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EFECTO DE LOS COMPONENTES DE LA PARED CELULAR
VEGETAL SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA SUPERÓXIDO
DISMUTASA DE A. brasilense
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Manuel Méndez Gómez , Elda Castro Mercado , Homero Reyes de la Cruz , Elda Beltrán
Peña4, Ernesto García Pineda5
Eje1. La investigación en las Ciencias Básicas
Mesa 3: Ciencias Agrícolas y Biotecnología
Palabras Clave: respuesta de defensa, estrés oxidativo, simbiosis.
Durante la interacción planta-microorganismo se lleva acabo un dialogo
molecular entre estos dos actores, donde se involucra una gran variedad de
moléculas como las especies reactivas de oxigeno y componentes de pared
celular tanto de la planta como de la bacteria. Los componentes de pared
celular de la planta tienen la capacidad de inducir respuestas de defensa en la
planta misma. Por su parte, los lipopolisacaridos que forman parte de la pared
celular de las bacterias Gram negativas pueden suprimir las respuestas de
defensa de las plantas durante la interacción. En este trabajo analizamos el
efecto de componentes de la pared celular sobre la actividad de la enzima
superóxido dismutasa (SOD) de A. brasilense Sp245. Encontramos que la
pectina, exudado radical y raíz completa incrementan la actividad de esta
enzima. Mientras que el acido poligalacturonico disminuye ligeramente la
actividad. Por otro lado, los lipopolisacarios de A. brasilense no afectan la
producción de anión superóxido en el sistema radical de la planta. Sin embargo
cuando la plántulas fueron tratadas con filtrados del cultivo bacteriano se
incrementa ligeramente la producción de esta molécula. Con estos resultados
demostramos que la superóxido dismutasa de A. brasilense incrementa su
actividad en respuesta a los componentes de pared celular de la planta,
posiblemente como un mecanismo de defensa ante el estrés oxidativo
generado por la planta durante las primeras etapas de la interacción.
Introducción
Las plantas interactúan con una gran cantidad de microorganismos que pueden
tener un efecto positivo o negativo sobre su crecimiento. Las rizobacterias, son
un grupo de bacterias que tienen la capacidad de promover el crecimiento
vegetal a través de fijar el nitrógeno atmosférico, sintetizar fitohormonas,
inducción de resistencia sistémica ante diferentes tipos de estrés, entre otros.
Una afectiva interacción planta-rizobacteria requiere un coordinado
reconocimiento en que señales moleculares son intercambiados entre ambos
actores. Un ejemplo es durante la interacción Rhizobium-leguminosa, en donde
la bacteria secreta factores Nod en respuesta a flavonoides liberados por la
planta. Este factor Nod inducen la formación de hilos de infección y nódulos en
la planta.
Tanto en la interacción patogénica como en la simbiótica, el incremento en la
producción de EROs es detectado en los primeros eventos plantamicroorganismo y parece ser una respuesta común de las plantas. Esta
producción llamada explosión oxidativa puede ser considerada como una señal
especifica durante el proceso de interacción (Nanda et al., 2010). A diferencia
de las interacciones patogénica, donde la producción de EROs es de dos
fases, una baja y seguida por una alta producción; en la interacciones
simbióticas la segunda producción parece no tener lugar (Lohar et al 2007).por
lo tanto, se podría pensar que estas diferencias podrían actuar como señales
especificas para determinar que respuestas puede activar el hospedante hacia
el microorganismo. De cualquier manera las bacterias simbióticas son
reconocidos como agentes patógenos que desencadenan una respuesta de
defensa en la planta. Debido a que las plantas producen EROs durante la
interacción con microorganismos, las bacterias poseen mecanismos
enzimáticos para contrarrestar los efectos de estas moléculas. Tal es el caso
de la SOD que destoxifica al anión superóxido. Un ejemplo muy claro es el
incremento en la expresión de genes como la SOD, glutatión reductasa en la
bacteria durante la interacción G. diazotrophicus cepa PAL5 y plantas de arroz
(Alquéres et al., 2013).
Sin embargo en muchos estudios se ha reportado la participación de moléculas
como proteínas superficiales y lipopolisacaridos bacteriales en el
establecimiento de la interacción ya que se cree que tienen un papel en
suprimir los mecanismos de defensa de las plantas (Mithöfer, 2002).
Por lo tanto en este trabajo se analizó la actividad de la superóxido dismutasa
de A. brasilense durante la interacción con la planta. Para esto se utilizo como
modelo de estudio A. brasilense-planta de trigo. Además se analizo el efecto
lipopolisacaridos y proteínas superficiales bacteriales sobre la producción de
anión superóxido en plantas de trigo.
Objetivo
Analizar el efecto de componentes de pared celular sobre la actividad de la
enzima superóxido dismutasa de A. brasilense Sp245.
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•
Objetivos particulares
Analizar el efecto de pectina, acido poligalacturonico, exudados
radicales, raíz completa sobre la actividad de la superóxido dismutasa.
Analizar la producción de anión superóxido en plántulas de trigo durante
el tratamiento con lipopolisacaridos y bacterias previamente tratadas con
papaína.
Materiales y Métodos
Cepa, medio de cultivo y condiciones de crecimiento de A. brasilense. A.
brasilense sp245 fue proporcionada por la Dra. Gladys Alexandre de la
Universidad de Tennessee, USA y crecido en medio LB mínimo pH: 7 (Triptona
10 gr/l; extracto de levadura 5 gr/l; NaCl 5 gr/l) suplementado con MgSO4 a 2.5
mM (0.186 gr/l) y ClCa 2.5 mM (.277 gr/l). Al medio de cultivo se le adiciono
Tetraciclina a una concentración de 10μg/ml como medio de selección. Se
incubó a 28 ºC con agitación de 180 rpm durante 24 horas. Para el tratamiento
con papaína se centrifugo 50 ml del cultivo bacteriano a 3 200 rpm durante 5
minutos. Posteriormente se resuspendió en 45 ml de medio LB mínimo, se
adiciono 5 ml de una solución de papaína 1 mM e incubar por 2 horas a 37 ºC
en agitación. Cumpliendo el tiempo, se centrifugo y se resuspendio en 50 ml de
medio LB mínimo. La papaína se preparo en un buffer que contiene 50 mM de
Tris, 0.15 M de NaCl, 2 mM de EDTA a pH: 8. Al momento de disolver la
papaína, se adiciona 5 mM de cisteína y se esteriliza con un filtro de 0.2 μm.
Por otra parte la solución de papaína se desnaturaliza con autoclave a 15 lb de
presión, 121 ºC durante 20 minutos. Para la obtención del filtrado libre de
bacterias, el inoculo fue filtrado con una membrana de 0.2 mm.
Para el tratamiento con componentes de pared celular, el inoculo fue crecido
junto con 1mg/ml de pectina y acido poligalacturonico, 100 mg de raíz
completa, 2.4% de exudados de raíz v:v (obtenido de plántulas crecidas en
H2O destilada estéril durante 5 días) y100 μM de paracuat, durante 24 h.
Condiciones de crecimiento de trigo e infección y detección de de
especies reactivas de oxigeno. Las semillas de trigo variedad NANDA fueron
donado por el D.C. Mario González del INIFAP, Celaya. Las semillas fueron
desinfectadas con una solución de SDS al 1% durante 3 minutos seguido por
una solución de cloro al 1% durante 5 minutos (entre las dos soluciones se
enjuaga tres veces con agua destilada estéril). Las semillas desinfectadas se
colocaron en cajas petri con algodón y papel filtro húmedo e incubado durante
3 días a 26 ºC en oscuridad. Para los tratamientos, las plántulas se transfirieron
en tubos de ensaye conteniendo 2 ml de medio Lb minimo (pH. 7) y
posteriormente infectadas con 2 ml de A. brasilense (DO600nm: 0.900) que
contiene aproximadamente 2x108 UFC sin tratamiento y previamente tratadas
con papaína, 2 ml de papaína desnaturalizada y 2 ml de filtrado. Las muestras
se incubaron por 24 h a 25 ºC. Para visualizar la producción de anión
superóxido, la raíz de las plántulas de trigo fuero teñidas durante 15 minutos
con una solución de NBT al 0.1% disuelto en un buffer de fosfato de sodio 50
mM, pH 7.5.
Extracción de lipopolisacaridos. De un cultivo de 24 horas de crecimiento, se
centrifugo y se peso 411 mg de bacteria. Se resuspendio en 15 ml de buffer de
Tris-HCL (pH: 8) conteniendo 2 mM de MgCl2. Posteriormente se adiciono 20μl
de DNasa de 10kU y 100μl de RNasa de 5μg/ml. Se sonicaron las células a 50
pulsos durante 15 seg y 10 de reposo en hielo por 7 veces. Se incubo a 37 ºC
por 2 horas. Se adiciono 20 µl de cloroformo por mg de célula para crear una
fase de separación. Agitar e incubar por 10 minutos. Centrifugar a 12 000 g por
10 minutos. Recuperar la fase acuosa. Disolver el extracto de LPS en 23.75 ml
de 0.375 M de cloruro de magnesio en etanol absoluto al 95 %. Almacenar a 20 ºC, durante toda la noche, para precipitar los LPS. Centrifugar a 12 000 g
por 15 minutos y decantar. Resuspender la pastilla en 1 ml de agua destilada
estéril. Por ultimo se liofilizó la muestra para mantenerlos secos a 4º C.
Extracción y actividad de SOD de A. brasilense. Para extraer la SOD, se
centrifugo 25 ml de cultivo bactriano a 3 200 rpm por 5 minutos. Se
resuspendió en 2 ml de buffer de fosfato de potasio 50 mM pH: 7.
Posteriormente se sónico a 50 pulsos con intervalos de 15 segundos de
sonicado y 10 de descanso a 4 ºC, por 7 veces. Se centrifugo a 12 000 rpm por
2 minutos. Se recupera el sobrenadante y se cuantifica la cantidad de proteínas
totales por el método de Bradford. La actividad de la SOD se visualizo en geles
nativos de poliacrilamida al 8% por la inhibición de la reducción del NBT.
Resultados
Efecto de componentes de pared celular.
Para simular la interacción A. brasilense-planta de trigo, la bacteria fue crecida
durante 24 h junto con diferentes componentes de pared celular. Cumpliendo el
tiempo se analizo la actividad de la superóxido dismutasa de la bacteria en
geles de poliacrilamida. Como se puede observar, el tratamiento con AP
disminuye ligeramente la actividad de esta enzima. Mientras que en el
tratamiento con pectina incrementa la actividad de la SOD al igual que con raíz
completa y exudados radicales. Para corroborar que el incremento en la
actividad de esta enzima es debido a que las bacterias están en estrés, A.
brasilense fue crecido con paracuat un compuesto que induce la producción de
especies reactivas de oxigeno. El tratamiento con este compuesto incrementa
la actividad la actividad de esta enzima (Fig. 1).
Tratamientos
Ab
AP
Pec
Ex
Raíz Prq
Ab AP
Pec
Ex
Prq
Fig. 1. Actividad de la superóxido dismutasa de A. brasilense. Ab: A.
brasilense. AP: acido poligalacturonico. Pec: pectina. Ex: exudado.
Raíz: raíz completa. Prq: paracuat
Efecto de proteínas y lipopolisacaridos de A. brasilense sobre la
producción de anión superóxido en raíz de trigo.
Debido a que algunos componentes de las bacterias pueden afectar la
respuesta de defensa de las plantas, se analizo el efecto de proteínas que se
encuentran en la superficie de A. brasilense y lipopolisacaridos sobre la
producción de anión superóxido en la raíz de plántulas de trigo. El tratamiento
con filtrado de bacterias y papaína desnaturalizada no afecta la producción del
anión superóxido en las plantas de trigo, mientras que las plantas tratadas con
Azospirillum previamente tratadas con papaína reduce la producción de anión
superóxido en la parte apical de la raíz de trigo. Este efecto no tiene diferencia
con las plantas tratadas con Azospirillum sin tratamiento (Fig. 2). Por lo tanto
las proteínas de esta bacteria probablemente no estén participando en la
reducción de la producción de anión superóxido en la raíz.
Tratamientos
Control
Filtrado
Papaína
+Ab papaína
+Ab
Fig. 2. Efecto de proteínas de A. brasilense sobre la producción de anión superóxido.
+Ab: A. brasilense previamente tratadas con papaína, +Ab: A. brasilense
El tratamiento de plántulas con lipopolisacaridos no afecta la producción de
anión superóxido en la raíz de trigo (Fig. 3). Por lo tanto, probablemente
Azospirillum tiene otro mecanismo para afectar producción de las especies
reactivas de oxigeno o el tiempo de tratamiento con estas moléculas no son
suficientes para poder observar un efecto.
Tratamientos
Control
LPS 50μg/ml
LPS 100μg/ml
Fig. 3. Efecto de los lipopolisacaridos sobre la producción de anión superóxido.
LPS: Lipopolisacarido
Conclusión
Los componentes de pared celular incrementan la actividad de la SOD de A.
brasilense sugiriéndonos que durante la interacción A. brasilense-trigo, la
planta activa la producción de especies reactivas de oxígeno. Por lo tanto la
bacteria activa sistemas antioxidantes para contrarrestar el efecto dañino de
estas moléculas. Mientras que las proteínas superficiales y lipopolisacaridos de
Azospirillum no participa para modificar la producción del anión superóxido en
la raíz en estas condiciones.
Referencias
Alquéres S, Meneses C, Rouws L, Rothballer M, Baldani I, Schmid M,
Hartmann A. 2013. The Bacterial Superoxide Dismutase and Glutathione
Reductase Are Crucial for Endophytic Colonization of Rice Roots by
Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5. MPMI. 26 (8), 937–945.
Lohar DP, Haridas S, Gantt JS, VandenBosch KA (2007) A transient decrease
in reactive oxygen species in roots leads to root hair deformation in the legumerhizobia symbiosis. New Phytol. 173, 39–49.
Mithofer A. 2002. Suppression of plant defence in rhizobia–legume symbiosis.
Trends Plant Sci. 7, 440–444.
Nanda AK, Andrio E, Marino D, Pauly N, Dunand C. 2010. Reactive oxygen
species during plant-microorganism early interactions. J. Integr. Plant Biol.
52(2), 195–204.