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Cátedra de Quimica Biológica
Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales
Universidad Nacional de Córdoba
DOCENTES
Dra María Angélica Perillo (Prof. Titular, Inv.Independiente CONICET))
Dr. Daniel A. García JTP (JTP, Inv.Adjunto CONICET)
Dr. Raúl H. Marín (JTP, Inv.Adjunto CONICET)
Dra. Julieta María Sanchez (JTP, Becaria postdoctoral CONICET)
Biól. Anahi del V. Turina (JTP, Becaria doctoral CONICET)
Biól. Eduardo M. Clop (Becario doctoral CONICET)
Biol. Jackelyn M. Kembro (Becaria doctoral CONICET)
Biol. Benjamín Caruso (Becario doctoral CONICET)
Dr. Martín Theumer (Becario postdoctoral CONICET)
Biol. Mariela E. Sánchez (Becaria Doctoral SeCyT-UNC)
Biol.Pedro D.Clop (Becario Foncyt)
Biol.Gabriela Reiner (Becaria Doctoral CONICET).
Biol. Leonardo Fruttero (Adscripto)
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PROGRAMA ANALÍTICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA.
1. La lógica molecular de la vida
Diversidad biológica y unidad bioquímica. Generalidades sobre metabolismo celular. Obtención,
almacenamiento, liberación y utilización de la energía. Ubicación subcelular de la actividad metabólica;
fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial. Macromoléculas y ensambles
supramoleculares: caracterización; papel del agua, efecto hidrofóbico e importancia de las interacciones
débiles (puente de hidrógeno, van del Waals) en su estructura y función. Propiedades coligativas de
disoluciones acuosas. Superpoblación molecular: efectos sobre la actividad del agua y sobre la actividad
y difusión de los solutos.
2. Evolución Bioquímica
Composición química de la materia viva. Evolución prebiótica. Ribozimas. Evolución: desde la
información unidimensional de la secuencia (ADN) a la información tridimensional de la función
(proteína). Transferencia de información biológica a nivel molecular (ADN- ARN- Proteína; gradientes de
carga y de materia) y de la dinámica estructural (cambios conformacionales en proteínas, catástrofe
microtubular, el citoplama celular como una matriz de percolación de dimensión fractal). Evolución de la
estructura: molécula, agregados supramoleculares, compartamentalización, aparición de gradientes y de
bombas. Mecanismos de transducción de energía y de señales. Evolución de la complejidad. Patrones
bioquímicos: metabolones.
3. Estructura y función de las Proteínas
Equilibrios ácido-base en aminoácidos. Unión peptídica. Proteínas: estructura primaria, secundaria (αhélice, hoja β, giros, bucles), terciaria (motivos: patrones de clasificación estructural) y cuaternaria.
Plegamiento: cooperatividad, estabilización progresiva. Desplegamiento. Cambios conformacionales y
actividad. Aislamiento, purificación y fraccionamiento de proteínas (precipitación selectiva,
cromatografías de intercambio iónico, filtración molecular y de afinidad). Electroforésis: determinación de
la masa molecular, número de protómeros y localización de puentes disulfuro. Ultracentrifugación.
Secuenciación de proteínas. MALDI-TOFF. Inmunodetección y cuantificación, ELISA, “Western blot”.
Síntesis en fase sólida. Determinación de estructura tridimensional: RMN (unidimensional y NOESY),
dicroismo circular, fluorescencia, difracción de Rayos X. Cuantificación de proteínas.
4. Ácidos nucleicos y flujo de información genética
Estructura química de los ácidos nucleicos. Bases púricas y pirimídicas. Nucleósidos y nucleótidos:
nomenclatura. Acido desoxirribonucleico (ADN): estructura primaria, secundaria y terciaria. Estructura de
los ácidos ribonucleicos: mensajero(ARNm), de transferencia(ARNt) y ribosomal (ARNr). Duplicación del
ADN, Transcripción de ADN en ARN, Procesamiento del RNA, intrones y exones, Código genético.
Virus: tipos ADN-virus y ARN-virus de uno y de dos filamentos. replicación. Virus oncogénicos. El
bacteriofago λ: mecanismo de integración al genoma de la celula huesped. Oncogenes. Viroides.
Plásmidos.
5. Investigación en genética
Ingeniería genética: aplicaciones y obtención del gen: por corte del ADN con endonucleasas de
restricción, por síntesis orgánica en fase sólida y a partir del ARNm. Secuenciación por interrupción
controlada de la replicación. Amplificación: PCR. Tecnología del DNA recombinante: Unión de
segmentos de ADN de distinto origen: método de las colas homopoliméricas. Vectores: plásmidos
semisintéticos y derivados del bacteriofago λ: características deseables. Introducción del vector a la
célula huésped (transformación). Selección del clon con el ADN recombinante y clonado. Manipulación
de genes de eucariotas, bibliotecas de genes a partir de ARNm. Niveles de expresión génica, chips de
genes (microarrays). Animales transgénicos. Mutagénesis dirigida para producir proteínas nuevas.
6. Investigación en evolución
Relaciones evolutivas a partir de secuencias de proteínas. Homologías de secuencias: secuencias
alineadas, significación estadística (“shuffling”), matriz de sustitución, bancos de datos para detectar
secuencias homólogas. Estudio de estructuras tridimensionales. Gráfico autodiagonal (autoalineamiento)
para detectar secuencias repetidas. Relación estructura/función: evolución divergente y convergente.
Construcción de árboles evolutivos. Evolución molecular en el laboratorio.
7. Bioenergética
Estados de equilibrio y estados estacionarios. Entropía y vida. Bioenergética: cambios de energía libre
de una reacción. Relación entre la constante de equilibrio y el cambio de energía libre estandar. Cálculo
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del cambio de energía libre estandar y el cambio de energía libre de una reacción redox. Reacciones
acopladas. Energética del transporte activo. Compuestos con alto potencial de transferencia de fosfato:
factores que influyen en el cambio de energía libre estandar durante la hidrólisis.
8. Enzimología
Enzimas clasificación y nomenclatura. Ribozimas. Cofactores. Coenzimas: definición: estructura química
y clasificación. Coenzimas de oxido-reducción: nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), nicotinamida
adenina dinucleótido fosfato (NADP), flavina adenina dinucleótido (FAD), coenzima Q (CoQ) y ácido
lipoico. Coenzimas que transfieren grupos fosfato; que transfieren grupos acilo: Coenzima A (Co A). Que
transfieren grupros glicosilo. Que intervienen en reacciones de decarboxilación: piridoxal fosfato y
biotina. Otras coenzimas. Vitaminas hidrosolubles que forman parte de coenzimas. Vitaminas
liposolubles, estructura y función. Estrategias catalíticas.
9. Cinética Enzimática
Mecanismo de la actividad enzimática. Cinética. Reacciones monosustrato: el modelo de MichaelisMenten; determinación de la Km y Vm por el método deLineweaver-Burk. Activadores e inhibidores.
Tipos de inhibición. Análogos del estado de transición. Anticuerpos catalíticos (reconocen el estado de
transición). Reacciones bisustrato: de desplazamiento simple y desplazamiento doble. Estrategias
reguladoras: enzimas alostéricas (cinética y modelos), isozimas, modificación covalente, escisiones
proteolíticas.
10. Glúcidos y Lípidos
Glúcidos: Monosacáridos, carbohidratos complejos, glicoproteínas, lectinas.
Lípidos: lípidos de membranas, balance hidrofílico-hidrofóbico, estructuras de autoagregación.
11. Biomembranas
Estructura y función de la membrana biológica. El modelo del mosaico fluido. Membranas internas de
células eucariotas. Membranas de células procariotas. Tipos de movimientos de las moléculas
constituyentes. Difusión (FRAP, SPT). Fluidez (anisotropía) y curvatura. Efectos de factores físicoquímicos y de la composición. Proteínas de membrana: extrínsecas, ancladas, intrínsecas. Predicción de
secuencias transmembrana a partir de la estructura primaria. Secuencias señalizadotas de
direccionamiento de proteínas. Fusión de membranas.
12. Transporte
Difusión: Difusión facilitada. Transporte activo.:Las bombas de Na+, K+ y Ca2+. Cotransporte y
contratransporte. Antibióticos de transporte. Medidas de conductancia: platch clamp. Sinapsis.
Potenciales de acción. Canales activados por voltaje. Canales activados por ligando. Nexus o uniones
íntimas.
13. Transducción de la información
Receptores de superficie. Curvas de saturación. Receptores ionotrópicos. Receptores 7TM. Segundos
mensajeros. Conversación cruzada. Sistema nervioso. Ultraestructura de la sinapsis. Teoría química de
la transmisión nerviosa. El potencial de membrana. Liberación, recaptación y degradación de los
neurotransmisores. Unión mioneural. El receptor nicotínico de acetilcolina: inhibidores. La acetil
coilinesterasa: inhibidores. Receptores de otros neurotransmisores.
14. Metabolismo
Metabolismo: visión de conjunto. Reacciones aclopladas. El ATP como divisa universal de energía libre.
Potencial de transferencia de grupos fosfato. Potencial de fosforilación. Motivos recurrentes en las vías
metabólicas. Transportadores activados. Evolución de las vías metabólicas.
Oxidaciones biológicas. Enzimas de oxido-reducción: Clasificación y ejemplos. Metabolismo del
superóxido. Glucólisis : reacciones, consumo y generación de ATP a nivel de sustrato. Generación de
NADH. Balance energético. Destinos del piruvato: formación de acetil-CoA, de etanol y de lactato.
Entrada de fructosa y galactosa. Gluconeogénesis : reacciones. Ciclo de Cori: rendimiento de ATP del
lactato.
15. Ciclo de Krebs
Ciclo de Krebs o de los ácidos tricarboxílicos (TCA): reacciones, formación de coenzimas reducida y ATP
a nivel de sustrato. Acoplamiento de las reacciones. Interacción de los metabolismos de glúcidos , lípidos
y proteinas. rendimiento de ATP en la oxidación total de glucosa. Ciclo del glioxalato.
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16. Fosforilación oxidativa.
Fosforilación oxidativa. Ubicación submitocondrial. Cadena Respiratoria Componentes. Niveles de
formación de ATP. La hipótesis quimio-osmótica. Motores moleculares: ATPsintasa. Bioenergética.
Regulación de la fosforilación oxidativa. Inhibidores.
17. Metabolismo de glúcidos
Via de las pentosas-fosfato. Biosíntesis del ácido ascórbico. Degradación intracelular del almidón y del
glucógeno: reacciones. Digestión. Interconversión de hexosas. Biosíntesis del glucógeno, almidón y
celulosa: reacciones. Regulación del metabolismo del glucógeno via AMPc. Biosíntesis de disacáridos.
18. Fotosíntesis
Fotosíntesis: ecuación global. Ubicación del proceso en el cloroplasto, pigmentos. Reacción de Hill. Las
reacciones luminosas: fotosistemas I y II. Cadena transportadora de electrones. Formación de ATP y
NADPH. Bioenergética. Mecanismo de formación de ATP. Reacciones enzimáticas: ciclo de Calvin.
Eficiencia de la fotosíntesis.
19. Metabolismo de lípidos
Biosíntesis y degradación de los triglicéridos, glicerofosfolípidos y esfingolípidos. Biosíntesis del
colesterol a partir de acetato. Formación de colecalciferol y ácidos biliares
Metabolismo de los ácidos grasos, degradación por  -oxidación de ácidos grasos saturados de cadena
par e impar y de ácidos grasos insaturados. Balance energético.  y oxidación. Ubicación subcelular.
Biosíntesis: sistema del citosol, reacciones. Sistemas microsomal y mitocondrial.
20. Metabolismo de amino ácidos
Metabolismo de los aminoácidos. Ciclo de fijación del nitrógeno. Degradación de los aminoácidos:
reacciones de tipo general: desaminación por transaminación, desaminación oxidativa, desaminación no
oxidativa y descarboxilación, ejemplos. Transporte del amoníaco. Ciclo de la urea: reacciones. Los
aminoácidos como precursores de otras biomoléculas: metabolismo del triptofano, fenilalanina, tirosina,
histidina y glutamato. Glutatión. Porfirinas. Biosíntesis del Hem. Hemoglobinas A, F y A2. Derivados de la
hemoglobina: oxihemoglobina, carboxihemoglobina, metahemoglobina y carbohemoglobina.
Degradadción de la hemoglobina. Formación de pigmentos biliares.
21. Metabolismo de ácidos nucleicos
Síntesis de novo de pirimidinas. Biosíntesis de bases púricas y desoxiribonucleótidos. Síntesis de NAD+,
FAD, Coenzima A.
Uratos. Replicación, recombinación y reparación del DNA, polimerasas,
topoisomerasas y helicasas. Fragmentos de Okazaki. Síntesis de DNA en eucariotas, ciclo celular,
telomerasa. Síntesis y maduración del RNA. El ribosoma como estructura desupramolecular.
22. Metabolismo de proteínas
Biosíntesis de proteínas. Codigo genético: características. Formación de aminoacil-ARNt. Mecanismo de
la síntesis de proteínas: etapas de iniciación, elongación y terminación. Modificaciones posttraduccionales. Antibióticos inhibidores. Endo y Exopeptidasas. Tipos de mutaciones.
23. Integración metabólica y control de la expresión génica
Regulación metabólica. Control de la expresión genética en procariotas. Ooperón lac y operón trp:
inducción y represión. Control en eucariotas. Regulación por modificación de la actividad de la enzima:
activación por precursor e inhibición por producto final. Regulación hormonal. Hormonas de mamíferos:
bases moleculares del mecanismo de acción. Receptores de hormonas de estructura esteroide,
peptídica y derivada de aminoácidos. Endocitocis y reciclo de los receptores. Hormonas vegetales y de
insectos.
24. Inmunoquímica
Inmunoquímica. Inducción de anticuerpos específicos. La unión Ag-Ac. Heterogeneidad de los
anticuerpos. Estructura química de las inmunoglobulinas. Teorías sobre la formación de anticuerpos.
25. Bioquímica de sistemas sensoriales
Olfato, gusto, visión, audición y tacto, aspectos bioquímicos. Receptores y mecanismos de transducción
de señales involucrados.
26. Motores moleculares
NTPasas de lazo P. Mecanismo de la contracción muscular, asociación cíclica de la actina y miosina.
Microtúbulos, tubulina, quinesina y dineína. Movimiento flagelar en bacterias, motor rotativo; quimiotaxis.
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PROGRAMA SINTÉTICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA .
1. La lógica molecular de la vida
2. Evolución Bioquímica
3. Estructura y función de proteínas
4. Ácidos nucleicos y flujo de información genética
5. Investigación en genética
6. Investigación en evolución
7. Bioenergética
8. Enzimología
9. Cinética Enzimática
10. Glúcidos y lípidos
11. Biomembranas
12. Transporte
13. Transducción de la información
14. Metabolismo
15. Ciclo de Krebs
16. Fosforilación oxidativa
17. Metabolismo de glúcidos
18. Fotosíntesis
19. Metabolismo de lípidos
20. Metabolismo de amino ácidos
21. Metabolismo de ácidos nucleicos
22. Metabolismo de proteínas
23. Integración metabólica y control de la expresión génica
24. Inmunoquímica
25. Bioquímica de sistemas sensoriales
26. Motores moleculares
TRABAJOS PRACTICOS
TP 1 y 2. Espectrofotometría. Purificación, cuantificación y análisis estructural de proteínas
TP 3, 4 y 5. Cinética Enzimática
TP 6 y 7. Fotosíntesis. Mecanismos de transducción de energía
OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA.
Al terminar el curso el estudiante deberá:
• Adquirir una clara comprensión del metabolismo celular a la luz de conceptos de:
- Mecanismos de transducción de energía y de información.
- Termodinámica, cinética y catálisis de reacciones bioquímicas
- Importancia de la compartamentalización en la generación de gradientes químicos y
electroquímicos.
- Modulación dinámica de la estructura y función de biomembranas, proteínas y de la organización
compleja del citoplasma
- Vías metabólicas fundamentales y su integración
- Patrones bioquímicos y su evolución
• Desarrollar del pensamiento crítico.
• Adquirir destreza en el uso de metologías del laboratorio bioquímico
BIBLIOGRAFIA
Bioquímica General
- Blanco, A. Química biológica, Ed.El Ateneo, 2006.
- Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996*.
- Harper, H.A, Manual de Química Fisiológica. Ed. El manual moderno 1980*
- Horton, R.H, Moran, L.A., Ochs, R.S., Rawn, J.D., Scrimgeour, K.G. Bioquímica. Ed.Pentice Hall,
Hispanoamericana, SA. Mexico, 1995, 1999*.
- Lehninger, Albert L.. Principios de bioquímica . 2ºEd., Omega, Barcelona, 2001.
- Nelson, David L.. Lehninger : principios de bioquímica .3º Ed., Omega, Barcelona, 2001.
6
- Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, 5º Ed., Reverté SA, España, 2003.
- Torres, H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioquímica General. Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983*.
- Walker, J. M.. Biología molecular y biotecnología .2º Ed. Acribia, Zaragoza, 1997.
Problemas
- Esteban J.M. y Cavanillas J.M.. Problemas de Química. Ed. Alhambra. 4a. España. 1976.
- Holme, David J. . Resolución de problemas de bioquímica analítica, Acribia, Zaragoza, 1996.
- Segel I.J. Cálculos en Bioquímica. Acribia. Saragoza. España. 1972.
Bibliografía de consulta sobre temas específicos
Química General, Química Orgánica y Química-Física
- Atkins, P.N y M.J Clugston. Principios de Fisicoquímica. 1986. Addisson-Wesley. Ed. Iberoamericana.
México.
- Atkins, P.W. Fisicoquimica. Ed. Addison-Wesley Iberoamericana, S.A. Wilmington, Delaware,
USA.1991
- Brown, T. L., LeMay, H. E. y Bursten, B.E.. Química, La Ciencia Central. Prentice-Hall
Hispanoamericana, S.A., Quinta Edición. 1993.
- Morris, J.G. Fisicoquímica para biólogos. Ed. Reverté. Barcelona. 2002.
- Whitten, W.K y K.D Gailey. Química General. Ed. Interamericana. México. 1986.
Biofísica-Química y Biología Celular
- Alberts, B. . Biología molecular de la célula , 3º Ed., Omega, Barcelona, 1996-2002.
- De Robertis, E.M.F.. Biología celular y molecular de Eduardo D. P. De Robertis .12º Ed., El Ateneo,
Buenos Aires, 1998.
- Estrada Cerqueda, C.. Cinética del transporte a través de membranas, Ed. Blume, Madrid, 1976.
- Grigera, J.R. Introducción a la biofísica del agua, Eudeba, Buenos Aires, 1976.
- Maggio B. Introducción a la biofísico-química. Ed.Gonzalez Truccone. Córdoba, Argentina. 1987*.
- Vicente Córdoba, C.. Biofísica, Ed.Síntesis, Madrid, 1992
Cinética enzimática
- Segel I.H.. Enzyme kinetics. Behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme
systems. Wiley Classics Library Editions. Wiley Intersci.Pub., New York. 1993*.
- Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimología. Ed Aguilar. 1967.
- Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan vol. XXXI
Fotosíntesis
- Andreo C., Vallejos R. Fotosíntesis. Serie Biología, monografía no 30 OEA, 1984.
- Hall D.O., Rao K. Fotosíntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977.
- Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977.
Análisis Bioquímico e Instrumental
- Gore M.G.. Spectrophotometry and Spectrofluorometry A practical Approach. Ed. Oxford University
Press. Inc. NY. USA. 2000.
- Henry RJ, Cannon D.C. y Winkelman J.W. Química Clínica: Bases y Técnicas. Tomo I. 2a Ed. Jims.
Barcelona. España.1980*.
- Willard H.H. Merritt Jr. .L, y Dean J.A.. Métodos Instrumentales de Análisis. Ed. CECSA. México.
1974.
- Skoog D.A. y West D.M.. Análisis Instrumental. Ed.Interamericana. México. 1975.
- D'Ocon Navaza, María Carmen. Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico, Paraninfo, Madrid,
1999.
Bibliografía especializada
- Aon M.A. and Cortassa S. Dynamic Biological Organization. Fundamentals As Applied To Cellular
Systems. Chapman and Hall, London, UK. 1997*.
- Daune, M.. Molecular Biophysics. Structures in motion, Oxford University Press, Oxford. 1999*.
- Makishima, Shoji. Pattern dynamics : a theory of self-organization, Ed. Kodansha Scientific, Tokio,
2001.
La bibliografía citada está disponible en la Biblioteca “Ricardo Lutti" (Centro) de la FCEFyN, UNC.
* disponibles en la Cátedra de Química Biológica.
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CRONOGRAMA
Semana
CLASES TEÓRICAS:
Comienzan: 14 de marzo Finalizan: 23 de junio
TRABAJOS
PRÁCTICOS
CLASES TEÓRICAS
Aulas 219 o 218
Miércoles
15
15
12 -14 hs
Aula 219
TEMA
Viernes
10-12 hs
Aula 218
TEMA
1
14/03/06
La lógica molecular de la
vida
16/03/06
Metabolismo.
Evolución Bioquímica
2
21/03/06
Proteínas
23/03/06
Ácidos nucleicos
3
28/03/06
Investigación en genética
30/03/06
Investigación en
evolución
4
04/04/06
Bioenergética
06/04/06
Feriado (Semana
Santa)
5
11/04/06
Cinética Enzimática
13/04/06
Enzimología
6
18/04/06
Glúcidos
20/04/06
7
25/04/06
Biomembranas
27/04/06
8
02/05/06
Transducción de señales
04/05/06
Glicólisis
Gluconeogénesis
Glucógenolisis
9
9/05/06
Interconversión de
hexosas; Vía de las
pentosas
11/05/06
PRIMER EXAMEN
PARCIAL
10
16/05/06
Ciclo de Krebs
Cadena Respiratoria
18/05/06
Fotosíntesis
11
23/05/06
Metabolismo de lípidos
25/05/06
FERIADO
12
30/05/06
Metabolismo de lípidos
01/06/06
13
06/06/06
Metabolismo de a.a.
08/06/06
14
13/06/06
Biosíntesis de proteínas
15/06/06
Lípidos
Laboratorio 13
o
o
1 Semana
2 Semana
Comisiones Comisiones
1-3-5
2-4-6
TP 1
Espectrofoto
metría
TP 1
Espectrofoto
metría
TP 2
Proteínas *
TP2
Proteínas
TP3
Cinética I
Transporte
Metabolismo de
lípidos
Metabolismo de
ácidos nucleicos
TP3
Cinética I
TP4
Cinética II *
TP4
Cinética II
TP5
Cinética III y
Seminario 1
TP5
Cinética III y
Seminario 1
TP6
Fotosíntesis
TP6
Fotosíntesis
TP7
Integración metabólica
Transducción
y control de la
de energía y
expression génica
Seminario 2
15
20/06/06
Inmunoquímica
22/06/06
Bioquímica de
sistemas sensoriales
16
27/06/06
SEGUNDO EXAMEN
PARCIAL
29/06/06
RECUPERATORIO
TP
04/07/07
Recuperatorio Ex.Parciales
TP7
Transducción
de energía y
Seminario 2
* Las Comisiones 1, 3 y 5 Recuperan TP.
Comisión 3 recupera TP Proteínas (anotarse con anterioridad en otra Comisión)
Comisión 1recupera TP Cinética II (24/4, 8-12 hs Laboratorio 12)
Comisión 5 recupera TP Cinética II (anotarse con anterioridad en otra Comisión)
CONDICIONES PARA EL CURSADO
Correlativas regularizadas: Química Orgánica y Física I.
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ASISTENCIA:
Clases Teóricas: no obligatoria
Trabajos Prácticos: 80% obligatoria
ACTIVIDADES
Clases teóricas:
Exposición.
Discusión de problemas teóricos.
Trabajos prácticos:
Resolución de problemas.
Trabajos de laboratorio.
Seminarios de discusión de trabajos científicos.
EVALUACIONES
I. Trabajos Prácticos:
a) Evaluación oral durante el desarrollo del TP. Se tendrá en cuenta: desempeño, destreza, atención, participación,
puntualidad, y la presentación de Trabajos Científicos (cuando corresponda).
b) Una evaluación escrita al final de cada TP.
II Exámenes Parciales:
Se tomarán 2 (dos) exámenes parciales sobre temas desarrollados en clases teóricas y prácticas.
CONDICIONES PARA LA REGULARIZACIÓN
Desempeñarse satisfactoriamente durante los TP (item a) y aprobar la presentación del 80% de los Trabajos Científicos .
Aprobar 6 de las 7 evaluaciones escritas de los Trabajos Prácticos (item b).
CONDICIONES PARA LA PROMOCIÓN:
Correlativas Aprobadas (al comenzar el cursado): Química Orgánica y Física I
Aprobar el 80% de los TP
Aprobar cada uno de los Ex.Parciales con 4 puntos, como mínimo, y alcanzar un promedio de 7 puntos entre ambos.
RECUPERATORIOS (al final del cuatrimestre)
Se podrá recuperar:
- Un TP que haya resultado reprobado, para alcanzar las condiciones indicadas más arriba.
En caso de inasistencia, podrá recuperarse el TP, sólo por causa debidamente justificada, en alguna Comisión donde el
mismo aún no se hubiera dictado. En este caso no habrá recuperatorio al final del cuatrimestre..
- Un examen parcial (por cualquier razón: inasistencia, reprobado o para aumentar nota).
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TRABAJO PRACTICO Nº 1
ESPECTROFOTOMETRÍA
Los problemas y la guía de estudio deberán ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En
caso de necesitar aclarar dudas los docentes estrán disponibles en sus horarios de consulta, en la cátedra.
Los alumnos serán evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante el desarrollo de la experiencia
práctica (evaluación oral), sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP. Deberán concurrir con
guardapolvo a los TP.
OBJETIVOS:
- Conocer los fundamentos teóricos y las aplicaciones de la espectrofotometría.
- Comprender las propiedades que deben reunir los métodos experimentales de análisis.
- Adquirir destreza en el manejo del espectrofotómetro.
- Valorar la importancia del dominio de técnicas auxiliares para poderlas aplicar con criterio ante los problemas
planteados.
TEMAS PARA REPASAR:
-
Disoluciones.
Estequiometría.
Luz. Teoría ondulatoria. Teoría cuántica.
Ondas electromagnéticas. longitud, frecuencia,
período de una onda y unidades en que se miden.
Relación entre velocidad, longitud de onda y
frecuencia. Energía de ondas electromagnéticas.
PROPIEDADES DE LOS MÉTODOS QUÍMICOS DE ANÁLISIS
Exactitud: es el grado en que la medida promedio se aproxima al valor real. La determinación de la
exactitud se logra comparando los resultados observados con el valor real. Expresa la corrección de una
medición.
Precisión: es el error debido al azar, la variación de los resultados obtenidos con una técnica cuando la
misma muestra se analiza repetidamente. Expresa la reproducibilidad de una medición. Cuanto menor
sea la variación observada, mayor es la precisión.
Sensibilidad: es la variación mínima en la cantidad de un compuesto que puede ser detectada, o la
mínima cantidad significativamente diferente del blanco.
Especificidad: es la propiedad del método de medir sólo la especie química en estudio, sin la
interferencia de otras que puedan estar presentes. Todo método exacto es preciso, pero un método
preciso no es necesariamente exacto.
ERRORES EN LAS MEDICIONES DE LABORATORIO
Error: es la diferencia entre el valor observado y el real, es decir, la combinación del error sistemático y
el error debido a la falta de precisión. Los errores pueden dividirse en dos clases: 1) errores
determinados, 2) errores indeterminados.
Errores determinados: son aquellos cuya magnitud puede determinarse:
a) errores instrumentales y debidos a aparatos y reactivos: balanza y pesas, aparatos volumétricos,
material de vidrio calibrado, reactivos, etc.;
b) errores operativos: son de naturaleza física, asociados con manipulaciones en un análisis.
c) errores personales: errores operativos del analista.
d) errores del método: tienen origen en las propiedades químicas y fisicoquímicas del sistema analítico.
Errores indeterminados o aleatorios: son pequeñas fluctuaciones en los sucesivos valores de una
cantidad medida. No son evitables ni previsibles por parte del observador. Pueden tratarse por métodos
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estadísticos. Dada una cantidad de datos el analista puede estimar la incertidumbre introducida por
errores aleatoreos y concluir con respecto al efecto de esos errores en un resultado analítico.
FOTOCOLORIMETRIA
La fotocolorimetría es una técnica que permite medir la absorción de radiación electromagnética,
ultravioleta y visible de numerosas especies químicas inorgánicas y orgánicas, para su análisis cuali y
cuantitativo.
Las moléculas son capaces de absorber radiaciones electromagnéticas. Tanto la longitud de
onda de la radiación absorbida como la eficiencia con que se absorbe, dependen de:
•
•
la estructura de la molécula y
el medio en que se halla.
En el proceso de absorción de la radiación, un fotón incidente cede su energía a una molécula,
lo que da lugar a la excitación de la misma que pasa a un nivel de energía superior:
A
h.ν
A*
A = molécula absorbente
A* = molecula absorbente en estado de excitación energética.
h.ν = energía de un fotón
donde h= Constante de Planck y ν : frecuencia de radiación.
Los estados excitados de los átomos o moléculas son de vida media corta (10-9 s) y, en
consecuencia, la molécula en estado excitado vuelve rápidamente al estado fundamental. Comunmente,
la energía es liberada al medio como calor, pero en ciertos casos la especie química excitada puede
sufrir un cambio (reacción fotoquímica) o emitir parte de la energía absorbida como radiación
electromagnética de longitud de onda mayor a la incidente (fluorescencia o fosforescencia).
LEYES DE LA ABSORCION
Cuando la luz atraviesa una muestra, sólo una fracción de ella es transmitida. La proporción de
luz transmitida se denomina Transmitancia (T) y se calcula de la siguiente manera:
T = I / I0
Donde I = la intensidad de luz transmitida por la muestra
I0 = la intensidad de luz incidente
La transmitancia toma valores entre 0 – 1. También se expresa como porcentaje si se multiplica
por 100 y sus valores están en el rango de 0-100%:
%T = (I / I0 ) x 100
La relación (I / I0 ), también puede ser expresada como luz absorbida en lugar de luz transmitida.
En ese caso nos referimos a la Absorbancia (A) de una muestra.
La Absorbancia es adimensional, varía en el rango de 0 - ∞ y se define como:
A = log 1/T = log10 (I0 / I)
11
Por sustitución se comprueba que la absorbancia y el porcentaje de transmitancia están
relacionados mediante la siguiente expresión:
A = log (100 / %T)
A = 2 - log( % T)
LEY DE LAMBERT:
¨La fracción de luz absorbida por un medio transparente es independiente de la
intensidad de luz incidente, y cada capa sucesiva del medio, absorbe una fracción igual de la luz que
pasa a travez de él¨.
Esto lleva a un decaimiento exponencial de la intensidad de luz a lo largo del paso óptico
en la muestra, que puede ser expresado matemáticamente como sigue:
Log10 (I0/I) = A = K b
Donde b = la longitud del paso óptico de la cubeta de espectrofotometría y K es una constante del
medio, que fue descifrada por Beer.
LEY DE BEER:
¨La cantidad de luz absorbida es proporcional al número de moléculas de cromóforo que la
luz atraviesa¨.
La constante K, es proporcional a la concentración de cromóforo (c) : K = a c , donde a es
la absortividad o coeficiente de absorción, una propiedad del cromóforo en sí misma.
La absortividad a es una constante que depende de:
• la longitud de onda de la luz incidente,
• la identidad de la sustancia analizada y
• del medio en que ésta se encuentre (pH, solvente e interacción con otras sustancias)
La constante a representa la probabilidad de absorción a una longitud de onda determinada
La LEY DE LAMBER Y BEER queda resumida entonces, en la expresión:
Log10 (I0/I) = a c b
A=acb
Cuando el paso óptico está expresado en cm y la concentración en M, la absortividad se
-1
-1
denomina ¨coeficiente de extinción molar o absortividad molar¨ (ε), entonces sus unidades son M cm .
Cuando b=1 cm, la absorbancia se denomina Densidad óptica (DO)
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE SOLUTO EN UNA SOLUCIÓN
Dadas una disolución de concentración desconocida a la que llamaremos “problema” y otra
disolución de concentración conocida a la que llamaremos “testigo”, aplicando la ley de Lambert y Beer
a cada disolución se obtienen las siguientes expresiones:
Ap=a.b.cp
At=a.b.ct
Dado que el “problema” y el ”testigo” son disoluciones de una misma sustancia cuyos valores de
absorbancia se determinan a la misma λ , los valores de absortividad serán iguales. Además, dado que
se utiliza la misma cubeta para medir la A, los valores de b también serán iguales.
En consecuencia:
12
Dividiendo m.a.m.
a.b.cp
Ap/ At = __________
a.b.ct
podemos simplificar a y b, y al despejar queda:
cp=
Ap.ct
At
donde Ap= absorbancia del problema.
At= absorbancia del testigo.
cp = concentración del problema.
ct = concentración del testigo.
CURVA DE CALIBRACIÓN
Una curva de calibración es un gráfico de A o %T en función de la concentración de soluto; su
empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentración del
absorbente. En general se grafica A en función de la concentración (Fig.1a) pero, hay instrumentos que
sólo miden %T (Fig.1b). En éste caso, deben transformarse las lecturas de %T en valores de A,
mediante el empleo de la ecuación A = 2 - log( % T).
Alternativamente, puede trazarse el gráfico de %T en función de la concentración en papel
semilogarítmico (Fig.1c). De otro modo, resultaría difícil utilizando un número limitado de puntos
obtenidos experimentalmente, comprobar gráficamente si la lectura sigue o no la ley de Lambert y Beer .
Papel semilogarítmico
b
%T
A
Concentración (mg/ml)
c
%T
a
Concentración (mg/ml)
Concentración (mg/ml)
Fig.1: Curvas de Calibración
Por consideraciones del error fotométrico, debe procurarse que los puntos situados entre valores
de A de 0,1 y 1,0 (10% y 80% T) sean representados de la forma más exacta posible al trazar la gráfica.
Las escalas del sistema de registro del aparato son: lineal para %T y logarítmica para A: por
éste motivo, el error en las lecturas de %T es constante en toda la escala, lo cual no ocurre con la A. Sin
embargo, debido a que A y concentración se relacionan proporcionalmente, en la práctica se lee A.
En equipos con visores digitales, es posible trabajar con disoluciones con 0,1>A>1,0, como se indica
más arriba. En los equipos donde los valores de A se determinan de acuerdo a la posición de una aguja
que se mueve sobre una escala (galvanómetro), la aplicación de esta técnica se limita a muestras que
produzcan lecturas comprendidas entre 0,1 y 0,3, dado que en este rango de valores aún es posible
interpolar datos en la escala logarítmica. Valores menores pueden estar por debajo de la sensibilidad del
equipo y, a valores mayores, las menores divisiones de la escala son muy pequeñas y la apreciación de
las lecturas resulta poco precisa.
ESPECTRO DE ABSORCIÓN
Las soluciones absorben energía preferentemente en una ó más regiones del espectro
electromagnético, siendo la absorción inferior o nula en las demás regiones. Se denomina Espectro de
absorción a la representación gráfica de la probabilidad de absorción en función de la longitud de onda.
El espectro de absorción se determina midiendo la absorbancia a distintas longitudes de onda para
establecer la longitud de onda de máxima absorción (λ max).
En el siguiente ejemplo, la λ max es aproximadamente 420nm (indicada por la fecha).
13
0.20
Fig. 2. Espectro de Absorción
Absorbancia
0.15
0.10
0.05
0.00
300
λmax
350
400
450
500
Long onda (nm)
ESPECTROFOTÓMETRO
Las mediciones de absorbancia se realizan en un espectrofotómetro, que básicamente consta
de una fuente de luz, un monocromador para seleccionar la longitud de onda, una cubeta transparente
para contener la muestra, un detector de intensidad luminosa y un sistema de registro (Fig. 3).
Sistema de
Registro
Fig. 3. Esquema de un espectrofotómetro
MEDICION DE LA ABSORBANCIA
1) Si tenemos una solución coloreada de concentración desconocida, la denominamos tubo problema.
Podemos conocer su concentración midiendo la absorbancia en el fotocolorímetro o espectrofotómetro a
una longitud de onda apropiada.
2) Previamente a la lectura, el aparato es llevado a cero de absorbancia con un tubo que contiene
solvente sin la sustancia problema y se denomina blanco. Este tubo puede contener varias sustancias,
además de disolvente, a la misma concentración en que se encuentra en el tubo problema, excepto la
sustancia que se desea cuantificar. Por ej. si la sustancia coloreada problema se encuentra disuelta en
agua conteniendo NaCl al 1% e KOH al 2%, el tubo blanco contendrá NaCl al 1% e KOH al 2% en agua,
sin la sustancia en estudio. La finalidad de usar el tubo blanco es descontar la absorción de sustancias
que no sean específicamente la sustancia problema y así poder medir la absorbancia propia de la
sustancia en estudio.
3) Un tercer tubo que denominamos testigo corresponde a una solución de concentración conocida de
la sustancia en estudio. Se prepara disolviendo una cantidad conocida de soluto en un volumen conocido
de solvente conteniendo las mismas sustancias que la solución problema: por ej. NaCl al 1% e KOH al
2% para el caso que se está analizando. Se lee al fotocolorímetro, llevado previamente a cero de
absorbancia con el blanco, de la misma forma que se hizo con el tubo problema. Finalmente, la
14
concentración del tubo problema se puede calcular mediante la interpolación del valor de absorbancia en
una curva de calibración (para lo cual es necesario la preparación de varios tubos testigos) o mediante la
comparación con un testigo.
4) Lo descripto en los puntos anteriores es válido para medir la concentración de sustancias incoloras
siempre que estas sustancias sean capaces de reaccionar con otras, dando productos de reacción
coloreados y que el color finalmente obtenido sea proporcional a la concentración de la sustancia en
estudio. El tubo blanco, el cual no contiene la sustancia que desarrolla color, deberá ser tratado de forma
similar al tubo problema y a los testigos, es decir tendrá los mismos reactivos y se los procesará de
forma similar y paralela a los otros tubos. Hay sustancias incoloras que tienen la propiedad de absorber
la luz ultravioleta; en estos casos pueden ser cuantificadas sin tratamiento previo, midiendo la
absorbancia a una λ comprendida entre 200 y 400 nm (correspondiente al rango de luz ultravioleta).
GUIA DE ESTUDIO
1. Observe el esquema del espectro electromagnético de la Fig.4 y compare c (velocidad), λ (longitud
de onda), ν (frecuencia) y energía de la radiación electromagnética indicada.
2. Defina luz blanca y luz monocromática.
3. ¿Qué tipos de monocromadores conoce ?
4. ¿Qué efecto produce la absorción de la luz por una molécula?
5. ¿Existe alguna restricción con respecto a la longitud de onda de la luz que una sustancia puede
absorber?
6. ¿Cuál es la utilidad de un espectro de absorción?
7. ¿Qué son la espectrofotometría y la fotocolorimetría; qué aparatos se usan?
8. Indique cuáles son las diferencias y similitudes entre un fotocolorímetro y un espectrofotómetro.
9. Concepto de ley de Lambert y Beer.
10. Definición de absorbancia y transmitancia.
11. ¿Cómo se preparan y qué utilidad tienen los tubos blanco, testigo y problema?
12. ¿Cómo construye y qué utilidad tiene una curva de calibración ?
13. ¿Cómo elige la longitud de onda de trabajo?
14. ¿Cuál es el fundamento químico del método de Biuret para cuantificar proteínas?
Fig. 4: Espectro Electromagnético
15
Color
λ(m)
-17
ν(Hz) x 10
7
x 10
Violeta
3.90 – 4.55
7.69 – 6.59
Azul
4.55 – 4.92
6.59 – 6.10
Verde
4.92 - 5.77
5.77 – 5.97
6.10 – 5.70
5.97 – 6.22
5.03 – 4.82
6.22 – 7.80
4.82 – 3.84
Amarillo
Naranja
Rojo
E = h.ν
E=
ν =
c
λ
h.c
λ
5.70 – 5.03
PROBLEMAS
1-
Una disolución de proteínas de concentración desconocida, se diluye 5 veces con agua destilada. A
partir de esta dilución, se vuelve a diluir 3 veces con agua destilada. Esta última dilución dió por método
Biuret una absorbancia de 0,12 (testigo de concentración = 4 mg/ml, dió 0,25 de absorbancia).¿Cuál es
la concentración de la solución original de proteínas? R = 28,8 mg/ml.
2- Una solución de proteínas de concentración desconocida, dió por método de Biuret una A = 0,09
(testigo de concentración 4mg/ml dió A = 0,25 ).De dicha solución se desea tomar 100 ug. ¿ Qué
volumen de dicha solución se debe pipetear? R = 69 µl.
3- Interprete el significado de las sig. curvas de calibración para la cuantificación de proteínas por el
método de Biuret. ¿ Cuál de ellas corresponde a un esquema de trabajo correcto?
2
1
Absorbancia
3
Concentración (mg/ml)
4-
Los datos de la Tabla 1 corresponden a absorbancias de una solución de flunitrazepam 25 µM en etanol 3% V/V y
en tris HCL 50 mM, pH 7,4 medidos a diferentes longitudes de onda:
λ
210
220
250
260
270
280
290
320
330
340
350
360
370
A
0.2
0.604
0.446
0.407
0.320
0.286
0.272
0.250
0.190
0.120
0.070
0.040
0.020
a)Grafique el espectro de absorción y coloque el título correspondiente.
b)¿Qué longitud de onda elegiría para realizar una curva de calibración?
c)¿ Cómo se preparó el tubo blanco?
d)¿ Es necesario descontar el blanco cada vez que se cambia la longitud de onda? Si-No. J.S.R.
16
5- El siguiente es un protocolo de trabajo para la cuantificación de ADN en base a su contenido de
desoxirribosa empleando el reactivo de difenilamina.
Blanco
NaCl
Testigo
Problema
1ml
ADN 100µg/ml
1 ml
en Nacl 1M
ADN [ ] desc en
NaCl 1M
difenilamina
2ml
Volumen final
a) Complete los espacios en blanco.
b)¿ Por qué coloca NaCl 1M y no agua destilada en el blanco?
c)¿ Cómo realizaría una curva de calibración si sólo cuenta con una solución de ADN de 100 µg/ml?
d)¿ Qué precauciones debe tener al elegir las concentraciones de los testigos?
e)¿ Cómo corregiría este protocolo en los casos en que: 1-la absorbancia del problema sea >> 0,3 y
2- la absorbancia del problema sea << 0,1 ?
f)¿ Por qué deben tener todos los tubos igual volumen final?
6-
Calcular la absorbancia que corresponde a cada uno de los siguientes valores de transmitancia: a) 0%
b) 0,2%
c) 0,8%
d) 1,52%
e) 2%
7-
Calcule el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol si A = 0,2 y la concentración es 11.428
nmoles/l, λ= 410 nm y b = 1 cm. R = 17.500
8-
Se cuantificó una solución de tirosina por absorción al UV. Esta solución dio A = 0,16 ; calcule la
concentración nM de tirosina considerando que dicha solución había sido diluida primero 3 veces y
-1
-1
-5
luego 2 veces más. ε = 14.000 l.mol . cm , λ = 274 nm. R = 6,85.10 M.
9-
Una solución de una sustancia de PM 600 a una concentración de 40 µg/ml tiene A = 0,3 a 540 nm,
medida en una cubeta de 1 cm de paso óptico. Calcule el coeficiente de extinción molar. R = 4.500
10- Una solución contiene dos flavonoides : flavonoide 1 (F1) y flavonoide 2 (F2). Se quiere cuantificar
ambos sin una purificación previa. Analizando la Fig. 6 se observa que entre 220 nm y 420 nm sus
espectros se superponen, por lo tanto la cuantificación de cualquiera de ellos interfiere con la del otro. A
longitudes de onda superiores a 420 nm sólo absorbe F1. Calcule la concentración molar de F1 y F2 en
ésa solución sabiendo que:
17
F1
A
Testigo de F1
Testigo de F2
c1 = 15 µM
c2 = 15 µM
A350 = 0,105
A350 = 0,195
F2
A450 = 0,293
Solución problema (mezcla de F1/F2)
cF1 = ? , cF2 = ?
0
200
300
400
500
600
A450= 0,3
A350 = 0,25
Longitud de onda (nm)
Respuesta:
-5
•
concentración de F1=1,54.10 M.
•
concentración de F2=1,09.10 M.
-5
EJERCITACION ADICIONAL
1- Calcule el número de moles, micromoles y milimoles que hay en 2g de Na(OH) (PM=40).
2- ¿Qué cantidad de glucosa (PM=180) tiene que pesar para preparar 200 ml de una solución 0,05 M?
R = 1,8 g.
3- ¿Qué volumen de una solución 10 mM se puede preparar con 1 g de glucosa (PM=180). R = 555,55 ml.
4- Si tiene 3 litros de una solución de Na(OH) 0,5 M, ¿Cuántos moles y que concentración molar poseen los
siguientes volúmenes: a) 50 ml; b) 0,25 ml; c) 1 litro.
R: a) 0.025 moles, 0.5 M; b) 1.25 x 10-4 moles, 0.5 M; c) 0.5 moles, 0.5 M
5- ¿Qué molaridad tiene una solución que contiene 60 gr de NA(OH) (PM=40) por litro? R: 1.5 M.
6- ¿Qué cantidad de NA(OH) (PM=40) estan contenidos en 3 litros de una solución 2.5 M ? R: 300gr.
7- Una solución de ácido sulfúrico al 98% P/P, cuya densidad es 1.8 g/cm3, ¿qué molaridad tiene? R: 18 M.
8- ¿Cuál será la molaridad de una solución de ácido clorhídrico (PM=36.5) al 37% P/P cuya densidad es
3
1.19 g/cm ?. R: 12 M
9- ¿Cómo procedería para preparar 2 litros de una solución de ClK 10 mM a partir de una solución 3 M ?
R: tomar 6.67 ml (3 M). colocarlos en un matraz de 2 litros enrasar con agua destilada.
18
10-Se quieren preparar 6 litros de una solución 0.25 M de ácido sulfúrico a partir de una solución 63% P/P
3
(densidad=1.7 g/cm ). ¿Qué volumen debe tomar?. R: 137,28 ml.
11-Los siguientes son los resultados de la cuantificación de H2SO4 en una misma muestra realizado por un
método "A" por cuatro analistas diferentes:
a- 50,00 % P/P, densidad= 1,3952 g/ml
b- 70,00 % P/V
c- 7,00 M
d- 7100 mM
De acuerdo al enunciado anterior diga:
a-¿Cómo procede para comparar los resultados anteriores?
b-¿Que puede decir acerca de la precisión del método empleado en la cuantificación?
DATOS: PM H2SO4 = 98,08
12-Se desea investigar los efectos de flunitrazepam sobre el comportamiento de ratas en situación de
"stress". Para ello cuenta con dos lotes de cinco ratas de 300 g cada una. El lote Nº1 (experimental) es
inyectado con una solución de flunitrazepam 67µM en cloruro de sodio 0,8775 % P/V (solución
fisiológica).
a) ¿Cómo procede para preparar 100 ml de dicha solución ?
b) ¿Cuál es la utilidad del segundo lote de ratas? ¿Con qué inyecta esas ratas? ¿Cómo prepara esa
solución?
c) Si la dosis de flunitrazepam cuyo efecto se desea investigar es 70 µg/kg de peso corporal, ¿qué
volumen debe inyectar a cada animal?.
DATOS: flunitrazepam = droga sólida , PMflunitrazepam = 313,3 PACl = 35,5 PANa = 23
12- En el siguiente gráfico se muestran espectros de absorción de varias sustancias. ¿Cuál de las
longitudes de onda indicadas elegiría para luego trabajar con un fotocolorímetro y cuál para trabajar
con un espectrofotómetro? Estos espectros fueron obtenidos con un espectrofotómetro o con un
fotocolorímetro? Podria obtener un espectro como el B si sólo dispusiera de un fotocolorómetro para
analizar su muestra?
Absorbancia
0.4
0.3
B
A
0.2
0.1
0.0
C
300
450
600
750
Long Onda (nm)
13- La siguiente tabla corresponde a absorbancias de soluciones estándares de albúmina sérica bobina:
[Albúmina] (Mx103)
A
0.2
0.033
0.5
0.081
1.25
0.195
3.12
0.440
7.81
0.703
19
a)¿ Se cumple la ley de Lambert y Beer en este intervalo de concentraciones?
b) Si no fuera así.¿ Cuál es el límite superior de concentración del rango lineal?
c) Determinar la concentración de albúmina cuya absorbancia medida en las mismas condiciones
experimentales es 0,116.
14- Se desea investigar el contenido de glucosa en sangre después de la administración por vía oral de 0,5
g de dicho compuesto. Se trabajó con un grupo de 20 ratas de 2 meses de edad, peso promedio 300 g.
Se tomaron muestras de sangre a 0, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos después de la ingestión y se
determinó en suero la cantidad de glucosa por un método fotocolorimétrico, expresó como el valor
promedio en mg % P/V de glucosa en sangre. (Tabla 4). En otro experimento se tomó otro grupo de 20
ratas con las mismas características y sometidas al mismo tratamiento que las anteriores. Una hora
antes del experimento fueron inyectadas por vía endovenosa con 200 µl de una solución 20 µM de
Glucagón (el glucagón es una hormona pancreática que incrementa el nivel de glucosa por la
estimulación de la degradación de glucógeno en higado) (Tabla 5).
a) Identifique para cada experimento la variable dependiente y la independiente. J.S.R
b) Grafique los resultados y coloque título a los mismos.
c) Indique la ecuación matemática a la que se ajustan los datos.
TABLA 4
mg % p/v glu/sangre
TABLA 5
tiempo min
mg % p/v glu/sangre
tiempo min
70
0
140
0
105
30
175
30
122
45
195
45
140
60
210
60
175
90
260
90
210
120
290
120
14- Postule dos modelos de experimentación donde pueda identificar variables dependientes e
independientes.
20
PARTE PRACTICA
CUANTIFICACIÓN DE ALBÚMINA POR EL MÉTODO DE BIURET
FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE BIURET (Gornall, A.G et al., 1949, J. Biol. Chem., 177-766):
Las sustancias que contienen dos -CONH2 ; -CH2NH2; -C(NH)(NH2); o -CSNH2, unidos, sea
directamente entre sí, o a través de un átomo de carbono o nitrógeno; y las estructuras peptídicas que
contengan como mínimo dos enlaces peptídicos, en presencia de Cu++y en solución alcalina, forma un
complejo de color violeta, el complejo de Biuret.
O
C
C
NH
RC H
O
C
O
HN
Cu2+
NH
RC H
H CR
C
O
HN
H CR
Violeta-púrpura
Complejo proteína-Cu(II)
El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado llamado Biuret que se forma cuando
se calienta la urea a una temperatura de unos 180°C, en presencia de Cu++y en medio alcalino.
NH2
O
C
O
O
NH2
UREA
180 ºC
O
C
2+
NH
O
C
NH
NH2
NH2
NH2
C
C
NH2
+ NH2
Cu
C
C
NH2
NH2
C
C
NH
BIURET
O
O
NH2
Cu2+
NH2
O
O
HN
O
HN
C
C
NH2
NH2
O
Complejo Cu-Biuret
Esta reacción también es producida, naturalmente, por los enlaces peptídicos de las proteínas y
es el fundamento de la técnica del biuret para la determinación de proteínas en suero u otros líquidos
biológicos.
El método de biuret desarrollado por Gornall et al. permite cuantificar soluciones que contengan
entre 1 y 10 mg de proteínas por mililitros.
21
M ATERIALES Y MÉTODOS:
Reactivo de biuret: Disolver 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) y 6g de tartrato de sodio y potasio
tetrahidratado en 500ml de agua destilada. Agitando constantemente, añadir 300ml de Na(OH) al 10%.
Diluir hasta 1 litro con agua destilada y guardar en frasco de plástico.
Solución testigo: Albúmina bovina a una concentración de 5mg/ml en agua destilada.
Protocolo: En el tubo blanco colocar 1 ml de agua destilada; en el tubo testigo colocar 1 ml de solución
testigo de albúmina; en el tubo problema colocar 1 ml de la solución problema. Agregar a cada uno de
los tubos 4 ml de reactivo de biuret, agitando y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30
minutos. Con el tubo blanco llevar a cero de absorbancia al fotocolorímetro (550 nm). Luego leer el tubo
problema y el tubo testigo.
En el trabajo práctico se prepararán varios tubos testigos a los fines de construír una curva de calibración
IMPORTANTE: TRAER PAPEL MILIMETRADO
RESULTADOS
Tubo
Absorbancia
[Proteinas] (mg/ml
T1
T2
T3
P
DISCUSIÓN
BIBLIOGRAFIA
-
Problemas de Química. J.M. Esteban y J.M. Cavanillas. Ed. Alhambra. 4a. 1976. España.
Cálculos en Bioquímica. I.J.Segel. Ed. Acribia. Saragoza. España. 1972.
Métodos instrumentales de análisis. H.H. Willard,.L.Merritt Jr., y J.A.Dean. Ed. CECSA. México. 1974.
Análisis Instrumental. D.A. Skoog y D.M. West. Ed.Interamericana. México. 1975.
Química Clínica: Bases y Técnicas. R.J. Henry, D.C. Cannon y J.W. Winkelman. Tomo I. 2a Ed. Jims. Barcelona.
España.1980.
- Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3º Ed. NY. USA.2000
- Spectrophotometry and Spectrofluorometry A practical Approach. Edited by Michael G. Gore. Ed. Oxford University
Press. Inc. NY. USA. 2000.
22
TRABAJO PRACTICO Nº 2
PURIFICACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS
Los alumnos deberán concurrir con la tarea de investigación (por escrito) sobre técnicas para estudios de
proteínas que les fue asignada por el docente en el TP anterior. Se hará una puesta en común de la
información obtenida por cada grupo. Serán evaluados en forma escrita al final de esta clase.
OBJETIVOS
- Conocer los fundamentos teóricos de las técnicas utilizadas en la purificación y caracterización de proteínas.
- Valorar la importancia del dominio de diferentes técnicas y del conocimiento acerca de las caracteríaticas
particulares de la proteína a purificar, para poder aplicarlos con criterio.
- Adquirir y aplicar herramientas teóricas para la resolución de los problemas planteados.
TEMAS PARA REPASAR
−
−
−
−
−
−
Estructura de Proteínas. Abreviaturas de los nombre de los aminoácidos: código de 1 y 3 letras.
Equilibrio Acido-Base de amino ácidos y de proteínas.
Coeficiente de sedimentación.
Enzimas de restricción.
Concepto Actividad específica
Temas 2,4,5,6 del programa de la materia.
TÉCNICAS UTILIZADAS EN EL ESTUDIO DE PROTEÍNAS:
1- Fraccionamiento subcelular por
centrifugación diferencial y por
gradiente de sacarosa.
2- Precipitación salina.
1-Espectrofotometría
ANALISIS DE
ESTRUCTURA
1- Espectrofluorimetría
2- Espectrofluorimetría
2- Dicroismo circular
3- Diálisis.
3- Elisa
3- RMN
PURIFICACIÓN
CUANTIFICACIÓN
4- Cromatografía de filtración por
gel.
4- FTIR
5- Cromatografía de intercambio
iónico.
6- Cromatografía de afinidad.
7- Cromatografía líquida de alta
presión.
8- Electroforesis en geles.
9-Isolelectroenfoque y
electroforesis bidimensional.
5- MALDI-MS
ANALISIS DE
ACTIVIDAD
1- Actividad
enzimática
2- Unión de
radioligandos
3-Formación
de complejo
Ag-Ac
4Conductancia
a iones
6- Secuenciación
7-Perfil hidropático
8-Difracción de rayos X
9- Comparación de
secuencias.
23
PROBLEMAS
1- Forma y Dimensión (a) La tropomiosina, una proteína muscular de 70 kd, está formada por un
superhelicoide de α-hélices con dos hebras. Calcular la longitud de la molécula. (b) Suponer que un
segmento protéico de 40 residuos se pliega en una estructura β-antiparalela de dos hebras con un giro
en horquilla de 4 residuos. ¿Cuál es la longitud máxima de este motivo?
2- La ubicación lo es todo. Las proteínas transmembranas contienen a menudo α-hélices. Teniendo en
cuenta que el interior de las membranas es muy hidrofóbico, predecir qué tipo de aminoácidos habría en
estas hélices. ¿Porqué una α-hélice es especialmente adecuada para encontrarse en el entorno
hidrofóbico del interior de una membrana?
3- Especies menores. En un aminoácido como la alanina la forma principal a pH 7 en disolución es la
zwitteriónica. Suponiendo un valor de pKa de 8 para el grupo amino y un valor de pKa de 3 para el ácido
carboxílico, calcular la proporción entre la concentración de la forma neutra del aminoácido y (con el
ácido carboxílico protonado y el grupo amino neutro) y la forma zwitteriónica a pH 7.
4- Mensaje oculto. Traducir la siguiente secuencia de aminoácidos en código de una letra: Leu-Glu-AlaArg-Asn-Ile-Asn-Gly-Ser-Cys-Ile-Glu-Asn-Cys-Glu-Ile-Ser-Gly-Arg-Glu-Ala-Thr.
5- Concentrado en la concentración. Una disolución de una proteína cuya secuencia incluye tres residuos
de triptofano, sin residuos de tirosina, ni de fenilalanina, tiene una absorbancia de 0,1 a 280 nm en una
celda de 1 cm de paso óptico. Obtener la concentración de la proteína en unidades de molaridad. Si la
proteína tiene una masa molecular de 100 kd, hallar la concentración en miligramos de proteína por
mililitro de disolución.
6- Movimiento lento. La tropomiosina, una proteína muscular de 93 kd , sedimenta más lentamente que la
hemoglobina (65 kd). Sus coeficientes de sedimentación respectivos son 2,6 S y 4,31 S. ¿Cuál es la
carácteristica estructural responsable de su lentitud en la sedimentación?
7- Esferas que sedimentan ¿Cual es la dependencia entre el coeficiente de sedimentación S de una
proteína esférica y su masa? ¿Cuánto más rapidamente sedimentará una proteína de 80 kd que una de
40 kd?
8- Determinación del tamaño. Las movilidades electroforéticas relativas de una proteína de 30 kd y una de
92 kd utilizadas como estándar en un gel de SDS-poliacrilamida son, respectivamente, 0,8 y 0,41. ¿Cuál
es la masa aparente de una proteína que tiene una movilidad de 0,62 en este gel?
9- ¿Una asociación nueva? El gen que codifica una proteína que tiene un único puente disulfuro
experimenta una mutación que sustituye un residuo de serina por uno de cisteína. Se quiere comprobar
si el apareamiento de los sulfhidrilos en este mutante es el mismo que en la proteína original. Proponer
un experimento que resuelva esta cuestión.
10- Elegir la columna. El octapéptido AVGWRVKS se digirió con tripsina. ¿Sería el intercambio iónico o la
exclusión molecular la técnica más apropiada para separar estos productos? Explicarlo (b) Suponer que
el péptido se digiere con quimiotripsina. ¿Cuál sería la técnica de separación óptima?Explicarlo
11- ¿Haciendo más enzima? Durante la purificación de una enzima un investigador realiza un paso de
purificación que produce un incremento en la actividad total dando un valor mayor que el que está
presente en el extracto crudo. Explicar como se puede incrementar la actividad total.
24
12- Problema de purificación de proteínas. Completar la siguiente tabla
Procedimiento de
purificación
Extracto puro
Precipitación con
(NH4)2SO4
Cromatografía DEAEcelulosa
Cromatografía de
exclusión molecular
Cromatografía de
afinidad
Proteína
total (mg)
Actividad
total
20 000
4.000000
5000
3.000000
1500
1.000000
500
750 000
45
675 000
Actividad
específica
Nivel de
purificación
Rendimiento
(%)
1
100
13- Estructura cuaternaria. Una proteína se purificó hasta la homogeneidad. La determinación del peso
molecular por cromatografía de exclusión molecular da 60 kd. La cromatografía en presencia de urea 6
M da una especie de 30 kd. Cuando se repite la cromatografía en presencia de urea 6 M y βmercaptoetanol 10 mM, aparece una especie molecular única de 15 kd. Describir la estructuira de la
molécula.
14- Secuencia de proteínas I. Determinar la secuencia de un hexapéptido basándose en los siguientes
datos. Nota: Cuando no se conoce la secuencia, los aminoácidos se separan con una coma.
(ver datos en la Tabla de ruptura específica de los polipéptidos, al final de la guía).
Composición de aminoácidos
Análisis N-terminal del hexapéptido
Digestión por tripsina
Digestión por carboxipeptidasa
Digestión por quimiotripsina
(2R,A,S,V,Y)
A
(R,A,V) y (R,S,Y)
no hay digestión
(A,R,V,Y) (R,S)
15- Secuencia de proteínas II. Determinar la secuencia de un péptido de 14 aminoácidos en base a los
siguientes datos.
Composición de aminoácidos
Análisis N-terminal del péptido
Digestión por carboxipeptidasa
Digestión por tripsina
Digestión por quimiotripsina
(4S,2L,F,G,I,K,M,T,W,Y)
S
L
(3S,2L,F,I,M,T,W) y (G,K,S,Y)
(F,I,S) (G,K,L) (L,S) (M,T) (S,W) (S,Y)
Análisis N-terminal del péptido
Tratamiento con bromuro de cianógeno
(F,I,S), S
(2S,F,G,I,K,L,M*,T,Y) (2S,L,W)
25
DATOS
1 residuo de α-hélice contribuye con 1.5 Å a la longitud total de la α-hélice.
1 residuo de hoja plegada β contribuye con 3.5 Å a la longitud total de la estructura β.
1 residuo = 110 D
Ruptura específica de los polipéptidos
Reactivo - Ruptura química
Lugar de ruptura
Bromuro de cianógeno
O-Iodobenzoato
Hidroxilamina
2-Nitro-5tiocianobenzoato
Ruptura enzimática
tripsina
clostripaína
Proteasa de Staphylococcus
trombina
quimiotripsina
Carboxipeptidasa A
Lado carboxilo de los residuos metionina
Lado carboxilo de los residuos triptofano
Enlaces asparragina-glicina
Lado amino de los residuos cisteína
Lado carboxilo de los residuos lisina y arginina
Lado carboxilo de los residuos arginina
Lado carboxilo de los residuos aspartato y
glutamato (el glutamato solo en ciertas
condiciones)
Lado carboxilo de los residuos arginina
Lado carboxilo de los residuos tirosina,
triptofano, fenilalanina, leucina y metionina.
Lado amino del aminoácido C-terminal (salvo
arginina, lisina y prolina)
BIBLIOGRAFIA
- Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3º Ed. NY.
USA.2000
- Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
26
TRABAJO PRÁCTICO Nº 3
CINETICA ENZIMATICA I
En la primera semana (Cinética Enzimática I) se discutirán los aspectos teóricos y, en la segunda y tercera
semana (Cinética Enzimática II y III) se desarrollará la parte experimental. Los alumnos serán evaluados al
finalizar cada T.P de cinética (I, II y III) acerca de todos los apectos teóricos del tema y de los fundamentos
de las técnicas utilizadas.
OBJETIVOS
- Conocer el mecanismo por el cual transcurren las reacciones catalizadas por enzimas.
- Comprender como influyen el tiempo de incubación, la concentración de enzima, la concentración de sustrato,
temperatura, pH, y la presencia de inhibidores sobre la velocidad inicial y la concentración de producto formado en
reacciones catalizadas por enzimas Michaelianas. - Interpretar el significado de las constantes cinéticas KM y Vmax.
- Valorar la importancia del trabajo prolijo y ordenado para la obtención de resultados confiables.
TEMAS PARA REPASAR
- Soluciones amortiguadoras,
- pH,
- Fotocolorimetría.
TRAER: calculadora y papel milimetrado.
INTRODUCCION
Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza protéica. Una determinada enzima (E) se
combina con un determinado sustrato (S) formando un complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se
descompone para dar el producto (P) y enzima libre (E):
E+S
ES
E+P
La mayoría de las reacciones biológicas transcurren lentamente si no son catalizadas; las enzimas hacen
que el equilibrio de esas reacciones sea alcanzado rápidamente. Varios factores como a) el tiempo de
incubación; b) la concentración de enzima; c) la temperatura del medio; d) el pH y e) la concentración de
sustrato influyen en el transcurso de la reacción.
a) TIEMPO DE INCUBACIÓN: en la Fig. 1 se observa la variación de las concentraciones de complejo
enzima-sustrato (E-S), de sustrato [S] y de producto [P], en función del tiempo. La velocidad inicial (Vo)
corresponde a la velocidad medida dentro de un lapso de tiempo lo suficientemente corto como para que
la cantidad de sustrato consumido sea despreciable respecto a la cantidad de sustrato inicial (en la
práctica menos del 5% del total). La velocidad se expresa como la cantidad de producto formado por
unidad de tiempo (por ej. µmoles/min).
[P]
[S]
[E]
[ES]
Fig.1. Variación de la concentración de las
especies químicas que participan en una
reacción catalizada por enzimas, en función
del tiempo. [E]: concentración de enzima; [S]:
concentración de sustrato; [ES]: concentración
de
complejo
enzima-sustrato;
[P]:
concentración de producto.
27
tiempo
b) CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA: Velocidad en función de la concentración de enzima. La concentración
de enzima óptima se elige un rango de concentración de enzima tal que la velocidad inicial (Vo) sea
directamente proporcional a la concentración de la enzima
V
Fig 2. V elocidad de reacción
vs concentración de enzima
E
Concentración
de enzima óptima
c) EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACIÓN: Dentro de ciertos límites, la velocidad de reacción
aumenta con la temperatura. En general la velocidad se duplica a cada incremento de unos 10°C y
viceversa. Existe una temperatura óptima, por encima de esta, la velocidad decrece rápidamente por
desnaturalización de la enzima. La temperatura de máxima actividad no corresponde necesariamente a
la temperatura de máxima estabilidad.
Fig.4. Actividad enzimática vs temperatura
% Actividad
máxima
Temperatura
d) EFECTO DEL PH DEL MEDIO DE INCUBACIÓN: Cambios moderados en el pH afectan el estado iónico de la
enzima y con frecuencia también del sustrato. En general , la actividad óptima se encuentra entre pH 5 y
pH 9 como la tripsina. ver Fig.5., sin embargo algunas enzimas como la pepsina Fig.6 tiene su óptimo a
valores de pH bastante alejados de dichos límites. A valores extremos de pH se produce
desnaturalización de la enzima.
Actividad
Actividad
6
8
10
pH
2
4
6
pH
A partir de estos gráficos se puede determinar las constantes cinéticas que caracterizan a una enzima:
KM (constante de Michaelis) y Vmax (velocidad máxima), para un sustrato y en condiciones determinadas.
KM: este valor corresponde a la concentración de sustrato necesaria para alcanzar una velocidad igual a
la mitad de la Vmax
28
Vmax: es la velocidad que se alcanza cuando la enzima está saturada con sustrato (a altas
concentraciones de sustrato).
e) EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO: Variación de la velocidad inicial en función de la
concentración de sustrato. Si aumenta la concentración de S, mientras permanecen constantes las
demás condiciones, V0 crece hasta un valor máximo. La velocidad crece hasta que la enzima es
saturada por el S y se alcanza la velocidad máxima (Vmax).
Vo
1
Vo
(a)
(b)
Vmax
1
Vmax
Vmax
2
1
KM
[S]
Fig.6
1
[S]
(a) Curva de Michaelis–Menten de Vo en función de la concentración de S; (b) Gráfico de
Lineweaver-Burk o de dobles recíprocas.
GUÍA DE ESTUDIO
1. Catalizadores.
2. Enzimas. Características. Sitio activo de una enzima: características. Cofactor. Coenzima. Holoenzima.
3. Clasificación de enzimas.
4. Ubicación de las enzimas en la célula.
5. ¿A que se llama sustrato y producto?.
6. Mecanismo de acción de las enzimas.
7. ¿Alteran las enzimas el equilibrio de la reacción?
8. ¿Cómo se mide la concentración de una enzima?.
9. ¿Qué es la actividad específica de una enzima y en qué unidades se expresa?.
10. Factores que influyen en una reación catalizada por enzimas.
11. Función de Michaelis Menten. Representación gráfica.
12. Velocidad inicial. Velocidad máxima. Unidades.
13. ¿Porqué se debe trabajar a velocidad inicial?
14. KM. Unidades. ¿Cómo se determina?
15. Ecuación de Lineweaver-Burk. Representación gráfica.
16. Inhibición reversible e irreversible, concepto. Inhibidores competitivos y no competitivos, concepto.
¿Cómo se diferencian? ¿cómo son las curvas de las directas e inversas de la velocidad en función
de la concentración de sustrato?.
29
PROBLEMAS
1. Explique el siguiente gráfico
V
Tiempo
2. a. Grafique velocidad en función de concentración de sustrato
b. Grafique la inversa de velocidad en función de la inversa de la concentración de sustrato.Identifique
en cada una de estas curvas Km y Vm.
3. ¿Qué relación existe entre Km y la afinidad de una enzima por un determinado sustrato?
4. ¿Cuándo la concentración de sustrato es igual a Km, Como es la velocidad inicial?
5.¿Qué relación exíste entre Km y sustrato cuando la reacción catalizada por la enzima alcanza el 80%
de la Vm?
6. Para medir la actividad catalítica de la fosfatasa ácida de higado de rata, la preparación enzimática fue
obtenida homogenizando 0.5 g de hígado en 10 ml de buffer. Se incubaron 0.2 ml de la preparación
++
enzimática a pH 5 y 37ºC en presencia de Ca durante 6' , en un volumen de 0.4 ml, el cual fue diluido a
4 ml para detener la reacción. Calcule los µmoles de producto formado por min. y por mg de tejido,
sabiendo que la absorbamcia fue 0.2, ε: 17500.
7. Se incubaron 200 µl de una preparación enzimática (0,3 mg proteínas/ml) en presencia de 0,5 ml del
sustrato correspondiente y de 0,5 ml de buffer pH 5, durante 15 min. a una temperatura constante de
37ºC. La reacción se detuvo por dilución del incubado hasta un volumen final de 10 ml con NaOH 0,1 M.
La absorbancia de esta solución fue 0,215. Calcular los µmoles de producto formado por min. y por mg
de proteínas. Solución testigo 2 µM → Abs. 0,15.
8. La trehalasa cataliza la hidrólisis de la trehalosa, en determinadas condiciones (pH 7, 30ºC). Una
muestra de trehalasa presenta un valor de Vm de 1.5 µmol de glucosa formada por minuto por mg de
proteína. ¿Cuál será el valor de Vm para la misma preparación enzimática pero en presencia de de 5
mmoles de trehalosa 6-fosfato el cual es un inhibidor competitivo con Ki = 2mmol/ml?
9. Pseudomonas aeruginosa cultivada en un medio de acetato posee una enzima que puede hidrolizar la
propionamida.
CH3CH2CONH2 + H2O -----------------> CH3CH2COOH + NH3
los estudios de velocidad inicial en los que se midio la producción de amoníaco a partir de la
o
propionamida a pH 7 y 37 C demostraron que la urea inhibe esta reacción. Examinando los efectos de
30
dos concentraciones diferentes de urea sobre un rango de concentraciones de propionamida se
obtuvieron los siguientes resultados:
[Propionamida]
VELOCIDAD INICIAL
(µmoles de NH3 liberados/min/mg de proteína)
SIN INHIBIDOR
CON INHIBIDOR (Urea)
1mmol/ml
5
6.7
10
20
50
160
194
263
400
576
2 mmol/ml
111
140
183
279
400
76
95
123
188
277
Determinar la Km para las diferentes condiciones. ¿Actúa la urea como un inhibidor competitivo o no
competitivo?
10. A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar a) tipo de inhibición b) KM del
sustrato.
Concentración de S (mM)
2
3
4
10
15
VELOCIDAD
(µg de producto formado/hora)
Sin inhibidor
Con inhibidor 6 mM
139
179
213
313
370
88
121
149
257
313
31
TRABAJO PRACTICO Nº 4
CINETICA ENZIMATICA II
PARTE PRACTICA I
ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA ÁCIDA DE HÍGADO
OBJETIVOS
- Medir la formación de producto en función del tiempo de incubación.
- Determinar la variación de la velocidad inicial en función de la concentración de la enzima.
Es decir, se determinarán las condiciones óptimas de tiempo de incubación y de concentración de enzima, las que
serán usadas durante el trabajo práctico siguiente para determinar KM y Vmax.
FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN
La fosfatasa ácida de hígado cataliza la siguiente reacción:
3-
p-nitrofenilfosfato + H2O
HO
p-nitrofenol + PO4
P
O
OH
O
OH
Enzima
+ Enz +
+
H+
O2N
p-nitrofenilfosfato
O2N
O-3
PO4
OH
-
+ H2O
O2N
p-nitrofenol
p-nitrofenolato
El sustrato p-nitrofenilfosfato disódico, es una reactivo artificial que tiene la propiedad de ser hidrolizado
por esta enzima del hígado y de otros tejidos, por ello puede ser usado para estudiar dichas enzimas. La
reacción es medida siguiendo la cantidad de producto formado, el p-nitrofenol, el cual se puede medir
mediante fotocolorimetría en un medio alcalino a 410 nm (Coeficiente de extinción molar: 17500) (ref.
Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan vol. XXXI).
MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación de la enzima:
Homogeneizar (en homogeneizador a embolo) 0.25 g de hígado en 15 ml de agua destilada. Dejar en
baño de hielo durante 10 min. En esas condiciones hipo-osmóticas, se rompen los lisosomas que
contienen la enzima, la cual queda soluble. Luego llevar la suspensión a 30 ml con buffer acéticoacetato de sodio, pH 5, y 0,2 M. La suspensión queda con una concentración de 1 mg de proteína por
ml.
Sistema de incubación:
32
Contiene cantidades variables de los siguientes componentes:
Sustrato: p-nitrofenilfosfato, 25 mM. PM 371,12.
Buffer: acido acético- acetato de sodio, pH 5, 0,1 M.
Enzima: homogeneizado de hígado 1 mg de proteína / ml.
Activador: Cl2Ca 11 mM.
Recomendaciones:
Colocar en un tubo todos los componentes menos la enzima. La reacción comienza con el agregado de
la enzima y la incubación a 37°C. Mezclar rápidamente y continuar la incubación durante un tiempo que
se indicará en cada caso. La reacción se detiene por el agregado de 5 ml de NaOH 0.1 M. El álcali, por
un lado inactiva a la enzima y por otro da el medio alcalino necesario para que el producto (p-nitrofenol)
desarrolle color. Es importante hacer en cada caso un tiempo de cero de incubación, este tubo contiene
lo mismo que los tubos problema pero con la enzima agregada después del NaOH. Este tubo se usa
como blanco para el fotocolorímetro.
PROTOCOLO
A) CURVA DE TIEMPO :
Tubo N
o
sustrato µl
Cl2Ca µl
buffer µl
enzima µl
tiempo
(min)
100 (5 mM)
1
100
250
100 (0,1 mg
10
prot)
2
100
“
100
250
100
“
15
3
100
“
100
250
100
”
20
4
100
“
100
250
100
”
25
5
100 ”
100
250
100
”
30
blanco
100 ”
100
250
100
”
0
Incubar a 37°C. Al cabo del tiempo de incubación frenar la reacción agregando 5 ml de NaOH 0.1 M. En
el blanco la enzima debe añadirse después del alcali. Leer en el fotocolorímetro a 410 nm y calcular los
µmoles de producto formado.
RESULTADOS
Tubo N
o
Absorbancia
µmoles de P
µmoles de p/min
1
2
3
4
5
33
GRÁFICO
CONCLUSIONES
B- CURVA DE CONCENTRACIÓN DE ENZIMA
Tubo N
o
1
Sustrato (µl)
Cl2Ca (µl)
Buffer (µl)
100 (5 mM)
100
300
enzima (µl)
tiempo (min)
50 (0,05 mg
SEGÚN
prot)
2
100
“
100
250
100 (0,1 “ )
3
100
“
100
200
150 (0,15 ” )
DETERMINADO
4
100
“
100
150
200 (0,2
EN: A
5
100 ”
100
100
250 (0,25 ” )
blanco
100 ”
100
100
250 (
”
LO
” )
)
Incubar a 37°C durante el tiempo determinado en A. Frenar la reacción agregando 5 ml de NaOH 0.1 M.
En el blanco la enzima debe añadirse después del álcali. Leer en el fotocolorímetro a 410 nm y calcular
los µmoles de producto formado.
RESULTADOS
Tubo N
o
Absorbancia
µmoles de P
µmoles de p/min
1
2
3
4
5
34
GRÁFICO
CONCLUSIONES
35
TRABAJO PRÁCTICO Nº 5
CINETICA ENZIMATICA III
PARTE PRACTICA II
ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA ÁCIDA DE HÍGADO
OBJETIVO
- Determinar los valores de KM y Vmax de la fosfatasa ácida de hígado.
PROTOCOLO
PREPARACIÓN DEL SISTEMA DE INCUBACIÓN:
Tubo
sustrato (µl)
Cl2Ca (µl)
Buffer (µl)
enzima (µl)
tiempo (min)
1
50 (2,5 mM)
100
250
SEGÚN
SEGÚN
2
100 (5 mM)
100
200
LO
LO
3
150 (7,5 mM)
100
150
ESTIMADO
ESTIMADO
4
200 (10 mM)
100
100
EN: B
EN: A
5
250 (12,5 mM)
100
50
blanco
100
100
200
Incubar a 37°C según el tiempo determinado en A. Luego agregar a cada tubo 5 ml de NaOH 0.1 M. En
el blanco la enzima se añade después del alcali. Leer en el fotocolorímetro a 410 nm y calcular los
µmoles de P formado.
ANÁLISIS DE DATOS:
a) Calcular las inversas de la concentración de sustrato indicadas en la tabla.
b) calcular las inversas de µmoles de producto formados en cada tubo.
c) graficar 1/Vo en función de 1/[S]. d) Determinar los valores de KM y Vmax.
RESULTADOS:
36
Curva de Saturación
Tubo N
o
Absorbancia
µmoles de P
µmoles de P/min
1
2
3
4
5
Curva de dobles recíprocas
Tubo N
o
1/V
1/[S]
1
2
3
4
5
GRÁFICOS
CONCLUSIONES
37
DISCUSIÓN DE TRABAJOS CIENTÍFICOS
GUÍA DE ESTUDIO.
Trabajo científico:
Jung G.Y. and Stephanopoulos G. (2004). A functional protein chip for pathway optimization
and in vitro metabolic engineering. Science 304: 428-431.
1. Escriba la cita bibliográfica completa (busque en bases de datos tales como PubMed).
2. Optimización de vías metabólicas: a) ¿cuál es su interés?, b)¿dónde reside su dificultad?, ¿cómo
puede encararse?.
3. ¿Qué son los microarreglos?, ¿en qué contexto se comenzaron a desarrollar?.
4. ¿Cuál es el objetivo del presente trabajo?
5. ¿Cuál es la estrategia experimental elegida? (palabras clave: fusión RNA-proteína, polilisina,
DNA, hibridización).
6. ¿Cuáles son las dos reacciones acopladas que se usan para poner apunto el sistema
experimental?. ¿Cuál es la utilidad del DNA marcado con fluoresceína?. ¿Cómo se detecta el
producto de estas reacciones acopladas?. Describa los experimentos realizados para poner a
punto la técnica (Figs. 1 y 2).
7. ¿Qué es la trehalosa y cuál es su importancia?
8. ¿Cuál es la vía metabólica a cuyo estudio se aplica la técnica desarrollada?
9. Describa la Fig. 3.
10. ¿Cuáles son las conclusiones alcanzadas respecto al funcionamiento de esta vía metabólica?
¿Es posible generalizar estas conclusiones a otras vías metabólicas?.
BIBLIOGRAFÍA
. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY.
USA. 2000.
. Harper H.A, Manual de química fisiológica. Ed. El manual moderno 1980
. Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimología. Ed Aguilar. 1967.
. Morris J., Fisicoquímica para biólogos.
. Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996.
. Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA.
México, 1995.
- Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan Vol. XXXI.
38
TRABAJO PRACTICO Nº 6
FOTOSÍNTESIS
Los problemas y la guía de estudio deberán ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En
caso de necesitar aclarar dudas los docentes estrán disponibles en sus horarios de consulta, en la cátedra.
Los alumnos serán evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante el desarrollo de la experiencia
práctica (evaluación oral), sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP.
OBJETIVOS
- Valorar la importancia de la fotosíntesis como proceso necesario para la vida en el planeta
- Conocer los procesos bioquímicos y termodinámicos involucrados en el proceso.
- Comprobar algunos aspectos de la fotosíntesis por medio de experimentos.
TEMAS PARA REPASAR
- Termodinámica de las reacciones redox.
INTRODUCCIÓN
La fotosíntesis es un proceso que puede tener lugar tanto en células de plantas y como de bacterias
verde-azules; por medio de este proceso estos organismos son capaces de utilizar la luz solar como
fuente de energía para efectuar la síntesis de ciertos compuestos.
La ecuación global de la fotosíntesis es :
Luz
6 CO2 + 6 H2O -----------------> C6H12O6 + 6O2
Puede resolverse en dos procesos caracterizados por el tipo de reacciones que se realizan en cada uno,
estas son:
• reacciones dependoentes de la luz ( o reacciones claras): la energía luminosa es captada por los
pigmentos y la transforman en ATP y NADPH y simultaneamente se libera oxígeno molecular.
• Reacciones de fijación del carbono (o de fase oscura): llamada así porque no es necesaria la luz
para llevarse a cabo; aquí el ATP y el NADPH se emplean como fuentes de energía y poder
reductor, respectivamente, y se produce la reducción del CO2 y la síntesis de glucosa.
Fotólisis del agua:
Esta reacción se conoce como reacción de Hill:
H2O + A ----------------> AH2 + 1/2 O2
El estudio del transporte electrónico inducido por la luz comienza con el descubrimiento de R.L
Hill: "La iluminación de cloroplastos en presencia de aceptores electrónicos artificiales provocaba el
desprendimiento de oxígeno y la simultánea reducción del aceptor”.
En la fotosíntesis normal el aceptor es el NADP pero en la reacción de Hill se utiliza un
aceptor artificial por ejemplo, un colorante que al reducirse se decolora.
39
GUIA DE ESTUDIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Concepto de fotosíntesis.
Concepto de reacciones dependientes de la luz y de fijación del carbono.
Ubicación y estructura del cloroplasto. Correlación entre estructura y función bioquímica.
Diferencia entre mitocondrias y cloroplastos.
Dadores y aceptores de electrones.
Importancia de la reacción de Hill
Diferencias entre fosforilación a nivel de sustrato, fosforilación oxidativa y fotofosforilación.
Ejemplos.
Rol Dual de citocromo b6f (cytochrome b6f) y citocromo c (cytochrome c) en cianobacterias como
ejemplo de transporte electrónico y fosforilación en la fotosíntesis y en la cadena respiratoria.
Estos organismos utilizan citocromo b6f, citocromo c y plastoquinonas para la fosforilación oxidativa y la
+
fotofosforilación. (a) En la fotofosforilación los electrones fluyen desde el agua al NADP (b) En la
fosforilación oxidativa los electrones fluyen desde el NADH al O2. Ambos procesos son acompañados por
el movimiento de protones a través de la membrana.
Figura tomada de: Lehninger
Principles of Biochemistry. David
L. Nelson & Michael M. Cox. W orth
Publishers. 3ºEd. NY. USA. 2000.
40
Integración de fotosistemas I y II en el cloroplasto.
Este “esquema en Z” muestra el transporte de electrones transferidos desde el agua (abajo a la
+
izquierda) hacia el NADP ( a la derecha) en la fotosíntesis no cíclica. La posición en escala vertical de
cada portador de electrones refleja su potencial de reducción estandar. Para elevar la energía de
+
electrones derivados del agua al nivel energético requerido para reducir NADP a NADPH, Los
electrones deben ser impulsados por fotones absorbidos en PSI (Photosystem I o Fotosistema I) y PSII
(Photosystem II o Fotosistema II) (ver flechas anchas). Un fotón es requerido por un electrón de cada
Fotosistema. Luego de la excitación los electrones de alta energía fluyen corriente abajo a través de una
cadena transportadora. Los protones se mueven a través de las membranas tilacoidales durante la lisis
del agua y durante el transporte de electrones a través del complejo citocromo b6f (o cytochrome b6f)
generando un gradiente de protones que es central para la formación de ATP. La flecha punteada indica
la vía cíclica de la transferencia de electrones, donde solo esta involucrado PSI, los electrones regresan
+
por una vía cíclica al PSI, en lugar de reducir NADP a NADPH.
Figura tomada de : Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth
Publishers. 3ºEd. NY. USA. 2000.
41
PARTE PRACTICA
EXPERIENCIA Nº 1: Fotosíntesis y luz. Liberación de oxígeno y fijación de CO2.
MATERIALES
Material vegetal: un trozo de Elodea
Solución de bicarbonato de sodio al 1%.
Tubos de ensayo, tapones de goma atravesados por un tubo de 0,5 cm de diámetro, pipetas de 0,2 ml.
Fuente de luz blanca.
Soportes y gradillas.
PROCEDIMIENTO:
1. Disponer los elementos en la manera indicada en la Fig.1, teniendo en cuenta que desde el tubo de
ensayo hasta la pipeta graduada el sistema debe estar lleno de solución de bicarbonato de sodio al
1%.
2. Marcar el nivel del líquido contenido en la pipeta.
3. Medir el pH de la solución de bicarbonato de sodio
4. Conectar la fuente de luz a 10 cm de distancia y observar la base del tallo de Elodea.
5. Controlar el pH de la solución a los 45 min de iniciada la experiencia.
Fig.1
RESULTADOS:
a) Qué efecto produce el desprendimiento de oxígeno en el sistema?
b) Por qué utiliza una solución de bicarbonato de sodio en lugar de agua?
c) Qué sucedería en el sistema si modificara la distancia entre la planta y la lámpara?
d) Cambió el pH? Explique sus resultados.
e) Enuncie el objetivo de esta experiencia.
CONCLUSIONES:
42
EXPERIENCIA Nº 2: Consumo de CO2
MATERIALES:
Material vegetal: Elodea
Dos tubos de ensayo
Solución de rojo de fenol
Fuente de luz blanca.
Papel de aluminio.
PROCEDIMIENTO:
1. Colocar 10 ml de solución de rojo de fenol en dos tubos de ensayo e insuflar aire con una pipeta hasta
que la solución vire de color rojo a color amarillo.
2. Introducir en cada tubo de ensayo un trozo de Elodea.
3. Exponer un tubo a la luz y cubrir el otro con papel de aluminio (oscuridad).
4. Observar los tubos a los 45 min de iniciada la experiencia.
Fig. 2
CO
Rojo
RESULTADOS
Explique sus resultados fundamentándolos y discuta con sus compañeros.
CONCLUSIONES:
43
EXPERIENCIA Nº 3: Fotólisis del agua.
OBJETIVOS:
Proponer la hipótesis correspondiente para demostrar la reacción de Hill.
MATERIALES:
Material vegetal: hojas de Palam-palam o de espinaca (50 g)
Solución de NaCl 0,035 M.
Solución de NaCl 0,35 M.
-4
Solución de 2,6-diclorofenolindofenol 2,5 x 10 M
o
Licuadora (tanto el vaso de la licuadora como las soluciones deben mantenerse en frío (0-4 C)
Aislamiento de cloroplastos
Homogeneizar en licuadora 50 g de material vegetal en 100 ml de NaCl 0,35 M durante 1 min. Filtrar por
gasa doble, recoger en un vaso y mantener en baño de hielo. Tomar 30 ml del homogeneizado y
centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Decantar y eliminar el precipitado de restos celulares. Centrifugar
el sobrenadante a 4000 rpm durante 10 min. Separar el sobrenadante y resuspender el precipitado de
cloroplastos en NaCl 0,035 M (1 ml). Mantener en baño de hielo.
PROTOCOLO:
Realizar el protocolo de trabajo (en forma de tabla) para demostrar la hipótesis.
RESULTADOS
CONCLUSIONES
44
PROBLEMAS
1. Interprete el siguiente gráfico en el que se observan varios factores que afectan la velocidad de la
fotosíntesis:
*
Efecto de la intensidad de luz a:
Velocidad
de
fotosíntesis
1
2
1. 25ºC y CO2 0,4%
2. 15ºC y CO2 0,4%
3. 25ºC y CO2 0,01%
3
Intensidad de la luz incidente
¿Qué indica la zona marcada con *?
Concentración
2. Explique las causas de las interconversiones entre RuDp (ribulosa difosfato) y PGA (ácido
fosfoglicérico) en experimentos de fotosíntesis, cuando varían la intensidad de iluminación y la
concentración de CO2.
1% CO2
Oscuridad
Luz
0,003% CO2
RUDP
PGA
PGA
RUDP
Tiempo (min)
Tiempo (min)
o´
o´
+
3. Calcular ∆G y E para la reducción del NADP por FRS.
4. Calcular la fuerza electromotriz expresada en voltios, registrada por un electrodo sumergido en una
+
o
solución que contiene las siguientes mezclas de NAD y NADH a pH=7 y 25 C, con referencia a una
semicelda de 0,00V:
+
a) NAD 1 mM y NADH 10 mM
+
b) NAD 1 mM y NADH 1 mM
+
c) NAD 10 mM y NADH 10 mM
5. Ordenar las siguientes sustancias según su tendencia creciente a ceder electrones:
a) clorofila del fotosistema I, b) plastoquinona, c) ferredoxina, d) agua, e) Feofitina (pheo),
6. Ordenar las siguientes sustancia según su tendencia creciente a aceptar electrones:
+
a) clorofila del fotosistema II, b) P680*, c) NADP , de plastocianina.
7. Suponiendo que se necesitan 8 cuantos de luz para la incorporación de una molécula de CO2 en
moléculas de glúcidos por medio de la fotosíntesis, calcule la eficiencia termodinámica en
condiciones estándar, para la síntesis de 1 mol de glucosa, si la longitud de onda de la luz utilizada
es a) 400 nm y b) 750 nm.
45
8. El aparato fotosintético del alga verdeazulada contiene grandes cantidades de ficoeritrina y
ficocianina, además de la clorofila A. La ficoeritrina tiene una absorción máxima entre 480 y 680 nm;
la ficocianina a 620 nm. Sugerir la misión de estos pigmentos.
9. Observe y analice el siguiente gráfico. Indique el tipo de fosforilación y justifique su respuesta.
- - - µmoles de oxígeno liberado
___ µmoles de fosfato esterificado
Tiempo
10. Observe y analice el siguiente gráfico. Indique el tipo de fosforilación y justifique su respuesta.
- - - µmoles de oxígeno liberado
___ µmoles de fosfato esterificado
Tiempo
DATOS: Para resolver los problemas 5 y 6
Agua: +0,82 V
NADP+: -0,32 V
Ferredoxina: -0,4 V
P700: +0,4 V
P680: +0,95 V
P680*: -0,95 V
Feofitina (Pheo): -0.75 V
Plastoquinona: +0,1 V
BIBLIOGRAFÍA
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY.
USA. 2000.
. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
. Hall D.O., Rao K. Fotosíntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977.
. Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977.
o
. Andreo C., Vallejos R. Fotosíntesis. Serie Biología, monografía n 30 OEA, 1984.
. Molt A.S. et al. 1951, Plant Physiology, 26, 164-175.
. Torres H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioquímica General Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983.
. Harper H.A, Manual de química fisiológica. Ed. El manual moderno 1980
. Morris J., Fisicoquímica para biólogos.
. Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996.
. Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA.
Mexico, 1999.
46
TRABAJO PRACTICO Nº 7
MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN DE ENERGÍA
Los problemas y la guía de estudio deberán ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En
caso de necesitar aclarar dudas los docentes estrán disponibles en sus horarios de consulta, en la cátedra.
Los alumnos serán evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante la discusión del trabajo científico
(evaluación oral), sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP.
OBJETIVOS
- Reconocer la aplicabilidad de las leyes de la físicas a los sistemas biológicos.
- Analizar fenómenos biológicas desde un punto de vista termodinámico. Fotosíntesis, respiración y motores
moleculares como ejemplos.
TEMAS PARA REPASAR:
Energia libre de Gibbs; reaciones de oxido reducción; transferencia de energia en la fotosintesis; cadena respiratoria;
fuerza proton motriz; motores moleculares.
PROBLEMAS
1- Condiciones estándar frente a la vida real. La aldolasa cataliza la siguiente reacción en la glicólisis:
aldolasa
Fructosa 1,6-bifosfato
0
dihidroxiacetona fosfato + gliceraldehído 3-fosfato
-1
0
-1.
El ∆G ’ para esta reacción es de + 5,7 kcal.mol , mientras que el ∆G en la célula es -0,3 kcal.mol
Calcular la relación entre reactantes y productos en el equilibrio y en condiciones intracelulares.
Utilizando los resultados obtenidos explicar: ¿cómo puede resultar esta reacción endergónica en
condiciones estandar y exergónica en condiciones intracelulares?
2- No siempre es lo mismo. Las concentraciones de ATP, ADP y Pi difieren según el tipo de célula,
consecuentemente la liberación de energía libre para la hidrólisis de ATP será tambien diferente según el
tipo de célula. Utilizando los datos de la tabla siguiente, calcular ∆G para la hidrólisis de ATP en las
0
células de músculo, hígado y cerebro. Teniendo en cuenta que el ∆G ’ para esta reacción es de + 7,3
-1
kcal.mol ,
Hígado
Músculo
Cerebro
ATP (mM)
3,5
8,0
2,6
ADP (mM)
1,8
0,9
0,7
Pi (mM)
5,0
8,0
2,7
3- Fuerza ácida: El pK de un ácido es una medida de su potencial de transferencia de grupos protónicos.
0
a) Establecer una relación ∆G ’ y pK.
0
b)¿Cuál es el ∆G ’ para la iónización del ácido acético, si su pK es de 4,8?
47
0
4- Los opuestos se atraen. El gráfico siguiente mustra como el ∆G para la hidrólisis de ATP varía en
2+
2+
función de la concentración de Mg (pMg=log 1/[ Mg ]).
2+
a) ¿Cómo afecta el descenso de [Mg ] al ∆G para la hidrólisis de ATP?
b) ¿Cómo se puede explicar este efecto?
8.4
8.2
34
8.0
7.8
33
7.6
32
7.4
31
-1
35
-∆G (kcal.mol )
-1
-∆G (kj.mol )
36
7.2
30
2
3
4
5
6
7
8
pMg 2
5- Cambio de divisas. Para una fuerza protón-motriz de 0,2 V (negativa en el lado de la matriz). ¿Cuál es
el valor máximo del cociente [ATP]/ [ADP] [Pi ] compatible con la síntesis de ATP?. Calcular el valor de
este cociente de tres maneras, suponiendo que el número de protones translocados por cada ATP
formado es dos, tres, y cuatro respectivamente. La temperatura es de 25ºC.
6- Cruce de caminos. Es posible determinar el lugar exacto donde actúa un inhibidor de la cadena
respiratoria gracias a la técnica de punto y corte. Britton Chance diseño elegantes métodos
espectroscópicos para determinar el cociente entre las formas oxidada y reducida de cada uno de los
transportadores. Este cálculo es posible porque cada uno de los estados tiene un espectro de absorción
característico, tal y como se ilustra en el gráfico adjunto para el caso de citocromo c. Si usted se
encuentra en posesión de un inhibidor y descubre que al añadirlo a mitocondrias que respiran los
transportadores localizados entre el NADH y QH2 se encuentran más reducidos y los transportadores
localizados entre el fotocromo c y el O2 se encuentran más oxidados ¿en qué punto actúa el inhibidor?
48
7- Distancia. Supongamos que la transferencia de energía entre dos moléculas de clorofila a distantes
entre sí 10 Å tiene lugar en 10 picosegundos. Supongamos que la distancia se incrementa hasta 20 Å
manteniendo constantes el resto de los factores. ¿Cuánto tardará en ocurrir la transferencia de energía?
8- ¿Se dice que es lenta? A su máxima velocidad una molécula de quinesina se desplaza con una
velocidad de 6400 Å por segundo. Teniendo en cuenta que el tamaño de la región motriz del dímero de
quinesina es de 80 Å, calcular su velocidad en unidades de su tamaño por segundo. Según esta relación
¿cuál sería la velocidad correspondiente de un automóvil que tuviera una longitud de 3 metros?
9- Levantamiento de pesos. Un único dominio motor de la miosina puede desarrollar una fuerza de
aproximadamente 4 piconewtons (4pN) ¿Cuántas veces puede levantar su peso un dominio motor de
-2
miosina? Tener en cuenta que 1 newton = 1 kg fuerza (1kg masa m.s ). Considerar que la masa
molecular del dominio motor es de 100 kd.
10- Las helicasas como motores. Las helicasas tales como la PcrA pueden utilizar una hebra sencilla de
ADN como guía. En cada ciclo la helicasa se desplaza una base en el sentido 3’-5’. Teniendo en cuenta
que la PcrA en presencia de un molde formado por una hebra sencilla de ADN puede hidrolizar ATP con
una velocidad de 50 moléculas por segundo (se hidroliza una molecula por ciclo) y que la longuitud de
una base de ADN es 3,4 Å. ¿Cómo es esta velocidad comparada con la velocidad de la quinesina que es
de 6400 Å por segundo?¿A qué se puede deber la diferencia de velocidad entre estos dos motores
moeculares?.
11- Nuevamente se mueve. Cuando a las bacterias tales como E. coli se las mantiene en ayunas durante
un período de tiempo suficiente, dejan de moverse. Sin embargo, cuando estas bacterias inmóviles se
colocan en un medio ácido nuevamente comienzan a moverse. Aportar una explicación teniendo en
cuenta el mecanismo de movimiento del flagelo de una bacteria.
12- Arrastrar cargas. Considérese la actividad de una única molécula de quinesina que transporta una
vesícula a lo largo de un microtúbulo. La fuerza necesaria para arrastrar una partícula esférica de radio a
con una velocidad • en un medio de viscosidad η es:
F= 6 • • a •ν
-1
Supongamos que una esfera de 2 •m se transporta con una velocidad de 0,6 •m. s en un medio acuoso
-1
-1.
con una viscosidad de •= 0.01 g.cm . s
-2
a) ¿Cuánta es la fuerza desarrollada por la quinesina? Expresar el valor en dinas (1 dina= 1 g.cm. s )
b) ¿Cuánto trabajo realiza en un segundo? Expresar el valor en ergios (1 ergio=1 dina cm).
c) Un motor de quinesina hidroliza aproximadamente 80 moléculas de ATP por segundo. ¿Cuánta es la
energía asociada a esta hidrólisis de ATP expresada en ergios? Comparar este valor con el trabajo
realizado.
49
DISCUSIÓN DE TRABAJOS CIENTÍFICOS
GUÍA DE ESTUDIO.
Trabajo científico:
Yasuda, R., Noji, H., Kinosita, K., & Yoshida M.. (1998). F1-ATPase Is a Highly Efficient Molecular
Motor that Rotates with Discrete Steps. Cell. 93: 1117–1124.
1. ¿Cúal es la función del ATP sintetasa? ¿Cómo es su estructura? ¿Cuál es la función de cada una de
las subunidades?
2. ¿Qué fenómeno se observa si la parte F1 se encuentra en ausencia de la parte F0 en un medio que
contiene ATP?
3. ¿Cómo se logra experimentalmente observar la rotación γ del F1-ATPase?
4. Explicar brevemente los resultados que se observa en la Figura 2a y 2b.
5. A cuál de los experimentos que se realizaron en los T.Prácticos de la materia, se asemeja el
experimento del gráfico 2b.
BIBLIOGRAFÍA
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY.
USA. 2000.
. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.
50