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Mutación de gen phbZ de Azospirillum brasilenseSp245 1 Rosales Cruz Araceli. 2Soto Urzúa Lucía *2Martínez Morales L. Javier. 2 Escuela de Biología. Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Edif.103J, 24 Sur y Av. San Claudio, Puebla, Pue., México. [email protected] 1 INTRODUCCIÓN. El incremento de la contaminación de plásticos requiere realizar estudios en materiales alternativos para estos productos derivados del petróleo, como los polihidroxialcanoatos (PHAs). Los PHAs son biopolímeros producidos por un gran número de microorganismos, los cuales lo utilizan como reserva de carbono y energía. Azospirillum brasilense es un importante productor de un tipo de PHA de cadena corta denominado poli-β-hidroxybutirato (PHB). A. brasilense produce PHB a partir de fuentes de carbono como glucosa o almidón, condensando dos moléculas de acetil CoA para formar 3-acetoacetil-CoA, con la liberación de 3-acetoacil-CoA para los monómeros 3-hidroxibutiril-CoA que posteriormente son polimerizados para obtener PHB, el cual es almacenado en gránulos que llegan a ser hasta el 80% de peso seco de la célula. La enzima PHBdepolimerasa degrada el PHB para ser aprovechado. En A. brasilense el gen que codifica para esta enzima es phbZ. El objetivo de este trabajo fue eliminar esta enzima y aumentar la acumulación de PHB. MATERIAL Y METODOS. Se realizó una mutante en el gen phbZ de A. brasilense por inserción de un cartucho de resistencia a kanamicina. La secuencia del gen pbhZ se obtuvo de la base de datos de NCBI para los análisis in silico, se diseñaron oligonucleótidos tomando 948 pb rio arriba y 776 pb rio abajo flanqueando al gen con sitios de corte para la enzima Bam HI, se amplificó por PCR y clonó en el vector pCR 2.1 TOPO, se transformó en células competentes de E. coli DH5α, se seleccionó con IPTG y X-Gal. Posteriormente se realizó digestión con enzima Bam HI para liberarlo e insertarlo en el vector suicida pSUP 202, después se insertó el cartucho de Km en el sitio único de Eco RI. La construcción se comprobó por PCR y se transformó a E. coli S 17.1 (donadora) para la conjugación con A. brasilense Sp 245 (receptora) y tener un intercambio alélico. Finalmente la presencia del gen se verificó por PCR en la cepa silvestre y en la cepa mutante (mayor tamaño). RESULTADOS. La mutante phbZ::km se comprobó realizando PCR de la cepa silvestre y mutante mostrando un tamaño de 1.2 kb y 2.4 kb, respectivamente, por la inserción del cartucho de kanamicina de 1.2 kb. La cuantificación de PHB mostro diferencias en su acumulación. CONCLUSIONES. La inserción del cartucho de kanamicina en el gen phbZ generó una mutante que alteró la acumulación del PHB. A B Ilustración 1. A. Electroforesis de las PCR de:Wt= gen phbZde A. brasilense Sp245, M= Mutante A. brasilense Sp245 phbZ::Km-, C= Control Plásmido con inserto, pSUP202:phbZ. C= Control plásmido con construccion pSUP202:phbZ::Km. B. Esquema de la construcción.
