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TECO DIAGNOSTICS
FOSFATASA ALCALINA
MÉTODO CINÉTICO
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REACTIVO PARA FOSFATASA ALCALINA:
Para la determinación cuantitativa de Fosfatasa Alcalina en suero.
INTRODUCCIÓN.
Distribuida en casi todos los tejidos del cuerpo, los nivele s de Fosfatasa
Alcalina (ALP) son de interés para el diagnostico de enfermedades
hepatobiliares y enfermedades de los huesos. La mayoría de la ALP normal en
suero proviene del tracto biliar. Los niveles normales de ALP dependen de la
edad y son elevados durante periodos crecimiento óseo. Los aumentos
moderados de ALP (sin incluir el hígado o hueso) se puede atribuirla mal de
Hodgkin, congestión cardiaca y a infecciones bacteriales estomacales. También
hay aumento en el tercer trimestre del embarazo.
La Fosfatasa Alcalina se determina midiendo el rango de hidrólisis de varios
esteres de fosfato, el p-Nitrofenilfosfato es uno de los esteres mas usados como
substrato por Fujita en 1939. Después Bower y McComb modificaron el
procedimiento a una prueba cinética. En 1974 el Comité de Enzima de la
Sociedad Escandinava de Química Clínica y Fisiología Clínica adoptó la
modificación del procedimiento anterior como el procedimiento recomendado.
El presente método es una modificación de los métodos mencionados como
referencia en el comité y de la Asociación Americana de Química Clínica.
PRINCIPIO.
La secuencia enzimática utilizada en esta prueba es como sigue:
p-Npp + H2O ----Alk Fosf
p – Nitrofenol + H3PO4
El p – Nitrofenol Fosfato es un hidrolizado a p – Nitrofenol y fosfato
inorgánica. El rango de hidrólisis del p-Nff medida a 405 nm es directamente
proporcional a la actividad de la Fosfatasa Alcalina.
REACTIVOS.
Las concentraciones se refieren a los reactivos reconstituidos.
Reactivo de Fosfatasa Alcalina: p-Nitrofenilfosfato 17mM, Iones Magnesio
amM, Buffer (pH 102.2 +0.2) activador y captador.
PRECAUCIONES.
1.- Use el reactivo solamente para diagnostico in Vitro.
CUIDADO: Los reactivos para diagnostico in Vitro pueden ser peligrosos.
Trátelos de acuerdo a los buenos procedimientos de laboratorio que dictan para
evitar la ingestión y contacto con los ojos y piel.
2.- Evite ingestión de los materiales.
PREPARACION Y CUIDADOS.
1.- Use el reactivo solamente para diagnostico in Vitro.
CUIDADO: Los reactivos para diagnostico in Vitro pueden ser peligrosos.
Trátelos de acuerdo a los buenos procedimientos de laboratorio que dictan para
evitar la ingestión y contacto con los ojos y piel.
2.- Los especímenes deben considera infecciosos y se deben manejar
apropiadamente.
3.- Use agua destilada o des ionizada donde se indique.
ALMACENAJE DEL REACTIVO Y ESTABILIDAD
Manténgase almacenado de 2-8° C. El reactivo sin reconstituir es estable hasta la
fecha de caducidad mostrada en la etiqueta. El reactivo reconstituido es estable
por 30 días a 2-8°C. En bote de vidrio ámbar, 24 horas a temperatura ambiente.
DETERIORO DEL REACTIVO.
No se use si
1.- El reactivo se ve turbio. Puede ser indicio de contaminación.
2.- Ha entrado humedad al frasco y se ha endurecido.
3.- El reactivo reconstituido tiene densidad óptica mayor a 0.8 a 405 ni.
COLECTA DE LA MUESTRA.
Utilice suero no memorizado. Se puede usar plasma con heparina. El oxalato, el
fluoruro y EDTA inhiben la Fosfatasa Alcalina. Las muestras se deben mantener
en refrigeración y se deben analizar tan pronto como sea posible. Se debe
establecer una rutina cronometrada ya que los niveles de FAL, aumentan
significativamente cuando se almacena de 2-8° C o a temperatura ambiente.
INTERFERENCIAS
EDTA citrato, fluoruro y oxalato inhiben la Fosfatasa Alcalina. Alguna drogas y
substancias afectan la actividad de la fosfatasa alcalina las publico el Young et,
al.
MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROPORCIONADOS
1.- Instrumentos de pipeteo.
2.- Tubos/ gradilla.
3.- Reloj.
4.- Block térmico. (37° C)
5.- Espectrofotómetro con capacidad de 405 nm.
INSTRUCCIONES GENERALES.
El reactivo para Fosfatasa Alcalina se puede usar en procedimientos con
instrumentos químicos automatizados o en métodos manuales en un espectro
confiable.
PROCEDIMIENTO AUTOMATICO.
Consulte la aplicación apropiada para el instrumento.
PROCEDIMIENTO MANUAL.
1.- Reconstituya de acuerdo a las instrucciones.
2.- Pipetee 1.0 ml de reactivo de trabajo en todos los tubos y pre incube a 37°C
por cinco minutos.
3.- Ponga el espectrofotómetro en cero con agua a 405 nm.
4.- Agregue 0.025 ml (25 µL) de muestra en los tubos respectivos y mezcle.
5.- Después de un minuto lea y registre la absorbancia. Regrese el tubo al block
térmico. Repita las lecturas cada minuto los próximos minutos.
6.- Calcule la (A Abs/min) diferencia promedio de absorción por minuto.
7.- La A Abs/min multiplicada por el factor 2187 (Cálculos) nos dará los
resultados en IU/L.
8.- Las muestras con valores sobre 800 IU/L se deben diluir 1:1 con solución
salina, corre de nuevo y multiplique por dos.
NOTA.
Si el espectrofotómetro cuanta con cubeta de temperatura controlada deje el tubo
en la cubeta mientras se toman las lecturas.
VOLUMEN ALTERNO
Si el espectrofotómetro requiere un volumen final mayor a 1.0 ml para la lectura
precisa, siga el PROCEDIMIENTO ALTERNO.
CALCULOS.
La unida internacional (IU/L) es la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de un micro mol de sustrato por minuto bajo condiciones
específicas.
IU/L = A Abs/min x 1000 x 1.025 = A Abs/mi x 2187
18.75 x 1 x 0.025
Donde:
A Abs/min = Cambio de absorción.
1000
= Conversión de IU/ml a IU/L.
1.025
= Volumen total de la reacción.
18.75
= Absorción mili molar del p-Nitrofenol.
1
= Trayecto de la luz en cm.
NOTA.
Si los parámetros cambian, el factor se debe calcular con la formula anterior.
UNIDADES SI.
Multiplique IU/L por 16.67 = (nkai/L)
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FOSFATASA ALCALINA
MÉTODO CINÉTICO
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PROCEDIMIENTO ALTERNO.
1.- Reconstituya el reactivo según instrucciones.
2. Pipetee 3.0 ml de reactivo en los tubos apropiados y permita que se equilibren
a 37°C.
3.- Ponga el espectrofotómetro en cero con agua a 405 nm.
4.- Agregue 0.01 ml (100 µL) de muestra en los tubos respectivos y mezcle bien.
5.- Después de un minuto lea la absorbancia (A1) y regrese el tubo a 37°C por
tres minutos más.
6.- Después de 3 minutos exactos, lea y registre la absorbancia (A2).
7.- La diferencia entre las absorbancias (A2-A1) multiplicada por el factor 551
(Vea Cálculos de procedimiento alterno) nos da los resultados en IU/L.
8.- Las muestras con valores sobre 500 IU/L se deben diluir con solución salina,
el resultado se multiplica por dos.
CALCULOS DE PROCEDIMIENTO ALTERNO.
La unida internacional (IU/L) es la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de un micro mol de sustrato por minuto bajo condiciones
específicas.
IU/L = (A2-A1) x 3.1 x 1000 = (A2-A1) x 551
3 min x 1 18.75 x 0.1
A2-A1
1000
3.1
18.75
0.1
= Cambio de absorción.
= Conversión de IU/ml a IU/L
= Volumen total de la reacción.
= Absorción mili molar del p-Nitrofenol.
= Volumen de la muestra.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO:
Esta metodología mide la Fosfatasa Alcalina total irrepectivamente del tejido u
órgano de origen. Para un diagnostico diferencial puede necesitarse mas pruebas.
3.- Estudio de precisión.
Entre prueba
Concentración:
DE
76.1
2.1
331.3
15.4
Concentración:
75.3
151
Prueba a prueba
DE
5.1
11.26
CV%
2.7%
4.6%
CV%
6.7%
3.4
REFERENCIAS.
1. Kochmar, J.F., and Moss D.W. Fuandamentals of Clinical
Chemestry, N.W., Tiestz (ed) p. 604, W.B. Saunders ans Company,
Philadelphia, PA (1976)
2. Kaplan, M.M and Reighetti, A: J Clin, Inv 34: 126 (1955)
3. Kaplan, M.M New England J. Med 286:200 (1972)
4. Fujita, J.J. Biochen, (Japan) 30.69 (1969)
5. Bower, G.N. Jr, Mcomb, R.B. Clin Chem. 12:70 (1966)
6. The Comitee on Enzyme of de Sacndinavan Society for Clinical
Chemestry and Clinical Physiology, Sand, J, Clin Lab, Invest 32:29
(1974)
7. Tietz , N.W. ed: Study Group od Alkaline Phosphatase, A reference
method for measurent of alkaline phosphatease activity in Human
Serum. Clin Chem. 29:751 (1983)
8. Demetrius, S.A. Drewes, P.A., Gin, J.B. Clinical Chemestry:
Principes and Technics, 2nd Ed, Haderstown (MD), Harper and Row,
p.927 (1974)
9. Young, D.S. es al: Clin. Chem 21:5 (1975)
10. Tiestz, N.W. Fundamentals of Clinical Chemestry (1976) 602-609.
Fabricado por:
CONTROL DE CALIDAD.
Se recomienda que se incluyan controles en cada grupo de pruebas. Se pueden
usar controles comerciales con valores establecidos para la Fosfatasa Alcalina.
El valor asignado del material de control se debe confirmar con la aplicación
seleccionada. Si no se pueden obtener los resultados dentro del rango apropiado
de valores, es un indicio de deterioro de reactivo, malfuncionamiento de los
instrumentos o errores del procedimiento.
VALORES ESPERADOS.
Adultos 25-90 IU/L 37°C . Los infantes tienen valores normales mayores. Se
recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores
esperados, ya que existen diferencias entre los instrumentos, laboratorios y
poblaciones específicas.
CARACTERISTICAS ESPECÍFICAS DE DESEMPEÑO.
1.- Linearidad= 90mg/dL.
2.- Comparación: Un estudio de comparación realizado entre nuestro método y
otro comercial resultó en una ecuación de regresión de y=0.95x + 3.5 y un
coeficiente de correlación de 0.999
Distribuido por:
Grupo Tecnología y Laboratorios S.A de C.V.
T. (81) 8370 7992
www.grupotecnolab.com