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QUÍMICA BIOLÓGICA
Trabajo Práctico N° 1: Cinética enzimática
Si se mide la aparición de producto o el consumo de sustrato en función del tiempo
de reacción enzimática, se obtiene una curva cuya pendiente en cada punto es
numéricamente igual a la velocidad de reacción en ese instante. En la mayoría de las
reacciones enzimáticas es posible, acortando suficientemente los períodos de medida de la
la reacción, obtener una zona inicial donde la aparición del producto o el consumo de
sustrato es función lineal del tiempo. En esta zona la pendiente es constante y en
consecuencia la velocidad en cualquier instante es la misma. La pendiente de la zona de
linealidad de aparición de producto o de consumo de sustrato en función del tiempo se
denomina "velocidad inicial". En la práctica se considera que se está en condiciones de
"velocidad inicial" cuando la cantidad de sustrato consumido es a lo sumo el 5% del inicial.
Todas las ecuaciones de cinética enzimática han sido desarrolladas suponiendo que
lo que se mide es la velocidad inicial. Por este motivo la determinación del tiempo de
incubación en el que es posible medir la velocidad inicial, es un paso indispensable en el
estudio de cualquier enzima.
En el experimento que se describe a continuación se hará el estudio cinético de una
enzima, la fosfatasa alcalina. Esta enzima, en medio alcalino y en presencia de Mg2+
cataliza la hidrólisis de ésteres fosfóricos. Para su determinación se utiliza como sustrato el
p-nitrofenil fosfato, que se escinde en p-nitrofenol y ácido fosfórico. El p-nitrofenol
liberado se encuentra en forma de anión de color amarillo, que puede determinarse
espectrofotométricamente a 410 nm (coeficiente de extinción molar: 18.000 M-1.cm-1).
Objetivo del experimento: Determinar la concentración proteica de una solución de
fosfatasa alcalina. Determinar los parámetros cinéticos de la enzima mediante un método
espectrofotométrico cinético. Expresar la Vmax en UI / mg de proteína.
Parte A: Determinación de la concentración proteica
Método de Bradford:
método por unión a colorantes
En condiciones adecuadas los grupos ácidos o básicos de las proteínas pueden
interactuar con grupos orgánicos de determinados colorantes para dar lugar a complejos
con un color característico.
Para el ensayo de Bradford se utiliza el colorante Coomassie Brillant Blue G250. Se basa en la conversión de la forma leuco del colorante (marrón-naranja) a una de
color intensamente azul cuando los grupos aniónicos del colorante interactuan con los
grupos amino de las proteínas.
Dicha reacción se mide por absorbancia a 595nm, existiendo una relación lineal
dentro de determinadas concentraciones de proteínas.
Este método es muy rápido y sensible y se puede trabajar en un rango de 20 a
140 microgramos de proteína para el ensayo estándar y de 1 a 50 microgramos para el
microensayo.
Materiales y Métodos:
• Espectrofotómetro y cubetas adecuadas
• Estándar de proteínas con concentración conocida: 1mg/ml de Seroalbúmina bovina
(BSA)
• Muestra de concentración desconocida (muestra incógnita)
Reactivo de Bradford: 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 se disuelven
en 50 ml de etanol y 100 ml de ácido fosfórico al 85%. Se ajusta el volumen a 1 litro
con agua y se filtra. Estable por 2 meses.
Microensayo: las muestras se llevan a 800 microlitros con agua, se agrega 0,2 ml de
reactivo de Bradford, se agita y se deja 5 min a temp ambiente. Leer a 595 nm e
interpolar en una curva estándar. Corregir por el factor de dilución si fuera necesario.
Preparación de la curva estándar:
μg de BSA
0
2
4
7
10
25
μl
0
H2O (μl)
800
c.s.p 800
c.s.p 800
c.s.p 800
c.s.p 800
c.s.p 800
Bradford(μl)
200
200
200
200
200
200
Abs 595nm
Luego de agregar el reactivo de Bradford agitar e incubar a Tº ambiente 5’.
Leer Abs a 595nm
Graficar Absorbancia en función de μg de proteína, calcular la pendiente de la
curva.
Efectuar diluciones de la muestra e interpolar esos datos en la curva estándar
para averiguar la concentración.
Parte B: Determinación de las velocidades iniciales
Materiales y métodos:
•
•
•
•
•
•
Pipetas automáticas
Cubetas de 100 ul
Recipiente con hielo granizado
Baño termostatizado a 37°C
Cronómetro
Espectrofotómetro
a) Sustrato:
p-nitrofenilfosfato (sal disódica)
CO32-/HCO3- (pH 10.7)
MgCl2
2x10-2 M
2x10-1 M
3x10-5 M
b) Enzima:
fosfatasa alcalina
CO32-/HCO3- (pH 10.7)
MgCl2
2x10-1 M
3x10-5 M
Estas soluciones deben conservarse a baja temperatura en un recipiente con hielo
granizado.
CO32-/HCO3- (pH 10.7)
MgCl2
c) Buffer:
2x10-1 M
3x10-5 M
Tabla: Composición de las mezclas de reacción para determinar la velocidad de aparición
de producto en función del tiempo para cada concentración de sustrato
Tubo N°
1
2
3
4
5
6
Sustrato (ul)
5
10
20
30
40
50
Enzima (ul)
10
10
10
10
10
10
Buffer (ul)
85
80
70
60
50
40
Procedimiento: Efectuar una dilución adecuada de la solución que contiene la enzima.
Llevar a cero el espectrofotómetro con agua, seleccionando 410 nm de longitud de onda.
Preincubar cada mezcla de sustrato y buffer durante 1 minuto a 37ºC según los volúmenes
que figuran en la tabla. Iniciar la reacción con el agregado de la enzima poniendo en
marcha, simultáneamente, el cronómetro. Pasar la mezcla de reacción a la cubeta y leer las
absorbancias cada 30 segundos durante 5 minutos. Para cada concentración de sustrato
determinar la velocidad inicial de reacción expresada como micromoles de producto
generados por minuto.
Parte C: Determinación de los parámetros cinéticos
Grafique velocidad inicial en función de la concentración de sustrato y la inversa de
la velocidad inicial en función de la inversa de la concentración de sustrato. Inspeccione los
gráficos e interprete si la cinética obedece a la ecuación de Michaelis-Menten. Estime de
las dos representaciones las constantes cinéticas de la enzima: la velocidad máxima (Vmáx)
y la constante de Michaelis (KM). Expresar la Vmáx como UI/mg de proteínas.
Cuestionario:
1- ¿Qué representación le parece más adecuada para estimar los parámetros cinéticos?¿Por
qué?
2 – En el caso de considerar significativa la hidrólisis no enzimática del sustrato, ¿cómo
procedería para determinar la velocidad inicial de reacción para cada concentración de
sustrato?
3 - ¿Hasta qué tiempo la velocidad de formación de producto es constante? ¿Por qué?
Relacione esta observación con el cálculo de la cantidad total de sustrato consumida
durante cada ensayo y si se cumple la condición de velocidad inicial.