilo (CO), la cadena lateral (R) y el grupo amino (N) siguen el
camino de la figura formando la palabra CORN (Figura 5).
Figura 5
Visualización del enlace peptídico. Hasta ahora se han observado los aminoácidos por
separado. No obstante, cuando las proteínas se sintetizan en el ribosoma se forma un
enlace covalente entre los aminoácidos (de tipo L) denominado enlace peptídico. Este
enlace se crea entre el extremo carboxilo de un aminoácido y el extremo amino del
próximo lo que produce la formación de una molécula de agua (Figura 6). Para observar
los aminoácidos formando una cadena polipeptídica abra el archivo “peptido.pdb”. Este
archivo muestra un trozo de una proteína de 5 aminoácidos cuya secuencia de
aminoácidos es: PHE-MET-LYS-GLU-LYS (Figura 6)
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Figura6.Formacióndelenlacepeptídico.Alaizquierda
se muestra la reacción de formación de un enlace
peptídico a partir de dos aminoácidos. Nótese que el
enlaceseestableceentreunátomodenitrógenoyun
átomo de carbono que tiene unido un oxígeno (ver
cuadrado). La secuencia inferior muestra los enlaces
peptídicos de la secuencia que vamos analizar la cual
contiene 5 aminoácidos cuyas cadena laterales se
muestran en verde y el enlace peptídico es resaltado
engris.
PHE
MET
LYS
GLU
LYS
Abra la molécula (péptido.pdb) con el programa VMD y visualícela como CPK. ¿Es
fácil identificar cada aminoácido o la cadena principal? Para facilitar su observación
coloree la estructura como “ResName” en la pestaña “Coloring Method”. Ahora cada
aminoácido en la cadena principal se muestra de acuerdo a un color. Identifique las
cadenas laterales de cada aminoácido presente en la secuencia. Cuentelas!. Si aún le
resulta difícil puede hacer aparecer los aminoácidos uno por uno. El primer aminoácido es
PHE (fenilalanina) y es el número 6 en esta secuencia. Para visualizarlo escriba resid 6 en
el panel “Selected Atoms”. Ahora para identificar los tipos de átomos presentes en PHE
cambie el color por “element” en el cuadro de “Coloring Method”. ¿Puede identificar el
carbono α? ¿Qué átomos tiene unidos? (compare la secuencia de la Figura 6 con lo que
observa en la estructura). Para observar el segundo aminoácido que es metionina (MET)
agregue un 7 en el panel “Selected Atoms”. Esto le dice al programa que muestre los
aminoácidos 6 y 7 de la secuencia. Ahora identifique el enlace peptídico entre que une a
PHE con MET. Para ayudarse puede usar la secuencia de la figura 6. Agregue más
números hasta mostrar todos los aminoácidos de la secuencia (llegue hasta el 10) y trate
de identificar el enlace peptídico a medida que van apareciendo los aminoácidos. Note
que los átomos que forman el enlace peptídico más el carbono α de cada aminoácido
conforman la cadena principal de la proteína. Para ver la cadena principal de la proteína
presione el botón “Create Rep” y en el cuadro de “Drawing Method” cambie a la opción a
“tube” (Figura 7).
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Figura 7
Visualización de la estructura de proteínas.
Conocer la estructura de una proteína consiste en determinar la posición espacial
(en coordenadas cartesianas x,y,z, por ejemplo) de todos los átomos que la componen.
Cuando un grupo de investigación determina la estructura de una proteína, mediante
cristalografía de rayos X o NMR, la deposita en una base de datos internacional de libre
acceso denominada Protein Data Bank (PDB; http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do).
Cada estructura se identifica con un código de cuatro caracteres con una extensión “.pdb”.
Descargue de la base datos PDB la estructura con el código 3CQD (Download->PDB File
(text)).
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Si desea observar la información contenida en el archivo pdb utilice un editor de texto
como el wordpad.
Coordenadas atómicas
Numero de
cada átomo
(INDEX number)
X
Y
Z
Numero del
aminoacido en la
secuencia (resid)
Tipo de
átomo
Aminoácido
(name)
Cadena
(chain)
Figura 1
Los programas de visualización de estructuras interpretan la información contenida
en el archivo pdb (figura 1) y la representan visualmente. Por ejemplo, el átomo 908
corresponde al carbono α (CA) de la Lys número 2 de la cadena A y está ubicado en las
coordenadas cartesianas x,y,z (19.469, 4.361, 8.492). La información de volumen,
formación de los enlaces covalentes y otras propiedades químicas de cada átomo es
deducida de su identificación en el archivo (CA; carbono alfa, CB; carbono beta... etc).
1. Estructura de una proteína es coherente con su función. Las proteínas que
catalizan reacciones químicas, como las enzimas, deben acomodar al sustrato en algún
bolsillo y poseer aminoácidos posicionados específicamente para catalizar la reacción.
Además, algunas de estas enzimas poseen sitios regulatorios llamados sitios alostéricos o
regulatorios. Muchas proteínas, poseen además moléculas orgánicas unidas como grupos
prostéticos (grupo el HEME de la hemoglobina), o iones y cofactores. Por otro lado, hay
proteínas que son factores de transcripción y realizan su función mediante la unión a otras
macromoléculas como el ADN (Represor ARC; Código PDB 1PAR).
Mediante el uso del programa "VMD" se observará la estructura de una enzima
(fosfofructoquinasa-2) y la localización de los sitios activos. La enzima le agrega una
molécula de fosfato a un azúcar para generar un azúcar con dos fosfatos.
fructose-6-P + MgATP
fructose-1,6-bisP
+
MgADP
Para observar la estructura Ud debe obtener el archivo 3CQD.pdb desde la base
de datos http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do. El archivo 3CQD.pdb contiene las
coordenadas cartesianas de la fosfofructoquinasa-2 obtenida en presencia de uno de su
sustratos, ATP. Para cargar el archivo, abrimos VMD-MAIN: File-New Molecule-
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Aparece una nueva ventana que nos permite buscar los archivos, seleccionamos el
archivo 3CQD.pdb y lo abrimos con los comandos open y luego load. Si todo anduvo
bien aparecerá la proteína representada en la ventana VMD OpenGL Display. Ud puede
rotar la estructura de la proteína como en el caso de los aminoácidos.
2. Selecciones y Representaciones. Menu: “Graphical Representations”. Tal como
vimos en el caso de los aminoácidos Ud puede representar la estructura de diferentes
maneras. Inicialmente hay una sola representación “all” representada en “Lines” y
coloreada por “name”. Pruebe modificando la representación de la estructura como CPK,
VWD y lines en el menú de “Graphical Representations”. Note lo asombroso de la
estructura y como cada átomo se localiza en un lugar específico del espacio.
También note el gran tamaño respecto al péptido analizado anteriormente. Esta enzima
es un homodímero constituido por 2 cadenas polipeptídicas idénticas denominadas como
A y B. Cada cadena está compuesta por 309 aminoácidos lo que hace un total de 4602
átomos organizados en el espacio!
Ud puede seleccionar los átomos de la proteína que quiere observar. Se pueden
elegir aminoácidos por su nombre (ej: resname TYR, mostrara todas las tirosinas), o por
su posición en la secuencia (Ej. resid 1, mostrara el primer aminoácido). Este comando
acepta rangos (ej Resid 2 to 4, mostrara los aminoácidos 2 a 4). En el manual del
programa puede encontrar muchas más opciones de selección de átomos.
Por ejemplo, para visualizar la cadena principal represente la proteína como “tube” en el
cuadro “Drawing Method”. Si desea ver dónde comienza la cadena agregue una
representación mediante el botón “Create Rep” y seleccione “resid 1”. Ud debería ver la
estructura como se muestra a la izquierda de la Figura 2.
Molecula: 3cqd
Figura 2.
Representaciones gráficas
Selección de átomos: Protein
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Visualización de la estructura cuaternaria de la proteína. Esta proteína contiene dos
subunidades con idéntica secuencia e idéntica estructura (es un homodímero). Para
distinguir ambas subunidades seleccione “Chain” en el cuadro “Coloring Method”. Esto
debiera mostrar la estructura como se observa a la derecha en la figura 8. Pregunta:
¿dónde cree que se ubican los sitios activos de la enzima?
Visualización de sitios activos y estructura secundaria. Para ver los sitios activos de
la enzima vamos a mostrar su estructura secundaria. El programa puede representar la
estructura secundaria de la enzima automáticamente debido al reconocimiento de
patrones repetitivos de puentes de hidrogeno y el cálculo de las rotaciones de algunos
enlaces. Esto lo verán en el segundo día de laboratorio. Por ahora simplemente vamos
a representar la estructura secundaria como se muestra en la figura 3. En “Coloring
Method” cambie la opción a “Secondary Structure” y en “Drawing Method” cambie la
selección por “New Cartoon”. La pregunta de los sitios activos la podemos responder
haciendo aparecer uno de los sustratos. Para eso cree una representación nueva y
escriba “Resid 313 310” en el cuadro “Selected ATOM”. Pruebe cambiando en “Drawing
Method” diferentes representaciones para la molécula de ATP.
Figura 3.
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Trayectorias moleculares (Demostrativo)
El programa VMD también puede ser utilizado para visualizar y analizar
trayectorias producidas mediante programas de dinámica molecular. Al igual que una
película, una trayectoria está constituida por múltiples cuadros o "frames" que representan
la ubicación de los átomos calculada entre intervalos finitos de tiempo. La trayectoria que
observarán representa la simulación del plegamiento de una proteína denominada como
VirC2 desde su estado desplegado hasta el estado final nativo y está compuesta por 4001
cuadros (Fig 1). El objetivo es observar los cambios conformacionales y cómo cambia el
"RMSD" en función del tiempo.
Normalmente las simulaciones requieren al menos dos archivos: un archivo que
contiene las coordenadas y la identidad de los átomos de la estructura de la proteína y
otro archivo, generalmente de gran tamaño, que contiene las posiciones atómicas en
función del tiempo de simulación.
Elimine las estructuras anteriores (simplemente puede abrir y cerrar el programa)
y abra el archivo VirC_03.gro que contiene las coordenadas de la estructura de VirC2.
Represente la estructura como "New Cartoon" y coloree como "Radial". Observe como la
hélice del carboxilo terminar de la proteína pasa por debajo de un "loop" o lazo.
Para cargar la información de la dinámica, simplemente abra el archivo
VirC_03_fold.xtc. Este archivo contiene las posiciones atómicas en función del tiempo. En
el panel principal observe como aumenta el número de cuadros a medida que el programa
lee la trayectoria (Fig 1, círculo rojo). De la misma manera que un reproductor de video,
Ud puede elegir la posición de la película manipulando los botones de la barra de
desplazamiento (Fig 1, cuadrado azul). Observe la película completa manipulando estos
botones.
Para promediar las fluctuaciones rápidas y observar mejor los cambios
conformacionales aumente el valor de "trajectory smoothing window size" a 3 (Fig 2).
Debido a que es difícil determinar los eventos importantes en una trayectoria mediante
una inspección visual, determine la variación del RMSD de la proteína a lo largo del
tiempo. Abra la aplicación "RMSD trajectory tools" (VMD main-> extension-> analysis->
RMSD trajectory tools). En la ventana de la aplicación, marque las opciones como se
muestra en la figura 3 y presione el botón Align y luego el botón RMSD. Esto debiera
generar un gráfico como el que se muestra en la figura 5.
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Utilice la información del gráfico para determinar cambios conformacionales importantes
en la proteína. ¿Que se puede deducir del gráfico? ¿Cuál es el estado desplegado? ¿Hay
algún intermediario? ¿cómo es su estructura? ¿Que eventos lo definen?
Fig 1
Fig 3
Fig 2
Fig 4
17
KIT PARA LA CONSTRUCCION DE MODELOS TOPOLOGICOS DE PROTEINAS
El objetivo básico del kit, creado por el Dr. Richard Garratt del Laboratorio de
Biología Estructural de la Universidad de São Paulo, es permitir el ensamblaje de modelos
físicos simplificados de proteínas (sin preocuparse de detalles atómicos), semejantes a
las representaciones de los Programas de Visualización de proteínas. Más
específicamente, los modelos construidos con los componentes del kit, enfatizan la
topología del plegamiento de la macromolécula en base a la disposición espacial de las
estructuras secundarias.
Los componentes, montados en una determinada secuencia, simbolizan
elementos de la estructura secundaria (alfa-hélices y hebras-beta), así como sus
conexiones, para la construcción de modelos representativos del plegamiento
tridimensional de cualquier estructura proteica.
COMPONENTES
Familiarícese con los componentes del kit (figura 1). Las piezas cilíndricas (a, b, c)
o extendidas (d, e), se pueden concatenar entre sí para producir alfa hélices y hebras beta
de diferentes tamaños, respectivamente. Dado que las hebras beta individuales deben
interactuar con otras hebras, la pieza (f) viene a representar esquemáticamente los
puentes de hidrógeno que se establecen entre estas hebras y se encajan en los orificios
laterales de las piezas (d, e). Los segmentos de la cadena polipeptídica que conectan
elementos de estructura secundaria, pueden ser representados por las piezas (g). Las
piezas transparentes (h) e (i) sirven para aumentar la estabilidad mecánica de la
estructura construida y pueden ser usadas de la forma más conveniente, sin representar
ningún aspecto de la estructura proteica. Por su parte, la pieza (j) puede ser usada
opcionalmente para rematar el extremo N-terminal de alguna alfa hélice.
Figura 1. Los componentes del Kit. Las piezas no obedecen a una escala específica. Sólo
como sugerencia, cada pieza cilíndrica puede ser tratada como una vuelta de alfa-hélice,
(3,5 residuos) y cada pieza extendida puede corresponder a 2 residuos.
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ELEMENTOS DE ESTRUCTURA SECUNDARIA
La figura 2 muestra ejemplos de elementos de estructura secundaria. Entre las
miles estructuras de proteínas resueltas, se han observado "distorsiones" en los
elementos de estructura secundaria. En la construcción del modelo será importante
introducir estas variaciones morfológicas. Por ejemplo, la alfa hélice canónica mostrada
en 2a puede modificarse hacia la forma 2e, mediante la introducción de un pedazo
pequeño del componente (g). Comparar, en el caso de 2b y 2c, la diferencia entre una
hebra beta sin torsión y con torsión, respectivamente. En el último caso, las piezas deben
ser ligeramente giradas dextrógiramente. Además, el mismo eje longitudinal de la hebra
puede presentar una curvatura (2d)
Figura 2: Elementos de estructura secundaria y sus distorsiones habituales.
La figura 3 muestra una sábana beta compuesta de 5 hebras paralelas, unidas por
la inserción de las piezas 1f. En este ejemplo, las hebras beta (con eje longitudinal
dextrógiro como en 2c) llevan a la formación de una sábana beta no planar, es decir
cóncava hacia uno de sus lados. Por otra parte, en el caso de una estructura típica de
barril, dado que las hebras presentan una inclinación respecto del eje longitudinal del
barril, las regiones que se enlazan mediante puentes de hidrógeno terminan
correspondiendo solo a los segmentos verdes. En la figura 3b se muestran distintos tipos
de sábanas (también llamadas hojas) beta. Por ejemplo, (c) y (d) son formados por el tipo
de hebra beta mostrado en 2d; sin embargo, en el caso de (d) el número de segmentos en
la hebra es mayor, en la región de torsión del eje longitudinal. Finalmente, en algunas
representaciones en los libros básicos de Bioquímica se suele mencionar la configuración
zig-zagueante de la cadena principal en el caso de las hebras que forman la sábana. Este
rasgo es presentado en el esquema 3e.
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Figura 3: Diferentes tipos de sábana beta.
CONSTRUCCION DE LA ESTRUCTURA TERCIARIA:
Ejercicio 1.
Los barriles-beta forman parte del número limitado de super-plegamientos (superfolds) conocidos, ya que es muy frecuentemente observado en estructuras de proteínas.
Esta morfología fue inicialmente identificada para la enzima TIM (triosa-fosfato isomerasa)
Objetivos.
1. Construir un barril beta/alpha8 a partir de una limitada cantidad de información
topológica.
2. Percibir que la tendencia de la sábana beta a "cerrarse" como un barril, es una
consecuencia mecánica natural de las propiedades de la hoja.
20
Figura 4. Información topológica para la construcción del barril alpha/beta8.
Es aconsejable proceder en etapas para la construcción de una estructura
tridimensional de proteínas con el kit. Por ejemplo, la figura 5 muestra diferentes etapas
en el montaje del barril beta/alpha8. El ejemplo mostrado no representa la estructura de
ninguna proteína específica, pero sirve para destacar la topología de este plegamiento.
Inicialmente, montar ocho hebras beta y torcer el eje longitudinal pieza a pieza (figura 5ac). Luego, unirlas mediante puentes de hidrógeno (5d).
Figura 5. Diferentes etapas para el montaje de un barril beta/alpha8.
Es necesario notar que las sábanas cerradas con la forma del barril, poseen una
inclinación respecto del eje longitudinal del barril (algunos autores han denominado este
efecto cizallamiento, traducido del inglés shear). Por lo tanto, en el montaje, el último
residuo de la primera hebra tiene que ser unido con el penúltimo de la segunda, el
penúltimo de la primera, con el antepenúltimo de la segunda, y así sucesivamente.
Realizando esto hebra a hebra, la torsión longitudinal introducida en el eje de cada hebra
individual, producirá de manera natural la curvatura que permitirá eventualmente el cierre
del barril (5e). Finalmente, el barril puede ser cerrado mediante puentes de hidrógeno
21
entre la última hebra y la primera (5f) y las alfa hélices pueden adicionarse del lado
externo del barril mediante el uso de conectores 1(g) y alfa hélices 2(a) para completar
una cadena polipeptídica única y continua.
Figura 6. Resultado esperado ejercicio 1.
*Ejercicio alternativo: intente la construcción de un barril beta/alpha8, usando la torsión
levógira en cada hebra.
22
Ejercicio 2
El dominio de unión a NAD (nicotinamida adenina dinucleótido) fue inicialmente
observado en deshidrogenasas como la alcohol deshidrogenasa de hígado, la malato
deshidrogenasa y la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa. Variaciones morfológicas
han sido subsecuentemente encontradas en otras faimlias de enzimas pero están
usualmnete asociadas a la función de unión de mononucleótidos o dinucleótidos, Por
definición, cada mitad es conocida como Rossmann Fold, en honor al apellido de su
descubridor.
Objetivos:
1. Construir el clásico dominio de unión a NAD, destacando mediante colores, la
semejanza de las mitades que lo componen.
2. Observar la localización del segmento de unión a fosfato entre la primera hebra y la
primera hélice para enfatizar su rol funcional.
3. Cuidar la correcta definición de quiralidad en la estructura protéica.
Figura 7. Información topológica para la construcción del dominio de unión a NAD.
23
Se sugiere construir primero la sábana beta de 6 hebras y luego adicionar las 5
hélices, garantizando que éstas estén posicionadas del lado correcto de la sábana, de
acuerdo con las reglas de quiralidad.
Prestar atención al hecho de que en las hojas beta abiertas, como las que se
trabajan en este ejercicio, el sitio mismo de unión se ubica en la "hendidura" que resulta
entre dos conectores que se curvan hacia lados opuestos de la hoja, entre las dos
mitades del dominio.
Figura 8. Resultado esperado ejercicio 2.
24
APOYO TEORICO PARA SESION 3
Efecto del pH sobre la solubilidad de una proteína. Determinación del Punto Isoeléctrico
(pI) de la caseína.
a) Introducción
Las proteínas presentan propiedades ácido-base que están determinadas por el número y tipo
de sus radicales ionizables, junto con los grupos amino y carboxi terminal. Las proteínas que
han sido modificadas post-traduccionalmente, ya sea mediante glicosilación, fosforilación,
sulfonación, acetilación, etc., poseen cargas adicionales. Existe un pH en que las proteínas
tienen una carga neta cero, el cual se conoce como punto isoeléctrico. A un pH diferente al de
su punto isoeléctrico, las proteínas presentan carga, lo cual permite que éstas migren al ser
sometidas a un campo eléctrico.
La insolubilidad de la caseína (una fosfoproteína) en su punto isoeléctrico puede ser utilizada
como un método conveniente para determinar este punto.
Si a una serie de tubos que contienen iguales volúmenes de una solución de caseína disuelta
en una solución de acetato de sodio, se les agrega cantidades variables de ácido acético, se
obtienen tubos con diferentes pHs.
Si se conoce el pK del ácido acético, el pH resultante en cada tubo puede ser calculado por
medio de la ecuación de Henderson-Hasselbach:
pH = pK + log
[ sal ]
[ácido]
pK ácido acético = 4,7
Considerando que el tubo N° 1 contiene 1 ml de acetato de sodio 0,1M y se le agrega 1,6 ml de
ácido acético 1M, antes de emplear la fórmula será necesario convertir el ácido a igual
molaridad que la sal, con lo que resulta:
pH = 4,7 + log
(16,67 )
(266,67)
pH = 4,7 + log 16,67 - log 266,67
pH = 4,7 + 1,22 – 2,42
pH = 3,5
25
Los pHs obtenidos en cada uno de los tubos, siguiendo el ejemplo dado para el tubo N° 1, están
calculados y dados en el esquema de trabajo.
Después del experimento, el pH del tubo que contenga un máximo de precipitación es tomado
como punto isoeléctrico.
Parte Experimental.
Reactivos.
1. Caseína al 0,5% en acetato de sodio 0,1 M
2. Ácido acético 1 M
3. NaOH 10 M
Procedimiento.
Rotule una serie de tubos de ensayo del 1 al 9.
En el tubo N° 1, agregue 320 µL de ácido acético 1 M y 680 µL de agua destilada. Mezcle
bien.
Añada 500 µL de agua destilada en cada uno de los 8 tubos restantes.
Saque 500 µL de la solución del tubo N° 1 y agréguelos al tubo N° 2, mezcle bien.
A continuación, saque 500 µL del tubo N° 2 y transfiéralos al tubo N° 3, mezcle bien, etc.
Continúe del mismo modo hasta completar la serie de tubos.
En el tubo N° 9 una vez efectuada la mezcla, saque 500 µL de solución, y descártelos.
Posteriormente agregue a cada tubo 100 µL de la solución de caseína en acetato de sodio 0,1
M. Mezcle al instante.
Anote en una tabla el efecto inmediato que se produce en los diferentes tubos y el que se
observa después de 15 minutos.
ESQUEMA DE TRABAJO
Agua destilada [µL]
Ácido acético 1 M [µL]
Volumen de solución que se
adiciona al tubo siguiente [µL]
Caseína en acetato 0,1 M [µL]
pH en cada tubo
Resultados inmediatos
Resultados a los 15 [min]
1
680
320
2
500
-
Tubos N°
3
4
5
500 500 500
-
6
500
-
7
500
-
8
500
-
9
500
-
500
100
3,5
500
100
3,8
500
100
4,1
500
100
5,0
500
100
5,3
500
100
5,6
500*
100
5,9
26
500
100
4,4
500
100
4,7
* = Descartar
Emplear en la tabla los siguientes símbolos:
0 = no cambia,
+ = opalescencia, y
x = precipitado
Con papel pH puede chequear el pH de los tubos
Al tubo con el mayor precipitado agregue 100 µL de NaOH y observe qué ocurre.
Comente los resultados obtenidos
Busque información sobre la técnica de isoelectroenfoque.
27
APOYO TEORICO PARA SESIONES 4 Y 5
Enzimas y catálisis
a) Introducción.
Las enzimas son proteínas que se encuentran en la célula mezcladas entre sí y con
muchas otras especies moleculares. Sin embargo, es posible detectarlas y determinarlas
con exactitud por las reacciones que catalizan. Para esto es necesario conocer el o los
sustratos y el o los productos de las reacciones y disponer de los métodos analíticos para
medirlos. Al mismo tiempo es imprescindible realizar todos los controles que permitan
descartar posibles artefactos que puedan simular una actividad enzimática, al hacer
aparecer el producto o desaparecer el sustrato de la reacción. Los controles más
importantes en enzimología son:
Blanco de sustrato: Mezcla de reacción semejante a la mezcla donde se detecta la
actividad enzimática, en la cual la solución de sustrato se reemplaza por un volumen
equivalente de su solvente, el que habitualmente es agua o un amortiguador. Este control
es útil cuando se sospecha que los componentes del sistema, con excepción del sustrato,
interfieren con el método para medir el sustrato o los productos.
Blanco de enzima: En este control la solución enzimática se reemplaza por un volumen
equivalente de su solvente, el que generalmente es un amortiguador. Este control es
importante cuando el sustrato es inestable y puede dar producto en ausencia de la
enzima.
Tiempo cero: Este control contiene todos los componentes necesarios para la detección
de la actividad enzimática y consiste en que la reacción se detiene en el momento mismo
de completar el sistema. Esto puede realizarse agregando un agente inactivante antes o
inmediatamente después de completar la mezcla de reacción. Este control detecta
interferencias debidas a cualquiera de los componentes y debe ser tomado en cuenta
para los efectos de la cuantificación de la actividad enzimática.
Es importante recordar que el estudio in vitro de una enzima implica que ésta debe ser
aislada y purificada, aunque sea parcialmente, para después analizar individualmente las
variables que influyen sobre su actividad. Para este proceso es indispensable fijar
inicialmente en forma tentativa las condiciones experimentales en que se realizará el
ensayo enzimático, tomando en consideración todos los conocimientos generales que se
tienen sobre la naturaleza de las enzimas y aquellos hechos particulares que nos
permiten suponer algunas cualidades o requerimientos especiales de la enzima en
estudio. De este modo se debe elegir un pH, una temperatura y un tiempo de incubación
compatibles con la naturaleza proteica de la enzima y que permitan analizar de manera
apropiada los distintos factores que influyen sobre la actividad enzimática.
En este trabajo práctico usaremos la β-galactosidasa, una enzima que hidroliza los βgalactósidos tales como lactosa u otros rompiendo el enlace o -glucosídico.
La actividad de esta enzima es relativamente fácil de detectar pues actúa también sobre
sustratos sintéticos cromogénicos que al ser hidrolizados originan productos coloreados.
El o-nitrofenil- β -galactósido es un sustrato sintético de la β-galactosidasa por el cual la
enzima presenta una alta afinidad, y que al ser hidrolizado libera ortonitrofenol.
28
CH2 OH
OH
O2 N
O
CH2 OH
OH
O
+
OH
H2O
O2 N
O
OH
OH
+
HO
β-Galactosidasa
OH
OH
orto-nitrofenil- β – galactósido
ortonitrofenol
El o-nitrofenol en medio alcalino toma un color amarillo. La absorción de este compuesto
a 420 nm es directamente proporcional a su concentración por lo menos hasta 0,30
µmoles/ml.
b) Medición de la actividad enzimática mediante el uso de técnicas de fotometría.
Cuando la luz atraviesa un medio transparente parte de ella puede ser absorbida, de
modo que la intensidad de la luz transmitida (It) es siempre menor que la intensidad de la
luz incidente (Io). La intensidad de la luz transmitida es función de la intensidad de la luz
incidente multiplicada por una potencia de 10 con exponente negativo cuyo valor depende
de una constante (ε, coeficiente de extinción) que es característica para cada medio
transparente, y del espesor del medio. Lo anterior queda expresado en la siguiente
relación:
It = Io x 10- l
ε
Estas mismas relaciones son aplicables al estudio de la absorción de la luz por soluciones
coloreadas de diferentes concentraciones: a medida que la concentración de la solución
(c) aumenta en progresión aritmética, la intensidad de la luz transmitida disminuye en
progresión geométrica:
It = Io x 10- c
ε
De aquí surgió la Ley de Lambert-Beer que relaciona la disminución de la intensidad de la
luz transmitida con la concentración y el camino recorrido por la luz al atravesar la
solución, lo que se expresa matemáticamente como:
log
Io
= εlc
It
La razón It / Io se llama transmisión o transparencia. Cuando la luz transmitida es igual a
la luz incidente el valor de la razón es 1 y la solución es totalmente transparente. Si se
descarta, por medio de un control apropiado (blanco), la luz absorbida por las paredes del
continente de la solución y por el solvente y se considera sólo la transparencia de la
sustancia disuelta (soluto) cuya concentración se desea medir, se habla de transmitancia.
Lo contrario a la transmisión se denomina opacidad y corresponde al valor recíproco de
ésta, es decir Io/It. Al aplicar logaritmos se obtiene que:
29
El logaritmo de la opacidad se denomina absorción o extinción. Cuando los términos Io e
It se emplean en el sentido que se les dio al definir la transmitancia este cuociente se
denomina absorbancia (A), de modo que:
A = εlc
La ecuación muestra que la absorbancia es directamente proporcional al camino recorrido
por la luz (l = constante) y a la concentración de la solución, y que además depende de
una constante (ε) que es característica para cada sustancia a una longitud de onda
determinada. De esto se deduce que la absorbancia de la solución dependerá sólo de su
concentración. Este principio permite determinar la concentración de una sustancia en
solución por medio de la fotometría.
Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorción de luz por
una solución de un compuesto de concentración desconocida, con la de una solución de
la misma sustancia cuya concentración se conoce; a esta última se le denomina solución
estándar o patrón. Si el compuesto cuya concentración se desea medir absorbe la luz
visible, las soluciones serán coloreadas y el método se denominará colorimétrico. Los
compuestos que no absorben en el espectro visible pueden hacerse reaccionar para
generar un compuesto coloreado.
La absorbancia de una solución es la resultante del la luz absorbida por el soluto más la
absorbida por el solvente. Para poder medir sólo la absorbancia del compuesto cuya
concentración se desea conocer, es necesario descartar la absorbancia de las otras
sustancias presentes en la solución (solvente, reactivos, etc.); por lo tanto, en todo
método espectrofotométrico es imprescindible hacer una mezcla que contenga todos los
componentes de la solución excepto aquel cuya concentración se desea medir; ésta se
denomina blanco de la reacción, y su absorbancia debe restarse a las muestras problema
y a los patrones.
Como se indicó antes, la relación entre la absorbancia de una solución y la concentración
del soluto que absorbe queda descrita por la Ley de Lambert-Beer, que establece una
proporcionalidad directa entre ambas variables. Si esta proporcionalidad no se cumple,
éste método de medición no puede emplearse. Por tanto, es indispensable conocer la
sensibilidad del método al trabajar con cualquier procedimiento espectrofotométrico,
determinando el intervalo de concentraciones en el cual se cumple la Ley de LambertBeer.
Cuando se determina la concentración de un compuesto en solución mediante
espectrofotometría es indispensable mantener constante el paso de luz para lo cual se
usan tubos especiales (cubetas) exactamente calibrados. Generalmente, se usan cubetas
de 1cm de paso de luz de modo que en estas condiciones la absorbancia queda
determinada por ε y la concentración del compuesto (c). Lo anterior significa que para
calcular la concentración debemos conocer el valor de A y de ε. La forma más exacta para
determinar la concentración de una solución problema es medir su absorbancia e
interpolar la concentración correspondiente en la curva de calibración.
30
Experimento 1: Determinar la actividad de la enzima β-galactosidasa
Materiales
Amortiguador fosfato de sodio pH 7,2
o-nitrofenil-β-galactósido (ONFG)
Carbonato de sodio
β-galactosidasa
0,1 M
0,01 M
1,0 M
Procedimiento Experimental
1. Coloque en un tubo de ensayo 0.5 ml de la solución amortiguadora, 0,2 ml de la
enzima y 0,6 ml de agua. Mezcle, equilibre los tubos a la temperatura ambiente e inicie
la reacción agregando 0,2 ml de sustrato. Anote el tiempo. Incube simultáneamente un
blanco de sustrato (todos los componentes menos el sustrato) y un blanco de enzima
(todos los componentes menos la enzima). Incube los tubos durante el tiempo que le
permita obtener una coloración amarilla visible en el tubo con el sistema completo (5 –
10 minutos). Todos los tubos deben tener el mismo tiempo de incubación.
2. Al finalizar el tiempo de incubación detenga la reacción agregando 0,3 ml de solución
de carbonato de sodio y agitando inmediatamente los tubos.
3. Complete con agua (1,2 ml) hasta un volumen de 3 ml y mida la absorbancia en el
espectrofotómetro a una longitud de onda de 380 nm.
Expresión de resultados
Distribuya en una tabla los tubos usados, los componentes de cada uno y sus respectivos
valores de absorbancia.
Experimento 2: Efecto del pH sobre la actividad de la enzima β-galactosidasa
Materiales
Amortiguador fosfato de sodio pH6,5
Amortiguador fosfato de sodio pH 7,5
Amortiguador acetato de sodio pH 4,8
Amortiguador Tris pH pH 9,0
o-nitrofenil-β-galactósido (ONFG)
Carbonato de sodio
β-galactosidasa
31
0,2 M
0,2 M
0,2 M
0,2 M
0,01 M
1,0 M
Procedimiento Experimental
1. Disponga una serie de 4 tubos de ensayo con los componentes que indica la tabla.
Tubo
Amortiguador
(ml)
pH
H 2O
(ml)
Sustrato 10 mM
(ml)
Enzima
(ml)
1
2
3
4
Acetato
Fosfato
Fosfato
Tris
4,8
6,5
7,5
9,0
0,6
0,6
0,6
0,6
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2 ml
0,2 ml
0,2 ml
0,2 ml
0,5
0,5
0,5
0,5
A 380 nm
2. Agregue todos los componentes del sistema menos la enzima. Agite. Inicie la reacción
agregando la enzima a intervalos de tiempo de 1 min. Incube todos los tubos durante 10
minutos (todos los tubos deben tener el mismo tiempo de incubación) y detenga la
reacción agregando 0,3 ml de la solución de carbonato de sodio, agitando
inmediatamente los tubos.
3. Complete con agua (1,2 ml) hasta un volumen de 3 ml y mida la absorbancia en el
espectrofotómetro a una longitud de onda de 380 nm.
Expresión de resultados
Distribuya en una tabla los tubos usados, los componentes de cada uno y sus respectivos
valores de absorbancia. Haga un gráfico de barras que muestre la actividad de la enzima
(A 380 nm) en función del pH del medio.
Experimento 3: Efecto de la temperatura sobre la actividad de la β –galactosidasa.
Materiales
Amortiguador fosfato de sodio pH 7,5
o-nitrofenil-β-galactósido (ONFG)
Carbonato de sodio
β-galactosidasa
0,1 M
0,01 M
1,0 M
Procedimiento Experimental
1. Disponga una serie de 4 tubos de ensayo con los componentes que indica la tabla a
excepción del sustrato, y en las condiciones de temperatura que se obtengan.
Tubo
1
2
3
4
Fosfato
pH7,5 (ml)
Temperatura
obtenida
0,5
0,5
0,5
0,5
Agua con hielo 0 -7 º
Ambiente
25- 28º
Baño
40 º
Termo
70 - 80 º
(º C)
H 2O
(ml)
Sustrato 10 mM
(ml)
Enzima
(ml)
0,6
0,6
0,6
0,6
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2 ml
0,2 ml
0,2 ml
0,2 ml
32
A 380 nm
2. Preincube cada tubo durante 2 - 3 minutos, con todos los componentes menos el
sustrato, a cada una de las temperaturas indicadas. Inicie la reacción agregando el
sustrato e incube durante 10 minutos (todos los tubos deben tener el mismo tiempo de
incubación)
3. Detenga la reacción agregando 0,3 ml de la solución de carbonato de sodio, agitando
inmediatamente los tubos.
4. Complete con agua (1,2 ml) hasta un volumen de 3 ml y mida la absorbancia de todos
los tubos en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 380 nm, y a las demás
longitudes de onda que tiene el espectrofotómetro.
Expresión de resultados
Grafique todos sus resultados (una curva para cada longitud de onda) en un gráfico de
actividad enzimática (absorbancia) versus temperatura.
Experimento 4: Efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad de la β –
galactosidasa.
Procedimiento Experimental
1. Disponga una serie de 4 tubos de ensayo. Coloque todos los componentes del sistema
enzimático, como se indica en la tabla, excepto la enzima. Mezcle, equilibre a la
temperatura de incubación e inicie la reacción agregando los ml de enzima que
corresponde a cada tubo. Mezcle inmediatamente e incube durante 10 minutos a
temperatura ambiente.
Tubo
Fosfato
pH 7,5 (ml)
H 2O
(ml)
Sustrato10 mM
(ml)
Enzima
(µL)
1
2
3
4
0,5
0,5
0,5
0,5
0,75
0,7
0,6
0,4
0,2
0,2
0,2
0,2
50
100
200
400
A 380 nm
2. Detenga la reacción agregando 0,3 ml de la solución de carbonato de sodio, agitando
inmediatamente los tubos.
3. Complete con agua (1,2 ml) hasta un volumen de 3 ml y mida la absorbancia en el
espectrofotómetro a una longitud de onda de 380 nm.
Expresión de resultados
Grafique la actividad de la enzima (absorbancia) en función de la cantidad (uL) de enzima.
33
Experimento 5: Efecto de de un inhibidor (lactosa) sobre la actividad de la β –
galactosidasa.
Procedimiento Experimental
1. Disponga una serie de 6 tubos de ensayo con los componentes que indica la tabla.
Coloque todos los componentes del sistema enzimático, excepto la enzima.
2. Mezcle, equilibre a la temperatura de incubación e inicie la reacción agregando los
ml de enzima que corresponde a cada tubo. Mezcle inmediatamente e incube
durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Tubo
Fosfato
H 2O
pH
7,5 (ml)
(ml)
1
2
3
4
5
6
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
Sustrato 2 mM
(ml)
Lactosa 50 mM
(µL)
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0
100
200
300
400
500
Enzima
(ml)
A 380 nm
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
3. Detenga la reacción agregando 0,3 ml de la solución de carbonato de sodio, agitando
inmediatamente los tubos.
4. Complete con agua (1,2 ml) hasta un volumen de 3 ml y mida la absorbancia en el
espectrofotómetro a una longitud de onda de 380 nm.
Expresión de resultados
Grafique la actividad de la enzima (absorbancia) en función de la cantidad (uL) de
inhibidor.
34
35