Download análisis del proceso de replicación viral en células c6/36

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUEL NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
“ANÁLISIS DEL PROCESO DE REPLICACIÓN VIRAL EN CÉLULAS
C6/36 PERSISTENTEMENTE INFECTADAS CON EL VIRUS DEL
DENGUE SEROTIPO 2”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN
CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
PRESENTA:
QBP. PADILLA BLANQUET LESLY JARENI
DIRECTOR DE TESIS:
Dr. JUAN SANTIAGO SALAS BENITO
MEXICO, D.F., 30 DE NOVIEMBRE, 2012
1
2
3
Este trabajo fue realizado en el laboratorio III de Biomedicina Molecular de la
Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía del Instituto Politécnico Nacional
bajo la dirección del Dr. Juan Santiago Salas Benito, y por beca de CONACYT
y del Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) de la
Secretaría de investigación y Posgrado de IPN
Este trabajo fue apoyado por la Secretaría de Investigación y Posgrado del
Instituto Politécnico Nacional (Proyecto 20110915 y 20120932) y por el Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología (Proyecto P160883).
4
A G R A D E C I M I E N T O
Agradezco a Dios, por permitirme concluir este proyecto. A mis padres,
hermanos, cuñada e hijos y a todas las personas que directa o indirectamente
han tenido a bien ayudarme en forma moral y económica para mi formación
como ser humano y profesional.
A mi director de tesis el Dr. Juan S. Salas Benito, por su disposición, tiempo,
ayuda y sobre todo por su gran comprensión en el transcurso de este proyecto.
A los miembros de mi comité tutorial, Dra. Monica De Nova, Dra. Rosa Ma. Del
Ángel (CINVESTAV), Dra. Laurence Marchat, Dr. Guillermo Ishiwara, por sus
valiosas sugerencias durante el desarrollo de este trabajo.
A Job Alí (CINVESTAV),
por todo el apoyo y disposición que me brindo
durante todo este tiempo.
A la Dra. Marta Argüello, por su gran colaboración en este trabajo.
A las responsables del laboratorio, Mati y Marianita, gracias por el gran apoyo,
cariño y comprensión que me brindaron.
A mis compañeros de generación que de alguna manera no me dejaron caer y
me impulsaron a seguir con este proyecto, muy en especial a mis amigas,
Angie, Dorita, Ali y Viole.
A mis amigas del labo, Tania y Wendi, gracias por los consejos, cariño y apoyo
durante todo este tiempo.
5
D E D I C A T O R I A
Dedico este trabajo a mi hijo RAFITA, a quien jamás encontraré la forma de
agradecer su amor, comprensión y apoyo, esperando que algún día
comprendas que mis logros son también tuyos e inspirados en ti, hago de este
un triunfo y quiero compartirlo por siempre contigo. TE AMO MI VIDA.
A mis papas, MARIO y ALBERTA, sabiendo que no existirá forma alguna de
agradecer una vida de sacrificios, esfuerzos y amor, quiero que sientan que el
objetivo alcanzado también es de ustedes y que la fuerza que me ayudo a
conseguirlos fue siempre su gran apoyo. LOS AMO.
A mis hermanos, mi FLACO y NEGRO, quienes la ilusión de su vida ha sido
verme convertida en una mujer de provecho, gracias por todo el amor y apoyo
que siempre me han brindado
A mi cuñada y sobrino, FABY y OSMARITO, por todo el cariño y apoyo que me
han dado.
A Doña Emma y Don Luis, gracias por todo el apoyo incondicional que me
dieron.
Y a todas aquellas personas que comparten conmigo este triunfo, GRACIAS.
6
ÍNDICE
ABREVIATURAS……………………………………………………………………….....i
LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………………..iv
LISTA DE TABLAS Y GRAFICAS……………………...............................................v
RESUMEN……………………………………………………………………………….vii
ABSTRACT……………………………………………………………………………….ix
I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………….1
1.1 Epidemiología………………………………………………………………...1
1.2 Epidemiología de Dengue en México……………………………………...3
1.3 Virus del Dengue……………………………………………………………..5
1.4 Genoma Viral……………………………………………………………..…..6
1.5 Ciclo de Replicación del DENV………………………………………….....8
II. ANTECEDENTES……………………………………………………………………11
III. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………….16
IV. OBJETIVOS…………………………………………………………………………17
V. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL…………………………………………………..18
VI. MATERIAL Y METODOS………………………………………………………….19
VII. RESULTADOS……………………………………………………………………..31
VIII. DISCUSIÓN………………………………………………………………………..55
IX. CONCLUSIONES…………………………………………………………………...63
X. ANEXOS……………………………………………………………………………...64
XI. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………...66
7
ABREVIATURAS
Ag.- Antígeno
BHK-21.- Fibroblastos de riñón de hamster
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
C.- Proteína estructural de la cápside
CDC.- Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades
CENAVECE.- Centro Nacional de Vigilancia Epidemiológica y Control de
Enfermedades
CEVECE.- Centro Estatal de Vigilancia Epidemiológica y Control de
Enfermedades.
cHP.- Región codificante de la proteína de la cápside
CS.- Secuencia de circularización
CPE.- Efecto citopático
CO2.- Dióxido de carbono
C6/36.- Células de Aedes albopictus
C6-L.- Células de Aedes albopictus persistentemente infectadas
D1.- Dengue serotipo 1
D2.- Dengue serotipo 2
D3.- Dengue serotipo 3
D4.- Dengue serotipo 4
DENV-1.- Virus del Dengue serotipo 1
DENV-2.- Virus del Dengue serotipo 2
DENV-3.- Virus del Dengue serotipo 3
DENV-4 .- Virus del Dengue serotipo 4
DENV.- Virus del Dengue
DEPC.- Dietilpirocarbonato
DI.- Defectuosos interferentes
dNTPs.- Desoxirribonucleótidos trifosfato
DNA.- Ácido desoxiribonucleico
DO.- Densidad óptica
E.- Proteína estructural de la Envoltura
EBV.- Virus de Epstein Bar
i
EDTA.- Ácido etilén diamín tetracético
ETV.- Enfermedades Transmitidas por Vector
FD.-Fiebre por Dengue
FHD.-Fiebre Hemorrágica por Dengue
JEV.-Virus de la encefalitis Japonesa
kb.- Kilobases
MEM.- Medio Esencial Mínimo
MgSO4 .- Sulfato de magnesio
min.- Minutos
ml.- Mililitros
mM.- Micromolar
nm.- Nanometros
NaCl.- Cloruro de sodio
NS1.-Proteína no estructural 1
NS2A.- Proteína no estructural 2A
NS2B.- Proteína no estructural 2B
NS3.- Proteína no estructural 3
NS4A.- Proteína no estructural 4A
NS4B.- Proteína no estructural 4B
NS5.- Proteína no estructural 5
No.- Número
OMS.-Organización Mundial de la Salud
pb.- Pares de bases
PBS.- Buffer Fosfato Salino
PCR.- Reacción en cadena de la polimerasa
pH.- Potencial de hidrógeno
prM.- Proteína estructural de Membrana
qPCR.- PCR en tiempo real
qRT-PCR.- RT-PCR en tiempo real
RdRP.- RNA polimerasa dependiente de RNA
RNA.-Ácido Ribonucleico
RNT.- Regiones no traducidas
RT.- Retrotranscriptasa
RT-PCR.- Reacción de la Cadena de Polimerasa en Transcripción Reversa
ii
s.- Segundos
SCD.- Síndrome de Choque por Dengue
SFB.- Suero fetal bovino
SL.- Estructura de tallo y burbuja
SLA.- Estructura de tallo y burbuja A
Tfl.- Thermas flavus
U.- Unidades
UAR.- Región rio arriba del codón AUG
UTR.- Región no traducida
VSV.- Virus de la estomatitis vesicular
V.- Volts
µl.- Microlitros
µg.- Microgramos
°C.- Grados centígrados
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Representación geográfica de los países tropicales y subtropicales
afectados por el mosquito transmisor del virus del Dengue, Aedes
aegypti…………………………………………………………………………………..1
Figura 1.2. Incidencia de Dengue en América, 1980-2010………………..…..…2
Figura 1.3. Representación del Panorama Epidemiológico de Fiebre y Fiebre
Hemorrágica por Dengue en México durante el 2011 según la Secretaria de
Salud....................................................................................................................4
Figura 1.4. Transmisión del virus dengue………………………………..………...5
Figura 1.5. Representación esquemática de los principales componentes del
genoma del virus del Dengue…………………………………..…………………….7
Figura 1.6. Ciclo de replicación del DENV…………………………………………9
Figura 7.4. Multiplaca de células C6/36 teñida con Naftol blue-black………....34
Figura 7.5. Ensayo de placa lítica de DENV-4 en células BKH-21………….……35
Figura 7.6. Integridad de RNA de las células C6/36 y C6-L infectadas con cada
uno de los serotipos del DENV (D1, D2, D3 y D4) por 24 h y no infectadas.....36
Figura 7.7. Integridad de RNA de las células C6/36 y C6-L infectadas con cada
uno de los serotipos del DENV (D1, D2, D3 y D4) por 48 h y no infectadas.....36
Figura 7.8. Reacción de RT-PCR con oligonucleótidos DV1 sentido y
antisentido…………..………………………………………………………………...37
Figura 7.9. Reacción de PCR-Anidada con oligonucleótidos específicos para
cada unos de los serotipos del DENV………….……….…………………………38
Figura 7.10. RT-PCR y PCR-Anidada de células C6-L………………...……….38
Figura 7.11. Purificación de los productos de la PCR-Anidada de las C6/36
infectadas para cada uno de los serotipos del DENV…………………..………..39
Figura 7.12. Secuencias correspondientes a cada uno de los productos
amplificados en la PCR-Anidada……………………...……………………...........40
Figura 7.14. RT-PCR de DENV….……………………………………………………………42
Figura 7.15. RT-PCR en tiempo real del gen S7………..……………………….43
Figura 7.18. DNA de clonas positivas……………………………………..………45
Figura 7.19. PCR para DEN2………………………………………...……………45
iv
LISTA DE TABLAS Y GRÁFICAS
Tabla 6.1. Secuencias de los oligonucleótidos para la RT-PCR de punto final y
secuencias de los oligonucleótidos para la PCR anidada…………………..…..24
Tabla 6.2. Secuencias de los oligonucleótidos para la RT-PCR en tiempo real
del DENV……….……………………………………………………………………..25
Tabla 7.1. Lotes del DENV evaluados por Platelia………………………..……..32
Tabla 7.13. Análisis “Blast2 de la secuenciación de los productos obtenidos de
la PCR-anidada de los cuatro serotipos del DENV………………………………41
Tabla 7.16. Concentraciones de RNA y número de copias a las que
corresponde del gen S7……………………..………………………………………44
Tabla 7.20. Concentraciones de DNA y número de copias a las que
corresponde DENV-2………………………..………………………………………46
Tabla 7.22. Cuantificación del genoma de DENV-1 a las 24 y 48h postinfección
en células C6/36 y C6-L……………………………………………………….…….47
Tabla 7.23. Cuantificación del RNA del gen S7 en células C6/36 y C6-L
infectadas con DENV-1 por 24 y 48h……………………………………..……….47
Tabla 7.26. Cuantificación del genoma de DENV-3 en células C6/36 y C6-L a
las 24 y 48h postinfección…………………………………………………………..49
Tabla 7.27. Cuantificación del RNA del gen S7 en células C6/36 y C6-L
infectadas por 24 y 48h con DENV-3 o no infectadas (NI)…………..………….50
Tabla 7.30. Cuantificación del genoma de DENV-4 en células C6/36 y C6-L
infectadas por 24 y 48h……………………………………………..……………….52
Tabla 7.31. Cuantificación del RNA del gen S7 en células C6/36 y C6-L
infectadas con DENV-4 por 24 y 48h o no infectadas (NI)…………………..….52
Gráfica 7.2. Ensayo de Platelia de DENV-1, 2 y 3………………………..……..32
Gráfica 7.3. Evaluación de lote y dilución más adecuada para cada serotipo del
DENV evaluados por el kit de Platelia…………………..…………………………33
Gráfica 7.17. Curva estándar del gen S7…………………………………..……..44
Gráfica 7.21 Curva patrón de DENV-2…………..………………………………..46
Gráfica 7.24. Cuantificación del genoma viral de DENV-1 en las células C6/36
y C6-L a las 24 y 48h postinfección……………………………………………......48
v
Gráfica 7.25. Cuantificación del RNA del gen S7 en células C6/36 y C6-L
infectadas con DENV-1 por 24 y 48h o no infectadas (NI)…………………..….49
Gráfica 7.28. Cuantificación del genoma viral de DENV-3 en las células C6/36
y C6-L a las 24 y 48h postinfección…………………...…………………………...50
Gráfica 7.29. Cuantificación del RNA del gen S7 en células C6/36 y C6-L
infectadas con DENV-3 por 24 y 48h o no infectadas (NI)……………………...51
Gráfica 7.32. Cuantificación del genoma viral de DENV-4 en las células C6/36
y C6-L a las 24 y 48h postinfección…………………………...…………………...53
Gráfica 7.33. Cuantificación del RNA del gen S7 en células C6/36 y C6-L
infectadas con DENV-3 por 24 y 48h o no infectadas (NI)………………………53
vi
RESUMEN
Actualmente el dengue es la enfermedad viral más importante transmitida por
un artrópodo del género Aedes. El virus del Dengue es causante de la Fiebre
por Dengue, Fiebre Hemorrágica por Dengue y del Síndrome de Choque por
Dengue que puede causar la muerte del paciente. El virus del Dengue,
pertenece a la familia Flaviviridae, y es un virus de RNA de cadena sencilla y
polaridad positiva. Existen 4 serotipos (1-4), que son antigénicamente
diferentes.
La interferencia viral es un fenómeno en donde la infección de un virus a una
célula resulta en la inhibición de la infección de otro y está determinada por
diversos factores, entre ellos las partículas defectuosas interferentes. Éstas se
generan durante el proceso de replicación viral, especialmente en virus de
RNA, debido la falta de actividad de “proof reading” de la RNA polimerasa viral
y se caracterizan por poseer mutaciones o deleciones importantes que las
hacen dependientes del virus silvestre o parental para poderse replicar. Como
su replicación resulta más eficiente, son capaces de competir por la maquinaria
celular y viral en el proceso replicativo ocasionando una disminución en la
replicación del virus parental, lo cual se traduce en un proceso de interferencia
viral. Este tipo de partículas han sido implicadas en el establecimiento y
mantenimiento de las infecciones virales de tipo persistente como las que
establece el virus del Dengue en su vector.
En el laboratorio de biomedicina molecular III se cuenta con la línea celular
C6/36, del mosquito Aedes albopictus, persistentemente infectada con el
serotipo 2 del virus del Dengue (C6-L) que presenta genomas virales
defectuosos y que ha desarrollado mecanismos de interferencia viral homóloga
que no han sido caracterizados pero que podrían estar a nivel de la replicación
viral.
En este trabajo se estandarizó la técnica de RT-PCR en tiempo real para
cuantificar el genoma del virus Dengue tanto en células C6/36 como en C6-L y
con ello conocer la eficiencia de la replicación viral en ambas líneas celulares
infectadas con cada uno de los serotipos del DENV por 24 y 48 h. Al comparar
el número de copias del genoma viral de las líneas celulares infectadas con los
serotipos 3 y 4, se observó una disminución en las células C6-L sugiriendo un
vii
fenómeno de interferencial viral a nivel de la replicación. Sin embargo, este
efecto no se observó en el serotipo 1, sugiriendo que este proceso de
interferencia es dependiente del serotipo. Estos resultados nos proporcionan
datos muy interesantes que nos ayudan a empezar a comprender los
mecanismos involucrados en el proceso de interferencia viral útiles para
proponer nuevas estrategias útiles en la erradicación o control de la transmisión
de este virus.
viii
ABSTRACT
Dengue is currently the most important viral disease transmitted by an
arthropod of the genus Aedes. Dengue virus causes diseases known as dengue
fever, dengue haemorragic fever and dengue shock syndrome that could be
fatal. Dengue virus, a member of the Flaviviridae family, is a positive singlestranded RNA virus . With are four antigenically different serotypes (1-4).
The viral interference is a phenomenon where the virus infection of a cell results
in the inhibition of the infection by other and it is determined by several factors
included the defective interfering particles, among others. These viral particles
are generated during the replicative process, especially in RNA viruses, due the
absence of proof reading activity of the viral RNA polymerase. They are
characterized by the presence of mutations and important deletions in their
genomes. Therefore they need the participation of the wild type virus during
their replication but at the same time are able to compete with the viral and
celular factors required for replication resulting in a reduction of wild type virus
titers and a homologous viral interference phenomenon. These defective viral
particles have been involved in the establishment and maintenance of
persistent viral infections like Dengue virus establishes in its vector.
The Biomedicina Molecular III laboratory has developed a C6/36 cell line from
Aedes albopictus mosquitoes persistently infected with Dengue virus type 2
(C6-L) where viral defective genomes have been detected and displays
homologous viral interference mechanisms not characterized yet but probably
at level of viral replication.
In this work the real time RT-PCR technique was standardized in order to
quantify the Dengue virus genomes in C6/36 as well as in C6-L cells. This
technique was used to evaluate the replication eficiency in both cell lines
infected with the Dengue virus serotypes for 24 and 48 hours. When the copy
number of viral genomes in both cell lines infected with serotypes 3 and 4 was
compared, an important reduction in C6-L was observed suggesting the
presence of viral interference at a replication level. However this effect was not
observed when the infection was performed with serotype 1, suggesting that the
viral interference is serotype dependent. These results provide interesting data
that will be helpful to understand the mechanisms involved in the viral
ix
interference process and will be useful to develop new strategies to eradicate or
to control the transmission of Dengue virus by its vector.
x
I. INTRODUCCIÓN
1.1 Epidemiología
En la actualidad el dengue es la enfermedad viral más importante transmitida
por un artrópodo y la Organización Mundial de Salud (OMS) calcula que más
de 2.5 billones de personas corren el riesgo de infección por el virus del
Dengue (DENV) (Guha 2005).
Esta enfermedad es transmitida por un mosquito que habita en las zonas
tropicales y subtropicales (Ling 2006) (figura 1.1) y que se reconoció por
primera vez en 1950. El número promedio de casos reportado por la OMS por
año ha aumentado de 908 casos entre 1950 y 1959 a 514 139 entre 1990 y
1999. Ahora, la cifra real se estima en cerca de 50 millones de casos al año
causando 24 000 muertes (Guha 2005).
Figura 1.1. Representación geográfica de los países tropicales y subtropicales afectados por el
mosquito transmisor del virus del Dengue, Aedes aegypti (Ling 2006).
Durante las últimas décadas, la enfermedad se ha extendido a la mayoría de
los países tropicales y se ha convertido en una importante causa de muerte y
hospitalización. Asia es una de las regiones más afectadas con 182 004 casos
1
concentrados especialmente en el sureste y regiones del Pacífico occidental
(Ling 2006), donde la fiebre hemorrágica por dengue (FHD) es la principal
causa de morbilidad y mortalidad entre los niños (Castro 2011). En Indonesia
se encontró que los serotipos más prevalentes en los 80s fueron el 1 y el 2
pero recientemente el 3 es el serotipo más predominante, aunque el 4 ha sido
el más aislado en todas las epidemias, principalmente en infecciones
secundarias (Malavige 2004).
Desde su aparición en América, el DENV se ha extendido dramáticamente a lo
largo de la región (figura 1.2) (Tapia 2012). La primera epidemia de fiebre por
dengue (FD) ocurrió en Cuba entre 1977 y 1978, causada por el serotipo 1,
seguida por la epidemia de FHD en 1981 causada por el serotipo 2 (Malavige
2004). El número de casos ha aumentado de 1,033,417 en 1980 a 2,725,405
en 1990, y 4,759,007 entre 2000 y 2007.
Figura 1.2. Incidencia de Dengue en América, 1980-2010 (Tapia 2012).
Entre 2001 y 2009, seis países representaron más del 75% de todos los casos
de la región: Venezuela, Brasil, Costa Rica, Colombia, Honduras y México. En
el 2011, más de un millón de casos de FD se han reportado en la mayoría de
los países de este continente, con más de 18,000 casos de dengue severos y
716 muertes, encontrándose los cuatro serotipos del virus en circulación (Tapia
2012).
2
1.2 Epidemiología del Dengue en México
En México, como en otras partes del mundo, la presencia del dengue está
condicionada a la existencia del vector, quien habita en áreas bien
determinadas (CENAVECE 2011). Se estima que cerca del 60% del territorio
nacional presenta condiciones que favorecen la diseminación de las
enfermedades trasmitidas por vector (ETV), en donde residen más de 50
millones de personas y se localiza la mayor parte de los centros agrícolas,
ganaderos, industriales, pesqueros, petroleros y turísticos, de importancia para
el país. Dentro de las ETVs, la más importante en México es el dengue
(CEVECE 2012). Los estados de la República que tienen menor riesgo a tener
dengue son: Baja California, Chihuahua, Durango, Zacatecas, Aguascalientes,
Guanajuato, Querétaro, Tlaxcala y el D.F, mientras que Sonora, Nuevo León,
Tamaulipas, Sinaloa, Veracruz, Nayarit, Jalisco, Colima, Michoacán, Guerrero,
Oaxaca, Chiapas, Tabasco, Campeche, Yucatán y Quintana Roo, son los de
mayor riesgo.
Los primeros casos de FHD identificados en la República Mexicana se
presentaron en San Luis Potosí, situación que prevaleció durante dos años; sin
embargo, la frecuencia de esta enfermedad se incrementó en número de casos
y en extensión territorial a partir de 1990. Hasta el 2011 el estado de Colima
presentaba la incidencia más alta (3.25) según reportes del Panorama
Epidemiológico de Fiebre y Fiebre Hemorrágica por Dengue, México, 2011 de
la Secretaria de Salud (figura 1.3) (CENAVECE 2011).
3
Figura 1.3. Representación del Panorama Epidemiológico de Fiebre y Fiebre Hemorrágica por
Dengue en México durante el 2011 según la Secretaria de Salud (CENAVECE 2011).
En la actualidad, de acuerdo al SINAVE y al INDRE, al 24 de julio, el número
de casos de FD, en lo que va del año 2012, asciende a 6,811 y los casos de
FHD han alcanzado los 3,259; para un total de casos de 10,070; este último
dato es casi cuatro veces que el reportado en la misma semana el año anterior.
En este periodo, el estado de Campeche es el que tuvo mayor incidencia de
casos de dengue con 138.8 por 100,000 habitantes. Los serotipos 1 y 2 del
DENV están presentes en todas las zonas endémicas, no así el serotipo 3,
cuya presencia se limita al estado de Chiapas y el serotipo 4 se ha observado
en Chiapas, Tabasco, Veracruz y Michoacán. En cuanto al número absoluto de
casos, la entidad federativa con mayor número es Yucatán con 1,754; seguida
por Veracruz con 1,648; Chiapas con 1,204; Campeche con 842; Guerrero con
800; Tabasco con 727; Oaxaca con 544; Nuevo León con 474 y Morelos con
519 (CEVECE 2012).
4
1.3 Virus del Dengue
El DENV es un patógeno humano causante de la FD, FHD y en casos severos
choque por dengue (SCD) (Kanthong 2007). El ciclo de transmisión del virus
involucra principalmente humanos y mosquitos (figura 1.4) (Franz 2006) del
género Aedes, Aedes aegypti, Aedes albopictus, Aedes polynesiensis,
dependiendo de la localización geográfica, siendo el primero el principal vector
(Adelman 2002). Éstos ingieren el virus, el cual
posteriormente alcanza el
intestino medio, en donde primero interactúa con los receptores de membrana
de las células y entra a través de endocitocis mediada por receptor. Después
se replica y se disemina a través de la hemolinfa a las glándulas salivales,
entre otros tejidos, para transmitirlo a los humanos durante la ingesta de sangre
(Guo 2010). El periodo de incubación extrínseca del DENV en el mosquito es
de 7-14 días y depende de la especie del vector, el genotipo del virus y los
factores ambientales, tales como humedad y temperatura (Xi 2008).
Inicialmente en el humano el DENV se replica en las células dendríticas de la
piel, y posiblemente los blancos secundarios son las células mononucleares de
sangre periférica, el bazo, los nódulos linfáticos, el hígado y el timo. En
particular los virus interactúan con los monocitos, macrófagos y células B
(Marija 2005).
Figura 1.4. Transmisión del virus dengue (SSA).
5
Las manifestaciones clínicas de la enfermedad ocasionada por este virus van
desde un cuadro parecido al de la influenza, conocida como FD, que se
caracteriza por fiebres muy altas, dolor de cabeza, dolor retro-orbital, artralgia,
y salpullido, pero rara vez causa la muerte. Mientras que la FHD es severa,
pues ocasiona hemorragias, trombocitopenia y fuga plasmática. El SCD incluye
todas las manifestaciones antes mencionadas, además de insuficiencia
circulatoria, hipotensión y puede ser mortal (Guha 2005).
El DENV es transmitido principalmente por la hembra de Aedes aegypti y como
vector secundario Aedes albopictus. La participación de estos mosquitos en la
transmisión depende de la localización geográfica pero ambos pueden ser
encontrados en muchas áreas urbanas y suburbanas (Malavige 2004). La
transmisión y la propagación de la infección por el DENV son determinadas por
la interacción de múltiples factores incluyendo el nivel de inmunidad de la
población humana; características de virulencia de la cepa viral; los factores
climáticos, como la temperatura y la lluvia; la supervivencia, la abundancia, la
alimentación de las hembras de Aedes y la densidad de la población humana,
entre otros (Vázquez 2010). La temperatura, las precipitaciones pluviales y la
humedad influyen en todas las etapas del desarrollo de los vectores, por
ejemplo, en la viabilidad de los huevos, el tamaño y la longevidad de los
mosquitos adultos así como de su dispersión en un área geográfica. Por otra
parte, factores como la urbanización no planificada, el alto índice de población,
la precariedad en la recolección de basura y en el suministro de agua,
problemas frecuentes en países en desarrollo, favorecen la proliferación de los
criaderos y diseminación de la infección causando epidemias de dengue
(Castro 2011).
1.4 Genoma viral
DENV es un virus envuelto que pertenece al género Flavivirus de la familia
Flaviviridae (Ling 2006). El virus incluye cuatro serotipos antigénicamente
diferenciables denominados 1, 2, 3 y 4 (Richardson 2006) y la infección por un
serotipo produce inmunidad para el mismo pero no protege contra la infección
por los otros (Castro 2011). El genoma de DENV es una cadena de RNA de
polaridad positiva con una longitud aproximada de 10.7kb. Codifica para una
6
poliproteína que es procesada proteolíticamente durante y después de la
traducción en 10 proteínas virales (Friebe 2010): tres estructurales y siete no
estructurales en el orden 5´ C (cápside), prM (membrana), E (envoltura), NS1,
NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5 3´ (Adelman 2002). Aunque no han
sido totalmente caracterizadas, se sabe que la proteína NS1 puede estar
involucrada en el ensamble del complejo replicativo (Lindenbach 1997, Ludert
2008), el extremo N-terminal de la proteína NS3 codifica para una serin
proteasa esencial para el procesamiento de la poliproteína viral mientras que la
región C-terminal posee un docimnio con actividad de helicasa que le permite a
esta proteína participar en la replicación. La proteína NS2B es un cofactor
coadyuva a la actividad de serin proteasa de la NS3 (Guo 2010). Mientras que
NS5, la más grande de las proteínas virales, funciona como una RNA
polimerasa dependiente de RNA (RdRP).
La región codificante del genoma viral está flanqueada en sus dos extremos
por regiones no traducidas (UTR). El extremo 5´ tiene un “Cap” tipo I
(m7GpppAmp) que permite la traducción “Cap” dependiente por parte de la
maquinaria celular pero puede recurrir a un mecanismo de traducción no
canónica bajo condiciones en las cuales los factores de la traducción son
limitados. Carece de cola de poli A en su región 3´ no traducida (figura 1.5)
(Friebe 2010).
Figura 1.5. Representación esquemática de los principales componentes del genoma del virus
del Dengue (Clyde 2006).
7
1.5 Ciclo de Replicación del DENV
La infección por DENV requiere de tiempo, espacio y de los mecanismos
moleculares de la replicación viral coordinados. El ciclo replicativo empieza
cuando el DENV se une y entra a una célula huésped vía endocitosis mediada
por receptor (Clyde 2006). Se ha descrito que los receptores a laminina,
lectinas y proteínas de choque térmico, así como una ruta de endocitosis
mediada por clatrina, son usadas en una infección por DENV en humanos y
mosquitos (Guo 2010, Paranjape 2010). Una vez internalizado, ocurre la
acidificación del endosoma que da lugar a la fusión de la membrana viral con la
vesicular permitiendo la entrada de la nucleocapside en el citoplasma y la
pérdida de la envoltura del genoma. La cadena de RNA se traduce para
generar las proteínas virales y posteriormente se inicia el proceso replicativo
donde ocurre la síntesis de una cadena negativa intermediaria que sirve como
molde para la producción de múltiples copias de RNA de polaridad positiva,
que posteriormente se ensamblan con las proteínas virales (Paranjape 2010,
Clyde 2006,) en el retículo endoplásmico o en vesículas derivadas del mismo
(Marija 2005) para formar los viriones que serán transportados a través de los
compartimentos del aparato Golgi y liberados por exocitosis (Clyde 2006,
Paranjape 2010) (figura 1.6).
La replicación del DENV involucra tres distintas especies de RNA: el genómico
de polaridad positiva, el antisentido de polaridad negativa y un RNA de doble
cadena (dsRNA); estas dos últimas especies sólo se presentan cuando el virus
se está replicando (Richardson 2006). A partir del RNA genómico de polaridad
positiva se sintetiza el de cadena negativa, la cual servirá entonces como
molde para la síntesis de varias cadenas de polaridad positiva.
8
Figura 1.6. Ciclo de replicación del DENV. Se representa los principales pasos, como: la
adsorción, penetración, fusión, traducción, replicación, ensamble y liberación del virus Dengue
(Salas 2011).
La circularización es necesaria para la replicación del RNA viral y es mediada
por dos secuencias complementarias identificadas en los extremos 5´y 3´. La
primera son las secuencias CS presentes en los dos extremos del genoma y la
segunda, conocida como región rio arriba del codón
AUG del extremo 5´
(UAR), que se une a su complementaria UAR del 3’ adyacente a una estructura
de tallo y burbuja denominada SL. Además de los dos elementos presentes en
el extremo 5´ esenciales para la circularización, hay una estructura de tallo y
burbuja A (SLA) y una región tipo horquilla que se encuentra dentro de la
región codificante de la proteína de la cápside (cHP). La SLA se compone de
los primeros 70 nucleótidos del genoma y se ha identificado como un promotor
para la síntesis del RNA, reclutando a la RdRp viral NS5. Una vez que NS5 se
una a SLA en el extremo 5´, se cree es “transferida” al sitio de inicio 3´ para la
9
síntesis de la cadena de RNA negativa por la vía de la circularización RNARNA debida a la interacción de ambos extremos del genoma. En el caso de la
región cHP parece que estabiliza toda la estructura 5´- 3´o participa en el
reclutamiento de los factores asociados con la maquinaria de la replicación
(Friebe 2010).
10
II. ANTECEDENTES
La interferencia viral es un fenómeno en el cual la infección por un virus resulta
en la inhibición de la replicación de otro. Existen diferentes tipos de
interferencia: la heteróloga, cuando se inhibe la replicación de un virus que
pertenece a una familia diferente a la del virus silvestre; y la homóloga, cuando
ambos virus pertenecen a la misma familia (Londiz 2001). El fenómeno de
interferencia viral todavía no está completamente entendido pero se sabe que
puede estar determinado tanto por factores relacionados tanto con la célula
huésped como con el virus. Por ejemplo, los receptores virales, que son las
primeras moléculas con las cuales el virión tiene interacción en la superficie
celular, pueden verse modificados. Este es el caso del Poliovirus (PV), que
necesita de la unión con su receptor celular PVR (“Poliovirus receptor” por sus
siglas en inglés) o CD155 para iniciar la infección (Kaplan 1989). Kaplan y
colaboradores demuestran que las células SOFIA, variantes de las células
HeLa, se vuelven resistentes a la infección por PV debido a la ausencia del
receptor con lo que se bloquea la entrada y, por lo tanto, la replicación viral
estableciéndose así una interferencia de tipo homólogo determinada por un
factor de la célula huésped (Kaplan, 1989). Posteriormente se descubrió que la
ausencia del receptor es debida a alguna modificación transcripcional ya que el
mRNA del receptor no es detectado y existe una desregulación de la expresión
del gen (Kaplan 1990). En otros casos el receptor viral puede estar presente
pero modificado. Pavio y colaboradores encontraron que las mutaciones
ocurridas en el PVR de las células IMR-32 sometidas a una infección
persistente con PV, incrementan su resistencia a ser infectadas por éste. En
este caso, aun cuando PVR está presente en la superficie celular e
interacciona con el virus, las mutaciones encontradas alteran la eficiencia del
proceso de entrada (Pavio, 2000). En el caso del virus de la inmunodeficiencia
humana (HIV), la proteína Nef es esencial para la replicación y la persistencia
viral. Su papel principal es la alteración de la expresión en superficie de
moléculas importantes para una sinapsis inmune (Ranjan, 2005). Hua y
colaboradores han demostrado que Nef desregula la expresión del receptor de
superficie CD4, molécula que actúa como receptor de HIV en los linfocitos y
11
macrófagos con lo cual se ve bloqueada la infección por nuevos viriones (Hua,
1997).
Para muchos virus, el paso inicial en el establecimiento de la infección es la
evasión de la respuesta inmune antiviral provista por el sistema del interferón
(IFN). El IFN es una familia de citocinas inducibles con actividad antiviral y
comúnmente agrupados en dos tipos. El tipo I, incluye el IFN-α (leucocitos),
IFN- β (fibroblasto) e IFN-ω. Y el tipo II, conocido como IFN inmune (IFN-γ). El
IFN de tipo I es inducido por una infección viral, siendo el IFN-β el principal
(Diamond, 2000). Los IFNs ejercen sus acciones a través de receptores de
superficie celular afines que son en gran parte especies específicas. El
y
parecen tener un receptor común, compuesto por dos subunidades: IFNAR-1 y
el IFNAR-2, mientras que el
se une a IFNGR-1 e IFNGR-2. Su ruta de
señalización es regulada por las proteínas JAK-STAT. El proceso de
señalización es iniciado con la unión del ligando del IFN a las subunidades
afines del receptor, lo que conduce a la activación de los factores de
transcripción y la fosforilación de tirosina por las proteínas JAK-STAT,
induciendo así un estado antiviral (Samuel, 2001). Varios estudios sugieren que
el interferón
,
y
modulan la infección por miembros de la familia
Flaviviridae in vitro e in vivo. Diamond y colaboradores demuestran que el IFN
inhibe la infección por DENV reduciendo significativamente los niveles del RNA
viral, sugiriendo que el interferón deteriora o estabiliza el RNA viral de cadena
negativa del DENV y que puede ser capaz de limitar la respuesta antiviral,
proponiendo este sistema como otro mecanismo de interferencia viral
(Diamond, 2000).
Como la mayoría de los virus transmitidos por artrópodos, el DENV puede
causar daños significativos cuando infecta células de vertebrados, sin embargo,
las células de mosquito mantienen infecciones persistentes, no citopáticas; por
lo tanto han desarrollado mecanismos para contrarrestar o controlar
específicamente la replicación del virus sin perjudicar significativamente la
función del vector (Adelman 2002). En Ae. aegypti, principal vector del DENV,
se han identificado y caracterizado dos caspasas iniciadoras de la apoptosis,
sugiriendo que este mecanismo puede funcionar como una respuesta inmune
que usa el vector para regular el establecimiento y replicación de parásitos
12
intracelulares como los virus (Baron 2008). En una infección por DENV el
mosquito se defiende por el sistema inmune innato, incluyendo iRNA y la vía
Toll (Guo 2010). La activación de la vía Toll por microorganismos a través de
los receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) conducen a una cascada
de eventos que resultan en la degradación del regulador negativo Cactus, la
translocación de factores de transcripción al núcleo tales como Dif, y un rápido
incremento de los compuestos antimicrobianos y otros factores (Xi 2008). Se
ha mostrado que en Ae. aegypti, la via Toll, la cual también está implicada en la
protección contra ciertos virus en Drosophila, controla la replicación del DENV
después del establecimiento de una infección persistente (Sanchez 2009). Xi y
colaboradores demostraron que en una infección por DENV-2 en Ae. aegypti
se induce una respuesta transcripcional inducida por genes de la ruta Toll y
Jak-Stat (Xi 2008). Por otra parte Ramírez y colaboradores mostraron que la
vía Toll es una potente defensa contra varios serotipos del DENV en etapas
tempranas de la infección en el mosquito. Esta vía induce la transcripción de
genes relacionados con la respuesta inmunes a través de la activación del
factor de transcripción Rel1 (Ramírez 2010).
En una infección por virus en vertebrados, el dsRNA desencadena un número
de respuestas antivirales mediante la inducción de
interferón
y
y la
activación de enzimas tales como la proteína cinasa R y 2´5´-oligoadenil
sintetasa, pero estos no son defensas que existen en el mosquito. Sin embargo
Adelman y colaboradores sugieren que el dsRNA producido como producto
intermedio en la replicación del virus es una señal que pone en marcha el
sistema de defensa del mosquito (Adelman), como son los RNA interferentes
(iRNA). Los iRNA son un mecanismo de defensa innata usada por
invertebrados para inhibir las infecciones por virus de RNA; sin embargo, se
conoce poco del papel antiviral de los iRNA en mosquitos. Sánchez y
colaboradores mostraron que en una infección por DENV 2 en Ae. aegypti
normalmente se generan pequeños RNAs interferentes (siRNA) específicos
contra DENV 2, lo cual corresponde a una respuesta por iRNA, sin embargo en
una infección persistente en mosquitos se sugiere que el virus evade esta
respuesta (Sánchez 2009) aunque puede ser un modulador importante en
este tipo de infección (Wu 2010).
13
En relación al virus, las partículas defectuosas (DI) fueron inicialmente
descritas para el virus de la influenza por von Magnus quien observó su
producción en embriones de pollo después de la infección con un gran inóculo
(Huang 1973). El análisis estructural de los genomas de las partículas DI revela
que la mayoría son mutantes virales (deleciones) originadas a partir del
genoma del virus silvestre. Son incapaces de replicarse por sí solas (Stollar
1979) y aunque las señales esenciales de la replicación y encapsidación están
preservadas, usualmente carecen de las secuencias que codifican para una o
varias proteínas, lo cual origina, por un lado, una alta dependencia por el virus
silvestre, pero por otro, una competencia por los factores de replicación y
encapsidación, lo que afecta la replicación y eventualmente conduce a una
reducción de los títulos virales del virus parental o silvestre (Lancaster 1998).
Esta interferencia por las partículas DI no es mediada por interferón y es
específica para el sistema homólogo del cual la partícula es derivada (Huang
1973). Las partículas DI representan un buen elemento de control de la
replicación del virus. Constantemente se generan por bajos niveles del virus
infeccioso y sólo hay interferencia cuando el virus silvestre es abundante
(Perrault 1981). La manera habitual de producir partículas DI en la mayoría de
los virus es llevar a cabo una serie de pases sin diluir y a una alta multiplicidad
de infección en una determinada línea celular (Stollar 1979). Este tipo de
partículas han sido implicadas en el desarrollo y mantenimiento de las
infecciones virales de tipo persistente (Lancaster 1998) como es el caso del
virus de la estomatitis vesicular (VSV) en células BHK (Holland 1974). Para el
caso de los flavivirus, Schmaljohn y Blair demostraron una infección persistente
por el virus de la encefalitis Japonesa (JEV), tanto en células de riñón de
conejo como en células Vero (Schmaljohn 1977), datos que posteriormente
fueron corroborados por Sung Wook y colaboradores en células Vero donde
además establecieron una conexión directa entre la presencia de las partículas
DI con la persistencia (Wook 2005). En un estudio más reciente, Kuen Nan y
colaboradores correlacionan la presencia de RNAs defectuosos interferentes
del JEV con la infección persistente de dos líneas celulares: las C6/36 de
mosquito y la BHK-21 de mamífero (Nan 2006) pero es June Chen y
colaboradores quienes establecen células C6/36 persistentemente infectadas
con el DENV serotipo 2 y suponen que las partículas defectuosas podrían estar
14
participando en el establecimiento y mantenimiento de este tipo de infecciones
(Chen 1994).
En relación al DENV, Igarashi, en 1979, establece líneas celulares C6/36 de
Ae. albopictus persistentemente infectadas de manera independiente con cada
uno de los cuatro serotipos del virus las cuales desarrollaron interferencia viral
cruzada con todos ellos, lo cual fue posteriormente corroborado por Dittmar y
Haines con un cultivo de células de C6/36 persistentemente infectadas con el
DENV serotipo 1, que fue resistente a una superinfección con el virus del
Dengue tipo 3 (Dittmar 1982). La presencia de partículas termosensibles en
estos cultivos sugirió la presencia de partículas de tipo DI (Igarashi 1979) pero
éstas no fueron caracterizadas. En el laboratorio de biomedicina molecular 3 se
tiene establecida una línea celular C6/36 proveniente del mosquito Ae.
albopictus (Igarashi 1978) persistentemente infectada con el DENV-2 (C6-L)
que presenta interferencia viral homóloga al menos para los serotipos 2 y 4, sin
embargo el mecanismo de esta interferencia no ha sido dilucidado. Estudios de
Juárez y colaboradores han mostrado que estas células contienen genomas
virales defectuosos con deleciones, principalmente a nivel de las proteína E y
NS5 (Juárez 2010), y sugieren que estos genomas podrían ser los
responsables, al menos en parte, de la interferencia viral al competir con el
virus silvestre por la maquinaria celular. Sin embargo, esto todavía no ha sido
establecido. Por otra parte, también se ha estudiado la entrada del DENV-2 y 4
en células C6/36 normales y persistentes, evaluado mediante citometría de
flujo, y los resultados obtenidos sugieren que no existe alteración en el receptor
del DENV que se encuentra en la célula, ya que no se observa una diferencia
significativa en la unión del virus a la superficie entre la células infectadas de
manera persistente y las normales, lo que sugiere que la interferencia viral
observada en estas células podría estar determinada en alguna fase del ciclo
replicativo viral posterior a la unión y entrada, y dada la existencia de los
genomas virales defectuosos en esta línea celular, posiblemente la
interferencia viral se esté dando a nivel de la replicación.
15
III. JUSTIFICACIÓN
El Dengue es un problema de salud pública que anualmente afecta a un
elevado número de personas en todo el mundo, principalmente en zonas
tropicales, provocando manifestaciones clínicas como FD, FHD y la más severa
de ellas, el SCD, que es causa de altas tasas de mortalidad. Actualmente no
existe un tratamiento antiviral específico y la vacuna se encuentra en fase de
prueba. Este virus es transmitido por un vector del género Aedes, y aunque
cuenta con diversos sistemas de defensa, es infectado por el virus de por vida
estableciéndose una infección de tipo persistente. En este tipo de infección se
establece un equilibrio entre el virus y la célula donde los determinantes virales
y del huésped que regulan la replicación del virus parecen estar participando y
donde se establece un mecanismo de interferencia viral homóloga que evita
que estas células sean reinfectadas por otro DENV. Los modelos de
infecciones persistentes con flavivirus y otros virus sugieren que las partículas
DI pueden ser en parte responsables de este fenómeno de interferencia viral y
del establecimiento de las infecciones de tipo persistente, sin embargo, los
mecanismos exactos por lo cual esto sucede no han sido totalmente
determinados. Se han sugerido diversos puntos del ciclo replicativo viral que
pudieran estar afectados y ser responsable del fenómeno de interferencia viral
pero en base a los antecedentes, donde se ha demostrado la presencia de
genomas virales defectuosos en células de mosquito persistentemente
infectadas, es posible que el proceso de replicación viral sea uno de los
afectados, por lo que es importante iniciar una investigación que nos permita
conocer la eficiencia de la replicación viral en células de mosquito
persistentemente infectadas. Este estudio nos permitirá comprender los
mecanismos involucrados en el proceso de interferencia viral para poder
proponer nuevas estrategias que nos ayuden a erradicar o controlar la
transmisión del virus.
16
IV. OBJETIVO GENERAL
Analizar la eficiencia de la replicación del virus del Dengue en células C6/36
persistentemente infectadas con el serotipo 2.
OBJETIVOS PARTICULARES
 Estandarización de la técnica RT-PCR en tiempo real para cuantificar el
genoma del virus del Dengue.
 Comparar la eficiencia de la replicación de los diferentes serotipos del
virus del Dengue entre células C6/36 normales y persistentemente
infectadas.
17
V. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
“Análisis
del proceso
de replicación viral en
V. ESTRATEGIA
EXPERIMENTAL
células C6/36 persistentemente infectadas con el
virus del Dengue serotipo 2”
VIRUS :1(Hawaii), 2 (Nueva Guinea), 3(H-87) y 4(H-241)
Propagados en cerebro de ratón
Infección de las células C6/36 con el DENV
Evaluación de los serotipos de DENV por PLATELIA
INFECCIÓN DE:
CONTROL: Células
C6/36 y C6-L no
Células C6/36 infectadas con DENV (24 y 48h)
Células C6-L re-infectadas con DENV (24 y 48h)
infectadas (NI)
RNA total
Estandarización de la qRT-PCR


CURVA GEN S7 (control interno)
CURVA DEL DENV-2
qRT-PCR 24 y 48h
C6/36 (NI)
C6-L (NI)
C6/36+DENV-1
C6-L+DENV-1
C6/36+DENV-3
C6-L+DENV-3
C6/36+DENV-4
C6-L+DENV-4
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
18
VI. MATERIAL Y MÉTODOS
Células C6/36 y C6-L
Se utilizaron células C6/36 (Aedes albopictus) (Igarashi 1978) que fueron
crecidas en medio MEM (Gibco Invitrogene) suplementado con vitaminas
(Sigma), suero fetal bovino al 10%, 0.034% de bicarbonato de sodio (J.T.
Baker) y antibióticos (penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 µg/ml -Sigma-) a
pH de 7.1 (potenciómetro Accumet pH Meter 915) ajustado con hidróxido de
sodio. Las células se incubaron a 35 °C en incubadora húmeda sin CO2 (Labline 494). Las células C6/36 persistentemente infectadas con DENV-2 (C6-L)
(Juárez 2012) fueron cultivadas de la misma manera. Las células BHK-21
fueron crecidas con el medio antes mencionado pero a 37 ºC y en una
incubadora (Lab-line) con 5% de CO2.
Propagación del virus
Se trabajó con los serotipos 1 (Hawaii), 2 (New Guinea), 3 (H-87) y 4 (H-241)
del DENV donados por el CDC y el INDRE, los cuales fueron propagados en
cerebros de ratones lactantes de la cepa Balb/c de 2-3 días de nacidos, a los
cuales se les inoculó el virus por vía intracerebral con una jeringa de insulina.
Se revisaron diariamente hasta notar los signos característicos de infección
como ataxia, movimiento torpe y lento y parálisis parcial o total. Posteriormente
se sacrificaron y procesaron según el protocolo reportado previamente (Gould
1991). Los extractos de cerebro obtenidos fueron alicuotados y almacenados a
-70º C hasta su uso (ultracongelador Sanyo MDF-V53VC).
Evaluación de la infectividad de los serotipos del DENV
En una multiplaca de 24 pozos (Corning) se dispusieron células C6/36 a razón
5
de 2.5 x 10 células/pozo con un volumen de medio de cultivo de 500 µl/pozo.
Se incubaron a 35º C toda la noche en incubadora (Lab-line 494). Se
2
4
prepararon 0.2 ml de cada dilución viral (10 a 10 ) usando como diluyente
solución de PBS-SFB al 0.5% (ver anexo) y un total de seis lotes de cada
serotipo del DENV. Se aspiró el medio de cultivo de la multiplaca y se lavó
cada pozo con 1 ml de solución PBS-SFB 0.5%.
19
Se agregaron las distintas diluciones de los virus a los pozos correspondientes
y se incluyó un control de células no infectadas donde sólo se colocó la
solución de PBS-SFB 0.5%. Posteriormente, la multiplaca se incubó a 37°C por
1 h en agitación suave (Incubadora Lab-line Imperial) para permitir la infección,
al término de la cual se lavó cada pozo suavemente con 1 ml de PBS-SFB
0.5% 3 veces. Se agregó el medio de cultivo (0.5 ml/pozo) fresco y se incubó
toda la noche a 35º C. A las 24 h postinfección se tomaron alícuotas de 0.1
ml/pozo las cuales fueron procesadas por ensayo de PlateliaTM Dengue NS1
AG (BioRad). La multiplaca se incubó hasta por 5 días para ver el efecto
citopático (CPE) al microscopio (Nikon 200). Las monocapas fueron teñidas
con 0.5 ml de naftol blue black (ver anexo) por 15 min a temperatura ambiente.
Medición semicuantitava del antígeno NS1 del virus Dengue mediante el
método enzimático (PLATELIATM DENGUE NS2 AG)
Para la medición de la eficacia de infección por el DENV se utilizó el kit de BioRad Platelia NS1 Dengue Ag siguiendo las indicaciones del fabricante (BioRad). Se utilizaron 50 µl de los sobrenadantes de células C6/36 infectadas con
cada uno de los serotipos a las 24 h postinfección (ver ensayo de arriba) y
como controles se incluyeron el negativo y positivo del kit así como
sobrenadante de células C6/36 no infectadas. El ensayo se leyó a una
absorbancia de 450/620 nm en un lector de ELISA (Stat Fax).
Ensayo de placa lítica para DENV-4
0
2
Se prepararon diluciones del DENV-4 (10 a 10 ) usando como diluyente
solución de PBS-SFB al 0.5%. Posteriormente, se incubaron 1 h a 37ºC. Por
otro lado, en una multiplaca de 24 pozos (Corning) se dispusieron células BHK
5
a razón de 2.5 x 10 células/pozo con un volumen de medio de cultivo de 500
µl/pozo las cuales fueron infectadas con 50 µl de las diluciones virales. La
infección se dejó por 4 h a 37ºC en la incubadora con CO 2. Después se
agregaron 0.5 ml de carboximetilcelulosa al 3% (ver anexo) con medio al 2X
(ver anexo) y se incubó a 37ºC en incubadora con CO2 por 9 días. Transcurrido
el tiempo se tiñó con 0.4 ml naftol-blue black 15 min a 37 ºC, después se lavó
con agua corriente y se observaron las placas.
20
Infección de las células C6/36 y C6-L con el DENV
En un frasco para cultivo celular de 25cm 2 (Corning) se colocaron células
C6/36 o C6-L a razón de 1 x 106 células/pozo con 6 ml de medio de cultivo y se
incubaron toda la noche a 35ºC en incubadora húmeda (Lab-line 494) sin CO2
para permitir su adhesión. Posteriormente, las monocapas fueron lavadas con
1 ml/pozo de PBS-SFB 0.5% e infectadas con los DENV 1, 2, 3 y 4 a las
diluciones encontradas como adecuadas en el ensayo de Platelia. Como
controles se incluyeron células C6/36 y C6-L no infectadas. La infección se dejó
progresar por 1 h a 37ºC en agitación suave. Posteriormente se removió el
virus y las células fueron lavadas 1 vez con 1 ml/pozo de PBS-SFB 0.5%.
Después se les agregaron 6 ml/pozo de medio de cultivo MEM y se dejó
proceder la infección por 24 y 48 h a 34º C. Entonces se extrajo el RNA total
como se indica a continuación.
Extracción de RNA total por la técnica de Trizol
Se retiró el medio de cultivo por aspiración del frasco donde se realizó el
ensayo de infección mencionado anteriormente y se adicionaron 2.5 ml de
Trizol® Reagent (Invitrogene). Posteriormente, se incubó a temperatura
ambiente en agitación suave por 10 min. Se pipeteó suavemente el contenido
de cada pozo para homogeneizar y los diferentes lisados se transfirieron a un
tubo Eppendorf de 1.5 ml. Se incubó por 5 min a temperatura ambiente sin
agitación, se les agregaron 0.250 ml de cloroformo (Monterrey) por tubo y se
agitaron vigorosamente por 15 s. Se incubó a temperatura ambiente por 3 min
sin agitación y después se centrifugaron a 12,000 x g por 10 min a 4 ºC en la
microcentrífuga (Eppendorf
5417R). La fase superior se recuperó y se
transfirió a un nuevo tubo de 1.5 ml. Posteriormente, se agregaron 0.625 ml de
isopropanol (J.T. Baker) para precipitar el RNA se mezcló por inversión y se
incubó por 10 min a temperatura ambiente. Después se centrifugó a 12,000 x g
a 4ºC por 10 min en la microcentrífuga. Se eliminó el sobrenadante y la pastilla
se lavó con 1.250 ml de etanol al 75% (J.T. Baker) preparado con agua DEPC
(Sigma) (ver anexo) y agitando brevemente. Posteriormente se centrifugó a
10000 rpm en la microcentrífuga por 10 min a 4 ºC. Se decantó el
21
sobrenadante y se dejó secar la pastilla a temperatura ambiente, la cual
después se resuspendió en 30µl de agua libre de RNAsas (DEPC).
Tratamiento con DNAsa
Este tratamiento se realizó con la finalidad de eliminar la posible contaminación
del RNA total con DNA genómico. Para ello, empleamos la enzima RQ1
RNase-Free
DNase
(Promega) siguiendo
el protocolo
del fabricante.
Brevemente, se agregaron 30 µl del RNA obtenido en el paso anterior y 1 µl de
la enzima RQ1. Posteriormente se incubó esta reacción a temperatura
ambiente por 40 min y se inactivó la enzima a 65°C por 10 min en un Termo
block (Lab Line). El RNA se precipitó con 3 µl de acetato de amonio 5M
(Promega) y 75 µl de etanol (J.T. Baker) al 100% y después se almacenó a -20
ºC toda la noche. Al siguiente día, la muestra se centrifugó 30 minutos a
velocidad máxima a 4ºC, se decantó el sobrenadante y la pastilla se lavó con
100 µl de etanol al 75% con agua DEPC. Posteriormente se centrifugó a 10,000
rpm en la microcentrífuga (Eppendorf 5417R) por 10 min a 4ºC, después se
decantó y se dejó secar la pastilla, la cual se resuspendió con 30 µl de agua
DEPC. Finalmente se procedió a cuantificar en el lector de ELISA (Epoch
Biotek 239567)
Verificación de la integridad del RNA
Para evaluar la integridad del RNA total obtenido de las células C6/36 y C6-L
se visualizó en un gel de agarosa al 1% en amortiguador TBE 1X (ver anexo)
teñido con bromuro de etidio (Sigma). La cámara de electroforesis se trató
primero con una solución de SDS 1% (ver anexo) preparada en agua DEPC
para eliminar las RNAsas. Se cargaron 3 μl de cada muestra con 3 μl de
amortiguador de muestra 2X (ver anexo) y la electroforesis se realizó a 100
Volts.
PCR anidada
Para la identificación de los serotipos del DENV se hizo una PCR anidada en
base al protocolo reportado por Seah y colaboradores (Seah 1995). Se utilizó
RNA de células C3/36 infectadas con cada uno de los serotipos y C6-L no
infectadas. Se comenzó con una RT-PCR en un solo paso utilizando el kit de
22
Promega (RT-PCR Access), para posteriormente someter los productos
obtenidos a una PCR anidada. Se preparó una mezcla de reacción con 10 µl
del amortiguador de reacción 5X, 1 µl de dNTP´s (10mM de dATP, dCTP,
dGTP, y dTTP), 1 µl de oligonucleótido DV1 sentido, 1 µl oligonucleótido DVI
antisentido (tabla 6.1) 50 pmol/µl, 2 µl de MgSO4 25 mM, 1 µl de AMV-RT, 1 µl
de Tfl, 0.5 µl de RNA total y agua libre de nucleasas para un volumen final de
50 µl. La reacción de RT-PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones:
para RT: 48°C por 45 min con un paso posterior de inactivación de la enzima
RT a 94°C por 5 min. Para la PCR: 35 ciclos con una temperatura de
desnaturalización de 94°C por 30 s; un paso de alineamiento de 57°C por 1
min. y uno de alargamiento a 68°C por 1 min con un ciclo final a 68°C por 10
min. La reacción se llevó a cabo utilizando un termociclador Eppendorf
Mastercycler. Las muestras se analizaron en un gel de agarosa al 2% en
amortiguador TBE 1X corrido a 100 V y teñido con bromuro de etidio.
De los productos amplificados se tomaron las muestras para hacer la PCR
anidada, utilizando el kit de Promega (RT-PCR Access). Se preparó una
mezcla de reacción con 10 µl del amortiguador de reacción 5X, 1 µl de dNTP´s
(10mM de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP), 1 µl de oligonucleótido DVI sentido, 1
µl (50 pmol/µl) oligonucleótido DSP1, 2, 3 o 4 antisentido según el serotipo
(tabla 6.1), 3 µl de MgSO4 25 mM, 1 µl de Tfl, 0.5 µl de RNA total y agua libre
de nucleasas para un volumen final de 50 µl. La reacción de PCR se llevó a
cabo bajo las siguientes condiciones: PCR: 94°C por 5min, 35 ciclos con una
temperatura de desnaturalización de 94°C por 30 s; un paso de alineamiento
de 59°C por 1 min y uno de alargamiento a 68°C por 1 min con un ciclo final a
68°C por 10 min. La reacción se llevó a cabo utilizando un termociclador
Eppendorf
Mastercycler.
Las
muestras
se
analizaron
por
medio
de
electroforesis con las mismas condiciones anteriormente descritas.
23
Secuencias de los oligonucleótidos para la RT-PCR de punto final
Oligonucleótidos
Secuencia
DV1 sentido
GGRACKTCAGGWTCTCC
DV1 antisentido
AARTGYGCYTCRTCCAT
K=G/T, R=A/G, Y=C/T, W=A/T
Secuencias de los oligonucleótidos para la RT-PCR anidada
Oligonucleótidos
Secuencia
DSP1
AGTTTCTTTCCTAAACACCTCG
DSP2
CCGGTGTCTRGCYCTGAT
DSP3
TTAGAGTYCTTAAGCGTCTCTTG
DSP4
CCTGGTTGACAAAAGTCTTG
Tabla 6.1. Secuencias de los oligonucleótidos para la RT-PCR de punto final y secuencias de
los oligonucleótidos para la PCR anidada, estos últimos amplifican un fragmento del gen NS3
con diferentes tamaños según el serotipo: 169pb (DENV-1), 362pb (DENV-2), 265pb (DENV-3)
y 426pb (DENV-4).
Secuenciación de los serotipos del DENV
Se purificaron los productos obtenidos de la PCR-anidada de los cuatro
serotipos a partir del gel de agarosa al 2% de acuerdo al protocolo del Kit
QIAquick Gel extraction (Qiagen). Se cuantificó el cDNA y se corrió un gel para
verificar la pureza de cada una de las bandas. La secuenciación fue realizada
en el Instituto de Fisiología de la Universidad Nacional Autónoma de México
con el equipo Applied Biosystems 310 Genetic Analyzer y los resultados
obtenidos
se
analizaron
con
el
programa
BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.).
24
RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)
Se procedió a realizar la estandarización de la qRT-PCR y para ello utilizamos
los oligonucleótidos en las condiciones mencionadas en un trabajo de Yee-Ling
y colaboradores (Ling 2007). Estos oligonucleótidos hibridan en la RNT 3´ del
DENV y son específicos para cada serotipo. Se les realizó un análisis con el la
base de datos BLAST para verificar su identidad con las secuencias reportadas
para las cepas del DENV con las que contamos en el laboratorio (ver tabla 6.2).
SEROTIPO
NOMBRE
D1
DENV-1
Hawaii
No. Acceso:
DQ672564
D2
DENV-2 New
Guinea No.
Acceso:
AF038403
D3
D4
SECUENCIA
TAMAÑO
ESPERADO
DEL
PRODUCTO
AMPLIFICADO
PARTE DEL
GENOMA
VIRAL
AMPLIFICADO
315 pb
RNT 3´
364 pb
RNT 3´
398 pb
RNT 3´
365 pb
RNT 3´
SENTIDO:
tccaaggacgttaaatgaagt
ANTISENTIDO:
gcatcattccaggcacaga
SENTIDO:
aaaaactatgctacctgtgag
ANTISENTIDO:
cacagaacgccag aaaatg
DENV-3 H87
No. Acceso:
M93130
SENTIDO:
gccaccttaagc cacagta
DENV-4 H241
No. Acceso:
AY947539
SENTIDO:
caacaacaaacaccaaagc
aaaaa
ANTISENTIDO:
ggaatggtgctgttgaatca
ANTISENTIDO:
cacagagcgccgcgagat
Tabla 6.2. Secuencias de los oligonucleótidos para la RT-PCR en tiempo real del DENV.
Posteriormente se hizo una RT-PCR en un solo paso con los oligonucleótidos
antes mencionados utilizando el kit de Promega (RT-PCR Access). Se preparó
una mezcla de reacción con 10 µl del amortiguador de reacción 5X, 1 µl de
dNTP´s (10mM de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP), 1 µl de oligonucleótido sentido
(según el serotipo), 1 µl oligonucleótido antisentido (según el serotipo) (tabla
25
6.2) (10µM), 3 µl de MgSO4 25 mM, 1 µl de AMV-RT, 1 µl de Tfl y 500 ng de
RNA total (volumen según la concentración del RNA) y agua libre de nucleasas
para un volumen final de 50 µl. La reacción de RT-PCR se llevó a cabo bajo las
siguientes condiciones: para RT: 48°C por 30 min con un paso posterior de
inactivación de la enzima RT a 95°C por 5 min. Para la PCR: 35 ciclos con una
temperatura de desnaturalización de 94°C por 1min; un paso de alineamiento
de 58°C para los serotipos 2 y 4, para el serotipo 3 a 56°C y para el serotipo 1
55°C por 1min. Un ciclo de alargamiento a 68°C por 1 min con un ciclo final a
68°C por 10 min. La reacción se llevó a cabo utilizando un termociclador
Eppendorf Mastercycler. Las muestras se analizaron en un gel de agarosa al
2% en amortiguador TBE 1X corrido a 100 V y teñido con bromuro de etidio.
Determinadas las temperaturas de alineamiento de los cuatro serotipos, se
hizo una qRT-PCR para el gen S7 (control endógeno) de las células C6/36 y
C6-L infectadas con cada uno de los serotipos y no infectadas a las 24 y 48 h.
Se hizo la qRT-PCR en un solo paso utilizando el kit Power SYBR®Green
RNA-to-CTTM 1-Step (Applied Biosystems) para lo cual se preparó una mezcla
de reacción con 0.2 µl de la RT-Enzyme Mix (125x), 12.5 µl de la RT-PCR Mix
(2x), 0.5 µl de oligonucleótido sentido S7F (GGGACAAATCGGCCAGGCTATC)
10µM,
0.5
µl
de
oligonucleótido
antisentido
S7R
(TCGTGGACGCTTCTGCTTGTTG) 10 µM, 500 ng de RNA (volumen
equivalente a la concentración) y agua libre de nucleasas para un volumen final
de 25 µl. La reacción de qRT-PCR SYBR green en un paso se llevó a cabo
bajo las siguientes condiciones: para RT: 48ºC por 45 min, para la activación
de la Taq polimerasa 4.5 min a 94ºC y para la PCR: 40 ciclos, un paso de
desnaturalización de 94°C por 30 s; un paso de alineamiento de 58°C por 20 s
y un paso de alargamiento a 72°C por 40 s. La reacción se llevó a cabo
utilizando el ABI-PRISM 7000, Applied Biosystems.
Una vez evaluado el control endógeno, se procedió a realizar la curva estándar
del gen S7, para esto se tomaron muestras de RNA de concentraciones
conocidas cada una de las cuales
equivale a un determinado número de
copias del gen. Para esto se toma en cuenta el tamaño del fragmento, que en
este caso es de 291 pb, que se multiplica por el peso molecular de cada base,
que es de 330g/ml, después el resultado es equivalente a 6.023 x 10 23,
26
posteriormente se hace la equivalencia en nanogramos. Se hizo la qRT-PCR
en un solo paso, siguiendo las condiciones de amplificación antes descritas.
Curva patrón del DENV-2
Como un mejor modelo de comparación para hacer el análisis de la infección
del DENV en C6/36 y C6-L a diferentes tiempos, se hizo una curva patrón con
el serotipo 2 del virus.
RT-PCR de DENV-2
Para la obtención del RNA del virus se empleó una RT-PCR en un solo paso
utilizando el kit de Promega (RT-PCR Access). Se preparó una mezcla de
reacción con 10 µl del amortiguador de reacción 5X, 1 µl de dNTP´s (10mM de
dATP, dCTP, dGTP, y dTTP), 1 µl de oligonucleótido D2
sentido, 1 µl
oligonucleótido D2 antisentido (tabla 6.2) 10 µM, 3 µl de MgSO4 25 mM, 1 µl de
AMV-RT, 1 µl de Tfl y 2 µl de RNA total de D2 obtenido anteriormente y agua
libre de nucleasas para un volumen final de 50 µl. La reacción de RT-PCR se
llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: para RT: 48°C por 45 min con un
paso posterior de inactivación de la enzima RT a 95°C por 5 min. Para la PCR:
35 ciclos con una temperatura de desnaturalización de 95°C por 1 min; un paso
de alineamiento de 58°C por 1 min y uno de alargamiento a 68°C por 1 min con
un ciclo final a 68°C por 10 min. La reacción se llevó a cabo utilizando un
termociclador Eppendorf Mastercycler.
Clonación de DENV-2 usando el vector pJET
En un tubo eppendorf se adicionaron 5 μl del producto de RT-PCR obtenido en
el paso anterior y los siguientes reactivos del kit de Fermentas, 10 μl de
amortiguador de reacción 2X, 1 μl del vector Pjet 1.2/blun+Cloning Vector 50
ng/µl, 3 μl agua libre de nucleasas y 1 μl de DNA ligasa T4 con un volumen
final de 20 µl. Se mezcló suavemente y se incubó a temperatura ambiente por 5
min y posteriormente a 4°C durante 72 h.
Preparación de células competentes
Para preparar células competentes se utilizaron bacterias de E.coli de la cepa
DH5-α frescas, las cuales fueron propagadas en medio LB (Sigma) y en la
27
incubadora (Lab-tech) a 37°C en agitación (200-190rpm) durante toda la noche.
Al día siguiente, se tomaron 100 µl del precultivo y se propagaron en 10 ml de
medio LB hasta que alcanzaran una densidad óptica de 0.5 a 600 nm. Se
tomaron 1.5 ml del cultivo y se centrifugaron a 10,000 rpm durante 2 min a 4 ºC
en la microcentrífuga (Eppendorf 5417R). Se decantó el sobrenadante y se
agregaron 150 µl de CaCl2 (150 mM) (Merck). Posteriormente se centrifugó a
10,000 rpm durante 2 min, se agregaron 100 µl más de CaCl2 (150 mM) y se
guardaron a 4 °C hasta su uso.
Transformación de células competentes con DENV-2
Para transformar las células competentes, a un volumen de 1.5 ml de bacterias
se agregaron 5 μl de la mezcla de ligación pJET1.2 (ver ensayo de arriba) y se
homogenizó suavemente. Se incubó en hielo por 20 min. y entonces se
sometieron las células a choque térmico por 90 segundos a 42°C en el Termo
block (Lab-line) e inmediatamente se transfirió a hielo 3 min. Se agregaron
500μl de medio LB, se tapó el tubo herméticamente y se colocó en la
incubadora en forma horizontal (Lab-tech) en agitación a 240 rpm a 37°C por 1
h. Posteriormente se espatularon de 100-200 μl de cada mezcla sobre una
placa de agar-ampicilina 100μg/ml precalentada y se dejaron crecer las
colonias bacterianas toda la noche en la incubadora a 37°C (Lab-line Imperial
III incubator). Transformamos células con el pBlueScript como control negativo.
Mini-preparaciones de plásmidos por lisis alcalina
Se seleccionaron colonias bacterianas al azar y se cultivaron en medio LB
líquido con ampicilina (100 μg/ml) 16 h a 37º C en agitación. Al día siguiente se
tomaron 1.5 ml de cada uno de los cultivos y se centrifugó a 14,000 rpm a 4 ºC
en la microcentrífuga (Eppendorf
5417R) durante 2 min. Se eliminó el
sobrenadante y se adicionaron 100μl de la solución I (ver anexo) a la pastilla y
se agitó con vórtex. Posteriormente, los tubos se incubaron en hielo y se
agregaron 200 μl de la solución II (ver anexo). Se agitó suavemente y se incubó
5 min en hielo. Se agregaron 150 μl de la solución III (ver anexo), se agitó
suavemente e incubó 5 min en hielo. Se centrifugó a 14,000 rpm a 4°C durante
5 min y el sobrenadante se transfirió a tubos nuevos de 1.5 ml. Se agregó 1 ml
de etanol frio (J.T.Baker) y se centrifugó a 14,000 rpm a 4°C durante 5 min. El
28
sobrenadante fue eliminado y se agregó 1 ml de etanol al 70%. Se centrifugó a
14,000 rpm en una centrifuga refrigerada (5425R Eppendorf) a 4°C durante 5
min (se repitió este paso 2 veces) y se dejó secar la pastilla durante 20 min a
temperatura ambiente. Finalmente, la pastilla se resuspendió en 30 μl de agua
de bidestilada estéril y se almacenó a -20°C.
PCR de DENV
Para seleccionar las clonas positivas del paso anterior, se utilizó el DNA
plasmídico obtenido y se analizó por PCR para DENV-2. Se hizo una PCR en
un solo paso utilizando el kit de Promega (RT-PCR Access). Se preparó una
mezcla de reacción con 5 µl del amortiguador de reacción 10X, 1 µl de dNTP´s
(10mM de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP), 1 µl de oligonucleótido D2 sentido, 1
µl oligonucleótido D2 antisentido (tabla 6.2) 10 µM, 3 µl de MgSO4 25 mM, 1 µl
de Tfl, 1 µl de DNA obtenido anteriormente y agua libre de nucleasas para un
volumen final de 50 µl. La reacción de PCR se llevó a cabo bajo las siguientes
condiciones: 40 ciclos con una temperatura de desnaturalización de 95°C por 1
min; un paso de alineamiento de 58°C por 1 min y uno de alargamiento a 68°C
por 1 min con un ciclo final a 68°C por 10 min. La reacción se llevó a cabo
utilizando un termociclador Eppendorf Mastercycler. Los productos obtenidos
se analizaron en un gel de agarosa al 2% en amortiguador TBE 1X corrido a
100 V y teñido con bromuro de etidio.
Una vez obtenida la clonación del fragmento de DENV-2, se hizo la curva
patrón
para
lo
cual
se
tomaron
muestras
de
DNA
plasmídico
de
concentraciones conocidas las cuales cada una de estas equivale a un
determinado número de copias del DENV-2. Así, se tomó en cuenta el tamaño
del fragmento, que en este caso es de 364 pb, que se multiplica por el peso
molecular de cada base, que es de 330 g/ml, y cuyo resultado es equivalente a
6.023x1023, posteriormente se hace la equivalencia en nanogramos. Una vez
obtenidos los resultados se hizo la PCR en tiempo real (qPCR), se preparó una
mezcla de reacción con 12.5 µl de la RT-PCR Mix (2x), 0.5 µl de
oligonucleótido sentido D2 10 µM, 0.5 µl de oligonucleótido antisentido D2
(tabla 6.2) 10 µM, 1 µl de RNA (volumen equivalente a cada una de las
concentraciones) y agua libre de nucleasas para un volumen final de 25 µl. La
reacción de qPCR SYBR green se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones:
29
un paso de 94ºC 5 s, para la activación de la Taq polimerasa 4.25 min a 94ºC,
para la PCR: 40 ciclos, un paso de desnaturalización de 94°C por 30 s; un paso
de alineamiento de 58°C por 20 s y un paso de alargamiento a 72°C por 40 s.
La reacción se llevó a cabo utilizando ABI-PRISM 7000, Applied Biosystems.
qRT-PCR de células C6/36 y C6-L infectadas con DENV a las 24 y 48h
Con el RNA total obtenido anteriormente, se hizo la qRT-PCR en un solo paso
para lo cual se preparó una mezcla de reacción con 0.2 µl de la RT-Enzima Mix
(125x), 12.5 µl de la RT-PCR Mix (2x), 0.5 µl de oligonucleótido sentido según
el serotipo 10 µM, 0.5 µl de oligonucleótido antisentido según el serotipo (tabla
6.2) 10 µM, 500 ng de RNA (volumen equivalente a la concentración) agua libre
de nucleasas para un volumen final de 25 µl. La reacción de qRT-PCR SYBR
green en un paso se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: para RT:
48ºC por 45 min, para la activación de la Taq polimerasa 4.5 min a 94ºC, para
la PCR: 40 ciclos, un paso de desnaturalización de 94°C por 30 s; un paso de
alineamiento de 55 ºC para D1, 56 ºC para D3 y 58°C D4 por 20 s y un paso de
alargamiento a 72°C por 40 s. La reacción se llevó a cabo utilizando ABIPRISM 7000, Applied Biosystems.
Todos los experimentos de qRT-PCR fueron realizados por triplicado y
analizados por sistema de análisis one-way ANOVA, GraphPad Prism 5, y se
consideraron valores estadísticamente significativos cuando la p fue <0.05.
30
VII. RESULTADOS
Aunque el DENV puede causar daños importantes cuando infecta a sus células
blanco, también es capaz de establecer una infección persistente o no
citopática, la cual se ha podido lograr en diversas líneas celulares de mamífero
pero las de mosquito parecen ser la que con mayor facilidad pueden sostener
este tipo de infección y que han desarrollado mecanismos para contrarrestar o
controlar específicamente la replicación del RNA del virus, sin alterar
significativamente la función del hospedero (Adelman 2002). Uno de los
mecanismos propuestos para el establecimiento
y mantenimiento
de
infecciones persistentes por algunos flavivirus descritas hasta el momento, es
la producción de partículas virales defectuosas interferentes (DI), las cuales
interfieren con la replicación del virus silvestre (Poidinger 1991). Es por eso,
que nuestro objetivo fue analizar la eficiencia de la replicación del DENV en
células C6/36 persistentemente infectadas con el serotipo 2.
Para cumplir con el objetivo planteado, evaluamos primero la eficiencia de
infección de varios lotes diferentes de cada uno de los serotipos del DENV con
la finalidad de seleccionar el más adecuado para nuestros posteriores ensayos.
Se utilizaron las cepas Hawaii para Dengue serotipo 1, Nueva Guinea para el
serotipo 2, H-87 para el serotipo 3 y H-241 para el serotipo 4 previamente
propagadas en cerebro de ratón lactante. Se hicieron diluciones seriadas de
diferentes lotes de cada uno de los serotipos (tabla 7.1), posteriormente se
infectaron células C6/36 sembradas en una multiplaca de 24 pozos y se
analizaron los sobrenadantes con el Kit de PLATELIA TM DENGUE NS1 AG a
las 24 horas postinfección.
El Platelia es un método enzimático que mide semicuantitativamente el
antígeno NS1 del DENV. La proteína NS1 es una glicoproteína no estructural
altamente conservada, la cual existe predominantemente en forma de dímero y
puede estar involucrada en el ensamble del complejo replicativo. En células
infectadas con DENV, NS1 es secretada como un complejo hexamérico
soluble. Además, se ha demostrado que el antígeno NS1 está presente en el
suero de pacientes infectados en fase aguda y en cultivos celulares infectados
con el DENV y que los niveles de NS1 de lo sobrenadantes correlaciona con
31
los títulos virales, sugiriendo que existe una correlación entre la presencia y
cantidad de esta proteína con la eficiencia de la replicación viral (Ludert, 2008).
Hawaii
Nueva Guinea
H-87
H-241
DENV-1
DENV-2
DENV-3
DENV-4
IC4.3
IC9.4B
IC1.3
IC5.4B
IC4.2 (21)
IC4.4V (3)
H87
IC8.1
IC4.2 (9)
IC4.5V
IC1.2
IC7.8
IC3.6
IC9.4 (17)
IC1.1
IC7.8
IC3.5
IC4.4V (23)
IC1.6 (26)
IC6.6
IC3.4
IC9.4 (20)
IC1.6 (6)
--
Tabla 7.1. Lotes del DENV evaluados por Platelia.
Posteriormente, medimos la absorbacia por triplicado de cada uno de los lotes
del virus y se sacó el promedio. En el gráfico 7.2 se muestran los resultados
obtenidos.
ENSAYO DE PLATELIA DENV
1.5
D.O.
ABSORBANCIA
450nm
1.0
0.5
N
IC .I.
4.
3
1
D 1 IC 0 2
E
4
N
.3
V
-1
1
D
E
IC 0 3
N
4
V
.3
D 2 I C 10 4
E
9.
N
4B
V
-2
D
I
C 10 2
E
9.
N
V
-2 4B
10
IC
3
D
9.
E
4B
N
V
1
D 3 IC 04
E
1.
N
3
V
-3
1
IC 0 2
D
E
1
N
.3
V
10 3
-3
IC
I.3
10
4
N
V
N
1
E
E
D
D
C
C
O
N
TR
O OL
N
TR (-)
O
L
(+
)
0.0
VIRUS
2
3
4
Gráfica 7.2. Ensayo de Platelia de DENV- 1, 2 y 3, a las diluciones 10 , 10 y 10 , así como de
células no infectadas como control negativo (N.I.). Los controles positivo y negativo incluidos en
el kit se muestran como Control (-) y Control (+) respectivamente.
32
Posteriormente se seleccionaron solo un lote de cada serotipo más adecuado
según los resultados obtenidos por el ensayo de Platelia, para las siguientes
infecciones (gráfica 7.3).
ENSAYO DE PLATELIA DENV
D.O.
ABSORBANCIA
450nm
1.5
1.0
0.5
10
2
3
D
E
N
V
-3
IC
9.
-2
V
D
E
N
IC
1.
4B
3
IC
4.
V
E
N
D
10
2
10
2
.I.
N
-1
N
T
O
C
C
O
N
T
R
R
O
O
L
L
(+
()
)
0.0
VIRUS
Gráfica 7.3. Evaluación de lote y dilución más adecuada para cada serotipo del DENV
evaluados por el kit de Platelia. Se muestran los resultados de las diluciones DENV-1(IC4.3),
DENV-2(IC9.4B) y DENV-3 (IC1.3) de cada serotipo seleccionado, los controles positivo (+) y
negativo (-) incluidos en el kit respectivamente y el sobrenadante de células no infectadas
(N.I.).
La multiplaca de donde se obtuvieron los sobrenadantes para el ensayo de
Platelia se incubó 5 días más para observar el CPE. Se tiñeron las monocapas
con Naftol blue-black y se observó su integridad. Como se observa en la figura
7.4, la destrucción de la monocapa es mayor cuanto menor es la dilución del
virus y no se aprecia de la misma manera en las células no infectadas, donde
está íntegra.
33
EFECTO CITOPÁTICO
LOTE 1
LOTE 2
LOTE 3
N.I.
102
C6/36
infectadas
con DENV-1
103
104
Figura 7.4. Multiplaca de células C6/36 teñida con Naftol blue-black. Se muestra un ejemplo de
células no infectadas (N.I.) así como infectadas con DENV-1 a diferentes diluciones.
Los resultados obtenidos para el serotipo 4 no se pudieron evaluar
adecuadamente mediante la técnica de Platelia por lo que se recurrió al ensayo
de placa lítica para titular al virus (figura 7.5) y se obtuvo un título de 1.7 x 105
UFP/ml.
34
ENSAYO DE PLACA LÍTICA
N.I.
100
1
DENV-4 (IC6 .6) 10
Ensayo por triplicado
102
1.7x105 UFP/ml
Figura 7.5. Ensayo de placa lítica de DENV-4 en células BKH-21. Se evaluó por triplicado el
lote IC6.6 del virus a diferentes diluciones. Se incluyeron como control células no infectadas
(N.I.). En la figura de abajo se muestra un acercamiento de las placas líticas (indicadas con
flechas) observadas en la monocapa de células.
Una vez verificada la infectividad de los distintos lotes virales, se procedió a
infectar células C6/36 y C6-L con cada uno de los lotes del DENV
seleccionados en base a los resultados obtenidos en el Platelia y placa lítica. El
lote IC4.3 para DENV-1, IC9.4B para DENV-2, IC1.3 para DENV-3 e IC6.6 para
DENV-4. Después de 24 o 48 h de infección, se obtuvo el RNA total con la
técnica de Trizol, se trató con DNAsa y se evaluó su integridad y pureza. Las
figuras 7.6 y 7.7 muestran la integridad del RNA total de las células C6/36 y
C6-L no infectadas e infectadas por 24 y 48 h donde se puede observar que no
existe degradación después del tratamiento con DNAsa.
35
C6/36
1kb
N.I. D1
D2
C6-L
D3
D4
N.I.
D1
D2
D3
D4
10 kb
3000pb
2000pb
1500pb
1000pb
500pb
Figura 7.6. Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio en el cual se observa la
integridad del RNA de las células C6/36 y C6-L infectadas con cada uno de los serotipos del
DENV (D1, D2, D3 y D4) por 24 h y no infectadas (N.I.); en el primer carril se colocó el
marcador de tamaño molecular de 1Kb (Bio-Labs).
C6/36
1kb
NI
D1
D2
C6-L
D3
D4
NI
D1
D2
D3
D4
10 kb
3000pb
2000pb
1500pb
1000pb
500pb
Figura 7.7. Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio en el cual se observa la
integridad del RNA de las células C6/36 y C6-L infectadas con cada uno de los serotipos del
DENV (D1, D2, D3 y D4) por 48 h y no infectadas (NI); en el primer carril se colocó el marcador
de tamaño molecular de 1Kb (Bio-Labs).
Con la finalidad de verificar la identidad de cada uno de los serotipos del DENV
con los que se cuenta en el laboratorio, se hizo una RT-PCR de punto final
empleando dos pares de oligonucleótidos que amplifican un fragmento de
aproximadamente 500 pb de la región codificante de la proteína NS3 de todos
los serotipos (figuras 7.8). Posteriormente cada uno de los productos fue
36
sometido a una reacción de PCR anidada bajo las condiciones mencionadas en
la metodología. En la figura 7.9 se muestran los resultados de la RT-PCR de
las células C6/36 infectadas con cada uno de los serotipos observándose que
cada uno genera un producto de diferente tamaño: de 169pb para DENV-1,
326pb para DENV-2, 265pb para DENV-3 y 426pb para DENV-4. Un resultado
semejante se obtuvo en la reacción donde se empleó el RNA total proveniente
de las células C6-L (figura 7.10), corroborándose la presencia del DENV-2.
C6/36
100pb
N.I.
D1
D2
D3
D4
1000pb
500pb
400pb
500pb
300pb
200pb
100pb
Figura 7.8. Reacción de RT-PCR con oligonucleótidos DV1 sentido y antisentido. Los productos
fueron visualizados en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Carril 1,
marcador de tamaño molecular de 100 pb (Bio-Labs). Los demás carriles muestran los
resultados de la reacción realizada con RNA total de células C6/36 no infectadas (N.I.) e
infectadas con los diferentes serotipos en DENV (D1-D4) donde se observan fragmentos de
aproximadamente 500 pb.
37
C6/36
100pb
N.I.
D1
D2
D3
D4
1000pb
DENV:
•
•
•
•
500pb
400pb
300pb
D1: 169 pb
D2: 326 pb
D3: 265 pb
D4: 426 pb
200pb
100pb
Figura 7.9. Reacción de PCR-anidada con oligonucleótidos específicos para cada unos de los
serotipos de DENV. Los productos fueron visualizados en un gel de agarosa al 2% teñido con
bromuro de etidio. Carril 1, marcador de tamaño molecular de 100 pb (Bio-Labs); carril 2,
control de células no infectadas (N.I.). Los demás carriles muestran los resultados de la
reacción realizada con RNA total de células C6/36 infectadas con los diferentes serotipos en
DENV (D1-D4). Los tamaños esperados de los fragmentos para cada serotipo se muestran a la
derecha del gel.
1
2
100pb N.I.
3
4
100pb C6-L
5
6
100pb C6-L
1000pb
500pb
400pb
300pb
326pb
D2
200pb
100pb
Figura 7.10. RT-PCR y PCR-anidada de células C6-L. Los productos fueron visualizados en un
gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Carriles 1, 3 y 5, marcador de tamaño
molecular de 100 pb (Bio-Labs); carril 2 control de células C6/36 no infectadas (N.I.), producto
de la RT-PCR de punto final usando RNA de las células C6-L; carril 4 producto de 500pb, y
carril 6 PCR-anidada de DENV-2 con un producto de 326pb.
38
Los productos de la PCR-anidada obtenidos a partir del RNA de las C6/36
infectadas con cada uno de los serotipos, se purificaron a partir del gel
mediante el kit Gel Extraction (Qiagen), la cual se evaluó en un gel de agarosa
al 1% (figura 7.11). A partir de los productos purificados se obtuvieron
secuencias de aproximadamente 150 pb para DENV-1, 330 pb DENV-2, 240 pb
DENV-3 y 450 pb DENV-4 (figura 7.12) y se analizaron mediante la base de
datos “Blast” para conocer el porcentaje de identidad con las cepas del
laboratorio de Biología Molecular III (tabla 7.13) corroborándose así la identidad
de las cepas virales con las que se trabajó.
1
100pb
2
D1
3
D2
4
D3
5
100pb
1000pb
1000pb
500pb
400pb
500pb
6
D4
400pb
300pb
300pb
200pb
200pb
100pb
100pb
Figura 7.11. Purificación de los productos de la PCR-anidada de las C6/36 infectadas para
cada uno de los serotipos del DENV. Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.
Carriles 1 y 5, marcador de 100 pb (Bio-Labs); carril 2, DENV-1; carril 3, DENV-2; carril 4,
DENV-3 y carril 6, DENV-4.
39
DENV-1 (150pb)
NNNNNNNANNGGANATAGTAGGTCTTTATGGAATGGAGTGGTGACAACAAG
TGGAACCTACGTCAGTGCCATAGCTCAAGCTAAAGCATCACAAGAAGGGCC
TCTACCAGAGATTGAGGACGAGGTGTTTAGGAAAGAAACTANNNNNNCNN
DENV-2 (330pb)
NNNNNNNNNNNNNNNNNNTTGTGGGTCTTTNTGGNANTGGTGTTGTTACAG
GAGTGGAGCNTATGTGAGTGCTATAGCCCAGACTGAAAAANNTATTGAAGAC
NNTCCANAGATCNAANATGACATTTTNNNAAANAGAAAATTNNNNATCATGG
ACCTCCACCCAGGAGCGGGAAACACGAANANNAACCTTCCGGCCATAGTCA
GAGAGGCTATAAAACGGGGCCTGAGGACATTAATCCTGGCCCCCACTAGAG
TCGTGGCAGCTGAAATGGAGGAAGCCCTAAGAGGACTTCCAATAAGATACC
AAACCCCAGCCATCAGAGCNNAGACACCGGA
DENV-3 (240pb)
NNNNNNNAGNNNNAANGNAGTGGGACTGTATGGCAATGGAGTGGTTACAAA
GAATGGAGGCTATGTTAGTGGAATAGCGCAAACAAATGCAGAACCAGATGG
ACCGACACCAGAGTTGGAAGAAGAGATGTTCAAAAAGCGAAATCTAACCATA
ATGGATCTTCATCCTGGGTCAGGAAAGACGCGGAAATATCTTCCAGCTATTG
TTAGAGAGGCAATCAAGAGACGCTTAAGAACTCTAAA
DENV-4 (450pb)
NNNNNNANNNNNNNNNNNgTTATCGGACTCTACGGAAATGGAGTAGTCACTA
AATCAGGTGATTACGTCAGTGCTATAACGCAAGCCGAAAGAACTGGTGAGC
CAGATTATGAAGTGGATGAGGACATTTTTCGAAAGAAAAGATTAACTATAATG
GACTTACACCCCGGAGCCGGAAAGACAAAAAGAATTCTCCCATCAATAGTCA
GAGAAGCCTTAAAAAGGAGGCTGCGAACCTTGATTTTGGCTCCCACGAGAG
TGGTGGCGGCCGAGATGGAAGAGGCCCTACGTGGACTGCCAATCCGTTATC
AGACCCCAGCTGTGAAATCAGAACACACAGGAAGAGAGATCGTAGACCTCA
TGTGTCATGCAACCTTCACAACAAGACTTTTATCATCAACCNNGGTTCCAAAT
TACAACCTCATAGTGATGGACNAAAGCACACTTAN
Figura 7.12. Secuencias correspondientes a cada uno de los productos amplificados en la
PCR-anidada, de aproximadamente 150, 330, 240 y 450 pb.
40
No. De
Descripción
Acceso
U09481.1
DENV-1,
Puntuación
Puntuación
Cobertura
Valor de
Identidad
máxima
total
de consulta
E
máxima
228
228
96%
8e-57
98%
475
475
94%
7e-131
91%
Hawwaii
AF038403.1
DENV-2, New
Guinea
M93130.1
DENV-3, H-87
409
409
92%
6e-111
99%
U09483.1
DENV-4, H241
747
747
90%
0.0
99%
Tabla 7.13. Análisis “Blast” de las secuencias de los productos obtenidos de la PCR-anidada de
los cuatro serotipos del DENV. Se puede observar la máxima identidad de las 4 cepas con las
que se cuenta en el laboratorio de biomedicina molecular III.
Para cumplir nuestro objetivo principal, se comenzó con la estandarización del
ensayo de RT-PCR en tiempo real para cuantificar el genoma de DENV. La
PCR en tiempo real es un método de amplificación y cuantificación simultánea.
La acumulación del producto de PCR se monitorea mientras se lleva a cabo la
amplificación. Analiza ciclo a ciclo los cambios de la señal fluorescente
generada durante las tres etapas de la PCR y entre mayor sea la cantidad de
DNA de la muestra, menor serán los ciclos necesarios para obtener una señal
fluorescente detectable. La cantidad de fluorescencia generada en cada ciclo
es proporcional a la cantidad de producto de amplificación generado.
La gráfica que presenta la cinética de amplificación de una PCR en tiempo real
se conoce como “Amplification plot” y en ella se grafica el tiempo o los ciclos en
el eje “X” y la intensidad de fluorescencia en el eje “Y”. El “baseline” o línea
basal son los ciclos iniciales de la PCR en donde el cambio en la señal de
fluorescencia es mínimo. Para efectuar los ensayos de cuantificación es
necesario definir el punto de intensidad de fluorescencia o umbral de detección
(“Threshold”), en el cual todas las muestras puedan ser comparadas entre sí. Al
ciclo en el cual cada muestra consigue llegar a este umbral de detección se le
conoce como CT (“threshold cycle” o ciclo de umbral de detección). De esta
forma, el CT es un número fraccional que indica cuantos ciclos le tomó a cada
41
muestra generar una cantidad suficiente de fluorescente para llegar al umbral
de detección (Manual_INMEGEN_Viia7).
Se comenzó con la preparación y cuantificación de los oligonucleótidos
específicos para la RT-PCR en tiempo real para cada serotipo para
posteriormente evaluarlos en una reacción de amplificación. Se infectaron
C6/36 con el DENV y se hizo una RT-PCR de punto final para comprobar la
eficiencia de los oligonucleótidos de acuerdo a las condiciones mencionadas en
la metodología. En la figura 7.14 se muestra la amplificación de cada uno de
los serotipos del DENV con tamaños de 315 pb para DENV-1, 364 pb DENV-2,
298 pb DENV-3 y 365 pb para DENV-4 de la RNT 3´ y con un temperaturas de
alineamiento de 55 ºC para DENV-1, 58 ºC para DENV-2 y DENV-4, 56 ºC para
DENV-3.
1
100pb
2
NI
3
4
D1
D2
5
6
D3
D4
1000pb
500pb
400pb
300pb
200pb
D1: 315 pb
D2: 364 pb
D3: 398 pb
D4: 365 pb
100pb
Figura 7.14. RT-PCR de DENV. Amplificación de cada serotipo con los oligonucleotidos
mostrados en la tabla 6.2. Gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Carril 1
marcador de tamaño molecular de 100 pb (Bio-Labs); en el carril 2, resultado de la reacción
realizada con RNA total de células no infectadas (N.I.); carriles 3 a 6 corresponden a los
productos de cada serotipo.
42
Posteriormente, se hizo una qRT-PCR para el gen S7 (control endógeno) de
291 pb de células C6/36 y C6-L infectadas con cada uno de los serotipos y
células no infectadas para tener la certeza de que las condiciones del
experimento no provoquen variaciones en el gen control, además de evaluar la
integridad del RNA, ya que cualquier contaminación en la muestra provoca
alteraciones en los resultados. Este gen S7 es parte de la proteína ribosomal
40S de las células C6/36 y ha sido utilizado como un buen control endógeno en
reacciones de qRT-PCR ya que no presenta variación en su expresión. En la
figura 7.15 se observa un ejemplo representativo de los productos de la
reacción del gen S7 de 291pb. Sin embargo, los resultados obtenidos de este
gen para los demás experimentos se mencionan más adelante.
100pb
NI
D1
D2
D3
D4
MIX
1000pb
500pb
400pb
S7
291pb
300pb
200pb
100pb
Figura 7.15. RT-PCR en tiempo real del gen S7. Gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de
etidio. En el carril 1 se observa el marcador de tamaño molecular de 100 pb (Bio-Labs); en el
carril 2, el producto del gen S7 de 291 pb aproximadamente de células C6/36 no infectadas
(NI); en los carriles 3 a 6, el producto del gen en células infectadas con cada uno de los
serotipos; y en el carril 7 un control negativo (reacción de qRT-PCR sin templado).
Posteriormente, se hizo una curva estándar del gen endógeno S7 empleando
concentraciones conocidas de RNA, las cuales
corresponden a un
determinado número de copias (tabla 7.16.) y después se graficó el CT
obtenido de la qRT-PCR (figura 7.17).
43
Concentración de
RNA (ng)
1594
159.4
15.94
1.594
0.1594
No. De Copias del Gen S7
CT
1x1011
1x1010
1x109
1x108
1X107
21.54
23.32
24.35
32.03
38.69
Tabla 7.16. Concentraciones de RNA y número de copias que corresponden al gen S7 según la
concentración, así como el CT obtenido de la qRT-PCR.
Gráfica 7.17. Curva estándar del gen S7. Resultados obtenidos de la qRT-PCR, en el eje X, el
log del número de copias a la que corresponde cada concentración como se indica en la tabla
2
7.16. En el eje Y el CT obtenido de cada reacción. r =0.94
Después, se hizo una curva estándar con DENV-2 para tener un patrón con
qué comparar los resultados de nuestros grupos experimentales. Para esto, se
transformaron bacterias de E.coli de la cepa DH5-α con un fragmento de 364
pb de DENV-2 clonado en el plásmido pJet (ver metodología). Se obtuvieron
las clonas positivas (figura 7.18) y posteriormente se hizo una reacción de PCR
para verificar la presencia del fragmento (figura 7.19).
44
1
1Kb
2
Control
(-)
3
4
DNA+D2
DNA+D2
10 kb
3000pb
2000pb
1500pb
1000pb
500pb
Figura 7.18. DNA de clonas positivas. Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. Se
observa la integridad del DNA de diferentes clonas del plásmido pJet, obtenido de la miniprep.
En el carril 1 se observa el marcador de tamaño molecular de 1 Kb (Bio-Labs); carril 2, control
negativo pBlueScript (sin inserto); carriles 3 y 4 plásmidos pJet con el fragmento de DENV-2.
1
100pb
2
Control
3
(-)
DNA+D2
4
DNA+D2
1000pb
500pb
400pb
300pb
D2
364pb
200pb
100pb
Figura 7.19. PCR para DENV-2. Gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Se
observa en el carril 1 el marcador de tamaño molecular de 100 pb (Bio-Labs); carril 2 el control
negativo pBlueScript (sin inserto); carriles 4 y 5, fragmento de 364 pb que corresponde a
DENV-2.
Para verificar que los plásmidos obtenidos de la miniprep contenían el
fragmento de 364 pb correspondiente a DENV-2, se realizó una PCR con el
DNA plasmídico. Como se puede observar, la amplificación del fragmento de
45
364 pb se obtuvo sólo cuando la reacción de PCR se realizó con los plásmidos
pJet-DENV-2 y no cuando se empleó otro plásmido sin inserto (figura 7.19).
Posteriormente, se hicieron los cálculos de las equivalencias de las
concentraciones de DNA de DENV-2 con el número de copias (ver
metodología) (tabla 7.20) y se llevó a cabo la qPCR para elaborar la curva
patrón de DENV (gráfica 7.21).
Concentración de
DNA (ng)
1994
199.4
19.94
1.994
0.1994
0.01994
0.001994
Num. Copias de DENV-2
CT
1x1011
1x1010
1x109
1x108
1X107
1X106
1X105
14.22
16.28
21.80
23.49
30.53
33.58
37.49
Tabla 7.20. Concentraciones de DNA y número de copias a las que corresponde DENV-2, así
como el CT obtenido para cada concentración.
Gráfica 7.21 Curva patrón de DENV-2. Resultados obtenidos de la qPCR, en el eje X, el log del
número de copias a la que corresponde cada concentración como se indica en la tabla 7.20. En
2
el eje Y el CT obtenido de cada reacción. r =0.99.
Una vez obtenidas ambas curvas, la del gen endógeno S7 y la de DENV-2, se
hicieron las qRT-PCR de las células C6/36 y C6-L infectadas con DENV-1, 3 y
4 por 24 y 48 h, así como el de las no infectadas (N.I.). Los resultados
obtenidos de los experimentos realizados por triplicado, se indican en tablas y
46
gráficas para poder comparar los tiempos de infección de ambas líneas
celulares. Se incluyeron los resultados del gen S7 de las células no infectadas
y de los dos diferentes tiempos de las dos líneas celulares.
Se inició con el análisis de la infección con DENV-1. Monocapas de células
C6/36 o C6-L fueron infectadas a una MOI de 0.1 por 1 h a 37º C en agitación.
A continuación se lavaron las monocapas para eliminar el virus no internalizado
y a las 24 y 48 h se purificó el RNA total para la realización de la reacción de
qRT-PCR según lo descrito anteriormente. Como control se incluyeron células
no infectadas y los resultados se presentan en las tablas 7.22 y 7.23.
Infección de 24h
DENV-1
Infección de 48h
C6/36
N.I.
C6-L
N.I.
C6/36+D1
C6-L+D1
C6/36+D1
C6-L+D1
CT
ND
ND
36.96 (±0.32)
37.31 (±0.25)
35.98 (±0.46)
36.11 (±1.06)
Log Num.
Copias
0
0
5.12 (±0.08)
5.03 (±0.07)
5.36 (±0.11)
5.33 (±0.26)
Num. de
copias
0
0
133,425
108,790
236,370
237,608
Tabla 7.22. Cuantificación del genoma de DENV-1 a las 24 y 48 h postinfección en células
C6/36 y C6-L. Se muestran los valores del CT y el número de copias a la que corresponde así
como la desviación estándar de cada resultado (±SD). Para las células no infectadas (N.I.), no
se detectaron copias del genoma viral (ND=no detectado).
GEN S7
Infección de 24h
Infección de 48h
C6/36 NI-S7
C6-L NI-S7
C6/36+D1-S7
C6-L+D1-S7
C6/36+D1-S7
C6-L+D1-S7
CT
25.85 (±0.71)
25.91 (±0.57)
25.89 (±0.44)
25.80 (±0.28)
25.82 (±0.28)
25.87 (±0.21)
Log
Num.
copias
9.49 (±0.17)
9.47 (±0.13)
9.48 (±0.10)
9.50 (±0.06)
9.50 (±0.06)
9.49 (±0.04)
Num. de
copias
3,259,409,328
3,093,838,707
3,106,604,042
3,213,409,538
3,161,531,004
3,079,594,196
Tabla 7.23. Cuantificación del RNA del gen S7 en células C6/36 y C6-L infectadas con DENV-1
por 24 y 48 h. Se muestra el CT y el número de copias a la que corresponde así como la
desviación estándar de cada resultado (±SD).
47
Las gráficas 7.24 y 7.25 muestran los resultados de las tablas 7.22 y 7.23
respectivamente donde se puede hacer una comparación de ambas líneas
celulares a los diferentes tiempos. Se cuantificó el genoma viral de DENV-1 en
las células C6/36 y C6-L a las 24 y 48 h postinfección. Como era de esperarse,
el número de copias del genoma viral en las células C6/36 fue más bajo a las
24 que a las 48 h y un comportamiento similar se observó en las células C6-L.
Aunque el número de copias aparentemente es menor en las células C6-L
comparado con las C6/36 a un tiempo dado, al comparar los resultados
obtenidos no se encontró una diferencia estadísticamente significativa
(P=0.09). Por otra parte, para el gen S7, no se encontraron variaciones en
ningún grupo experimental, lo que nos indica una buena calidad de la muestra
y a la vez un adecuado control interno.
INFECCIÓN CON DENV 1
Num. Copias del RNA Viral
400000
300000
200000
100000
48
h
48
h
D
6L
+
C
6/
36
+
D
1
1
24
h
1
D
6L
+
C
C
C
6/
36
+
D
1
N
24
h
I
0
Tiempo postinfección (h)
Gráfica 7.24. Cuantificación del genoma viral de DENV-1 en las células C6/36 y C6-L a las 24 y
48 h postinfección. Promedios de un experimento realizado por triplicado. Se muestran las SD.
Valor de P= 0.09.
48
GEN S7
Num. Copias del RNA Viral
4.0×10 09
3.0×10 09
2.0×10 09
1.0×10 09
h
h
1
48
24
C
6L
+D
D
1
C
6/
3
6+
6+
D
1
1
6/
3
C
C
6L
+
D
C
48
h
24
N
I
6L
N
I
6
6/
3
C
h
0.0
Tiempo postinfección (h)
Gráfica 7.25. Cuantificación del RNA del gen S7 en células C6/36 y C6-L infectadas con DENV1 por 24 y 48h o no infectadas (NI). Promedios de un experimento realizado por triplicado. Se
muestran las SD. Valor de P= 0.9.
.El mismo procedimiento se siguió para evaluar la replicación del DENV-3 en
ambas líneas celulares. Los resultados de la cuantificación del genoma viral se
muestran en la tabla 7.26 y en el gráfica 7.28 mientras que la evaluación del
gen control S7 se muestra en la tabla 7.27 y en el gráfica 7.29.
DENV-3
Infección de 24h
C6/36+D3
C6-L+D3
Infección de 48h
C6/36+D3
C6-L+D3
C6/36
N.I.
C6-L
N.I.
CT
ND
ND
35.22 (±0.38)
39.24 (±0.20)
33.81 (±0.18)
36.38 (±0.46)
Log Num.
Copias
0
0
5.55 (±0.10)
4.56 (±0.05)
5.90 (±0.05)
5.26 (±0.12)
Num. de
copias
0
0
360,303
36,159
803,407
209,039
Tabla 7.26. Cuantificación del genoma de DENV-3 en células C6/36 y C6-L a las 24 y 48h
postinfección. Se muestran los valores del CT y el número de copias a la que corresponde así
como la desviación estándar de cada resultado (±SD). Para las no infectadas (NI), no se
detectaron copias del genoma viral (ND=no detectado).
49
GEN S7
Infección de 24h
Infección de 48h
C6/36 NI-S7
C6-L NI-S7
C6/36+D3-S7
C6-L+D3-S7
C6/36+D3-S7
C6-L+D3-S7
CT
25.85 (±0.71)
25.91 (±0.57)
25.82 (±0.53)
25.88 (±0.30)
25.84 (±0.23)
25.89 (±0.11)
Log
Num.
Copias
9.49 (±0.17)
9.47 (±0.13)
9.50 (±0.13)
9.48 (±0.07)
9.49 (±0.05)
9.48 (±0.02)
Num. de
Copias
3,259,409,328
3,093,838,707
3,251,989,131
3,046,160,465
3,130,429,193
3,046,639,931
Tabla 7.27. Cuantificación del RNA del gen S7 en células C6/36 y C6-L infectadas por 24 y 48
h con DENV-3 o no infectadas (NI). Se muestra el valor de CT y el número de copias a la que
corresponde así como la desviación estándar de cada resultado (±SD).
INFECCIÓN CON DENV 3
Num. Copias del RNA Viral
1000000.0
800000.0
600000.0
400000.0
200000.0
C
N
.I.
6/
36
+D
3
24
h
C
6L
+D
3
24
C
h
6/
36
+D
3
48
h
C
6L
+D
3
48
h
0.0
Tiempo postinfección (h)
Gráfica 7.28. Cuantificación del genoma viral de DENV-3 en las células C6/36 y C6-L a las 24 y
48 h postinfección. Promedios de un experimento realizado por triplicado. Se muestran las SD.
Valor de P= 0.0001.
50
GEN S7
Num. Copias del RNA Viral
4.0×10 09
3.0×10 09
2.0×10 09
1.0×10 09
3
48
h
48
h
C
6L
+
D
+D
3
24
h
6/
36
D
3
C
6L
+
C
+D
3
6L
6/
36
C
C
C
6/
36
N
I
N
I
24
h
0.0
Tiempo postinfección (h)
Gráfica 7.29. Cuantificación del RNA del gen S7 en células C6/36 y C6-L infectadas con DENV3 por 24 y 48 h o no infectadas (NI). Promedios de un experimento realizado por triplicado. Se
muestran las SD. Valor de P= 0.9.
De igual manera que para DENV-1, la cantidad de genoma viral en las células
C6/36 infectadas con DEV-3 no fue el mismo a las 24 que a las 48 h, misma
tendencia que se observó en las células C6-L, sin embargo, a diferencia de
DENV-1, el número de copias del genoma de DEV-3 en las células C6-L fue
mucho más bajo que en las C6/36 en los dos tiempos evaluados con una valor
de P=0.0001 que es estadísticamente significativo. Estos resultados se
obtuvieron a pesar de emplear el mismo lote viral en el proceso de infección y
la misma MOI. Por otra parte no existieron variaciones significativas (P=0.9)
con el gen S7, indicando un buen control interno en los experimentos. Todos
estos resultados indican que el DEV-3 no es capaz de replicarse de la misma
manera en las células C6/36 que en las C6-L sugiriendo la presencia de
interferencia viral.
51
Finalmente, se realizó el mismo ensayo pero el serotipo 4 y los resultados se
muestran en la tabla 7.30 y en el gráfica 7.32 con los correspondientes
resultados para el gen S7 en la tabla 7.31 y en el gráfica 7.33.
DENV-4
C6/36
N.I.
C6-L
N.I.
ND
ND
CT
Infección de 24h
C6/36+D4
C6-L+D4
Infección de 48h
C6/36+D4
C6-L+D4
30.00 (±0.53)
28.46 (±0.61)
35.41
(±0.54)
32.84
(±0.50)
Log Num.
Copias
0
0
6.48 (±0.13)
5.50 (±0.14)
7.22 (±0.15)
6.14 (±0.12)
Num. de
copias
0
0
7,134,978
323,500
17,309,142
1,417,388
Tabla 7.30. Cuantificación del genoma de DENV-4 en células C6/36 y C6-L infectadas por 24 y
48 h. Se muestran los valores del CT y el número de copias a la que corresponde así como la
desviación estándar de cada resultado (±SD). Para las no infectadas (NI), no se detectaron
copias del genoma viral (ND=no detectado).
GEN S7
Infección de 24h
Infección de 48h
C6/36 NI-S7
C6-L NI-S7
C6/36+D4-S7
C6-L+D4-S7
C6/36+D4-S7
C6-L+D4-S7
CT
25.85 (±0.71)
25.91 (±0.57)
25.87 (±0.71)
25.86 (±0.51)
25.86 (±0.19)
25.90 (±1.06)
Log
Num.
copias
9.49 (±0.17)
9.47 (±0.13)
9.49 (±0.17)
9.49 (±0.12)
9.49 (±0.04)
9.48 (±0.24)
Num. de
copias
3259409328
3093838707
3214063338
3144739006
3101901052
3364023693
Tabla 7.31. Cuantificación del RNA del gen S7 en células C6/36 y C6-L infectadas con DENV-4
por 24 y 48 h o no infectadas (NI). Se muestra el valor de CT y el número de copias a la que
corresponde así como la desviación estándar de cada resultado (±SD).
52
INFECCIÓN CON DENV 4
Num. Copias del RNA Viral
2.5×10
07
2.0×10 07
1.5×10 07
1.0×10 07
5000000.0
48
h
48
h
C
6L
+
6/
36
+
D
D
4
4
24
h
4
C
C
C
6/
36
+
6L
+
D
D
4
N
.I.
24
h
0.0
Tiempo postinfección (h)
Gráfica 7.32. Cuantificación del genoma viral de DENV-4 en las células C6/36 y C6-L a las 24 y
48 h postinfección. Promedios de un experimento realizado por triplicado. Se muestran las SD.
Valor de P= 0.001.
GEN S7
Num. Copias del RNA Viral
5.0×10 09
4.0×10 09
3.0×10 09
2.0×10 09
1.0×10 09
4
D
6L
+
C
C
6/
36
48
h
48
h
+D
4
24
h
4
D
6L
+
C
+D
4
N
I
C
6/
36
C
6L
N
I
6/
36
C
24
h
0.0
Tiempo postinfección (h)
Gráfica 7.33. Cuantificación del RNA del gen S7 en células C6/36 y C6-L infectadas con DENV3 por 24 y 48 h o no infectadas (NI). Promedios de un experimento realizado por triplicado. Se
muestran las SD. El valor de P= 0.9.
53
Al graficar los resultados de este experimento, fue muy evidente la diferencia
del número de copias del genoma viral obtenido en ambas líneas celulares a
los dos tiempos postinfección, con un valor de P de 0.001 que nuevamente es
estadísticamente significativo. Aquí se puede observar que la replicación del
virus en las células C6-L infectadas con este serotipo no es muy eficiente pues
el valor obtenido es muy bajo comparado con las C6/36 en ambos tiempos.
Nuevamente, para el control interno, el gen S7, no se observaron variaciones
que indiquen mala manipulación de las muestras.
54
VIII. DISCUSIÓN
Los mosquitos son vectores
de
patógenos que
causan importantes
enfermedades en el humano, entre estas el dengue. Aedes aegypti es el
principal vector de este virus que causa
más mortalidad y morbilidad que
cualquier otra enfermedad viral transmitida por artrópodos (Baron 2008). En las
décadas recientes, el mecanismo de la replicación viral y la ultraestructura de
las proteínas virales, así como el mecanismo inmune del hospedero para evadir
al virus, se han estudiado extensamente, llegando a desarrollar nuevos
antivíricos y vacunas (Ishikawa 2011). Sin embargo las vacunas para Dengue
se encuentran en fase de prueba y el control actual de la enfermedad casi
exclusivamente en la erradicación de los mosquitos con el uso de insecticidas y
estrategias para reducir el hábitat de las larvas del vector pero pese a estos
esfuerzos, el número de casos de esta enfermedad siguen aumentando cada
año y, por lo tanto se siguen buscando estrategias alternas de control (Baron
2008). Esta enfermedad ha alcanzado niveles alarmantes, lo cual implica la
necesidad de desarrollar nuevas tácticas contra el dengue a través de una
mejor comprensión de las interacciones virus-vector (Ramirez 2010). El vector
es importante para el virus, pues ahí se replica, y lo disemina a través de la
transmisión a los humanos (Baron 2008). La complejidad de la transmisión del
DENV y la dinámica de la enfermedad se ve agravada por la existencia de
cuatro serotipos y sus genotipos, lo cual implica la existencia de variables que
son cruciales para la infección y replicación en el hospedero (Ramirez 2010).
La identificación de los factores del huésped implicados en la propagación viral
es fundamental para la comprensión de los mecanismos moleculares de la
infección y el desarrollo de nuevas terapias (Le Sommer 2012).
La infección por DENV en humanos es aguda y autolimitada, sin embargo, en
mosquitos es de por vida o persistente. Este tipo de infecciones persistentes
ocurren de manera natural en los mosquitos y en los cultivos celulares
derivados de ellos. Éstos últimos proporcionan un modelo in vitro para estudiar
las enfermedades crónicas y para investigar el proceso por el cual las
infecciones persistentes se establecen y mantienen. Durante este tipo de
infecciones en los cultivos celulares, se han observado importantes cambios en
el ciclo de la replicación viral, presumiblemente por la presencia de partículas
55
defectuosas interferentes (Juárez 2012). En el laboratorio de biomedicina
molecular III de la Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía se ha
establecido una línea celular C6/36 persistentemente infectada con el DENV-2
que presenta genomas virales defectuosos, interferencia viral a la re-infección
con los serotipos 2 y 4 y la generación de bajos títulos virales (Juárez 2012).
Debido a la presencia de los genomas virales defectuosos y a que éstos ha
sido implicados en los procesos de interferencia viral en las infecciones de tipo
persistente, particularmente en el proceso de replicación por competencia por
los factores virales y o celulares requeridos en el proceso, en este trabajo se
planteó el análisis de la replicación de los 3 serotipos del DENV en células
C6/36 persistentemente infectadas con el serotipo 2, denominadas C6-L. Para
esto se emplearon y propagaron los serotipos 1 (Hawaii), 2 (New Guinea), 3 (H87) y 4 (H-241) en cerebro de ratón lactante (Gould 1991) y posteriormente su
viabilidad se evaluó infectando células C6/36 con el kit de PLATELIA, que es
un ensayo inmunoenzimatico que detecta la presencia de la proteína NS1 en el
sobrenadante de células infectadas. Esta proteína, está relacionada con la
replicación del virus y es liberada al medio, además de que se ha demostrado
que sus niveles correlacionan con los títulos virales (Ludert 2008). Para el caso
de DENV-4 se optó por emplear la técnica de placa lítica en células BHK-21
debido a que los resultados obtenidos mediante el kit de Platelia no fueron
satisfactorios. Los resultados obtenidos en estos ensayos fueron analizados y
se demostró que los 4 serotipos eran infectivos.
Para comprobar la identidad de las cepas de cada uno de los serotipos, se
infectaron células C6/36 con cada uno y se les extrajo el RNA total a las 48 h
postinfección. Posteriormente, con el RNA total se hizo una PCR anidada en
base a las condiciones reportadas previamente (Seah 1995) y los productos
obtenidos fueron secuenciados y analizados con la base de datos BLAST con
lo que se encontró que para los cuatro serotipos el máximo de identidad fue
superior al 90% con respecto a las secuencias reportadas, lo que nos confirmó
la identidad de cada una de las cepas. Estos mismos ensayos nos
corroboraron la infección persistente por el serotipo 2 en las células C6-L y aquí
no hubo necesidad de hacer este procedimiento, ya que los resultados de la
secuenciación fueron reportados recientemente (Juárez 2012).
56
La PCR en tiempo real es un método de amplificación y cuantificación
simultánea (Manual_INMEGEN_Viia7). En particular, los ensayos qRT-PCR
nos proporcionan sensibilidad, velocidad y una mejor estadística de los
experimentos (Richardson 2006). Para poder cumplir con nuestro objetivo
principal, fue necesario realizar primero la estandarización de la técnica RTPCR en tiempo real (qRT-PCR) para cuantificar el genoma del DENV. Primero
se hizo una búsqueda de oligonucleótidos que fueran específicos para cada
uno de los serotipos y que además ya hubieran sido utilizados en este tipo de
técnica. Los oligonucleótidos utilizados fueron tomados de un trabajo de Ling y
colaboradores (Ling 2007) y se ajustaron las condiciones de la reacción donde
la mejor concentración para hacer los experimentos fue de 500 ng y las
temperaturas de alineamiento fueron 55 ºC para DENV-1, 58 ºC para DENV-2 y
4 y 56 ºC para DENV-3.
Una vez establecidas las condiciones de la qRT-PCR, con el RNA total de
células no infectadas, se hizo la curva estándar con el gen control S7 (gráfica
7.17), que codifica para una proteína ribosomal de las C6/36 (Sengul 2009).
Posteriormente se hicieron ensayos de qRT-PCR de las células C6/36 y C6-L
no infectadas e infectadas con los serotipos 1, 3 y 4 a los dos tiempos de 24 y
48 h, para cuantificar el genoma del gen S7 y asegurar que las condiciones de
la infección no alteraran la expresión de este gen, y por lo tanto fuera un buen
control endógeno de nuestro trabajo. Además por la sensibilidad de la técnica,
con estos ensayos comprobamos que la integridad del RNA total era suficiente
para realizar nuestros experimentos (tabla 7.23, 7.27 y 7.31). Después se
elaboró una curva estándar para la cuantificación del genoma viral, para lo cual
se utilizó un fragmento de la región no traducida 3´de 364 pb de DENV-2, el
cual fue clonado en el plásmido pJET. Con el DNA obtenido se hicieron los
cálculos para obtener las concentraciones equivalentes a un determinado
número de copias (tabla 7.20) y posteriormente los resultados de la reacción de
qRT-PCR fueron graficados (gráfica 7.21). Esta curva sirvió como un patrón
para poder analizar los resultados de nuestros grupos experimentales.
Una vez establecidas las curvas y las condiciones para los experimentos,
procedimos a comparar la eficiencia de la replicación del DENV entre células
C6/36 normales y persistentemente infectadas. Para esto, se hicieron las
reacciones de qRT-PCR de las células C6/36 y C6-L no infectadas (N.I.) e
57
infectadas con DENV-1, 3 y 4 por 24 y 48 h. No se hicieron experimentos de
este tipo para DENV-2, pues las células están persistentemente infectadas con
este serotipo y es imposible diferenciar, mediante esta técnica, el genoma viral
exógeno del endógeno.
Uno de los resultados que primero llamó nuestra atención es que los diferentes
serotipos del virus no se replican con la misma eficiencia en la línea celular
C6/36 pese al haber utilizado la misma MOI. Si comparamos el tiempo de 24 h
postinfección, el número de copias de DENV-1 (tabla 7.22) y DENV-3 (tabla
7.26) es muy inferior al de DEV-4 (tabla 7.30) y lo mismo se observa a las 48 h
postinfección. En relación a esto, se ha reportado que la producción de
partículas virales de DENV-4 en las células C6/36 es mayor que las de DENV-3
y 1 cuando se evalúa la infección a las 24 h y que estas diferencias se pierden
conforme progresa la infección a días (Sakoonwatanyoo 2005), resultados que
están acordes con los obtenidos en este trabajo.
Analizando cada una de las infecciones, en la realizada con DENV-1 al,
comparar el número de copias obtenidas a las 24 y 48 h en ambas líneas
celulares, se encontró que no hubo una diferencia significativa, pues el valor de
P fue de 0.09, sugiriendo que no existe interferencia viral a este nivel. Con
respecto a nuestro control endógeno (gen S7) no se observaron variaciones en
la cantidad de RNA de las células infectadas y no infectadas a los dos tiempos.
Para el caso de la infección con DENV-3, en el número de copias a los dos
tiempos entre las dos líneas celulares, se demostró una diferencia significativa
con un valor de P de 0.0001, lo que nos sugiere la existencia de interferencia
viral a ese nivel. El número de copias del genoma viral en las células C6/36 se
incrementó de las 24 a las 48 horas como era de esperarse y aunque esta
misma tendencia se observó en las células C6-L, siempre la eficiencia de la
replicación viral fue menor. Para el control interno, tampoco hubo variaciones
en los dos tipos de células a los diferentes tiempos, con un valor de P de 0.9.
Esto nos indica nuevamente que las variaciones observadas en el número de
copias del genoma viral no fueron debidas al uso de cantidades diferentes de
RNA en las distintas reacciones. Un resultado similar de bajo número de copias
en las células C6-L se obtuvo cuando la infección se realizó con DENV-4, con
un valor de P de 0.001, sugiriendo nuevamente un fenómeno de interferencia
viral a nivel de la replicación. En este caso se observó nuevamente el mismo
58
fenómeno de un aumento en el número de copias entre las 24 y las 48 horas
pero nuevamente la eficiencia de la replicación parece fue menor en las células
C6-L. Al igual que en los demás ensayos, el control del gen S7 no tuvo ninguna
variación, en todas las condiciones.
Por lo tanto, con los resultados obtenidos, podemos sugerir que existe un
fenómeno
de
interferencia
viral
homóloga
de
las
células
C6-L
(persistentemente infectadas con DENV-2) con los serotipos 3 y 4 pero no con
el 1 y que aparentemente ocurre a nivel de la replicación, aunque faltaría
determinar qué factores virales y/o celulares están participando en este
proceso. Estudios previos realizados por Igarashi en 1979 donde establece
células C6/36 persistentes con cada uno de los cuatro serotipos del virus,
encuentra interferencia viral cruzada con todos ellos que evidencía por una
disminución en los títulos virales comparados con células C6/36 normales. En
este trabajo Igarashi no establece la causa de este fenómeno pero sí reporta la
existencia de algún factor termosensible secretado al medio de cultivo con
actividad antiviral y encuentra que los virus generados por las células
persistentemente
infectadas
presentan
mutaciones
que
los
hacen
termosensibles y con virulencia atenuada en el modelo de ratón lactante
(Igarashi 1979). Posteriormente, en 1982, Dittmar reporta que un cultivo de
células de C6/36 infectadas con el DENV serotipo 1 fue resistente a una
superinfección con el serotipo 3 (Dittmar 1982). Finalmente, en un trabajo de
June Chen y colaboradores, donde también se establecen células C6/36
persistentemente infectadas con el DENV serotipo 2, observan una oscilación
de los títulos virales a lo largo del tiempo, como si existiera algún fenómeno de
interferencia (Chen 1994). Aunque en ninguno de los trabajos previos se
demuestra, los datos sugieren que en todos los casos podrían estar
participando las partículas defectuosas interferentes. Este tipo de partículas
poseen genomas con importantes mutaciones y deleciones y no son capaces
de replicarse por sí mismas sino que requieren de la ayuda del virus parental
pero al mismo tiempo tienen un proceso de replicación más eficiente que les
permite competir con el virus silvestre por los factores celulares y/o virales
requeridos para la replicación causando una disminución en dicho proceso
(Perrault 1981, Nayak 1985); incluso se ha encontrado recientemente que este
tipo de partículas en DENV circulan en la naturaleza entre seres humanos y
59
mosquitos y que pudieran ser responsables de la reducción de la prevalencia
de la enfermedad en determinados periodos de tiempo en una zona geográfica
determinada
(Aaskov
2006).
La
presencia
de
genomas
defectuosos
interferentes ha sido demostrada recientemente en las células C6-L (Juárez
2012) y aunque faltan más estudios por realizar, podrían fungir como
interferentes virales a nivel de la replicación de los serotipos 3 y 4 de DENV
pero no explicarían la falta de interferencia con el serotipo 1, ya que la
maquinaria replicativa está conservada para los 4 serotipos.
Varios mecanismos celulares ha sido implicados en el control de las
infecciones en mosquitos tales como los RNAs interferentes (RNAi), los
receptores tipo Toll y la vía de deficiencia inmune o Imd (Baron 2010, Guo
2010), de las cuales una de las más importantes es mediada por los RNAi,
especialmente en las infecciones por flavi y alfavirus (Keene 2004, Myles 2008,
Campbell 2008, Sanchez 2009, Brackney 2009, Hess 2011) y también se le ha
involucrado como uno de los factores que determinan las infecciones virales
persistentes en estos vectores (Hess 2011). En la vía de generación de los
RNAi participa una proteína con actividad de nucleasa llamada Dicer-2 (Dcr2)
que curiosamente es disfuncional en las células C6/36 por la presencia de una
mutación que crea un codón de terminación de la traducción en el RNAm, que
trae como consecuencia la generación de la proteína truncada que tiene
ausente los dominios de RNAsa (Scott 2010, Brackney 2010, Morazzani 2012).
Este hecho sugeriría que los RNAi no serían el principal mecanismo de control
de las infecciones virales en esta línea celular, aunque recientemente se ha
descrito la presencia de una vía Dcr2 independiente denominada piRNA que se
activa durante las infecciones por alfavirus como Sindbis y Chinkungunya
(Morazzani 2012, Vodovar 2012). Este tipo de respuesta antiviral es altamente
específica y, aunque se desconoce aún el mecanismo, el DENV es capaz de
evadirla, al menos parcialmente, logrando un infección exitosa en el vector
(Sánchez 2009, Hess 2011). Tal vez la respuesta antiviral preestablecida por la
infección persistente por el serotipo 2 es eficiente en controlar la replicación de
los serotipos 3 y 4 pero no del 1, sin embargo, este es un punto que requerirá
más estudios.
60
Trabajos previos realizados por Igarashi (1979) y Dittmar (1982) han
demostrado que en células C6/36 persistentemente infectadas con DENV
existe interferencia viral homóloga con la cepa Hawaii de DENV-1, la empleada
en este estudio. El hecho de que no se pudiera distinguir la infección por
DENV-1 en las células persistentemente infectadas de la ocurrida en células
normales en este trabajo, sugiere que el fenómeno de interferencia observada
por los autores arriba mencionados no es a nivel de la replicación. En este
sentido, otro de los factores que se han sugerido participan en el fenómeno de
interferencia viral son los receptores, es decir, las moléculas de la superficie
celular que participan en la unión e internalización del virus. Se sabe que la
ausencia de dichos receptores (Kaplan 1989, Kaplan 1991), mutaciones en los
mismos que modifican la eficiencia de la entrada del virus (Pavio 2000) o la
disminución de su expresión en la superficie (Hua 1997) causan una
disminución, o incluso abolen, la infección por un virus determinado. En
estudios preliminares realizados en el laboratorio se encontró que la unión de
DENV-4 a la superficie no se veía modificada en las células C6-L al ser
comparada con la línea celular normal, descartando parcialmente que la causa
de la interferencia viral fuera a este nivel. A este respecto Sakoonwatanyoo y
colaboradores demuestran que los diferentes serotipos del DENV no son afines
a un mismo receptor. Por ejemplo, observan que DENV-2 es más a fin por el
heparán sulfato que DENV-1 y que DENV-3 y 4 utilizan una proteína de unión a
laminina
para
entrar
a
las
células
de
mosquito
pero
no
DENV-1
(Sakoonwatanyoo 2005). Este podría ser un factor que podría explicar porque
otros autores han observado interferencia viral con DENV-1 y nosotros no pero
se requerirá de más estudios para determinarlo.
Finalmente, los cuatro serotipos del DENV están estrechamente relacionados
pero son antigénicamente distintos y comprenden varios genotipos los cuales
presentan diferencias en sus procesos infecciosos, tanto en el mosquito como
en el humano (Xi 2008) y existen poblaciones de Ae. aegypti que presentan
variaciones es la susceptibilidad a la infección por DENV-2 (Baron 2008).
61
En resumen, se requerirá de mayores estudios para poder dilucidar los
mecanismos que están participando en el proceso de interferencia viral
dependiente de serotipo. El tener conocimiento de estas diferencias entre los
serotipos del DENV, nos permitirá buscar estrategias específicas para poder
entender la infección de DENV en su vector, así como los mecanismos
celulares y virales que participan en su control durante las infecciones
persistentes que serán útiles en el diseño de estrategias encaminadas a
disminuir la transmisión del DENV a los seres humanos.
62
IX. CONCLUSIONES
La eficiencia de la replicación viral en células C6/36 infectadas con cada uno de
los serotipos del DENV por 24 y 48 h no es la misma, pues el número de copias
del genoma no fue el mismo entre ellos a pesar de haber usado una misma
multiplicidad de infección.
La eficiencia de la replicación de los serotipos 3 y 4 del DENV fue menor, tanto
a las 24 como a las 48 h en las células C6-L comparada con las células C6/36
normales lo que sugiere la existencia de un fenómeno de interferencial viral a
nivel de la replicación.
No se encontró una diferencia significativa en la eficiencia de la replicación de
DENV-1 entre las células C6/36 y las C6-L ni a las 24 ni a las 48 h, lo que
sugiere que no existe un fenómeno de interferencia viral en las células C6-L a
nivel de la replicación para este serotipo.
63
X. ANEXOS
TBE 1X
Tris-Base
10.8 g
Ácido Bórico
5.5 g
EDTA
0.93 g
Aforar con 1 litro con agua destilada. Esterilizar. El pH final 8.3.
PBS 10X
NaH2PO4
2.3 g
Na2HPO4
11.5 g
NaCl
90 g
Aforar con 1 litro con agua destilada. Esterilizar. El pH final 7.0.
SDS 10X
SDS
10 g
Dietilpirocarbonato
1 ml
Aforar a 100ml.
Agua DEPC
Aforar a 1 Litro con agua destilada. Esterilizar.
Naftol Blue Black
Naftol Blue Black
1g
Acetato de Sodio
13.6 g
Ácido Acético Glacial
60 ml
Aforar a 1 litro de agua destilada.
Carboximetilcelulosa 3%
Carboximetilcelulosa
1.5g
Aforar con 50 ml de agua destilada y agitar con barra magnética toda la noche
a temperatura ambiente. Esterilizar.
64
PBS-SFB 0.5%
SFB
2.5ml
Aforar a 500ml con PBS 10X. pH final 7.5. Filtrar.
Solución I
Glucosa 50 mM
Tris Cl 25 mM
EDTA 10 mM
Solución II
NaOH 0.2 N
SDS 1%
Solución II
Acetato de potasio 5M
60 ml
Ácido acético glacial
11.5 ml
Agua
28.5 ml
Medio MEM
1.92 g
NaHCO3
0.068 g
SFB
10 ml
Antibióticos
1.5 ml
Medio 2X
Aforara a 100ml.
Buffer de muestra 2X
Glicerol 50%
Azul de Bromofenol 0.25%
Xilencianol 0.25%
65
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