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Perfilado metabólico de plantas del
género Virola spp (Myristicaceae)
provenientes de la Amazonía y
Orinoquía Colombiana y evaluación
de la actividad antifúngica contra
Fusarium oxysporum
Luisa Lorena Orduz Díaz
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá D.C., Colombia
2015
Perfilado metabólico de plantas del
género Virola spp (Myristicaceae)
provenientes de la Amazonía y
Orinoquía Colombiana y evaluación
de la actividad antifúngica contra
Fusarium oxysporum
Luisa Lorena Orduz Díaz
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
Magister en Ciencias - Química
Director (a):
Dr. Luis Enrique Cuca Suárez
Profesor titular Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional
de Colombia
Línea de Investigación: Productos Naturales Vegetales
Grupo de Investigación: Estudio químico y de actividad biológica de Rutaceae y
Myristicaceae Colombianas
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá D.C., Colombia
2015
A mis padres, mi hermana, mi familia y mis
amigos…
El experimentador que no sabe lo que está
buscando no comprenderá lo que encuentra.
Claude Bernard
Agradecimientos
En primera instancia a Dios, por darme la vida.
A la Universidad Nacional de Colombia, por las oportunidades y enseñanzas recibidas
durante mi paso por sus aulas.
Al Dr. Luis Enrique Cuca Suarez, por permitirme hacer parte de su grupo de
investigación, por su paciencia, enseñanzas, comprensión y apoyo durante el desarrollo
de este proyecto.
Al Dr. Ericsson Coy, mi jefe, mi modelo a seguir, mi maestro, mi colega, quien me
motivó a iniciar este proyecto, me apoyó y guio durante el desarrollo del mismo con
paciencia y una sonrisa, demostrando que cuando las cosas se hacen con dedicación y
empeño, se obtiene buenos resultados. Gracias por la confianza y por estar siempre
dispuesto a escuchar y aconsejar.
Al Laboratorio de Productos Naturales Vegetales y todos sus integrantes: Elizabeth,
Diego M, Juan Carlos, Jorge P, Tatiana, Erika, Profe Fabián, Profe Oscar y Profe
Mónica, por la colaboración y aportes a mi trabajo. Especialmente al Profe Wilman por
el apoyo y colaboración en la recolección de muestras.
Al Laboratorio de Química Bioorgánica de la Universidad Militar Nueva Granada
donde se realizaron los Análisis cromatográficos (LC-DAD-ESI-MS y GC-MS) y
cuantitativos y sus integrantes, Andresito, Diego Q, Diana G., Lili, Willy, Ricardo,
Juanito, Ronald y todos los demás, por la compañía durante las largas jornadas y todos
aquellos momentos compartidos.
A mis amigos y colegas Freddy Bernal y Camilo Guerrero, quienes siempre estuvieron
dispuestos a escucharme, explicarme y motivarme para que todo saliera de la mejor
forma. Gracias por los cafés, las pausas activas, las alegrías y los viajes compartidos.
Espero visitarlos pronto.
VIII
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
A Juliana Cardona y Catalina Rozo, quienes me ofrecieron su amistad, y compartieron
conmigo sus experiencias. Gracias por aquellos momentos felices, ratos amargos y por
los cafés pendientes.
Al Instituto Amazónico de Investigación Científica – SINCHI y en especial a Marcela
Carrillo y al Ing. Bernardo Giraldo por la recolección y clasificación de algunas de las
muestras objeto de este estudio.
Al Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Militar Nueva Granada por proveer
los espacios para la realización de pruebas antifúngicos y proporcionarme la cepa del
hongo.
Al Dr Massuo J. Kato y a la Dra Lydia Yamaguchi por su apoyo durante la pasantía de
Investigación en su laboratorio, la sus enseñanzas recibidas, su inmensa amabilidad y
hospitalidad.
Al Laboratorio de Química de Productos Naturales de la Universidad de Sao Paulo y
sus integrantes: Yasmín, Marcilio y Renan, por la colaboración y aportes a este trabajo.
Al Instituto de Química de la Universidad de Sao Paulo-Brasil, donde se llevaron a
cabo los análisis de Cromatografía Liquida acoplada a espectrometría de masas de alta
resolución y de Resonancia Magnética Nuclear.
De manera muy especial a mis padres Luz Mery y Gabriel y mi hermana Daniela, pues
son el motor de mi vida. Gracias por la compresión durante estos dos años y aquellas
palabras y frases de aliento, que siempre llegaban en el momento indicado y apoyarme
en todas las locuras que se me ocurren.
Finalmente todas aquellas personas que en algún momento me acompañaron,
enseñaron, aminaron, y aconsejaron, Sandrita Mondragón, Javier R., Sindy Lorena,
Kikita, y todos los demás amigos, compañeros, colegas o familiares que de una u otra
forma aportaron a este proyecto.
Resumen y Abstract
IX
Resumen
Las plantas pertenecientes al género Virola son ampliamente usadas por las
comunidades indígenas en la Amazonia colombiana debido a sus propiedades
medicinales. Virola es uno de los géneros más importantes de la familia Myristicaceae;
en Colombia, veintiún especies pueden ser encontradas, y algunas han sido reportadas
como potenciales antifúngicos. Veintiocho extractos etanólicos de diferentes partes de la
planta (hojas, madera, corteza, flores y frutos) pertenecientes al género Virola (V.
carinata, V. elongata, V. peruviana, and V. callophylla) fueron evaluadas usando un
método microescala de medio suplementado contra Fusarium oxysporum, agente
causante del marchitamiento vascular en plantas de importancia económica como tomate
(Solanum lycopersicum), banano (Musa paradisiaca) y clavel (Dianthus caryophyllus).
Los extractos fueron perfilados usando técnicas como LC-DAD, LC-LRMS, LC-HRMS y
1
H-NMR, y la fracción soluble en n-hexano de los mismos se analizó por GC-MS. La
actividad antifúngica de los extractos fue determinada a tres concentraciones diferentes
encontrando inhibición de hasta el 90% en el crecimiento miceliar del hongo. El análisis
cromatográfico y espectroscópico de los extractos indicó la presencia de compuestos
particulares en algunos de estos, como es el caso de los flavonoides, lo cual se acreditó
por un estudio comparativo, que inició con el aislamiento de cuatro flavonoides a partir de
las hojas de V. carinata, los cuales fueron usados para establecer su presencia en otros
extractos. Un análisis multivariado por componentes principales (PCA) de los perfiles
cromatográficos y espectroscópicos completos muestra algunos conglomerados. Estos
confirman la similaridad de los extractos principalmente respecto a la composición de
aquellos provenientes de madera y corteza, lo cual no es posible ver con una
comparación directa de los cromatogramas o espectro obtenidos. La correlación entre la
actividad antifúngica (como variable de supervisión) y los datos cromatográficos fue
llevada a cabo por medio de una regresión de mínimos cuadrados parciales (OPLS).
Este análisis permitió encontrar algunos grupos de señales que tiene una alta correlación
con la actividad los cuales fueron identificados tentativamente por LC-HRMS. Este
X
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
modelo permite la discriminación de extractos activos en una búsqueda racional de
activos antifúngicos.
Palabras clave: Metabolómica, Virola, derreplicación, Análisis de Componentes
Principales, Análisis de Mínimos Cuadrados Parciales, Perfilado Metabólico.
Abstract
Plants belonging to the genus Virola are widely used by indigenous communities in the
Colombian Amazon due to their medicinal properties; Virola is one of the most important
genera of the Myristicaceae family; in Colombia, twenty-one species can be found, and
they have also been reported as potential antifungals. Twenty eight ethanol-soluble
extracts from different plant parts (leaves, wood, bark, flowers and fruits) belonging to the
genus Virola (V. carinata, V. elongata, V. peruviana, and V. callophylla) were evaluated
using a micro-scale amended medium method against Fusarium oxysporum, the causal
agent of vascular wilt disease in plants of economic importance such as tomato (Solanum
lycopersicum), banana (Musa paradisiaca) and carnation (Dianthus caryophyllus). The
extracts were profiled using LC.DAD, LC-LRMS, LC-HRMS and 1H-NMR techniques, and
the n-hexane-soluble fraction of the extracts was analyzed by GC-MS. The antifungal
activity of the extracts was determined at three concentrations finding inhibition values
higher than 90%. The results indicated that extracts exhibited dose-dependent inhibition
of fungal mycelium at different levels. The analysis of chromatographic/spectroscopic
data indicated the presence of particular compounds in some extracts such as flavonoids
which was accredited by a comparative study, starting with the isolation of four flavonoids
from V. carinata leaves which were used to stablish their presence in the other extracts. A
multivariate analysis by principal component analysis (PCA) of the complete
chromatographic and spectroscopic data profiles showed some clusters. This clustering
confirmed the similarity of extracts of the same plant, even in the composition of extracts
of bark and wood, which would not be just possible with a direct comparison of the
chromatographic/spectroscopic data. The correlation between the antifungal activity (as
supervision variable) and chromatographic/spectroscopic data was performed through
Partial Least Squares (OPLS). This analysis allowed finding some groups of signals
having high correlation with the activity which were tentatively identified by LC-HRMS.
Contenido
XI
The present model let to the discrimination of active extracts within a rational searching of
antifungals from Virola species.
Keywords: Metabolomics, Virola, dereplication, Principal Component Analysis (PCA),
Partial
Least
Square
(PLS),
Fingerprinting.
Contenido
XIII
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... IX
Lista de figuras ............................................................................................................ XVI
Lista de tablas ............................................................................................................. XIX
Lista de Símbolos y abreviaturas ................................................................................ XX
Introducción..................................................................................................................... 1
1.
2.
Capítulo 1. Estado del arte....................................................................................... 3
1.1
Familia Myristicaceae ...................................................................................... 3
1.2
Género Virola .................................................................................................. 5
1.2.1
Morfología del Género Virola................................................................. 6
1.2.2
Estudios fitoquímicos del género Virola ................................................. 7
1.2.3
Actividad biológica del género Virola ..................................................... 9
1.3
Metabolómica ................................................................................................ 10
1.1.1
Método Cualitativo .............................................................................. 13
1.1.2
Método Cuantitativo ............................................................................ 13
1.4
Métodos de recolección y tratamiento de datos ............................................. 14
1.4.1
Recolección de Datos ......................................................................... 14
1.4.2
Tratamiento de datos .......................................................................... 16
1.5
Reducción de datos por análisis multivariados............................................... 17
1.5.1
Análisis de Conglomerados Jerárquico (HCA)..................................... 18
1.5.2
Análisis por componentes principales (PCA) ....................................... 18
1.5.3
Análisis por mínimos cuadrados parciales (PLS)................................. 18
1.6
Bibliografía..................................................................................................... 19
Capítulo 2. Perfil químico y capacidad antioxidante de extractos de plantas del
género Virola de la Amazonia y Orinoquia colombiana combinado con análisis
multivariado ................................................................................................................... 27
2.1
Introducción ................................................................................................... 27
2.2
Metodología ................................................................................................... 29
2.2.1
Material Vegetal .................................................................................. 29
2.2.2
Obtención de Extractos Etanólicos ...................................................... 30
2.2.3
Cuantificación de fenoles totales ......................................................... 31
2.2.4
Cuantificación de Flavonoides Totales ................................................ 31
2.2.5
Capacidad Captadora de Radicales DPPH· ....................................... 31
2.2.6
Capacidad Captadora de Radicales ABTS +·........................................ 32
XIV
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
2.2.7
Capacidad Reductora (método FRAP) .................................................32
2.2.8
Análisis Estadístico ..............................................................................33
2.3
Resultados y discusión ...................................................................................33
2.4
Conclusiones ..................................................................................................41
2.5
Bibliografía .....................................................................................................42
3. Capítulo 3. Perfilado metabólico no dirigido de plantas del género Virola en
ambiente no supervisado ..............................................................................................47
3.1
Introducción....................................................................................................47
3.2
Metodología ...................................................................................................49
3.2.1
Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia (LC-DAD-ESI-LRMS) ...........49
3.2.2
Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia acoplada a Espectrometría de
Masas de Alta Resolución (LC-HRMS) ..............................................................49
3.2.3
Análisis de fracciones hexánicas por cromatografía de gases acoplada
a espectrometría de masas (GC-MS).................................................................49
3.2.4
Análisis por Resonancia Magnética Nuclear ........................................50
3.2.5
Pretratamiento de Datos ......................................................................50
3.2.6
Análisis Estadístico ..............................................................................51
3.3
Resultados y discusión ...................................................................................52
3.4
Conclusiones ..................................................................................................65
3.5
Bibliografía .....................................................................................................66
4. Capítulo. 4. Perfilado metabólico no dirigido en ambiente supervisado:
identificación de compuestos antifúngicos en plantas del género Virola. ................69
4.1
Introducción....................................................................................................69
4.2
Metodología ...................................................................................................71
4.2.1
Análisis Cromatográficos y espectroscópicos ......................................71
4.2.2
Aislamiento de Metabolitos del extracto de Hojas de V. carinata .........71
4.2.3
Identificación de Metabolitos ................................................................72
4.2.4
Ensayo de actividad antifúngica por método de medio suplementado. 72
4.2.5
Análisis Estadístico ..............................................................................73
4.3
Resultados y discusión ...................................................................................73
4.3.1
Actividad antifúngica contra F. oxysporum de extractos etanólicos de
especies de Virola..............................................................................................73
4.3.2
Perfilado metabólico con supervisión utilizando una sola variable
continúa. ............................................................................................................75
4.3.3
Estudio comparativo ............................................................................80
4.3.4
Perfilado metabólico con análisis discriminante ...................................81
4.4
Conclusiones ..................................................................................................82
4.5
Bibliografía .....................................................................................................83
5.
Conclusiones y recomendaciones ........................................................................87
5.1
Conclusiones ..................................................................................................87
5.2
Recomendaciones..........................................................................................88
5.3
Productividad Científica ..................................................................................88
5.3.1
Participación en Eventos .....................................................................88
A.
Anexo: Curvas de Calibración métodos cuantitativos. ........................................91
B.
Anexo: Análisis estadístico de datos cuantitativos .............................................93
C.
Anexo: Datos espectroscópicos de los compuestos aislados ............................96
Contenido
XV
D.
Anexo: Análisis estadístico de datos de actividad antifúngica ........................ 100
E.
Anexo: Validación del modelo de predicción de actividad por OPLS. ............. 103
Contenido
XVI
Lista de figuras
Pág.
Figura 1.1. Distribución de la familia Myristicaceae a nivel mundial (GBIF 2014). ............ 3
Figura 1.2. Detalles morfológicos de la Familia Myristicaceae, hojas, fruto y flores. (Kühn
y Kubitzki 1993) ......................................................................................................... 4
Figura 1.3. Distribución del género Virola en América y Colombia (GBIF 2014) ............... 5
Figura 1.4 Morfología de las plantas del género Virola. (a. Planta completa b. corteza c.
raíz) ........................................................................................................................... 6
Figura 1.5. Morfología de las plantas del género Virola. (a. Hoja elíptica b. hoja oblonga
c. distribución en las ramas) ...................................................................................... 6
Figura 1.6 Morfología de las plantas del género Virola. (a. Frutos b. flores) ..................... 7
Figura 1.7. Integración de las disciplinas “omicas “en la explicación del funcionamiento
de los seres vivos (Sumner, Mendes et al. 2003) ..................................................... 11
Figura 1.8. Procedimiento generalizado en un estudio de metabolómica en productos
Naturales (Harvey, Edrada-Ebel et al. 2015) ............................................................ 13
Figura 1.9. Procedimiento estándar para métodos metabolómicos cualitativos (Patti,
Yanes et al. 2012) .................................................................................................... 13
Figura 1.10. Procedimiento estándar para métodos metabolómicos cuantitativos (Patti,
Yanes et al. 2012) .................................................................................................... 14
Figura 2.1. Contenido de fenoles totales y flavonoides totales de los veintiocho extractos
evaluados. ............................................................................................................... 34
Figura 2.2. Curva dosis-respuesta obtenida por el método de DPPH, para el extracto de
corteza de Virola peruviana ..................................................................................... 35
Figura 2.3. Concentración Inhibitoria media, IC50, para los veintiocho extractos
evaluados por los dos métodos de captura de radicales, ......................................... 36
Figura 2.4. Resultado de la determinación del poder reductor de los veintiocho extractos
objeto de estudio...................................................................................................... 37
Figura 2.5. Diagrama de dispersión, para determinar correlación entre las variables ..... 37
Figura 2.6. PCA a partir de los datos de cuantificación de metabolitos y capacidad
antioxidante ............................................................................................................. 39
Figura 2.7. PCA excluyendo extractos de frutos para observar mejor la diferenciación de
otros extractos ......................................................................................................... 40
Figura 2.8. a. Análisis de conglomerados jerárquicos excluyendo outliers; b. Grafica de
contribución de componentes del PCA .................................................................... 40
Figura 3.1. Perfiles cromatográficos de los 28 extractos objeto de estudio a 270nm.
Columna Sinergy RPC18 de 150 mm x 4.6mm, 5µm. ............................................... 52
Figura 3.2. Análisis de componentes principales de los datos obtenidos por LC-DAD. .. 53
Contenido
XVII
Figura 3.3. Diagrama de dispersión (PC 1 vs PC 2) distinguiendo extractos de acuerdo a
la parte de la planta. .................................................................................................54
Figura 3.4. Diagrama de dispersión obtenido del Análisis de componentes principales de
los datos obtenidos por LC-DAD (Componente 1 vs componente 3). Color según
lugar de recolección Azul = Guaviare, Amarillo = Vaupés, Rojo= Meta, Verde =
Amazonas. ...............................................................................................................55
Figura 3.5. Grafica Hotelling’s T2 indicando que muestras se alejan del modelo creado.
.................................................................................................................................55
Figura 3.6. TIC obtenidos en el análisis por LC-LRMS y LC-HRMS. ..............................56
Figura 3.7. PCA con base en el análisis de las muestras por LC-LRMS (datos punto a
punto). Color según lugar de recolección Azul = Guaviare, Amarillo = Vaupés, Rojo=
Meta, Verde = Amazonas. ........................................................................................57
Figura 3.8. PCA con base en el análisis de las muestras por LC-LRMS (datos punto a
punto). Color según la especie Azul = V. elongata, Amarillo =V. callophylla, Rojo= V.
peruviana, Verde =V. carinata. .................................................................................57
Figura 3.9. PCA obtenido con los datos tratados de LC-LRMS (matriz de 153 variables),
grafica de contribución y Grafica Hotelling’s T2 indicando que muestras se alejan del
modelo creado .........................................................................................................58
Figura 3.10. PCA obtenido con los datos tratados de LC-LRMS (matriz de 153 variables).
Sin outliers (VcfH, VcH y VcAWD) ............................................................................58
Figura 3.11. PCA con base en el análisis de las muestras por LC-HRMS (datos punto a
punto). Color según lugar de recolección Azul = Guaviare, Amarillo = Vaupés, Rojo=
Meta, Verde = Amazonas. ........................................................................................59
Figura 3.12. PCA obtenido con los datos tratados de LC-HRMS (matriz de 176
variables), grafica de contribución y Grafica Hotelling’s T2 indicando que muestras se
alejan del modelo creado .........................................................................................60
Figura 3.13. PCA obtenido con los datos tratados de LC-HRMS (matriz de 173 variables)
y HCA.......................................................................................................................60
Figura 3.14. TIC para las 28 fracciones hexánicas obtenidas a partir de los extractos
etanólicos objeto de estudio. ....................................................................................61
Figura 3.15. PCA con diferenciación por color con base en HCA de las fracciones
hexánicas obtenidas de las 28 muestras de estudio. ................................................61
Figura 3.16. Perfiles espectroscópicos 1H-NMR 200 MHz de las muestras de estudio. ..62
Figura 3.17. PCA con los datos de 1H-NMR de los 28 extractos estudiados.
Diferenciación por color según la parte de la planta, azul claro = arilo, purpura =
cascara, rojo=corteza, amarillo=fruto, verde=hojas, azul=madera, grafica de
contribución y Grafica Hotelling’s T2 indicando que muestras se alejan del modelo
creado. .....................................................................................................................63
Figura 3.18. PCA a partir de la fusión de nivel medio de los datos obtenidos en las
diferentes plataformas analíticas. Diferenciación por color según lugar de
recolección Azul = Guaviare, Amarillo = Vaupés, Rojo= Meta, Verde = Amazonas. .64
Figura 4.1 Metodología de Aislamiento de Metabolitos a partir del extracto de V. carinata
Hojas (VcH) ..............................................................................................................72
XVI
II
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Figura 4.2 Resultados de ensayo de inhibición del crecimiento miceliar de F. oxysporum
a tres concentraciones diferentes (1.00 µg/mL, 0.1 µg/mL y 0.001 µg/mL). ............. 74
Figura 4.3 Resultado del ensayo antifúngico en medio suplementado con VeM2 (arriba) y
fotografía al microscopio con ampliación 40x. De izquierda a derecha: Control, 0.001
µg/mL, 0.1 µg/mL, 1.00 µg/mL. ................................................................................ 74
Figura 4.4. Regresión por OPLS, con los datos obtenidos por técnicas cromatográficas y
espectroscópicas usando como variable de supervisión el % de Inhibición de los
extractos a 1.00 µg/mL. a. LC-DAD b. LC-LRMS c. LC-HRMS d. 1H-NMR .............. 76
Figura 4.5 Grafica S-line de la regresión por OPLS de los datos obtenidos por LC-DAD
(arriba) respecto al cromatograma de la muestra más activa VcM2 y la menos activa
VcfM (abajo). ........................................................................................................... 76
Figura 4.6 Grafica S-line de la regresión por PLS de los datos obtenidos por LC-HRMS
(arriba) respecto al cromatograma de la muestra más activa VcM2 y la menos activa
VcfM (abajo). ........................................................................................................... 77
Figura 4.7. Grafica S-line de la regresión por PLS de los datos obtenidos por 1H-NMR
(arriba) respecto al espectro de la muestra más activa VcM2 y la menos activa VcfM
(abajo). .................................................................................................................... 80
Figura 4.8. Cromatograma con los 4 flavonoides aislados usados para derreplicación. . 81
Figura 4.9. Análisis de regresión por OPLS-DA a. LC-DAD, b. LC-LRMS, c. LC-HRMS, d.
1
H-NMR. Muestras diferenciadas por color según el lugar de recolección: Amazonas
= Verde, Guaviare = Azul, Meta = Rojo y Vaupés= Amarillo. ................................... 82
Contenido
XIX
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1.1 Géneros que componen la familia Myristicaceae y su distribución a nivel
mundial ......................................................................................................................3
Tabla 2.1. Información extractos a estudiar. ....................................................................29
Tabla 2.2 Coeficientes de correlación de Pearson calculados entre las variables
evaluadas.................................................................................................................38
Tabla 4.1 Identificación tentativa de metabolitos de interés de acuerdo al análisis por
regresión OPLS de los datos LC-HRMS ...................................................................78
Contenido
XX
Lista de Símbolos y abreviaturas
AA
ácido ascórbico
ABTS
ácido 2,2′-azinobis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico
ACN
acetonitrilo
AcOEt
acetato de etilo
AcOiPr
acetato de isopropilo
ANOVA
Análisis de varianza
CC
Cromatografía en Columna
CDCl3
cloroformo deuterado
CHCl3
cloroformo
COSY
Correlation spectroscopy
COW
Correlation Optimised Warping
DA
Análisis Discriminante (Discriminant Analysis)
DEPT 135
Distortionless enhancement of polarization transfer
DPPH
radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo
EdP
éter de petróleo
ESI
Ionización por Electrospray (Electrospray Ionization)
EtOH
etanol
FRAP
Ferric Reducing Antioxidant Power
GC-MS
Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (Gas
Chromatography-Mass Spectrometry)
HCA
Análisis de conglomerados Jerárquico (Hierarchical Cluster Analysis)
HCOOH
ácido fórmico
HMBC
Heteronuclear correlation through multiple bond coherence
HMQC
Heteronuclear multiple quantum correlation
HNN
Hokonen Neural Networks
HPLC
Cromatografía Liquida de alta eficiencia (Hight Performance Liquid
Cromatography)
IC50
Concentración Inhibitoria Media
Contenido
XXI
icoshift
interval correlation optimised shifting algorithm
J
Constante de acoplamiento
LC-HRMS
Cromatografía liquida acoplada a Espectrometría de masas de alta
Resolucion (Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry)
LC-DAD
Cromatografía liquida acoplada a Detector de Arreglo de Diodos (Liquid
Chromatography with Diode Array Detection)
LC-LRMS
Cromatografía liquida acoplada a Espectrometría de masas de baja
Resolucion (Liquid Chromatography-Low Resolution Mass Spectrometry)
m
Multiplete
m/z
Relacion masa/carga
MeOH
metanol
OPLS
Mínimos cuadrados parciales ortogonal (orthogonal PLS)
PC
Componente Principal (Principal component)
PCA
Análisis de componentes principales (Principal Component Analysis)
PLS
Mínimos cuadrados parciales (Partial Least Square)
RP
Reverse-phase
TIC
Cromatograma total de iones (Total Ion Chromatogram)
Tol
tolueno
TPTZ
2,4,6-tripiridil-s-triazina
tRet
Tiempo de retención
TROLOX
ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico
UV-Vis
Ultravioleta visible
Introducción
En la actualidad los hongos fitopatógenos han sido base para varias investigaciones
debido a los daños causados sobre cultivos de importancia económica en el país, y la
necesidad de desarrollar algún tipo de control para evitar la proliferación de los mismos.
La búsqueda de activos antifúngicos inicia debido a la resistencia que puede causar el
uso reiterativo de algunos fungicidas además de la toxicidad causada por los mismos
sobre las plantas y los animales. Los productos naturales son una opción para ser
utilizados dentro de un programa integrado de control de plagas, ya que algunos de estos
cumplen dicha función en la planta sin generar grados considerables de toxicidad y
bioacumulación. Sin embargo, los estudios fitoquímicos llevados a cabo de la forma
tradicional necesitan una gran cantidad de insumos y muestra para la obtención y
caracterización de metabolitos presentes en un extracto vegetal, y para después ser
evaluados y determinar su actividad biológica en escenarios tales como en el tratamiento
de
enfermedades,
remediación
de
cultivos,
control
de
plagas,
entre
otros.
Adicionalmente, en algunos casos la actividad no está dada solo por un compuesto, sino
por una mezcla de los mismos y es posible encontrar tales compuestos en otras partes
de la planta o en plantas del mismo género, así como también se pueden encontrar
compuestos conocidos o inactivos que no generen información representativa del
extracto objeto de estudio.
Las plantas de la familia Myristicaceae han sido ampliamente estudiadas con base a la
información etnobotánica, principalmente dada por las comunidades indígenas. Dentro de
esta familia se encuentra el género Virola, el más abundante en América, que se
caracteriza por presentar una gran diversidad de metabolitos dentro de los cuales se
encuentran alcaloides, diarilpropanos, estilbenos, lignanos y neolignanos, ácidos grasos,
mono y sesquiterpenos y flavonoides, los últimos, abundantes en plantas en general en
la familia Myristicaceae. Actualmente, todos los estudios realizados de elucidación y
evaluación de la actividad de plantas del genero Virola, aunque generan información
acerca de la familia y el género, se han llevado a cabo de manera aislada, y no presentan
información que pueda dar una visión general de la especie. Para integrar la información,
2
Introducción
muy recientemente se han desarrollado procesos globalizados apoyados en la
metabolómica, disciplina que ayuda a entender de forma generalizada la producción de
metabolitos indicando semejanzas y diferencias en organismos vivos, siendo de gran
utilidad para la selección de especies que puedan llegar a presentar actividad biológica,
lo cual sería la base para realizar una discriminación más certera. Esta es una de las
formas emergentes en las que se permite abordar este tipo de procesos que, además de
partir de cantidades pequeñas de muestra, permite encontrar aquellas relaciones entre
las diferentes características químicas y biológicas de las muestras de estudio a partir del
análisis estadístico multivariado.
Todo esto hace importante el estudio de Virola en la búsqueda de compuestos
antifúngicos por medio del uso de la metabolómica como base para la discriminación a
partir de los perfiles cromatográficos de extractos de plantas de este género. Por tanto, la
relación entre la actividad biológica y la composición se podría predecir con base en el
análisis de los perfiles metabólicos, resaltando variables (relacionadas a grupos de
compuestos) que influyen en la actividad biológica. Lo anterior permite crear un modelo
estadístico adecuado para predecir y/o detectar, a partir de los perfiles metabólicos y
variables cuantitativas, si algún(os) componente(s) presente(s) en las muestras,
correlacionan con la actividad, como una alternativa racional a la realización de estudios
biodirigidos que pueden ser costosos y demorados en algunos casos.
1. Capítulo 1. Estado del arte
1.1 Familia Myristicaceae
La familia Myristicaceae corresponde a un grupo taxonómico de plantas que es
altamente representativa entre las especies forestales de los bosques húmedos de la
región pacífica y amazónica; está conformada por aproximadamente 21 géneros (Tabla
1.1), los cuales se encuentran distribuidos, como se observa en la Figura 1.1, en el
trópico y subtrópico de Asia, América y África (Herrera 1994, Sauquet 2004).
Figura 1.1. Distribución de la familia Myristicaceae a nivel mundial (GBIF 2014).
El centro de origen y de distribución de las especies americanas de la familia es la
cuenca del Amazonas; se encuentran principalmente a baja altitud, no se adaptan a
condiciones de clima frio, y de esta manera, no se extienden por encima de aquellas
regiones correspondientes a faldas de montaña. No obstante, algunos árboles de la
familia han sido registrados hasta altitudes de aprox. 2000 m.s.n.m. La gran mayoría
prefiere un suelo húmedo, además de condiciones de sombra (Kühn y Kubitzki 1993,
Herrera 1994).
Tabla 1.1 Géneros que componen la familia Myristicaceae y su distribución a nivel mundial
Continente
Asia
África
América
Géneros presentes
Endocomia, Horsfieldia, Gymnacrantera, Knema, Myristica,
Paramyristica
Maulotchia, Brochoneura, Doyleanthus, Cephalosphaera, Staudtia,
Pycnanthus, Coelocaryon, Haematodendron, Scyphocephalium
Otoba, Osteophloeum, Iryanthera, Bicuiba, Virola, Compsoneura
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
4
Las plantas de esta familia son conocidas por su amplio uso por parte de comunidades
indígenas. A nivel económico se reconocen también por la nuez moscada, una especia
obtenida de Myristica fragans, la cual es utilizada en culinaria para dar sabor y olor a
ciertas comidas (Kühn y Kubitzki 1993). Igualmente son fuentes maderables, útiles para
la elaboración de pulpa para hacer papel y otros usos que van desde el ámbito comercial
(obtención de aceites) hasta lo mágico-ritual (Gottlieb 1979, Schultes y Hofmann 1982).
Se compone principalmente por plantas leñosas arborescentes raramente arbustivas,
en general son dioicas, a veces monoicas; las hojas son alternas, simples, enteras, de
consistencia submembranosa a coriácea, dísticas, perinervias y sin estipulas, como se
presenta en la Figura
1.2 (Kühn y Kubitzki 1993, Herrera 1994). Algunos árboles
producen un exudado rojizo proveniente de la corteza.
Las inflorescencias son axilares, raramente terminales, fasciculada en racimos y a veces
se pueden presentar solitarias; el fruto es carnoso , la semilla es recta y está cubierta por
una arilo coloreado, en general los frutos de la familia son en apariencia similares a la
nuez moscada, aromáticos y ricos en grasas (Kühn y Kubitzki 1993).
Figura 1.2. Detalles morfológicos de la Familia Myristicaceae, hojas, fruto y flores. (Kühn y Kubitzki
1993)
Las plantas de esta familia presentan la siguiente clasificación taxonómica (GBIF
2014).
•
Reino :
Plantae
Capítulo 1
5
•
Subreino:
Tracheobionta (Plantas Vasculares)
•
Superdivisión:
Spermatophyta (Plantas con semillas)
•
División:
Magnoliophyta (Plantas con Flores)
•
Clase:
Magnoliopsida (Dicotiledóneas)
•
Subclase:
Magnoliidae
•
Orden:
Magnoliales
•
Familia:
Myristicaceae
Respecto a los metabolitos encontrados en esta familia se encuentran reportes de ácidos
grasos, flavonoides, alcaloides, alquilfenoles, fenilpropanos, cumarinas, terpenos,
lactonas, neolignanos y estilbenos, entre otros. (Gottlieb 1979, Kühn y Kubitzki 1993,
Kato 1995, Martın
́ ez Valderrama 2000) Además se ha reportado actividad biológica
antiparasitaria, antiulcerogénica, antifúngica y antimicrobiana tanto de extractos como de
compuestos aislados (Pham, Jossang et al. 2000, Rojas, Bustamante et al. 2003,
Suffredini, Paciencia et al. 2006, Cuca Suárez, Bernal et al. 2009).
1.2 Género Virola
De los seis géneros de la familia Myristicaceae presentes en América, el género Virola
es el de mayor importancia debido a que se encuentra ampliamente distribuido en Centro
y Suramérica (Figura 1.3). Lo componen un gran número de especies (aprox. 45), de las
cuales 24 se encuentran registradas en el país según el Herbario Nacional Colombiano,
en las regiones del Pacifico, Orinoquía y Amazonía principalmente (Herrera 1994, HNC
2014).
Figura 1.3. Distribución del género Virola en América y Colombia (GBIF 2014)
Algunas especies del género Virola (V. calophylla , V. calophylloidea V. theiodora y V.
elongata) son también conocidas porque exudan de su corteza una resina densa
(Schultes y Hofmann 1982) la cual es secada, molida, comprimida en pellets y mezclada
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
6
con otras plantas para ser ingerida o usada como polvo inhalado conocida popularmente
como Ya-kee, Épena, Yá-to o Paricá, por parte de la comunidad Waika del Vaupés y
otras de la Orinoquia, así como en Brasil y Venezuela (de Smet 1985). También se han
encontrado reportes del uso de exudados de estas plantas como compuesto toxico
impregnado en las flechas para usos en cacería o defensa de las mismas comunidades
(Macre y Towers 1984).
1.2.1 Morfología del Género Virola
Se caracterizan por ser arboles perenes, a veces caducifolios durante la floración, de
hasta 40 m de altura y 120 cm de diámetro del tronco. Las raíces contrafuertes en la
base del tronco se pueden elevar hasta 2 m por encima del piso. La corteza es
generalmente lisa de la cual se exuda un fluido de color amarillo que al contacto con el
aire se torna rojizo (Ver Figura 1.4) (Garcia Barriga 1992, Kühn y Kubitzki 1993, Herrera
1994).
a.
b.
c.
Figura 1.4 Morfología de las plantas del género Virola. (a. Planta completa b. corteza c. raíz)
Sus hojas son oblongas o elípticas, de ápice acuminado y longitud variable de hasta 50
cm o más, organizadas en la rama de forma alterna y periplanar (Ver Figura 1.5) (Garcia
Barriga 1992, Herrera 1994).
a.
b.
Figura 1.5. Morfología de las plantas del género Virola. (a. Hoja elíptica b. hoja oblonga c.
distribución en las ramas)
c.
Capítulo 1
7
Las flores son pequeñas de color verdoso o blanco, carentes de pétalos y se organizan
en fascículos de hasta 15 flores en plantas dioicas. Sus frutos se producen en cápsulas,
que constan de un pericarpio leñoso y una semilla cubierta oleaginosa, rodeada de arilo
carnoso comúnmente rojizo. (Figura 1.6) (Garcia Barriga 1992, Herrera 1994).
a.
b.
Figura 1.6 Morfología de las plantas del género Virola. (a. Frutos b. flores)
1.2.2 Estudios fitoquímicos del género Virola
Respecto a su composición química, el género Virola se caracteriza por poseer una
amplia variedad de metabolitos secundarios como alcaloides, flavonoides, diarilpropanos,
estilbenos, lignanos y neolignanos, ácidos grasos, mono y sesquiterpenos, entre otros.
Específicamente, se han reportado alcaloides de tipo triptaminico y β-carbolina como la
5-metoxi-N,N-dimetiltriptamina 1 aislado de corteza de
V. elongata y V. theiodora
(Schultes 1969), la N,N-dimetiltriptamina 2 aislada de las hojas de V. theiodora (Agurell,
Holmstedt et al. 1969), y la 2-metil-6-metoxi-1,2,3,4-tetrahidro-β–carbolina 3 aislado de
V. calophylla.
H
N
R1
N
R3
1 R1= OCH3 R2=R3=CH3
H
N
O
R2
2 R1= H R2=R3=CH3
N
3
Los metabolitos de núcleo flavonoide también son comunes en Virola, como es el caso
de los de tipo flavanona como la pinocembrina 4, aislada de V. surinamensis y de tipo
flavan-3-ol como el fisetinidol aislado de V. elongata (Martın
́ ez Valderrama 2000). Así
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
8
mismo, la 2’,6’-dihidroxi-4,4’-dimetoxidihidrochalcona y 4’-hidroxi-3’,7-dimetoflavano
fueron aisladas del extracto bencénico de madera de V. calophylloidea (Martinez V y
Cuca S 1987)
HO
O
OH O
4
Algunos metabolitos del núcleo diarilpropano como el virolanol B y C (5 y 6
respectivamente)
y
virolaflorina
pueden
ser
considerados
como
marcadores
quimiotaxonómicos ya que sólo han sido aislados de plantas de este género, (Martın
́ ez
Valderrama 2000) de la misma manera estilbenos como el 3,5,4’-trimetoxi-trans-estilbeno
aislado de V. elongata (MacRae and Towers 1985)
O
R
OH
OH
O
OH
5 R=H
6 R= CH3
Otro grupo de metabolitos muy comunes en Virola son los lignanos, principalmente de
tipo dibencilbutirolactónicos, ariltetralónicos, ariltetralínicos, furofuránico (Bernal y Suárez
2007) como la sesamina 7 y tetrahidrofuránico como la grandisina 8, aisladas de V.
sebifera, V. flexuosa y V. surinamensis (Lopes, de Almeida Blumenthal et al. 1996, Rotz
R., Cuca S. et al. 2009), al igual que la cubebina, hinokinina, y asarinina que fueron
aisladas del fruto de V. carinata (Cavalcante, Yoshida et al. 1985)
O
O
O
O
O
H
O
O
H
O
O
O
O
O
7
O
También han sido aislados neolignanos del tipo 8.O.4’, como la
8
surinamensina 9 y
virolina 10 (Kawanishi, Uhara et al. 1982, Barata, Santos et al. 2000) además de
carinatidina, dehidrocarinatidina, carinatidiol, dehidrodieugenol B, galcatina e isobafenol
que fueron obtenidos de la corteza de V. carinata (Gottlieb, Maia et al. 1976, Kawanishi,
Uhara et al. 1983).
Capítulo 1
9
O
O
O
OH
O
R
9 R = OCH3
10 R = H
Otra clase de metabolitos ha sido encontrada en la fracción grasa obtenida de las
plantas de este género que está compuesta principalmente por ácido caproico, láurico,
mirístico 11 (mayoritario), palmítico y oleico, dicha fracción es usada principalmente para
la elaboración de jabón y cremas (Gottlieb 1979).
O
OH
11
Finalmente, se ha reportado que el aceite esencial obtenido de hojas y flores de V.
surinamensis está compuesto principalmente por monoterpenos como el α-pineno, βpineno, mirceno, α-felandreono, α- terpineno, limoneno, linalol y terpinoleno, además de
sesquiterpenos como β-elemeno, cariofileno, germacreno-D, viridifloreno, δ- cadineno,
entre otros (Lopes, Kato et al. 1999)
1.2.3 Actividad biológica del género Virola
Además de la gran diversidad de metabolitos reportados en el género, es posible
encontrar diferentes estudios de actividad de las especies de Virola, ya sea de los
compuestos aislados, así como de extractos y fracciones depuradas de las mismas.
En este contexto, algunos neolignanos aislados de V. surinamesis y V. pavonis fueron
probados in vitro contra parásitos de Leishmania donovani en su forma promastigote y
amastigote encontrando que presentan actividad a concentración de 50µM para la forma
amastigote (Barata, Santos et al. 2000).También el aceite esencial de hojas de V.
surinamensis se evaluó contra Plasmodium falciparum encontrando que inhibe el 100%
del crecimiento de dicho parásito en su estadío trofozoito y esquizonte (Lopes, Kato et al.
1999).
Respecto a la actividad antifúngica reportada para especies de este género, se ha
encontrado que mezclas de neolignanos inhiben el crecimiento de Neurospora crassa, y
lignanos
aislados
de
V.
oleífera
presentan
actividad
contra
Cladosporium
10
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
sphaerospermum a una cantidad mínima de 25 µg (Sartorelli, Young et al. 1998); también
otros compuestos como 2′, 6’-dihidroxi-4,4′-dimetoxidihidrochalcona, biochanina A, 2′hidroxi-7,4′-dimetoxiisoflavona y 3-epi-jurenólido C aislados de la raíz V. surinamensis
presentan actividad contra Cladosporium cladosporioides a una cantidad mínima de 5 µg,
mientras que algunos flavonoides como la 7-hidroxiflavanona y la 7-hidroxi-4′metoxiisoflavona, mostraron actividad inhibitoria 10 veces mayor que el control (Lopes,
Kato et al. 1999) y componentes del aceite esencial (terpenos) intervienen en los
procesos de la formación de la pared celular de los hongos (Zacchino, Rodrıguez et al.
1998).
Los flavonoides, abundantes en plantas del genero Virola y en general en la familia
Myristicaceae (Martın
́ ez Valderrama 2000), son compuestos de gran importancia pues
están involucrados en la fotosensibilización, transferencia de energía, crecimiento, control
de la respiración, fotosíntesis, morfogénesis y defensa de las plantas contra patógenos
invasores incluyendo insectos, bacterias, hongos y virus. El amplio rango de actividad
biológica atribuida a los flavonoides es atribuida a su capacidad de manifestar efectos
antioxidantes, capturar radicales libres y formar quelatos con cationes divalentes.
Además se ha demostrado que tienen la capacidad de inhibir enzimas como hidrolasas,
hialuronidasas, fosfatasa alcalina, arilsulfatas, lipasas, glucosidasas y kinasas entre otras
(Razzaghi-Abyaneh y Rai 2013).
Además de las ya enunciadas, también se encuentran reportes del genero Virola y sus
constituyentes con actividad antibiótica, anticonceptiva (Carvalho, Galdino et al. 2010),
antiinflamatoria (Carvalho, Ferreira et al. 1999), antioxidante (Rezende, Davino et al.
2005) y antiulcerogénica (Hiruma-Lima, Batista et al. 2009), entre otras.
1.3 Metabolómica
La metabolómica está definida como un estudio interdisciplinario que
involucra la
identificación y cuantificación de los metabolitos (de bajo peso molecular) producidos por
un organismo (Weckwerth 2007, Ramsden 2009) mediante el uso de técnicas o
herramientas analíticas sofisticadas, lo que la hace , una poderosa herramienta que
permite además evaluar los cambios en los perfiles metabólicos usando principalmente
métodos estadísticos multivariados. Hace parte de las ciencias interdisciplinarias
Capítulo 1
conocidas
11
como
“ómicas”
donde
se
pueden
encontrar
la
genómica
(DNA),
transcriptómica (RNA), proteómica (Proteínas) y la metabolómica (Metaboloma), que en
conjunto dan una visión general del funcionamiento y la fisiología de los seres vivos
(Fiehn 2002, Sumner, Mendes et al. 2003).
Figura 1.7. Integración de las disciplinas “omicas “en la explicación del funcionamiento de los seres
vivos (Sumner, Mendes et al. 2003)
La metabolómica ha sido aplicada en un amplio rango de campos, como por ejemplo
en la búsqueda de biomarcadores, permitiendo encontrar compuestos producto del
metabolismo exclusivo de especies y familias (Rochfort 2005); control de calidad, pues
permite hacer análisis de muestras basados en medidas de diferentes variables (no solo
continuas sino también categóricas) para asegurar la misma composición y calidad de los
productos en una línea de producción (Cubero-Leon, Peñalver et al. 2014); mejora de
propiedades funcionales de alimentos al poder relacionar la composición con los
beneficios que puede prestar y la forma de incrementar dichas propiedades modificando
condiciones que puedan influir en la producción de metabolitos beneficiosos (Fiehn,
Robertson et al. 2007); biomedicina en la búsqueda de patrones en el metabolismo que
puedan ser causantes de enfermedades como el cáncer y que permitan la detección
temprana de enfermedades crónicas, entre otras aplicaciones (Kaddurah-Daouk y
Krishnan 2009).
Al comparar la metabolómica con las otras “omicas”, se puede encontrar que esta es la
más dinámica, debido a que los metabolitos producidos y las cantidades de los mismos
pueden cambiar respecto a estímulos ambientales (Koo, Wei et al. 2014). Al ser un
12
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
término tan amplio, la metabolómica puede abordarse de diferentes formas: una de las
cuales es la metabonómica, la cual hace referencia al análisis cuantitativo de una
respuesta multiparamétrica de un sistema vivo como repuesta a un estímulo (en
condiciones controladas), modificación genética, enfermedad o tratamiento terapéutico
(Nicholson, Lindon et al. 1999, Dunn y Ellis 2005, Ramsden 2009); por otro lado el
perfilado metabólico (profiling), que corresponde a un análisis centrado a un grupo de
compuestos previamente seleccionados los cuales son usualmente cuantificados en su
totalidad usando curvas de calibración validadas con estándares certificados. Este
proceso, al ser un análisis especifico, no requiere de varias técnicas analíticas pues el
uso de una sola es suficiente (Dunn y Ellis 2005, Weckwerth 2007). También podemos
encontrar perfilado metabólico (Fingerprinting), el cual enmarca un análisis rápido y
global de las muestras con el fin de obtener una clasificación; la cuantificación no es
empleada generalmente, pero si permite diferenciar entre muestras de diferente origen o
diferente estadío de crecimiento (Dunn y Ellis 2005, Weckwerth 2007, Garcia-Perez,
Vallejo et al. 2008, Dias, Urban et al. 2012).
En procedimiento generalizado para llevar a cabo un estudio en metabolómica se
presenta en la Figura 1.8, donde después de la recolección o toma de la muestra, se
realiza la extracción siguiendo un protocolo estandarizado de acuerdo al tipo de
metabolito de interés. La toma de datos se realiza usando herramientas analíticas que
permitan la obtención de una gran cantidad de datos, los cuales deben ser tratados por
medio de software especializado para minimizar los errores típicos de las técnicas
analíticas usadas (corrimiento en tiempos de retención, efecto matriz, escalas de medida,
etc). Después de esto, dependiendo el tipo de estudio a realizar (dirigido o no dirigido) se
lleva a cabo un proceso de derreplicación a través de bases de datos y/o cuantificación
de metabolitos (Patti, Yanes et al. 2012, Harvey, Edrada-Ebel et al. 2015). Con este
procesamiento se crea un matriz en la cual cada variable da una característica de la
muestra y esta se somete a análisis estadístico multivariado, para finalmente encontrar
patrones de comportamiento, semejanzas y diferencias entre las muestras objeto de
estudio (Hu and Xu 2014, Harvey, Edrada-Ebel et al. 2015).
Capítulo 1
13
Figura 1.8. Procedimiento generalizado en un estudio de metabolómica en productos Naturales
(Harvey, Edrada-Ebel et al. 2015)
Existen dos formas de abordar la metabólica: el método dirigido o cuantitativo y el
método no dirigido o cualitativo (Patti, Yanes et al. 2012):
1.1.1
Método Cualitativo
(No dirigido, perfilado, fingerprinting) basado en el análisis conjunto y multivariante de los
datos generados para cada individuo, el cual permite establecer relaciones de diferencia
y similitud entre los individuos que se están analizando; el procedimiento general inicia
con una pregunta de investigación adecuada seguida del planteamiento del diseño
experimental que la soporte. Este diseño debe permitir al final de todo el proceso el
número suficiente de variables respuesta para una adecuada interpretación de los
resultados y respuesta a la pregunta inicial. Una vez se tenga el diseño experimental
adecuado, se realiza la preparación de las muestras (las cuales deben ser tratadas de la
misma forma), se hace la recolección de datos, la reducción por medio de métodos de
análisis de datos multivariados y finalmente, en lo posible, la identificación de los
metabolitos presentes (Dunn y Ellis 2005, Weckwerth 2007).
Figura 1.9. Procedimiento estándar para métodos metabolómicos cualitativos (Patti, Yanes et al.
2012)
1.1.2
Método Cuantitativo
(Dirigido) En este método tan solo intervienen en el análisis multivariado aquellos
metabolitos que a priori se sabe que intervienen en el fenómeno que se desea estudiar
(Patti, Yanes et al. 2012). El procedimiento general inicia, al igual que el abordaje
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
14
anterior, con la pregunta y el diseño experimental, luego de la preparación de las
muestras (tratadas de la misma forma), se hace la identificación de los metabolitos de
interés y la construcción de la curva de calibración para la cuantificación de los mismos,
la reducción por medio de métodos de análisis de datos multivariados y, finalmente, se
hace la interpretación biológica de los resultados obtenidos (Dunn y Ellis 2005, Griffiths
2008).
Figura 1.10. Procedimiento estándar para métodos metabolómicos cuantitativos (Patti, Yanes et al.
2012)
1.4 Métodos de recolección y tratamiento de datos
1.4.1 Recolección de Datos
La recolección de datos para el análisis metabolómico se basa en diferentes
plataformas analíticas, principalmente cromatográficas para asegurar la separación de la
mezcla de metabolitos (Rochfort 2005). En otros casos, cuando el análisis es dirigido a
un grupo de metabolitos en mezclas poco complejas o para control de calidad en el cual
se miden parámetros específicos, se utilizan métodos analíticos dirigidos como
cuantificación por espectrofotometría, voltmaperometría, potenciometría, conductimetría y
cualquier otro que dé un indicativo de composición (Sumner, Mendes et al. 2003)
Dentro de las técnicas más usadas para productos naturales y matrices de gran
complejidad están:

GC
(Cromatografía de gases) Esta técnica es ampliamente utilizada para muestras
volátiles, no termolábiles (como aceites esenciales) o que puedan ser derivatizadas
(como ácidos grasos), entre otros; ofrece ventajas como alta reproducibilidad de los
tiempos de retención, alta sensitividad y la posibilidad de acceder a librerías (un gran
numero bases de datos y librerías especializadas para identificación de compuestos)
Capítulo 1
15
(Putri, Yamamoto et al. 2013, Bansal, Chhabra et al. 2014); Esta es una de las
plataformas analíticas más ampliamente usadas, que genera una gran cantidad de
información y permite ser acoplada a
una gran variedad de detectores como
espectrometría de masas, ionización de llama, conductividad térmica, captura de
electrones y nitrógeno-fosforo, entre otros (Dunn y Ellis 2005, Skoog, Crouch et al. 2008,
Koo, Wei et al. 2014).

HPLC
(Cromatografía líquida de alta eficiencia) Permite analizar aquellos metabolitos que se
encuentran fuera del alcance de la cromatografía de gases, como aquellos con carácter
no volátil y/o termolábil (Dunn y Ellis 2005). La variedad de detectores (arreglo de diodos,
espectrómetro de masas, fluorescencia, índice de refracción, etc.) y columnas (fase
normal, fase reversa, exclusión por tamaño, intercambio iónico, afinidad, etc.) que
pueden usarse acopladas a esta técnica es tan amplia que permite el análisis de una
gran variedad de metabolitos (Quattrocchi, de Andrizzi et al. 1992). El detector de arreglo
de diodos no permite hacer identificación, pero se puede utilizar para métodos
cualitativos cuando el grupo de metabolitos a analizar tiene espectros de absorción
característicos (Dunn y Ellis 2005, Skoog, Crouch et al. 2008, Bansal, Chhabra et al.
2014).

NMR
(Resonancia magnética nuclear) Es una técnica no destructiva, puede ser utilizada en
conjunto con técnicas cromatográficas y no requiere pretratamiento de la muestra;
pueden analizarse compuestos puros, extractos complejos o fluidos biológicos, etc (Ellis,
Dunn et al. 2007). Al ser una técnica de baja sensibilidad, las impurezas pasan
inadvertidas respecto a los metabolitos objetivo, por lo cual está encaminada a detectar
compuestos mayoritarios y la mayoría de las aplicaciones se dan al análisis de 1H-RMN
en estudios clínicos. La detección de metabolitos en esta técnica depende de la
abundancia de los isotopos objeto de estudio ( 1H, 13C,
19
F,31P,15N), aunque la
sensibilidad se puede mejorar incrementando los tiempos de análisis (acumulación), lo
que puede llegar a limitar el número de muestras objeto de estudio, o usando sondas
criogénicas o microsondas (Dunn y Ellis 2005).
Adicionalmente a las anteriormente descritas, se pueden utilizar otras técnicas
analíticas como espectroscopia infrarroja FT-IR, electroforesis capilar (Garcia-Perez,
16
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Vallejo et al. 2008) y técnicas bidimensionales y combinadas (Rochfort 2005, Tistaert,
Dejaegher et al. 2011)
1.4.2 Tratamiento de datos
Múltiples plataformas analíticas son usadas en el estudio en metabolómica y la
mayoría de las veces la variación en parte de los datos obtenidos no es causada por
diferencias en la muestras sino debida a errores sistemáticos propios de la técnica
usada. Así, las técnicas cromatográficas usadas son dependientes del tiempo y se
pueden presentar pequeños corrimientos de las señales en el cromatograma, lo cual
genera interferencias en el análisis de los datos y, por otro lado, técnicas como
espectrometría de masas pueden presentar diferencias en la ionización de las muestras
por efecto matriz (Skov, van den Berg et al. 2006, Sysi-Aho, Katajamaa et al. 2007). Esto
se elimina o se reduce llevando a cabo el pretratamiento de los datos que incluye la
alineación de los cromatogramas y espectros respecto a una señal patrón, ya sea propia
de la muestra o preferiblemente de un estándar externo que no interfiera con el análisis,
la deconvolución de espectros, normalización y escalado de datos (Putri, Yamamoto et
al. 2013).
La alineación de los cromatogramas se puede llevar a cabo usando algoritmos como
COW (correlation optimised warping), el cual corrige errores discretos en tiempos de
retención respecto a un cromatograma de referencia previamente establecido, el cual
debe guardar similitud con todos los cromatogramas a alinear, los cuales son divididos en
segmentos y cada uno se mueve cierto número de puntos en cada dirección de acuerdo
a la flexibilidad programada, sin generar grandes cambios en la forma, altura, y área de
las señales (Nielsen, Carstensen et al. 1998, Skov, van den Berg et al. 2006, Jellema
2009). Otro algoritmo para alinear es icoshift (interval correlation optimised shifting
algorithm), inicialmente desarrollado para tratar datos de resonancia magnética, usa una
referencia promedio obtenida automáticamente de los datos tanto de resonancia como de
cromatografía y permite realizar alineamiento parcial de señales; es un método más
rápido que COW y se pueden definir el número de segmentos en los cuales se divide el
perfil (Tomasi, Savorani et al. 2011). Existen otros algoritmos de alineamiento de
cromatogramas como Recursive alignment by fast Fourier transform (RAFFT), Dynamic
time warping (DTW), Variable penalty dynamic warping (VPdtw), Parametric time warping
Capítulo 1
17
(PTW), entre otros; el uso de estos depende de la complejidad de la muestra, o de los
parámetros que se quieren corregir (Jellema 2009, Jiang, Zhang et al. 2013).
El siguiente paso en el pretratamiento de los datos es la normalización, la cual es útil
cuando las variables son de órdenes de magnitud diferentes, pues en comparación una
variable de menor orden de magnitud se puede ver opacada por otra que no permita
diferenciar entre muestras. Este proceso se puede realizar previo al análisis de los datos
o en el momento de hacer el análisis multivariado (Sysi-Aho, Katajamaa et al. 2007, Putri,
Yamamoto et al. 2013).
Para los datos obtenidos por técnicas acopladas a espectrometría de masas
adicionalmente se hace deconvolución de los datos, esta consiste en tomar el TIC (total
ion current) y obtener los cromatogramas por separado de los iones seleccionados para
el análisis (método cuantitativo) y volverlos a unir para eliminar cualquier tipo de
interferencia. Así se asegura que las señales en el cromatograma son debido a la
presencia de los metabolitos objetivo (Putri, Yamamoto et al. 2013, Koo, Wei et al. 2014).
1.5 Reducción de datos por análisis multivariados
La cantidad de datos generados por técnicas cromatográficas es tan grande que no es
posible llevar a cabo análisis por medio de correlación de variables, pues con 10
variables para un conjunto de datos se pueden encontrar 45 correlaciones lo que no
permite una interpretación adecuada de los datos obtenidos perdiendo información (Díaz
Monroy y Morales Rivera 2012, Putri, Yamamoto et al. 2013). Por lo tanto, después de
llevar a cabo el pre-procesamiento de los datos, se hace uso de la quimiometría, esta se
puede describir como la disciplina en la que interaccionan ciertos métodos matemáticos
y estadísticos en procesos de medida de caracterización química; esta ha sido
desarrollada como consecuencia del cambio de los datos obtenidos con las nuevas y
emergentes técnicas analíticas; el análisis se realiza por medio de métodos estadísticos
de análisis de datos multivariados que tiene por objetivo determinar todas las variaciones,
semejanzas y diferencias en una matriz de estudio (Kumar, Bansal et al. 2014).
Los métodos de análisis de datos multivariados se pueden clasificar en métodos
supervisados y no supervisados (Griffiths 2008). Dentro de los métodos no supervisados
(su objetivo es la estructuración de un conjunto de datos multivariados mediante la
18
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
reducción del número de variables independientes) están análisis de conglomerados
jerárquico (HCA), análisis discriminante (DA), análisis por componentes principales
(PCA), entre otros; en el caso de los supervisados se encuentran principalmente el
análisis por mínimos cuadrados parciales. (PLS), regresión lineal múltiple y las redes
neurales de Hokonen (HNN) (Ramsden 2009, Jones y Hügel 2013, Putri, Yamamoto et
al. 2013).
1.5.1 Análisis de Conglomerados Jerárquico (HCA).
Tiene como objetivo principal definir la estructura de los datos colocando
observaciones parecidas en grupos; la información se expresa con un punto en el
espacio bidimensional en el cual las distancias entre estos puntos se calculan, y el
procedimiento de la agrupación depende de las distancias entre los mismos (menos
distancia, mayor semejanza) (Sumner, Mendes et al. 2003). El resultado es visualizado
en un dendrograma o árbol y permite una fácil visualización de las muestras (Díaz
Monroy y Morales Rivera 2012, Putri, Yamamoto et al. 2013).
1.5.2 Análisis por componentes principales (PCA)
Es el método de análisis de datos más utilizado en metabolómica, que tiene por
objetivo la estructuración de un conjunto de datos mediante la reducción del número de
variables a un conjunto más pequeño (componentes) que contienen la mayor parte de la
variabilidad presente en el conjunto inicial (Griffiths 2008, Díaz Monroy y Morales Rivera
2012). Así el PCA permite eliminar variables (si es posible) que aporten poco al estudio y
facilitar la interpretación de los datos. Este tipo de análisis permite además encontrar
correlación entre las variables evaluadas (como por ejemplo composición y actividad),
encontrar similitudes y/o diferencias entre las muestras analizadas (Díaz Monroy y
Morales Rivera 2012, Putri, Yamamoto et al. 2013).
1.5.3 Análisis por mínimos cuadrados parciales (PLS)
El PLS es una técnica que combina el análisis de componentes principales y la
regresión múltiple; su objetivo es predecir o analizar un conjunto de variables
dependientes a partir de un conjunto de variables independientes o predictores (Abdi
2003). Esta predicción es llevada a cabo por la extracción de las predictores o conjunto
de factores ortogonales (llamados variables latentes) las cuales tienen mejor poder de
Capítulo 1
19
predicción. La matriz X es una matriz de datos obtenidos con el método no-dirigido,
mientras que la matriz Y son los datos conocidos utilizados para supervisar la regresión
(Tobias 1995, Abdi 2003). Este tipo de análisis incluye PLS-Análisis Discriminante (PLSDA), PLS Ortogonal (OPLS) y OPLS-DA . Si la matriz Y tiene variables específicas y ya
conocidas, los enfoques PLS y OPLS son los métodos convenientes para la identificación
de aquellos metabolitos significativos que son correlacionables con las variables en Y
(Putri, Nakayama et al. 2013).
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2. Capítulo 2. Perfil químico y capacidad
antioxidante de extractos de plantas del
género Virola de la Amazonia y Orinoquia
colombiana
combinado
con
análisis
multivariado
2.1 Introducción
Las plantas de la familia Myristicaceae son conocidas por su amplio uso por parte de
comunidades indígenas de la Amazonia y la Orinoquia; sus aplicaciones van desde el
campo de la medicina tradicional hasta lo mágico-ritual, pasando por ser fuentes
maderables y usadas para la elaboración de pulpa para hacer papel. De los seis géneros
presentes en América, el género Virola es el de mayor importancia debido a que se
encuentra ampliamente distribuido y lo componen un gran número de representantes,
con un número aproximado de 45 especies (Garcia Barriga 1992, Herrera 1994, HNC
2014).
Las plantas del género Virola son también conocidas porque exudan de su corteza
una resina densa que al contacto con el ambiente adquiere una coloración ámbar, la cual
es usada en diferentes formas dependiendo del tópico a tratar, siendo su principal uso
para la elaboración del polvo alucinógeno, conocido popularmente como Rapé, por parte
de algunas comunidades indígenas (Schultes y Hofmann 1982).
Dentro de los metabolitos que se pueden encontrar en estas especies están
alcaloides, flavonoides, diarilpropanos, estilbenos, lignanos y neolignanos, entre otros. Se
han reportado alcaloides triptaminicos como la 5-metoxi-N,N-dimetiltriptamina aislado de
V. elongata y V. theiodora (Schultes 1969, Miles, Ly et al. 1987); estilbenos como el
3,5,4’-trimetoxi-transestilbeno aislado de V. elongata (MacRae y Towers 1985), así como
lignanos de núcleo furofuránico y tetrahidrofuránico, como la sesamina y la grandisina,
respectivamente, aislados de V. sebifera, V. flexuosa y V. surinamensis (Rotz R., Cuca S.
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
28
et al. 1987, Lopes, de Almeida Blumenthal et al. 1996), además de los neolignanos 8-O4’, como la surinamensina y la virolina (Kawanishi, Uhara et al. 1982, Martinez, Cuca et
al. 1985).
Los fenoles y los flavonoides, adquieren principal importancia en las Virola debido a que
se encuentran relacionados a la actividad antiinflamatoria (Carvalho, Ferreira et al. 1999),
antibiótica y antifúngica (Lopes, Kato et al. 1999). Los flavonoides, abundantes en plantas
de este género y en general en la familia Myristicacea (Martın
́ ez Valderrama 2000), son
compuestos de gran importancia ya que algunos diarilpropanos como virolanol B y
virolanol C y virolaflorina son considerados marcadores quimiotaxonómicos del género
(Martın
́ ez Valderrama 2000), además están involucrados en la fotosensibilización,
transferencia de energía, crecimiento, control de la respiración , fotosíntesis,
morfogénesis y defensa de las plantas contra patógenos invasores incluyendo insectos,
bacterias, hongos y virus (Havsteen 2002). El amplio rango de actividad biológica referida
a los flavonoides es atribuida a su capacidad de manifestar efectos antioxidantes, captura
de radicales libres y quelar cationes divalentes, además se ha demostrado que tienen la
capacidad
de inhibir enzimas como hidrolasas, hialuronidasas, fosfatasa alcalina,
arilsulfatas, lipasas, glucosidasas y kinasas, entre otras (Razzaghi-Abyaneh y Rai 2013)
La composición de un extracto, con respecto a un metabolito o grupo de metabolitos
de interés, puede ayudar en la caracterización del mismo, más aun cuando se quiere
encontrar una relación entre la proporción de los mismos, y la especie objeto de estudio o
el lugar de recolección (Fiehn, Robertson et al. 2007). Este estudio se puede llevar a
cabo por medio de un análisis metabolómico (Patti, Yanes et al. 2012), que permita
relacionar varios parámetros cuantitativos al mismo tiempo, así como encontrar
relaciones entre las variables analizadas por medio de matrices de correlación (Díaz
Monroy y Morales Rivera 2012), análisis jerárquico y de mínimos cuadrados parciales
como métodos quimiométricos de reducción de datos (Dunn y Ellis 2005, Griffiths 2008).
Los modelos creados a partir de variables de interés ya sean cualitativas o cuantitativas
ayudan en la caracterización de extractos y permiten hacer una discriminación inicial de
los mismos ya sea respecto al lugar de recolección, la especie, o la parte de la planta
evaluada, que permita establecer en una muestra desconocida información referente a
estas características.
Capítulo 2.
29
2.2 Metodología
2.2.1 Material Vegetal
Las muestras de V. carinata, (Madera y Corteza), V. elongata (Hojas Corteza y
Madera) y V. peruviana (Hojas Corteza y Madera) fueron recolectadas en la Estación
Experimental El Trueno, del Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas (Sinchi),
en el municipio El Retorno, departamento de Guaviare, Colombia. Se hicieron dos
colectas, la primera en el año 2009 a cargo de la Ing. Juliana Cardona y la segunda en
2013 a cargo del Ing. Bernardo Giraldo, las dos determinadas por el Biólogo Dairon
Cárdenas. Un espécimen de cada especie reposa en el Herbario Amazónico Colombiano
(COAH) con los códigos COAH 67306, COAH 72082 y COAH 49606 respectivamente. La
muestra de Virola callophylla (Hojas, Corteza y Madera) fue colectada en Mitú – Vaupés
por la Ing Juliana Cardona y determinada por el Biólogo Dairon Cárdenas, un espécimen
reposa en el Herbario Amazónico Colombiano (COAH) con código COAH 64850.
Además se colectaron otras muestras en el parque nacional natural Amacayacú,
Departamento del Amazonas (V. callophylla, V. carinata y V. elongata ) por el Profesor
Luis Enrique Cuca y un espécimen de cada ejemplar reposa en el Herbario Nacional
Colombiano con código COL 366259, COL 366257, COL 366254, respectivamente. Las
muestras de V. carinata de la Orinoquia fueron colectadas en Granada y Puerto López,
Departamento de Meta, por el Profesor Wilman Delgado y determinadas por el Biólogo
Adolfo Jara, y un espécimen reposa en el Herbario Nacional Colombiano con código COL
563244 y COL 366257, respectivamente. En la Tabla 2.1 se presenta un resumen del
total de muestras objeto de estudio, discriminadas por especie, lugar de colección y parte
de la planta, así como la abreviatura dada a cada una.
Tabla 2.1. Información extractos a estudiar.
Especie
V. carinata
V.elongata
Parte de la planta Abreviatura Lugar de Colección
hojas
VcH
corteza
VcC
madera
VcM
hojas
VeH
corteza
VeC
madera
VeM
Guaviare
Guaviare
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
30
V.peruviana
V. callophylla
V. elongata
V. callophylla
V. carinata
V. elongata
V. peruviana
V. carinata
V. carinata
hojas
VpH
corteza
VpC
madera
VpM
hojas
VcfH
corteza
VcfC
madera
VcfM
hojas
VeH2
madera
Vem2
hojas
VcfH2
Amazonas
madera
VcM2
Amazonas
hojas
VeH13
corteza
VeC13
madera
VeM13
hojas
VpH13
corteza
VpC13
madera
VpM13
hojas
VcH PL
Hojas
VcH WD
Corteza
VcC WD
Frutos
VcF WD
Arilo
Vca WD
Cascara
Vcp WD
Guaviare
Vaupés
Amazonas
Guaviare
Guaviare
Meta
2.2.2 Obtención de Extractos Etanólicos
El material vegetal (hojas, corteza y madera de cada especie), seco y molido se
sometió a extracción por maceración en etanol al 96% a temperatura ambiente, se filtró y
se concentró a presión reducida en rotavapor, para eliminar el disolvente y obtener
veintiocho extractos etanólicos crudos. A partir de cada extracto etanólico seco se
preparó una disolución de 2,5 mg/mL en etanol absoluto, la cual fue usada para la
cuantificación de fenoles y flavonoides y las evaluaciones de capacidad antioxidante.
Capítulo 2.
31
2.2.3 Cuantificación de fenoles totales
Para la cuantificación de fenoles totales se usó el método de Folin-Ciocalteu (Folin y
Ciocalteu 1927, Ainsworth y Gillespie 2007); se tomaron 200 µL de la disolución del
extracto etanólico (2,5 mg/mL) y se adicionaron 400 µL del reactivo de Folin – Ciocalteu,
después de tres minutos se adicionaron 1500 µL de Na 2CO3 7,35% y se dejaron
reaccionar en oscuridad por 2 horas; pasado el tiempo de incubación se midió la
absorbancia a 765 nm. Cada una de las determinaciones se realizó por triplicado. El
contenido de fenoles totales se determinó por interpolación de la absorbancia en una
curva de calibración previamente construida (Anexo A) usando como patrón Acido, el
resultado se presenta en mg Eq de Acido Gálico /g de Extracto Seco (Wolfe, Wu et al.
2003).
2.2.4 Cuantificación de Flavonoides Totales
Para la cuantificación de flavonoides totales se usó el método de AlCl 3 (Woisky y Salatino
1998). Se tomaron 50 µL de la disolución del extracto etanólico (2,5 mg/mL) y se
adicionaron 150 uL de AlCl3 (10%), 150 uL de Acetato de Sodio 0,1M y 850 uL de etanol.
La mezcla se dejó reaccionar en oscuridad por 40 minutos. Pasado el tiempo de
incubación se midió la absorbancia a 420 nm. Cada una de las determinaciones se
realizó por triplicado. El contenido de flavonoides totales se determinó por interpolación
de la absorbancia en una curva de calibración previamente construida (Anexo A) usando
como patrón Quercetina el resultado se presenta en mg Eq de Quercetina /g de Extracto
Seco (Pękal y Pyrzynska 2014).
2.2.5 Capacidad Captadora de Radicales DPPH·
A partir de una disolución stock del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo, DPPH, (100mM) se
preparó una disolución de DPPH de trabajo a una concentración 10mM, realizando la
correspondiente dilución con etanol, de tal manera que la absorbancia a 515 nm
estuviera cercana a 1, usando como blanco etanol. En diferentes celdas para
espectrofotometría se tomaron 5µL, 15µL, 25µL, 35µL 50µL de la disolución de cada
extracto por separado (cada una por triplicado) y se llevaron a 50 µL con etanol. Se
adicionaron 1950 µL de DPPH 10mM y se incubaron a temperatura ambiente por 40
minutos en ausencia de luz. Se midieron las absorbancias a 515 nm, y se calculó el % de
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
32
inhibición para cada dosis y para cada tratamiento respecto a la absorbancia del DPPH
con etanol. Con estos datos se construyó la curva dosis-respuesta mediante regresión
no-lineal usando el programa GraphPad Prism 5.0, con el fin de determinar la
concentración inhibitoria media (IC50) (Thaipong, Boonprakob et al. 2006, Wootton-Beard,
Moran et al. 2011, Apak, Gorinstein et al. 2013)
2.2.6 Capacidad Captadora de Radicales ABTS+·
A partir de
una disolución stock del catión radical del ácido 2,2′-azinobis-3-
etilbenzotiazolin-6-sulfonico, ABTS+·, (preparada a partir de una mezcla en partes iguales
del ABTS 7mM y disolución de Persulfato de Potasio 4,9 mM, que se deja reaccionar a
temperatura ambiente, en ausencia de luz por mínimo 18 horas antes de usar), se
preparó una dilución en etanol (1mL de ABTS +· por cada 40 mL de etanol), llamada
ABTS+· de trabajo, con absorbancia a 734 nm cercana a 1. En diferentes celdas para
espectrofotometría se tomaron 5µL, 10µL, 30µL, 50µL 70µL, 100µL, de la disolución de
cada extracto (cada una por triplicado) y se llevó a 100 µL con etanol. Se adicionaron
1900 µL de ABTS+· de trabajo y se incubaron por 6 minutos a temperatura ambiente
(Thaipong, Boonprakob et al. 2006, Wootton-Beard, Moran et al. 2011, Apak, Gorinstein
et al. 2013). Pasado el tiempo, se tomaron las medidas de absorbancia a 734 nm, y se
calculó el % de inhibición para cada dosis respecto a la absorbancia del ABTS +· con
etanol. Con estos datos se construyó la curva dosis-respuesta en GraphPad Prism 5.0
para determinar el IC50.
2.2.7 Capacidad Reductora (método FRAP)
En celdas para espectrofotometría, se tomaron 100µL de la solución problema (cada una
por triplicado) y se adicionaron 1900 µL de reactivo FRAP (ferric reducing antioxidant
power) recién preparado (que consiste en una mezcla de 25 mL de Buffer pH 3,6, con 2,5
mL de FeCl3 20mM y 2,5 mL de 2,4,6-tripiridil-s-triazina,TPTZ, 10 mM, incubada a 37 °C
por 30 minutos). Al tiempo se preparó el blanco tomando 100 µL de etanol y 1900 µL de
reactivo FRAP. Se Incubaron a 37°C por 30 minutos en ausencia de luz y se midió la
absorbancia a 593 nm. Se determinaron los equivalentes de Trolox (ácido 6-hidroxi2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico) por interpolación en una curva de calibración
previamente construida (Anexo A), el resultado se presenta en mM eq Trolox/g de
Capítulo 2.
33
Extracto Seco (Thaipong, Boonprakob et al. 2006, Wootton-Beard, Moran et al. 2011,
Apak, Gorinstein et al. 2013).
2.2.8 Análisis Estadístico
Para el análisis de los datos, inicialmente se hicieron pruebas de normalidad (ShapiroWilks), y test de ANOVA y Tukey (Anexo B) para determinar la varianza y las diferencias
significativas entre los datos en el software de libre distribución R project e InfoStat
versión estudiantil. Para el análisis conjunto de los datos obtenidos, inicialmente se
evaluó la correlación lineal entre variables (mediante coeficientes de Pearson). Así
mismo, se llevó a cabo un análisis de componentes principales con normalización de
datos, en el programa Simca 13.0 de Umetrics Inc. Como variables de entrada en la
matriz de datos multivariados se utilizaron los parámetros químicos calculados
anteriormente para cada muestra (contenido de fenoles totales, contenido de flavonoides
totales y capacidad antioxidante por los tres métodos).
2.3 Resultados y discusión
El contenido de fenoles totales (concentraciones en un intervalo de 5.56 ± 0.93 a 507.31
± 33.41 mg Eq de Ac. Gálico/ g extracto seco), y de flavonoides totales (concentraciones
en un intervalo de 4.04 ± 0.15 a 54.96 ± 2.20 mg Eq de Quercetina/ g extracto seco) se
presentan en la Figura 2.1. Se observa que la mayor cantidad de fenoles se presenta en
las cortezas de cada especie, y la mayor cantidad de flavonoides se encuentra en los
extractos de hojas evaluados. Cada valor en la gráfica corresponde al promedio de tres
réplicas ± la desviación estándar (coeficientes de varianza entre replicas inferiores al
10%), adicionalmente presentado la clasificación pro Tukey de las muestras según los
parámetros evaluados.
34
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Figura 2.1. Contenido de fenoles totales y flavonoides totales de los veintiocho extractos evaluados.
Se encuentra reportado que los flavonoides generan beneficios para la salud inhibiendo
la peroxidación lipídica, quelando metales y atenuando procesos de formación de
especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (Havsteen 2002, Heim, Tagliaferro et al. 2002,
Pourcel, Routaboul et al. 2007), los flavonoides como titonina (7,4’-dimetoxi-3’hidroxiflavona) y sus derivados se han reportado como antiinflamatorios (Carvalho,
Ferreia et al 1999), y dentro de los compuestos fenólicos, se pueden encontrar mezclas
de neoligananos-8.O.4’ reportados como activos antifúngicos inhibiendo la formación de
la pared celular de Neurospora crassa (Zacchino, 1998). Al observar la gráfica de
contenidos totales, se puede observar que el comportamiento de fenoles y flavonoides no
es el mismo, lo que aparentemente indica que las dos variables evaluadas dan una
característica diferente de las muestras.
Un tipo de propiedad atribuida a la presencia de fenoles y flavonoides es la capacidad
antioxidante (Rice-Evans, Miller et al. 1996, Ainsworth y Gillespie 2007); así, como otra
variable de caracterización química de las muestras, se realizó la evaluación de la
capacidad captadora de radicales DPPH· y ABTS+·, los cuales se basan en la inhibición
de un radical comercial estable. Esta inhibición genera una disminución de su longitud de
onda de máxima absorción durante la reacción de reducción como se presenta en la
Ecuación 1 para el radical DPPH· (Brand-Williams, Cuvelier et al. 1995, Apak, Gorinstein
et al. 2013).
DPPH● + AH → DPPH-H + A●
DPPH● + R● → DPPH-R
Ecuación 1. Ecuación de reacción del radical estable DPPH·
Capítulo 2.
35
A partir los datos de absorbancia obtenidos a diferente concentración de los extractos en
presencia de DPPH· y ABTS+·, se construyó la curva dosis-respuesta, para así determinar
la concentración inhibitoria media (IC50 en µg/mL) de cada extracto evaluado. En la
Figura 2.2, se presenta como ejemplo la curva dosis-respuesta obtenida para el extracto
de corteza de V, peruviana, la cual se construyó con los datos de inhibición del extracto a
siete concentraciones diferentes en el software
Graph Pad Prism 5.0.
VPC DPPH
100
%Inhibition
80
60
40
20
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Concentration
Figura 2.2. Curva dosis-respuesta obtenida por el método de DPPH, para el extracto de corteza de
Virola peruviana
De la misma forma se calcularon IC50 para todas las muestras, para tener un valor
absoluto del parámetro, pues otras determinaciones relativas (como el cálculo de
Equivalentes de Trolox, TEAC) usualmente no permite hacer una comparación adecuada
debido al comportamiento característico dependiente de la dosis de cada muestra.
En la Figura
2.3, se presentan los resultados de la capacidad antioxidante de los
extractos expresados como IC50 (µg/mL) tanto por el método de DPPH (concentraciones
entre 5.99 ± 1.53 y 90.01 ± 3.54 µg/mL) como por el de ABTS (concentraciones entre
5.61 ± 1.13 y 90.04 ± 3.58 µg/mL), mostrando la misma tendencia, pues los dos métodos
se basan en el mismo principio de captura de un radical estable coloreado (Thaipong,
Boonprakob et al. 2006, Apak, Gorinstein et al. 2013). Se utilizó como patrón Ácido
Ascórbico (AA), compuesto que reporta una alta capacidad antioxidante, usado para la
conservación de alimentos y como referente (Brand-Williams, Cuvelier et al. 1995).
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
36
Figura 2.3. Concentración Inhibitoria media, IC50, para los veintiocho extractos evaluados por los
dos métodos de captura de radicales,
Algunos extractos, como aquellos provenientes de las cortezas de las tres especies,
tienen un valor de IC50 comparable con el obtenido para el compuesto de referencia (AA).
Teniendo en cuenta que se llevó a cabo el análisis con el extracto etanólico, puede
deberse a la presencia de un(os) compuesto(s) con una mayor capacidad captadora de
radicales que el referente.
Existen, además, varios métodos para la evaluación de la capacidad antioxidante que
pueden ser utilizados como otros parámetros químicos en la caracterización de las
muestras además de DPPH y ABTS, como FRAP (ferric reducing antioxidant power), el
cual se basa en la formación de un complejo de Hierro (II), con TPTZ, el cual tiene un
máximo de absorción de 593 nm; una de las diferencias de este método respecto a los
anteriormente descritos, es que se lleva a cabo a pH ácido, para simular condiciones
fisiológicas. La reacción que resume esto se presenta en la Ecuación 2 (Apak, Gorinstein
et al. 2013).
Fe (TPTZ)23+ +ArOH → Fe (TPTZ)22+ + ArO● + H+
Ecuación 2. Ecuación de reacción de formación del complejo coloreado en el método FRAP.
En la Figura 2.4, se presentan los resultados de capacidad antioxidante por método de
reducción del ion férrico (método de FRAP), donde se puede observar que, a diferencia
de los métodos anteriormente utilizados, no se presenta una tendencia clara respecto al
poder reductor de extractos provenientes de cierta parte de la planta como se en las
Capítulo 2.
37
otras pruebas y aunque las metodologías se reportan para evaluar la capacidad
antioxidante, los resultados no son comprables (Thaipong, Boonprakob et al. 2006).
Figura 2.4. Resultado de la determinación del poder reductor de los veintiocho extractos objeto de
estudio.
A partir de las gráficas de resultados de cuantificación de fenoles y flavonoides totales,
captura de radicales y poder reductor por separado, no es posible determinar relación
entre estas variables. Sin embargo se pudo observar que aunque hay métodos utilizados
para expresar un mismo parámetro, como la capacidad antioxidante, se presentan
diferencias en los resultados debido a que las metodologías utilizadas no se basan en el
mismo mecanismo. Así, con los valores de contenidos totales de fenoles y flavonoides,
capacidad antioxidante por DPPH, ABTS y FRAP se llevó a cabo un análisis estadístico,
en el programa de libre distribución R, para evaluar las correlaciones entre las diferentes
variables medidas, cuya grafica de dispersión se presenta en la Figura 2.5.
Figura 2.5. Diagrama de dispersión, para determinar correlación entre las variables
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
38
Se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson para cada par de variables
(Tabla 2.2) de los cuales se puede inferir que existe una correlación (lineal) alta entre el
contenido de fenoles y la capacidad antioxidante medida por el método FRAP, indicando
que estos metabolitos pueden llegar a ser los responsables de la capacidad reductora de
los extractos evaluados.
Este análisis de correlación permite eliminar variables, con el fin de hacer más riguroso el
análisis multivariado; en este caso, DPPH y ABTS presentan el mismo comportamiento,
lo cual se encuentra acorde con lo reportado en literatura (Apak, Gorinstein et al. 2013)
pues son dos métodos basados en el mismo principio de captura de un radical coloreado,
aunque en algunos casos presentan diferencias en su comportamiento. Se esperaba una
mayor correlación entre los métodos de capacidad antioxidante por FRAP y DPPH o
ABTS, pero los resultados indican que estas dos metodologías nos aportan información o
características diferentes de las muestras de estudio, debido a que los métodos DPPH y
ABTS se basan en la capacidad de un compuesto para capturar un radical y FRAP en el
poder reductor de un prooxidante como el ión férrico (Apak, Gorinstein et al. 2013).
Tabla 2.2 Coeficientes de correlación de Pearson calculados entre las variables evaluadas
Fenoles
Flavonoides
FRAP
DPPH
ABTS
Fenoles
1,00
-0,27
0,94
-0,77
-0,79
Flavonoides
-0,27
1,00
-0,23
0,15
0,12
FRAP
0,94
-0,23
1,00
-0,70
-0,73
DPPH
-0,77
0,15
-0,70
1,00
0,94
ABTS
-0,79
0,12
-0,73
0,94
1,00
El análisis de correlación permite determinar el comportamiento de una variable
estudiada respecto a la otra y en un grupo pequeño de variables, excluir aquellas que
generan redundancia en el análisis de los datos (Díaz Monroy y Morales Rivera 2012).
No obstante, no es posible a partir del mismo encontrar diferencias y semejanzas entre
muestras analizando todos los parámetros evaluados simultáneamente. Con tal fin se
llevó a cabo un análisis de datos multivariados por componentes principales, PCA , en
programa SIMCA 13.0 de Umetrics con los datos obtenidos, para generar un modelo a
partir de características o propiedades químicas que permitiera referenciar o discriminar
las muestras del grupo de estudio, resultados que el cual logra explicar el 88,1% de la
Capítulo 2.
39
varianza total de los datos con los dos primeros componentes encontrando que las
muestras se agrupan en dos conglomerados: uno de ellos, correspondiente a extractos
provenientes de fruto (3 muestras) aunque fuera del 95% de confianza y otro con los
demás extractos (25 muestras) como se presenta en la Figura 2.6. Este análisis además
de permitir la reducción de variables y presentar la información en forma gráfica y sencilla
ayuda a determinar qué muestras presentan similitudes entre sí y qué tan diferentes
pueden ser respecto a la varianza entre grupos.
Figura 2.6. PCA a partir de los datos de cuantificación de metabolitos y capacidad antioxidante
La varianza de los datos dentro del grupo de 25 extractos no es significativa respecto a la
varianza entre los dos grandes conglomerados encontrados y, de esta forma, no es
posible hacer una discriminación entre el grupo de 25 extractos. No obstante, al excluir
los frutos del análisis (VcFWC, VcPWD VcAWD por ser outliers), como se presenta en la
Figura 2.7 se pueden obervar diferencias entre las 25 muestras restantes .
Para facilitar su visualización, este análisis se combinó con un análisis de conglomerados
jerárquicos, HCA (Figura
2.8a), permitiendo así observar diferencias que no eran
evidentes en el primer PCA. En la Figura 2.7, se observa que si hay comportamientos
similares en extractos de cortezas y maderas (en rojo y amarillo), así como
conglomerados formados por extractos de hojas independientemente de la especie, el
lugar y la fecha de recolección, ejemplo de esto son las muestras VeH y VeH13, que son
40
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
colectadas de la misma planta V. elongata en Guaviare, en diferente época y año, que
forman un conglomerado con VpH proveniente de V. peruviana.
Figura 2.7. PCA excluyendo extractos de frutos para observar mejor la diferenciación de otros
extractos
Las muestras se agruparon en 4 conglomerados, de acuerdo al análisis jerárquico HCA,
presentado en la Figura 2.8ª, en donde las distancias entre las muestras facilitaron la
visualización de aquellos semejantes entre sí en sus propiedades evaluadas.
Inicialmente, en el análisis por componentes principales, graficando las dos primeras
componentes no se pueden distinguir distancias entre grupos, pero cuando se combinan
dos métodos de análisis multivariado como HCA y PCA, se puede obtener más
información, como ocurre en este caso, los cuáles están explicando el 89,9% de la
varianza total de los datos con las dos primeras componentes.
a.
b.
Figura 2.8. a. Análisis de conglomerados jerárquicos excluyendo outliers; b. Grafica de contribución
de componentes del PCA
Capítulo 2.
41
2.4 Conclusiones
La diferencia encontrada entre los extractos en la composición respecto a la
concentración de fenoles y flavonoides indica que podría existir compartimentalización de
los mismos en la planta, así como una variación en la distribución de estos de acuerdo a
las necesidades y cambio del entorno. Lo anterior se podría racionalizar dado que la
presencia de flavonoides en altas concentraciones en las hojas ayuda en la protección
contra los rayos UV y contra el ataque de microorganismos. Igualmente los flavonoides
intervienen en otro tipo de interacciones con el medio ambiente, pues se ha reportado
que algunos inhiben enzimas digestivas, para evitar que estas sean consumidas por
herbívoros. Por su parte, la alta cantidad de fenoles en las cortezas, ayuda a la
protección contra el ataque de hongos, puesto que se ha comprobado su actividad y el
papel importante que juegan en otro tipo de relaciones ecológicas.
Se encontró que la composición respecto a metabolitos como flavonoides y fenoles
tienen el mismo comportamiento entre especímenes de Virola (altos contenido de
flavonoides en las hojas y altos contenidos de fenoles en las cortezas), lo cual puede
indicar que la producción de estos no es dependiente totalmente de las variaciones del
entorno, sino que tienen otra función, pues no hay diferencias marcadas entre muestras
de diferente especie o lugar de colección.
Los menores valores de IC50, tanto por el método de ABTS · como por DPPH,
encontrados en los extractos de cortezas indican que existen compuestos en estas
muestras con una alta capacidad de captura de radicales, aunque esta capacidad no es
causada por la presencia de fenoles, pues el coeficiente de correlación de Pearson no
indica relación lineal entre este grupo de variables, mientras que respecto a la capacidad
antioxidante por el método FRAP y el contenido de fenoles en las muestras si se
presenta una muy buena correlación, por lo cual se puede inferir que los fenoles pueden
participar en la reducción el ion férrico, evitando que otro tipo de moléculas se oxiden y
generen alteraciones en los organismos.
El análisis estadístico ayuda a evaluar la correlación entre variables y reducir el número
de las mismas con el objetivo de eliminar datos redundantes y determinar cómo es el
comportamiento de una respecto a la otra
42
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
El uso de técnicas de análisis de datos multivariados permite hacer una clasificación o
discriminación de muestras basados en varias características/propiedades de las mismas
de forma simultánea, lo cual permite encontrar tendencias en un grupo amplio de
muestras. En el caso de los extractos de Virola, se pueden encontrar semejanzas entre
extractos dela misma parte de la planta de especímenes que provienen de diferentes
lugares y pertenecen a diferentes especies, respecto a las características evaluadas.
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Capítulo 2.
45
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before and after in vitro digestion measured by FRAP, DPPH, ABTS and Folin–Ciocalteu
methods." Food Research International 44(1): 217-224.
3. Capítulo 3. Perfilado metabólico no dirigido
de plantas del género Virola en ambiente no
supervisado
3.1 Introducción
La caracterización de extractos con propiedades totalizadas permite hacer una
discriminación inicial importante. No obstante, este tipo de propiedades corresponde a
información globalizada de las muestras objeto de estudio, dado que estas se componen
de otros grupos de metabolitos diferentes a flavonoides y compuesto fenólicos. Lo
anterior hace necesario ampliar el análisis de tal manera que se permita generar mayor
cantidad de información sobre la composición de los extractos, en el marco de una visión
holística, lo cual permitirá establecer o aclarar hipótesis, por ejemplo, si la composición
en metabolitos secundarios es totalmente dependiente de la interacción con el medio en
que se encuentran o de la especie de estudio, entre otros escenarios.
La metabolómica está definida como un estudio interdisciplinario que
involucra la
identificación y cuantificación de los metabolitos (de bajo peso molecular) producidos por
un organismo (Weckwerth 2007, Ramsden 2009) mediante el uso de técnicas o
herramientas analíticas sofisticadas, lo que la hace , una poderosa herramienta que
permite además evaluar los cambios en los perfiles metabólicos usando principalmente
métodos estadísticos multivariados para el tratamiento de los datos (Fiehn 2002, Sumner,
Mendes et al. 2003). Dentro de la metabolómica se encuentra el termino perfilado
metabólico (Fingerprinting) el cual enmarca, dentro de la misma disciplina, un análisis
rápido y global de las muestras con el fin de obtener una clasificación (la cuantificación
no es empleada generalmente) y permite diferenciar entre muestras de diferente origen o
estadio de crecimiento, como en el presente caso de muestras de las diferentes especies
de Virola (Dunn y Ellis 2005, Weckwerth 2007, Garcia-Perez, Vallejo et al. 2008, Dias,
Urban et al. 2012).
48
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Múltiples plataformas analíticas son usadas en el estudio en metabolómica. Así, las
técnicas cromatográficas (tanto cromatografía liquida como de gases) y espectroscópicas
(Resonancia Magnética Nuclear e Infrarrojo), permiten obtener una gran cantidad de
información acerca de la composición de cierto grupo de muestras (Richards, Dumas et
al. 2010, Putri, Yamamoto et al. 2013). La cantidad de datos generados por técnicas
cromatográficas es tan grande, que no es posible llevar a cabo análisis por medio de
correlación de variables, o análisis punto a punto, que generan perdida de información
que puede llegar a ser relevante en la clasificación o diferenciación de muestras (Díaz
Monroy y Morales Rivera 2012, Putri, Yamamoto et al. 2013).
Para el tratamiento de grandes cantidades de información, son empleados métodos
estadísticos de análisis multivariado enmarcado en un estudio quimiométrico, lo cual
permite evaluar varias características al mismo tiempo, y relacionar estas para entender
mejor el comportamiento general de un grupo de muestras (Kumar, Bansal et al. 2014).
Una de las herramientas estadísticas más sencilla y más usada para el análisis de datos
multivariados en un ambiente no supervisado es el Análisis por Componentes Principales
(PCA), el cual explica las estructuras de las varianzas y covarianzas de un conjunto de
variables mediante combinaciones lineales no relacionadas entre sí, conocidas como
componentes principales, minimizando el número de dimensiones y permitiendo
mantener la mayor parte de la varianza; tiene por objetivos la simplificación y reducción
de datos, detección de outliers, selección de variables, clasificación y predicción de
comportamientos, presentando la información contenida en tablas en graficas
bidimensionales o tridimensionales (Wold, Esbensen et al. 1987, Ramsden 2009).
El uso de una o varias técnicas analísticas para la caracterización de muestras, permite
obtener una gran cantidad de información, sin embargo al momento de escoger la técnica
adecuada para dar respuesta a un objetivo en particular es necesario evaluar por
separado inicialmente las variables encontradas por cada técnica, para después realizar
una fusión de las mismas y comprobar los resultados obtenidos, con el fin de encontrar
aquella que permita crear el modelo más adecuado.
Capítulo 3
49
3.2 Metodología
3.2.1 Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia (LC-DAD-ESILRMS)
El análisis cromatográfico de los extractos se llevó a cabo utilizando un equipo
Shimadzu Prominence con detector de arreglo de diodos SPD M20A, columna
Phenomenex Sinergy RP-C18 de 150 mm x 4,6mm, 5µm, flujo 0,8 mL /min, fase móvil A:
HCOOH 0,1% y B: ACN en modo gradiente (0-5 min 10%B, 25 min 60% B, 48 min
100% B, 55 min 10% B) Los datos fueron adquiridos cada 1.2 nm entre 190 – 800 nm,
longitud de onda de monitoreo seleccionada fue 270 nm y volumen de inyección de 10 µL
(2,5 mg Extracto Seco/mL). Para la detección por espectrometría de masas, se utilizó un
espectrómetro Shimadzu LC2020, interfase de ionización electrospray, ESI, modo
positivo (SCAN 50 – 800 m/z), bloque de calentamiento 400°C, temperatura del línea de
desolvatación 250°C, voltaje del detector 1,05 kV, flujo de gas de nebulización (N 2) 1,5
L/min y gas de secado (N2) 9,0 L/min.
3.2.2 Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia acoplada a
Espectrometría de Masas de Alta Resolución (LC-HRMS)
El análisis por Cromatografía liquida acoplada a Espectrometría de masas de Alta
resolución, se llevó a cabo usando un cromatógrafo Shimadzu, columna Phenomenex
Luna C18 de 150 x 2.0 mm 3µm, fase móvil A. H2O 0,1% HCOOH y B: ACN 0,1%
HCOOH en modo gradiente (0-5 min 10%B, 25 min 60% B, 48 min 100% B, 55 min 10%
B). Temperatura del Horno 40 °C, Longitud de onda 254 y 330 nm. Sistema acoplado a
un Espectrómetro de Masas Bruker micrOTOFQ II, interfase de ionización ESI, modo
positivo, voltaje de capilar 4.5 kV, gas de secado nitrógeno 0,8 L/min, energía del
cuádruplo 7.0eV, energía de colisión 14 eV.
3.2.3 Análisis de fracciones hexánicas por cromatografía de
gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS)
Para complementar el análisis, y debido a la característica apolar de algunas de las
muestras, se llevó a cabo un análisis de Cromatografía de Gases de las fracciones
hexánicas de cada extracto, para lo cual se tomaron aproximadamente 300 mg de
muestra y se adsorbieron en Silica Gel. La mezcla se dispuso sobre una columna de
50
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Silica Gel y se eluyó con 250 mL de hexano, recolectando una fracción por muestra. Se
concentró en rotavapor y se llevó a un volumen total de 2 mL para su análisis por
cromatografía de gases GC-MS en un cromatógrafo Thermo Scientific Trace 1300 con
una columna capilar Restek Rxi 5Sil-MS de 60m, 0.25 mm ID y 0.25 µm df , flujo de gas
de arrastre(Helio) de 1.2 mL/min y con analizador de masas cuadrupolar; temperatura
del inyector 250 °C en modo Split (1:10), con rampa de temperatura iniciando en 50°C
por 5 minutos, incrementado la temperatura 12°C/min hasta 150°C manteniendo 3
minutos, incrementando 1.5°c/min hasta 180 °C manteniendo por 2 minutos y finalmente
incrementando 15 °C/ min hasta una temperatura final de 290 °C manteniéndose por 3
minutos; temperatura línea de transferencia 280°C y temperatura de fuente de iones
250 °C.
3.2.4 Análisis por Resonancia Magnética Nuclear
Para el análisis de los extractos, 10 mg de cada extracto se disolvieron en 1.00 mL de
cloroformo deuterado, CDCl3, se filtraron a través de algodón previamente desengrasado.
Se obtuvieron los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H-NMR en un equipo
Bruker AC 200 de 200 MHz.
3.2.5 Pretratamiento de Datos
El tratamiento de los datos, depende de la técnica utilizada para el análisis. Así, para
datos de LC-DAD se extrajeron en formato ACSII y se importaron en Excel para así
obtener una matriz de datos donde cada 0,640 s se tiene un dato de intensidad en mUA
(miliunidades de Absorbancia) a 270 nm. Para los datos de LC-HRMS, LC-MS y GC-MS
se llevó a cabo inicialmente un proceso de detección de picos, corrección de línea base y
deconvolución en MzMine 2.17 (Pluskal, Castillo et al. 2010, MZmine2 2015), se
exportaron los nuevos datos en formato .csv y se importaron en OriginPro 8.5. Para los
datos de 1H-NMR, a partir del espectro en MestRec Nova se exportaron en formato texto
para ser importados a Excel.
Con las matrices importadas en OriginPro para cada técnica de análisis, se llevó a cabo
por separado la alineación de los cromatogramas utilizando el algoritmo de COW
(correlation optimised warping) obtenido de http://www.models.kvl.dk/ (Tomasi, van den
Berg et al. 2004, Skov, van den Berg et al. 2006, University of Copenhagen 2014)
ejecutado en Matlab R2013; los datos alineados fueron escalados utilizando la Ecuación
Capítulo 3
51
1 y después normalizados con la Ecuación 2, donde D hace referencia al dato original, E
al dato escalado y N al dato escalado y normalizado (van den Berg, Hoefsloot et al.
2006).
𝑬𝒊 =
𝑫𝒊
∑𝒏
𝟏 𝑫𝒊
Ecuación 3
𝑵𝒊 =
̅̅̅
|𝑬𝒊−𝑬|
𝝈
Ecuación 4
Los datos de resonancia magnética nuclear, se alinearon usando el algoritmo icoshift
(Interval
Correlation
Optimised
Shifting)
versión
1.2,
obtenido
de
http://www.models.kvl.dk/ (Savorani, Tomasi et al. 2010, Tomasi, Savorani et al. 2011,
Savorani, Tomasi et al. 2013) ejecutado en Matlab R2013; los datos alineados fueron
escalados utilizando la Ecuación 1 y después normalizados con la Ecuación 2, donde D
hace referencia al dato original, E al dato escalado y N al dato escalado y normalizado.
3.2.6 Análisis Estadístico
Con los datos alineados tanto de cromatografía como de espectroscopia se realizaron
análisis de conglomerados jerárquicos HCA y análisis de componentes principales PCA
en el programa Simca 13.0 de Umetrics, con escalado centrado. De cada modelo se
generaron las gráficas de contribución de componentes para determinar la varianza
acumulada explicada con las componentes generadas, Score line, Hotelling’s T2 y DMOX
para evaluar el modelo obtenido.
Para llevar a cabo la comparación, concatenación o fusión de los datos obtenidos en los
modelos generados, se utilizan las distancias al modelo y valores propios para cada
muestra respecto al análisis de componentes principales con los cuales se lleva a cabo
otro análisis estadístico para determinar semejanzas y diferencias entre los diferentes
modelos generados (Forshed, Idborg et al. 2007, Richards, Dumas et al. 2010). Existen
diferentes técnicas de fusión de datos en metabolómica, las cuales se clasifican en tres
niveles, fusión de bajo nivel (datos), fusión de nivel medio (características), fusión de
nivel alto (decisiones). Cada uno se aplica de acuerdo a la naturaleza de los datos
obtenidos. (Liu y Brown 2004, Biancolillo, Bucci et al. 2014)
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
52
3.3 Resultados y discusión
Inicialmente, las técnicas cromatográficas utilizadas fueron estandarizadas para obtener
el mejor perfil en términos de selectividad y resolución. El análisis de las muestras por
cromatografía liquida, utilizando detector de arreglo de diodos, cómo se observa en la
Figura 3.1, permite observar diferencias entre los diferentes extractos estudiados. Así,
las cortezas de las diferentes especies se caracterizan por tener compuestos de mayor
polaridad, mientras que los frutos tienen compuestos en su mayoría de baja polaridad.
Adicionalmente, se presentan señales en común para varios extractos, y algunos poseen
compuestos que se encuentran en mayor proporción respecto a otros.
Los análisis cromatográficos utilizando detección por UV-Vis, permitieron realizar un
perfilado metabólico (fingerprinting) de las muestras, el cual enmarca un análisis rápido y
global de las muestras con el fin de obtener una clasificación. La cuantificación no es
empleada generalmente. No obstante, este proceso permite diferenciar las muestras de
diferente origen, especie, época de recolección o parte de la planta como es el caso del
presente estudio (Dunn y Ellis 2005, Weckwerth 2007, Garcia-Perez, Vallejo et al. 2008,
Dias, Urban et al. 2012).
20.0
17.5
15.0
10.0
mUA
12.5
7.5
5.0
2.5
0.0
M
ue
st
ra
VCH
VCC
VCM
VEH
VEC
VEM
VPH
VPC
VPM
VCFH
VCFC
VCFM
VEH2
VEM2
VCFH2
VCM2
VCC WD
VCF WD
VEH13
VEC13
VEM13
VPH13
VPC13
VPM13
VCA WD
VCP WD
VCH WD
VCH PL
10
20
30
40
50
60
70
Tiempo (min)
Figura 3.1. Perfiles cromatográficos de los 28 extractos objeto de estudio a 270nm. Columna Sinergy
RPC18 de 150 mm x 4.6mm, 5µm.
Al observar el grupo de cromatogramas en cascada de la Figura
3.1, se puede
determinar la ausencia y presencia de algunas señales o su polaridad de acuerdo a las
proporciones de la fase móvil y la naturaleza de la fase estacionaria. No obstante, tales
apreciaciones son parciales y se pierde información que puede llegar a ser de utilidad en
Capítulo 3
53
la clasificación o diferenciación de muestras. Con el objetivo de realizar un análisis en el
cual se incluyan todos los datos generados (6751 variables) se realizó un PCA Figura
3.2 para así encontrar semejanzas entre extractos respecto a su composición y un
análisis de agrupación jerárquica para facilitar la visualización la información del
diagrama de dispersión PC1 vs PC2 (Score Plot) resultante.
Figura 3.2. Análisis de componentes principales de los datos obtenidos por LC-DAD.
De esta manera, en el diagrama de dispersión obtenido luego de ejecutar el algoritmo de
PCA de la Figura 3.2, donde se correlacionan el PC 1 vs PC 2 (que explican el 45% de
la varianza total), no se observan conglomerados claros que permitan ver algún tipo de
tendencia, pero cuando se diferencian por color aquellos extractos provenientes de
diferentes partes de la planta, es posible observar que estos tienen un comportamiento
similar sin importar el lugar de recolección o la especie (Ver Figura
3.3). Así, los
extractos provenientes de corteza (rojo), son los que presentan menor varianza en su
composición, así como aquellos provenientes de madera (azul) y los extractos de fruto,
arilo y cáscara, no presentan diferencias notables en la composición. Por lo tanto se
puede observar que la composición no es dependiente totalmente del lugar de
recolección, coincidiendo con lo observado en la caracterización realizada en el capítulo
2, donde fue apreciada una tendencia a procesos de compartimentalización en la
producción de metabolitos secundarios de las especies Virola estudiadas..
54
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Figura 3.3. Diagrama de dispersión (PC 1 vs PC 2) distinguiendo extractos de acuerdo a la parte de la
planta.
Teniendo en cuenta que los factores ambientales y la interacción con el entorno inducen
a la producción de metabolitos secundarios en las plantas (Dewick 2011), se esperaría
inicialmente que la separación de muestras se diera por lugar de recolección. Al graficar
el PC 1 vs PC 3, explicando el 30 % de la varianza de total de los datos, se puede
observar que si hay similitud en la composición de los extractos provenientes de
diferentes lugares como se presenta en la Figura 3.4.
La agrupación entre muestras colectadas en diferente lugar y de diferente especie indica
la presencia de compuestos comunes que podrían considerarse como marcadores
quimiotaxonómicos del género Virola, algunos de los cuales ya han se han determinado
como virolanol B y virolanol C y virolaflorina (Martın
́ ez Valderrama 2000) y se podría
comprobar su presencia por un análisis cromatográfico acoplado a espectrometría de
masas.
Capítulo 3
55
Figura 3.4. Diagrama de dispersión obtenido del Análisis de componentes principales de los datos
obtenidos por LC-DAD (Componente 1 vs componente 3). Color según lugar de recolección Azul =
Guaviare, Amarillo = Vaupés, Rojo= Meta, Verde = Amazonas.
En el análisis se observa un comportamiento diferente de las muestras VeH2 y VcfH, que
también salen de la tendencia en el primer diagrama de dispersión (Figura 3.3), aunque
no fueron datos atípicos (outliers). Al analizar la gráfica de la Figura 3.5, que indica la
distancia del centro del modelo a cada muestra, se comprueba en este caso que estas
dos muestras se encuentran más alejadas del modelo generado (mayor desviación
estándar) en el total de componentes.
Figura 3.5. Grafica Hotelling’s T2 indicando que muestras se alejan del modelo creado.
Para determinar la identidad de estos metabolitos comunes y también los diferentes, es
necesario llevar a cabo estudios de aislamiento y elucidación estructural o un estudio
derreplicativo a partir de datos de espectrometría de masas encontrados en la literatura.
Teniendo en cuenta lo anterior, se analizaron los extractos usando cromatografía liquida
acoplada a espectrometría de masas, tanto a alta como a baja resolución, con el fin de
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
56
hacer una comparación de metodologías analíticas y los resultados obtenidos en cada
una.
Los datos obtenidos se trataron de dos formas diferentes generando dos matrices para
análisis. Inicialmente, fueron importados en MZMine 2.17, se realizó corrección de línea
base, deconvolución, filtrado de señales, (Pluskal, Castillo et al. 2010, MZmine2 2015),
para así obtener una matriz donde cada variable es diferente basada en la relación m/z
de las señales detectadas y el área de las misma en cada muestra (si la señal está
ausente, el valor de área es 0). Después de corrección de línea base en MZMine fueron
exportados en formato .cvs para obtener la matriz punto, la cual se analizó por separado.
Este proceso se realizó tanto para los datos de espectrometría de masas de alta como de
baja resolución. Los TIC obtenidos se presentan en la Figura 3.6.
400
400
300
Intensidad
250
200
150
100
50
0
10
20
30
40
50
60
70
VCH PL
VCH WD
VCP WD
VCA WD
VPM13
VPC13
VPH13
VEM13
VEC13
VEH13
VCF WD
VCC WD
VCM2
VCFH2
VEM2
VEH2
VCFM
VCFC
VCFH
VPM
VPC
VPH
VEM
VEC
VEH
VCM
VCC
VCH
350
300
Intensidad
VCH PL
VCH WD
VCP WD
VCA WD
VPM13
VPC13
VPH13
VEM13
VEC13
VEH13
VCF WD
VCC WD
VCM2
VCFH2
VEM2
VEH2
VCFM
VCFC
VCFH
VPM
VPC
VPH
VEM
VEC
VEH
VCM
VCC
VCH
350
80
Tiempo (min)
250
200
150
100
50
0
0
10
20
30
40
Tiempo de retención (min)
50
Figura 3.6. TIC obtenidos en el análisis por LC-LRMS y LC-HRMS.
En los perfiles de las muestras se pueden observar diferencias, y también señales que se
encuentran presentes en todos los TIC. Las cuatro matrices generadas (deconvoluidas y
punto a punto para datos MS) se analizaron por separado usando métodos estadísticos
de análisis de datos multivariados, con el fin de no perder información contenida en las
múltiples variables determinadas. El PCA sobre los datos de LC-LRMS punto a punto
(4261 variables), presentado en la Figura
3.7, donde se diferencian por color los
extractos según el lugar de recolección, explicando el 45% de la varianza total de los
datos con los primeros 3 componentes, se encontró que 4 de las muestras provenientes
del Departamento de Meta presentan composición similar así como 4 de las muestras
provenientes de Guaviare, pero no se presentaron diferencias en la composición de las
Capítulo 3
57
demás muestras obteniendo el mismo resultado que se había determinado en el análisis
anterior de las muestras usando LC-DAD.
Figura 3.7. PCA con base en el análisis de las muestras por LC-LRMS (datos punto a punto). Color
según lugar de recolección Azul = Guaviare, Amarillo = Vaupés, Rojo= Meta, Verde = Amazonas.
Al hacer una diferenciación por color de acuerdo a la especie sobre el mismo análisis
anterior (Figura 3.8), se observa que las muestras que presenta un comportamiento
diferente pertenecen a la especie identificada como Virola carinata recolectada en dos
departamentos diferentes, indicando que existen metabolitos en esta especie que son
propios de la misma.
Figura 3.8. PCA con base en el análisis de las muestras por LC-LRMS (datos punto a punto). Color
según la especie Azul = V. elongata, Amarillo =V. callophylla, Rojo= V. peruviana, Verde =V. carinata.
Es posible, a partir del análisis cromatográfico de las muestras, generar una matriz con
un menor número de variables, solo teniendo en cuenta aquellas señales con intensidad
superior a un límite preestablecido o solo ciertos iones con relación m/z característico a
un tiempo de retención fijo (Katajamaa y Orešič 2007). Sobre el mismo archivo generado
después de análisis por LC-LRMS de los 28 extractos, después del procesamiento en
MZmine, se obtuvo una matriz de 153 variables con la cual se llevó a cabo el análisis
58
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
multivariado por PCA, cuyo resultado se presenta en la Figura 3.9, explicando el 96% de
la varianza total de los datos con los dos primeros componentes y donde se observan
tres muestras con varianza mayor, que no permiten ver las diferencias en el grupo de
extractos.
Figura 3.9. PCA obtenido con los datos tratados de LC-LRMS (matriz de 153 variables), grafica de
contribución y Grafica Hotelling’s T2 indicando que muestras se alejan del modelo creado
Se excluyeron las tres muestras de mayor varianza VcfH, VcH y VcAWD para realizar un
nuevo análisis (Figura 3.10) explicando el 50 % de la varianza total de los datos, pero no
es posible ver una tendencia respecto al lugar de recolección, la especie o parte de la
planta. Se llevó a cabo un Análisis Jerárquico, encontrando cuatro grupos de muestras;
en estos se presentan muestras de diferente procedencia, parte de la planta y especie
Figura 3.10. PCA obtenido con los datos tratados de LC-LRMS (matriz de 153 variables). Sin outliers
(VcfH, VcH y VcAWD)
Capítulo 3
59
Con los datos obtenidos al tratar las muestras, se pueden determinar diferencias de
acuerdo a la ausencia y presencia de ciertos iones, pero también, se puede perder
información si en este tratamiento se eliminan iones, es decir, si se ajusta un valor
mínimo muy alto.
Así mismo, los datos provenientes de LC-HRMS, se trataron de la misma forma que los
de baja resolución; primero se realizó un PCA sobre los datos punto a punto, obteniendo
una matriz de 3297 variables (Figura 3.11), explicando el 37% de la varianza total de los
datos en los primeros dos componentes, encontrando, al igual que en los datos de LCLRMS y LC-DAD, que las muestras de Meta son diferentes respecto al resto, y se
presentan de nuevo dos muestras de Guaviare (VcH y VcM) con composición diferente a
las demás. Aunque los datos obtenidos por LC-DAD y LC-LRMS son tomados bajo las
mismas condiciones cromatográficas se espera un comportamiento similar, pero los
datos de LC-HRMS son tomados bajo otras condiciones, permitiendo corroborar los
resultados obtenidos.
Figura 3.11. PCA con base en el análisis de las muestras por LC-HRMS (datos punto a punto). Color
según lugar de recolección Azul = Guaviare, Amarillo = Vaupés, Rojo= Meta, Verde = Amazonas.
El tratamiento de los datos de LC-HRMS en MZmine permitió obtener una matriz de 176
variables, 23 variables más respecto a LC-LRMS debido a que se pueden diferenciar
iones con relación m/z cercana, que en baja resolución podrían ser tomados como el
mismo. Con esta matriz se hizo nuevamente un PCA, encontrando un comportamiento
similar al encontrado con LC-LRMS y el análisis de los datos punto a punto de LC-HRMS,
donde VcH y VcM se encuentran alejadas del grupo de muestras y las provenientes de
Meta se encuentran en otro conglomerado.
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
60
Figura 3.12. PCA obtenido con los datos tratados de LC-HRMS (matriz de 176 variables), grafica de
contribución y Grafica Hotelling’s T2 indicando que muestras se alejan del modelo creado
En el PCA de los datos tratados, eliminando las muestras que presentan mayor varianza
en la Figura
3.13, solo permite ver que dos muestras VeH y VcPWD presentan
diferencias respecto a las demás, lo cual se comprueba con el HCA.
Figura 3.13. PCA obtenido con los datos tratados de LC-HRMS (matriz de 173 variables) y HCA.
Los análisis realizados por cromatografía liquida permiten el estudio e identificación de
compuestos de polaridad media – alta, pero también existen reportes de compuestos de
polaridad media – baja que no se pueden analizar por esta técnica analítica, por lo cual
se llevó a cabo una extracción con n-hexano, sobre el extracto etanólico, la cual se
analizó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas GC-MS (Figura
3.14Figura
3.14). Con los datos obtenidos, se construyó una matriz punto a punto
(deconvoluidos en MZmine, escalados, normalizados y alineados en Matlab) de los TIC
generados para cada muestra y una matriz a partir de las señales detectadas
(procesados en MZmine).
Capítulo 3
61
20.0
17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
VEH
VEM2
M
ue
st
ra
VPM
VEH13
VPM13
15
20
25
30
35
Tiempo de Retención (min)
Figura 3.14. TIC para las 28 fracciones hexánicas obtenidas a partir de los extractos etanólicos objeto
de estudio.
Al construir un modelo a través de un PCA se obtuvo el resultado que se presenta en la
Figura 3.15. Allí se puede apreciar que no se presentan conglomerados claros sino
dispersión total de las muestras, por lo cual se hizo un HCA. Con este análisis se
encontró que se presentan grupos con pocas muestras con una gran varianza entre las
mismas, lo cual se puede presentar porque la producción de este tipo de compuestos es
muy dinámica y se producen sin seguir ningún patrón de producción metabólica y
además los metabolitos se encuentran en baja concentración, en algunas muestras,
especialmente las cortezas, de las cuales no se obtuvo cantidad significativa.
Figura 3.15. PCA con diferenciación por color con base en HCA de las fracciones hexánicas
obtenidas de las 28 muestras de estudio.
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
62
Con los datos de cromatografía de gases no fue posible establecer relaciones entre las
muestras de acuerdo a su composición, pero debido a que algunas muestras tienen en
su mayoría metabolitos de baja polaridad, que no se pueden detectar por cromatografía
liquida, parte de la composición esta se estaría obviando, por lo cual, se utiliza otra
técnica analítica, con otro tipo de detección como resonancia magnética nuclear NMR la
cual permite determinar principalmente las señales características de los compuestos
mayoritarios.
Los datos espectroscópicos obtenidos se alinearon utilizando el algoritmo icoshift
(Savorani, Tomasi et al. 2013) el cual toma el un perfil promedio y alinea los datos
generando segmentos, se normalizaron y escalaron en Matlab. Al igual que para los
perfiles obtenidos en cromatografía, los datos espectroscópicos se compararon
gráficamente, encontrando señales en común para algunas muestras Figura 3.16.
23.6
17.7
11.8
5.9
0.0
VCH
VCC
VCM
VEH
VEC
VEM
VPH
VPC
VPM
VCFH
VCFC
VCFM
VEH2
VEM2
VCFH2
VCM2
VCCW D
VCFW D
VEH13
VEC13
VEM13
VPH13
VPC13
VPM13
VCAW D
VCPW D
VCHW D
VCHPL
8
6
4
2
0
ppm
Figura 3.16. Perfiles espectroscópicos 1H-NMR 200 MHz de las muestras de estudio.
Se realizó un PCA con los datos de 1H-NMR diferenciando por color según la parte de la
planta, explicando un 33% de la varianza total de los datos (19006 variables) en los dos
primeros componentes; resultado que se presenta en la Figura 3.17, donde se observa
que la mayoría de los extractos provenientes de corteza presentan un perfil similar, así
como los proveniente de maderas.
Capítulo 3
63
Figura 3.17. PCA con los datos de 1H-NMR de los 28 extractos estudiados. Diferenciación por color
según la parte de la planta, azul claro = arilo, purpura = cascara, rojo=corteza, amarillo=fruto,
verde=hojas, azul=madera, grafica de contribución y Grafica Hotelling’s T2 indicando que muestras
se alejan del modelo creado.
Los extractos de las hojas presentan mayor variación en su composición de metabolitos
mayoritarios por lo cual se presenta la dispersión de las muestras de hojas, y
adicionalmente se puede observar que las hojas presentan composición similar a las
cortezas. Aunque esta técnica permite determinar la presencia de todo tipo de
metabolitos de naturaleza orgánica, no incluye a metabolitos que se encuentran en baja
concentración (Dunn y Ellis 2005, Wishart 2008), lo que no permite un perfilado completo
de las muestras sobretodo en este caso que se quiere presentar un perfilado metabólico
(fingerprinting) cuyo objetivo es obtener una clasificación de muestras de diferente origen
(Dunn y Ellis 2005).
Aunque por separado cada técnica analítica da una gran cantidad de información, reunir
la información que se obtiene en todas las plataformas sin un tratamiento previo
generaría una matriz de gran tamaño en la cual cada variable seria insignificante y en el
análisis estadístico directo se perdería información (Forshed, Idborg et al. 2007,
Richards, Dumas et al. 2010). Existen diferentes técnicas de fusión de datos en
metabolómica las cuales se clasifican en tres niveles, fusión de bajo nivel (datos), fusión
de nivel medio (características), fusión de nivel alto (decisiones). En el primer nivel los
datos son concatenados antes de cualquier tipo de tratamiento dando prioridad o mayor
importancia (peso) a las variables de mayor interés; en el nivel medio la concatenación
se realiza después de una análisis estadístico sencillo que generen combinaciones de
64
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
variables con el fin de tener menor número de las mismas sin perder gran cantidad de
información; el nivel alto, actualmente el menos desarrollado, constituye la fusión de
datos después de generar un modelo por separado para cada fuente (Liu y Brown 2004,
Biancolillo, Bucci et al. 2014).
Para reunir los datos generados en el análisis de los extractos de Virola, se usó un
método de fusión de datos de nivel medio, obteniendo una matriz a partir de los valores
propios para cada muestra en cada modelo generado por PCA con número de
componentes variable explicando mínimo el 80% de la varianza total de los datos con el
fin de minimizar perdida de información, obteniendo así en total 56 variables. En la Figura
3.18, se presenta el resultado del PCA de los datos concatenados, explicando el 30 % de
la varianza total de los datos en los dos primeros componentes, diferenciados por color
según el lugar de recolección. En este análisis se observa un comportamiento similar a
los encontrados en los análisis anteriormente realizados, donde las muestras de Meta se
encuentran en un conglomerado separado de las demás muestras, indicando que existen
factores ambientales que influencian la composición de metabolitos secundarios de las
hojas, y frutos de esta muestra colectada en San Martin, pero la muestra que proviene de
Puerto López se comporta igual que el resto. Así, aunque hay un factor ambiental que
estimula la producción de metabolitos, este solo se hace evidente en ciertos órganos de
la misma. Una de las razones que podría estar influenciando este comportamiento es que
esta es la única muestra que se encuentra con frutos.
Figura 3.18. PCA a partir de la fusión de nivel medio de los datos obtenidos en las diferentes
plataformas analíticas. Diferenciación por color según lugar de recolección Azul = Guaviare, Amarillo
= Vaupés, Rojo= Meta, Verde = Amazonas.
Capítulo 3
65
La composición en general de las muestras objeto de estudio es similar, presentando
pequeñas variaciones, las cuales no están directamente asociadas al lugar de
recolección indicando que hay una parte del metabolismo secundario que podría ser
constante y no estar influenciada por ningún factor ambiental. Dentro de estos
metabolitos podrían encontrarse marcadores quimiotaxonómicos los cuales serían de
gran utilidad en la clasificación taxonómica y diferenciación de plantas del género Virola.
3.4 Conclusiones
El uso de varias técnicas analíticas acopladas al análisis estadístico de datos
multivariados permite obtener una mayor cantidad de información, la cual permite la
caracterización y diferenciación de las mismas con base en diferentes parámetros. Lo
anterior permite crear modelos multivariados más confiables. Así, la cromatografía
acoplada a DAD permite determinar que muestras poseen compuestos con cromoforos
de interés, la cromatografía de gases permite caracterizar la fracción de baja polaridad de
las muestras, la cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas permite bajo
las condiciones aquí utilizadas, el análisis de compuestos de polaridad media- alta y la
resonancia magnética el análisis de compuestos mayoritarios, información que permite
obtener un perfilado metabólico (fingerprinting) y determinar información generalizada de
los extractos de plantas del genero Virola .
A partir de los análisis cromatográficos se puede observar similitud entre extractos
provenientes de la misma parte de la planta sin importar el lugar de recolección, lo cual
indica que existen grupos de metabolitos fijos que se almacenan en ciertos lugares de la
planta ya sea para su protección contra patógenos o animales; sin embargo, el lugar de
recolección influye parcialmente, para generar diferencias significativas entre muestras
colectadas en cada uno de los departamentos.
Las muestras que se diferencian más del grupo de 28 extractos son las provenientes de
la única planta que tenía frutos en el momento de la recolección indicando que la
composición
respecto
a
metabolitos
secundarios
en
este
estadio
cambia
significativamente, pero esto no se puede comprobar debido a que no hay entre las
muestras otras con tales estadios fértiles.
66
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
El tratamiento de los datos de LC-LRMS y LC-HRMS con MZmine, aunque permite
eliminar falsos iones que pueden generar interferencias en el análisis estadístico,
también en algunos casos puede eliminar señales de compuestos en baja proporción
llevando a pérdidas de información. Así, los resultados del análisis estadístico difieren en
gran medida entre los datos totalmente tratados y los datos punto a punto los cuales han
sido sometidos a corrección de línea base. Los dos métodos de análisis permiten
diferenciar las muestras de estudio, aunque los resultados no son comparables.
El uso de varias técnicas analíticas permite obtener una gran cantidad de información,
pero ésta no es totalmente aprovechada si no se reúne en un solo modelo que permita
correlacionar las diferentes variables evaluadas. La fusión de nivel medio de datos en
este modelo en particular permitió corroborar los resultados encontrados a partir de los
datos de LC-DAD, LC-LRMS, LC-HRMS y 1H-NMR, aunque que los obtenidos por GCMS no presentaban el mismo comportamiento, no influyeron en el resultado final de la
fusión.
3.5 Bibliografía
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Capítulo 3
67
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4. Capítulo. 4. Perfilado
metabólico
no
dirigido
en
ambiente
supervisado:
identificación de compuestos antifúngicos
en plantas del género Virola.
4.1 Introducción
En la literatura científica es posible encontrar que extractos de plantas del género
Virola son utilizados tradicionalmente para el tratamiento de varias enfermedades, entre
las que se cuenta aquellas propiedades relacionadas con procesos infecciosos y
actividad antimicrobiana (Zacchino, Rodríguez et al. 1997, Sartorelli, Young et al. 1998,
Zacchino, Rodrıguez et al. 1998, Lopes, Kato et al. 1999, Rojas, Bustamante et al. 2003).
El escenario convencional de validar tales informaciones de uso tradicional parte del
hecho de determinar qué compuestos son los responsables de la actividad, lo cual
resulta ser un proceso que incluye el aislamiento y la caracterización de los bioactivos y,
en ocasiones, cuando se lleva a cabo el aislamiento de los mismos, se puede generar
una pérdida de la actividad biológica, ya que no necesariamente un solo compuesto
puede ser el responsable de una respuesta biológica. Por tanto, en tales situaciones se
requiere establecer una estrategia de evaluación que permita identificar el o el grupo de
compuestos
responsables
de
la
actividad.
Una
estrategia
recurrente
es
el
fraccionamiento biodirigido, que lleva paso a paso la separación e identificación de los
bioactivos. No obstante, tal proceso resulta demorado y costoso, pues requiere una
disponibilidad permanente del bioensayo. En los últimos años, con el desarrollo de
técnicas en perfilado metabólico (Harvey et al., 2015), se ha planteado un nuevo enfoque
en el que se relaciona la composición química de un extracto con su actividad biológica,
el cual se ha definido como un procedimiento muy llamativo por sus ventajas
relacionadas con el menor tiempo y costo.
70
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Para establecer una correlación composición-actividad es necesario determinar qué
variables están involucradas; la relación entre una variable independiente como la
composición (ausencia o presencia de compuestos y su concentración/proporción) y la
actividad biológica se puede determinar sin necesidad de aislar los metabolitos, utilizando
herramientas estadísticas como la regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS), que
permite analizar muchas variables correlacionadas o no al mismo tiempo y obtener
modelos con buen poder de predicción eliminando la información de menor relevancia y
maximizando aquella que evidencia una relación entre variables independientes y una o
más variables dependientes (Glen, Dunn III et al. 1989, Danvind 2002). Esta predicción
es llevada a cabo mediante la extracción de predictores o un conjunto de factores
ortogonales (variables latentes) los cuales tienen mejor poder de predicción, obteniendo
una ecuación como se presenta en la Ecuación 4.1 donde X son las variables
independientes, Y las variables dependientes y C un coeficiente el cual puede ser
positivo o negativo según la relación de las mismas (Abdi 2003).
Y = C1 X1 + C1X2 + C3X3+ …. + CnXn
Ecuación 4.1
Las variables dependientes a predecir o categorizar no son necesariamente
continuas, pues se pueden realizar análisis utilizando como variable de tipo categórico
(como el lugar de recolección) dando lugar a una regresión por mínimos cuadrados
parciales con análisis discriminante PLS-DA que permite la asignación de uno o varios
grupos previamente definidos. Este proceso resulta en un modelo de gran utilidad cuando
se pretende establecer trazabilidad del lugar de origen de una muestra (Díaz Monroy y
Morales Rivera 2012, Kumar, Bansal et al. 2014).
En la actualidad, los hongos fitopatógenos son objeto de investigación debido a los
importantes daños que ocasionan a cultivos y alimentos, generando grandes pérdidas
principalmente a los agricultores. Esto sumado a la resistencia generada por los
microorganismos debido al uso indiscriminado de plaguicidas, convierten a los hongos en
un problema de talla mundial (Dean, Van Kan et al. 2012). Dentro del grupo de hongos
fitopatógenos de mayor importancia se encuentra Fusarium oxysporum, un hongo
cosmopolita que afecta a más de 100 especies de plantas, entre ellas, algunas de
importancia económica como el clavel, rábano y tomate; ataca los tejidos conductores de
la planta (xilema) provocando el marchitamiento de las hojas, defoliación, retraso en el
Capítulo 4
71
crecimiento, necrosis y eventualmente muerte total de la planta (Fravel, Olivain et al.
2003, Pawar y Thaker 2007, Dean, Van Kan et al. 2012).
Por todo lo anterior, en el marco de la búsqueda de entidades químicas antifúngicas
de origen natural contra F. oxysporum y, teniendo en cuenta las propiedades
antimicrobianas reportadas para especies del género Virola, en el presente capítulo se
expone el estudio realizado, con base en el perfilado metabólico dirigido de especies de
este género en ambiente supervisado con la actividad biológica como parámetro de
correlación de composición y actividad, con el propósito de identificar bioactivos
antifúngicos, que servirán de moléculas objetivo (o hits) para posteriores estudios.
4.2 Metodología
4.2.1 Análisis Cromatográficos y espectroscópicos
Los análisis cromatográficos (LC-DAD, LC-LRMS y LC-HRMS) y espectroscópicos
(1H-NMR) se realizaron según la metodología previamente descrita en el Capítulo 3.
4.2.2 Aislamiento de Metabolitos del extracto de Hojas de V.
carinata
A partir de los perfiles cromatográficos y el análisis multivariado, se escogió el extracto de
hojas de V. carinata (VcH) para el aislamiento e identificación de metabolitos. El
aislamiento se realizó principalmente por cromatografía en columna (CC), usando sílica
gel 60 (0,063-0,200 mm, 70-230 mesh ASTM) como fase estacionaria y fase móvil según
se indica en la Figura 4.1. Los compuestos obtenidos se utilizaron como estándares para
derreplicación/comparación en los demás extractos.
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
72
Figura 4.1 Metodología de Aislamiento de Metabolitos a partir del extracto de V. carinata Hojas (VcH)
4.2.3 Identificación de Metabolitos
Para el proceso de elucidación estructural fueron utilizados los espectros de resonancia
magnética nuclear 1H y
13
C así como los experimentos unidimensionales (DEPT 135) y
bidimensionales (COSY, HMQC y HMBC) tomados en un equipo Bruker Avance III 500
MHz utilizando disolventes deuterados (CDCl 3 y CD3OD) (Anexo C).
4.2.4 Ensayo de actividad antifúngica por método de medio
suplementado.
La evaluación de la actividad antifúngica in vitro se realizó siguiendo metodología
propuesta por Keinath y Zitter 1998; en cajas de 2 cm de diámetro, se dispuso medio de
cultivo PDB (Potato dextrose broth) enriquecido con diferentes concentraciones del
extracto (10, 1.0, 0.1 mg/mL) y un control sin extracto; se inoculó un plug del hongo
obtenido a partir de un aislamiento monospórico activado en PDA proporcionado por el
Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Militar Nueva Granada. Las cajas se
incubaron a temperatura ambiente hasta que el micelio del control alcanzó el borde del
pozo; se estimó el porcentaje de inhibición por comparación con el área de crecimiento
miceliar en el control por medio de la Ecuación 4.2. Este ensayo se llevó a cabo por
triplicado.
%𝑰𝒏𝒉𝒊𝒃𝒊𝒄𝒊ó𝒏 = 𝟏𝟎𝟎 − (
(𝑨𝒓𝒆𝒂 𝑻𝒓𝒂𝒕𝒂𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐×𝟏𝟎𝟎)
𝑨𝒓𝒆𝒂 𝒅𝒆𝒍 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍
)
Ecuación 4.2
Capítulo 4
73
4.2.5 Análisis Estadístico
Para el análisis de los datos, inicialmente se hicieron pruebas de normalidad, test de
ANOVA y Tukey para los datos de actividad antifúngica (Anexo D) con el software de
libre distribución R Project. Los análisis supervisados se realizaron por medio de análisis
de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS) en el Software Simca 13 de
Umetrics, utilizando como variables independientes los datos cromatográficos y
espectroscópicos y como variable de supervisión o dependiente la actividad antifúngica
(% Inhibición) a 1.00 mg/mL de concentración de extracto. También se llevó a cabo una
regresión por OPLS con análisis discriminante (DA) respecto al lugar de recolección en
Simca 13 de Umetrics.
4.3 Resultados y discusión
4.3.1 Actividad antifúngica contra F. oxysporum de extractos
etanólicos de especies de Virola.
Los resultados del ensayo de actividad antifúngica (Figura
4.2) muestran que los
extractos derivados de las plantas del género Virola evaluadas presentan un
comportamiento dependiente de la dosis. Entre ellos, los extractos VcM y VpC no
presentan inhibición a una concentración de 0.01 µg/mL. El máximo porcentaje de
inhibición corresponde al extracto de VcM2 a 1.00 µg/mL, llegando a inhibir en un 93,65
% el crecimiento del hongo. Este valor de inhibición es considerado un resultado
promisorio en la búsqueda de activos antifúngicos, teniendo presente que se está
realizando una evaluación de un extracto etanólico sin ningún tipo de fraccionamiento.
Para algunos extractos, como VpM y VpM13 se observa que a la mayor concentración
hay una ligera menor inhibición del crecimiento. Este comportamiento es debido a un
fenómeno conocido como hormesis (Garzón y Flores, 2013), el cual se considera como
resultado de la defensa del hongo en respuesta a dosis altas del extracto. Por otro lado,
es posible ver que para algunos extractos no hay cambio en el porcentaje de inhibición
respecto al cambio significativo en la concentración, tal y como ocurre para el extracto
VcfH.
74
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Figura 4.2 Resultados de ensayo de inhibición del crecimiento miceliar de F. oxysporum a tres
concentraciones diferentes (1.00 µg/mL, 0.1 µg/mL y 0.001 µg/mL).
Al observar el efecto de los extractos sobre los hongos a partir de fotografías al
microscopio, es posible ver que debido a la presencia del extracto (como el ejemplo de la
Figura 4.3, tomando el resultado del extracto VeM2) el crecimiento de las hifas del hongo
a concentración de 0,01 µg/mL se presenta desordenado en comparación con el control,
indicando que a esta concentración, aunque no inhibe el crecimiento, el extracto tiene un
efecto inicial sobre el hongo, generando una disminución de la producción de hifas a
medida que incrementa la concentración del extracto. En otros casos (VcCWD, VcfH2,
VeH2 y VcFWD además de VeM2) las hifas también se vieron afectadas en su
morfología (mostrando hinchazón, nodulación y distorsiones), indicando así mismo que
los extractos tenían efectos tóxicos sobre el hongo acompañando la inhibición del
crecimiento micelial.
Figura 4.3 Resultado del ensayo antifúngico en medio suplementado con VeM2 (arriba) y fotografía al
microscopio con ampliación 40x. De izquierda a derecha: Control, 0.001 µg/mL, 0.1 µg/mL, 1.00 µg/mL.
Capítulo 4
75
4.3.2 Perfilado metabólico con supervisión utilizando una sola
variable continúa.
Encontrar una relación entre la composición y la actividad no es posible con datos
tratados y analizados por separado. Por lo cual se realizó el análisis conjunto entre la
actividad antifúngica a 1.00 µg/mL como variable de supervisión o dependiente (a esta
concentración se presenta mayor desviación estándar en los valores obtenidos) y los
perfiles cromatográficos y espectroscópicos por medio de una regresión por OPLS, la
cual mostró una distribución de los extractos de acuerdo a su actividad, la cual varía
según la técnica utilizada. En la Figura 4.4 se presentan los resultados de los análisis de
la regresión por OPLS con los datos de LC-DAD, LC-LRMS, LC-HRMS y 1H-NMR. Cada
técnica muestra una tendencia ligeramente diferente, lo cual es debido a que la presencia
de variables diferentes. Sin embargo, en todas es posible encontrar diferencias entre las
muestras con mayor y menor actividad las cuales se encuentran diferenciadas según la
escala de color a la derecha de cada análisis, donde inhibición cercana al 100% se
presenta de color rojo, y muestras con baja actividad (inhibición cerca al 0%) se
presentan de color azul. En todos los casos se muestra que la actividad puede
correlacionarse muy bien con la composición de los extractos, indicando así que el mayor
porcentaje de inhibición de los extractos más activos puede deberse a la presencia de
componentes mayoritarios bioactivos.
a.
c.
b.
d.
76
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Figura 4.4. Regresión por OPLS, con los datos obtenidos por técnicas cromatográficas y
espectroscópicas usando como variable de supervisión el % de Inhibición de los extractos a 1.00
µg/mL. a. LC-DAD b. LC-LRMS c. LC-HRMS d. 1H-NMR
Por lo tanto, con la regresión por OPLS es posible determinar qué señales en los
cromatogramas o espectros están relacionadas con una mayor actividad antifúngica. En
la Figura 4.5 se presenta la gráfica S-Line para la regresión por OPLS de los datos de
LC-DAD, utilizando como variable de supervisión el % inhibición a 1.00 µg/mL. Este
gráfico indica que las señales arriba de la línea horizontal son aquellas que se relacionan
en mayor medida con las muestras de mayor actividad (coeficientes positivos en la
Ecuación 4.1) y, las que están debajo de la horizontal, se relacionan con muestras con
menor actividad (coeficientes negativos en la Ecuación 4.2); de esta forma, a partir de
este modelo se puede decir que los extractos que presenten en su perfil señales al final
del cromatograma (mediana polaridad, según el S-Line, cercanas a 52, 56, 67 y 68
minutos) tiene una mayor probabilidad de inhibir el crecimiento de F. oxysporum.
Cuando se comparan los datos del S-Line con los cromatogramas de las muestras más y
menos activas, es posible observar que las señales mayoritarias en el perfil de VcM2
(más activo, en rojo) corresponden a aquellas señales con mayor relación a la actividad
antifúngica y estas no están presentes en la muestra VcfM (menos activo, en azul), lo
que permitiría racionalizar su baja actividad.
Figura 4.5 Grafica S-line de la regresión por OPLS de los datos obtenidos por LC-DAD (arriba)
respecto al cromatograma de la muestra más activa VcM2 y la menos activa VcfM (abajo).
Capítulo 4
77
La desventaja de realizar este análisis con datos provenientes de LC-DAD es que no es
posible saber si cada pico está haciendo referencia a un solo compuesto o a un grupo de
metabolitos que coeluyen; además no se proporciona información acerca de la identidad
de estos si no se dispone de estándares. No obstante, el uso de perfiles bajo detección
por UV-Vis sirve para hacer un tamizaje inicial, a menor costo de equipamiento, con el fin
de establecer qué señales correlacionan con los extractos más activos.
Figura 4.6 Grafica S-line de la regresión por PLS de los datos obtenidos por LC-HRMS (arriba)
respecto al cromatograma de la muestra más activa VcM2 y la menos activa VcfM (abajo).
En este sentido, un análisis con datos de espectrometría de masas permitiría obtener
información estructural de los metabolitos correlacionables con la actividad antifúngica.
No obstante, dadas las limitaciones conocidas, con los datos obtenidos por LC-LRMS no
fue posible diferenciar entre aquellos con masa molecular muy cercana, además la
resolución del equipo no permitió realizar una identificación tentativa más confiable. Por
lo tanto, los datos de LC-HRMS se trataron con una regresión por OPLS donde se
observan diferencias entre las muestras por su actividad (Figura 4.4 c), siendo esta la
técnica donde se presenta la mayor dispersión. De igual manera, se generó la gráfica SLine (Figura
4.6) indicando las variables o señales características de promisorios
antifúngicos, en este caso, principalmente compuestos presentes en la zona media del
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
78
cromatograma como componentes del extracto más activo, como se observa en la
comparación en la Figura 4.6.
Los metabolitos relacionados con alta y baja actividad se identificaron tentativamente por
comparación de su relación m/z en cada punto (basado en los resultados de la
deconvolución de los datos originales) en comparación con la información encontrada en
artículos publicados y bases de datos. En la identificación tentativa se tuvo en cuenta que
los metabolitos hubieran sido aislados previamente de plantas del género Virola o de
otros géneros de la misma familia.
En la Tabla 4.1 se presentan las señales de interés de acuerdo al S-Line; la identificación
se realizó utilizando el software Data Analysis 4.2 de Bruker para la determinación de la
fórmula molecular, a partir de la cual se usaron dos bases de datos KNApSAcK
(http://kanaya.naist.jp/knapsack_jsp/top.html) , y Dictionary of Natural Products Online
(http://dnp.chemnetbase.com/dictionary-search.do?method=view&id=6827740&si=) para
la búsqueda de coincidencias.
Tabla 4.1 Identificación tentativa de metabolitos de interés de acuerdo al análisis por regresión OPLS
de los datos LC-HRMS
N°
1
2
3
4
tRet
(min)
15.43
18.12
20.47
22.85
m/z
[M + H]+
191.0352
242.2834
301.0699
285.0738
5
6
23.20
23.87
7
25.60
8
25.90
9
27.02
299.0896
301.0686
269.0788
313.1050
287.1272
325.1414
135.0427
285.0740
10
27.50
11
12
29.5
32.81
305.1364
283.0950
241.0764
203.0694
203.1057
13
37.60
345.1713
Identificación
----hidroxibiochanina A
biochanina A o
xenognosina B
Compuesto C5
hidroxybiochanina A
formononetin
trimetoxiflavona
virolano
cagayanina
-biochanina A
xenognosina B
virolanol C
dimetoxiflavona
hidroxiflavanona
6-hidroxi-3,4-dihidro-1-oxo-β-carbolina
6-hidroxi-1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-βcarbolina
oleiferina F
Fórmula
Molecular
C16H12O6
C16H12O5
C17H14O5
C16H12O6
C16H12O4
C18H17O5
C17H18O4
C20H20O4
C16H12O5
C17H20O5
C17H14O4
C15H12O3
C11H10N2O2
C12H14N2O
C20H24O5
Capítulo 4
79
325.1419
203.1056
14
38.75
15
16
17
18
2.03
3.02
3.58
13.18
19
20
21
18.71
20.85
30.61
22
36.85
188.0823
339.1576
308.1386
209.1193
192.1042
174.1476
438.2384
292.2011
296.1027
255.1128
271.1384
137.0581
175.1208
301.1394
149.0217
cagayanina
6-hidroxi-1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-βcarbolina
---isoelemicina
-----4,7-dimetoxi-1-vinil-β-carbolina
trimetoxiestilbeno
-N-metiltriptamina
---
C20H20O4
C12H14N2O
--
C12H16O3
C15H14N2O2
C17H18O3
C11H14N2
Debido a que se encuentran isómeros (valores casi idénticos de [M+H] +, verificadas con
http://www.sisweb.com/referenc/tools/exactmass.htm),
no
es
posible
afirmar
qué
metabolito está presente. Ejemplo de esto son las hidroxiflavanonas y dimetoxiflavonas,
las cuales son abundantes en plantas del genero Virola (Martın
́ ez Valderrama 2000), y
por lo tanto, dada esta limitación de la técnica, su identificación solo se hizo de forma
generalizada al núcleo. En el grupo de compuestos identificados como correlacionables
con la actividad se presentan varios metabolitos previamente reportados con actividad
antifúngica como hidroxiflavanonas, dimetoxiflavonas y biochanina A (Lopes, Kato et al.
1999) y oleiferina F (Sartorelli, Young et al. 1998). Esto permite de cierta manera
fundamentar el modelo creado, a partir del cual es posible identificar otros metabolitos
como flavonoides y lignanos encontrados y no reportados como antifúngicos, o llevar a
cabo un aislamiento guiado por estadística multivariada. Así mismo, permite determinar si
una muestra puede o no ser activa con una prueba preliminar que permite obtener,
además, información acerca de la composición.
Completando el análisis supervisado, se tomaron como variables dependientes los datos
de los perfiles espectroscópicos de los extractos. NMR se podría considerar como una
técnica costosa, no obstante aporta información estructural mucho más certera pese a su
baja sensibilidad. Por tanto, con los datos de los espectros 1H-NMR se prosiguió a
80
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
determinar, como en el caso de los datos cromatográficos, si existe una relación entre las
señales características y la actividad antifúngica.
Figura 4.7. Grafica S-line de la regresión por PLS de los datos obtenidos por 1H-NMR (arriba)
respecto al espectro de la muestra más activa VcM2 y la menos activa VcfM (abajo).
En el resultado de la regresión por OPLS en la Figura 4.4 d. se presentan diferencias
entre muestras de acuerdo a la inhibición del crecimiento del hongo, y en el
correspondiente S-Line aparecen señales que se relacionan con la actividad. Al comparar
con la muestra más activa, estas no corresponden a las de mayor intensidad en dicha
muestra, esto debido a que los compuestos activos no necesariamente son los
mayoritarios en el extracto. De esta manera, se puede considerar que esta técnica, para
el caso específico de extractos etanólicos de Virola en las condiciones de análisis
utilizadas, no permite establecer relaciones claras en el modelo planteado para encontrar
compuestos promisorios como antifúngicos.
4.3.3 Estudio comparativo
A partir del extracto de V. carinata hojas, se aislaron 4 flavonoides estrechamente
relacionados estructuralmente: C5, D5, D8 y D10 (cuya elucidación estrutural se
encuentra en el Anexo C), los cuales se usaron como patrones para determinar su
Capítulo 4
81
presencia, por derreplicación, utilizando LC-HRMS (Ver Figura 4.8), en los restantes 28
extractos evaluados. Mediante este análisis se encontró que C5 solo se encuentra
presente en VcH y VcM, D5 y D8 solo se encuentran en VcH, y D10 se encuentra en
VcH, VeM2, VcM2 y VcM. De los compuestos aislados, únicamente para C5 presentó
correlación con la actividad antifúngica en el análisis por OPLS.
Figura 4.8. Cromatograma con los 4 flavonoides aislados usados para derreplicación.
4.3.4 Perfilado metabólico con análisis discriminante
Además de predecir la actividad (variable continua), los métodos supervisados ayudan en
la clasificación de muestras respecto a variables categóricas como el lugar de
recolección; para los extractos aquí evaluados se determinó, en el Capítulo 3, que la
composición no era completamente dependiente del lugar de recolección pero este se
puede determinar a partir de pruebas químicas, lo cual constituye una ayuda cuando se
desconoce esta información. Para este fin, se generó un modelo a partir de una regresión
OPLS y un análisis discriminante (DA). En la Figura 4.9, se observan los resultados de
la regresión siendo la técnica más apropiada para diferenciar entre grupos (Amazonas,
Guaviare, Meta, Vaupés) aquella que presenta una mayor varianza entre los mismos, es
decir, gráficamente, hay más distancia entre conglomerados (Díaz Monroy y Morales
Rivera 2012).
82
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
a.
b.
c.
d.
Figura 4.9. Análisis de regresión por OPLS-DA a. LC-DAD, b. LC-LRMS, c. LC-HRMS, d. 1H-NMR.
Muestras diferenciadas por color según el lugar de recolección: Amazonas = Verde, Guaviare = Azul,
Meta = Rojo y Vaupés= Amarillo.
El modelo generado con los datos de LC-LRMS, Figura
4.9 b., permite diferenciar
claramente entre lugares, mostrando además que existe un comportamiento similar entre
muestras provenientes del Amazonas y el Vaupés. Respecto a las otras técnicas, LCDAD permite diferenciar únicamente las muestras provenientes del Meta, pero hay una
varianza muy alta entre los extractos de este grupo, lo que le quita capacidad de
predicción al modelo. Por otro lado, se esperaba que LC-HRMS tuviera una tendencia
similar a LC-LRMS, pero por esta técnica dos muestras no se pueden discriminar
claramente (VccWD y VcHPL), creando un conglomerado con muestras de tres lugares
diferentes igual que en el caso de LC-DAD, lo cual le quita capacidad de predicción al
modelo generado. En el caso de la regresión utilizando los datos de 1H-NMR, la varianza
entre grupos es demasiado baja y crea zonas en donde se cruzan lo cual limita la
clasificación de los mismos mostrando que, usando los datos crudos para 1H-NMR, se
limita a la técnica para este tipo de análisis.
4.4 Conclusiones
A partir de estos modelos OPLS es posible predecir la capacidad de una muestra de
inhibir el crecimiento de F. oxysporum, lo cual permite generar mayor cantidad de
información acerca de la relación entre la composición y la actividad de las plantas del
Capítulo 4
83
género Virola. Esto hace posible realizar una discriminación inicial de extractos a partir de
pruebas químicas en un proceso racional de selección cuando se presentan una gran
cantidad de muestras y no es posible, por ejemplo, determinar la actividad de todas.
Como se observa, la actividad podría deberse a la mezcla de varios compuestos, una de
las razones por las cuales un modelo como el presentado permite la identificación de
bioactivos a través de mezclas de metabolitos activos. Esto en principio es beneficioso en
términos de procesos sinérgicos, dado que cada compuesto puede tener un mecanismo
de acción diferente, lo que limitaría en gran medida la generación de resistencia. Así, los
compuestos promisorios correlacionables con la actividad antifúngica fueron identificados
tentativamente como: hidroxibiochanina A, Compuesto C5, hidroxybiochanina A,
formononetin, trimetoxiflavona, virolano, cagayanina, biochanina A, xenognosina B,
virolanol C, dimetoxiflavona, hidroxiflavanona, 6-hidroxi-3,4-dihidro-1-oxo-β-carbolina, 6hidroxi-1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-β-carbolina, oleiferina F y 6-hidroxi-1-metil-1,2,3,4tetrahidro-β-carbolina.
Hay que tener en cuenta que cada técnica analítica requiere un tratamiento previo de la
muestra para obtener información relevante, como es el caso de 1H-NMR, la cual es útil
cuando se tienen fracciones poco complejas o más o menos depuradas, pues señales
con mayor acumulación o integración limitan la sensibilidad de la técnica, lo que se
traduce en pérdida de información.
Los métodos supervisados no solo permiten predecir variables continuas, sino realizar
una discriminación con base en variables categóricas. Por tanto, es posible inferir que
una parte, producto del metabolismo de las plantas del genero Virola, se ve afectada por
factores medioambientales de acuerdo al lugar de recolección, lo cual habilita la
clasificación de extractos que llevaría a trazar el origen de muestras en caso tal de
desconocer dicha información.
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Capítulo 4
85
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of
Myristicaceae."
Journal
of
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones
La cuantificación de metabolitos, como en este caso fenoles y flavonoides, y la
evaluación de la capacidad antioxidante, permite llevar a cabo un análisis estadístico
tomando estas propiedades químicas como variables de caracterización que permiten
realizar una discriminación de las muestras de estudio. Así, altos contenido de
flavonoides se presentan en las hojas y altos contenidos de fenoles en las cortezas
independientemente de especie o lugar de colección.
El gran número de datos suministrados por técnicas analíticas como LC-DAD, LC-MS,
GC-MS y NMR, se puede simplificar usando análisis estadístico de datos multivariados
para substraer mayor cantidad de información a partir de la cual se lleva a cabo la
caracterización y diferenciación de las muestras con base en diferentes parámetros. El
uso de herramientas estadísticas permite crear modelos para el análisis futuro de un gran
número de muestras simultáneamente, como el caso aquí presentado, en el cual se
obtiene información de 28 extractos diferentes y cómo estos se relacionan unos respecto
a los otros, encontrando que existen similitudes en la composición de aquellos
provenientes de la misma parte de la planta sin importar el lugar de recolección. Lo
anterior indica que algunos metabolitos se producen no necesariamente como respuesta
a un estímulo medioambiental, sin descartar, que el lugar de recolección influya en la
producción de otros compuestos, permitiendo al mismo tiempo obtener un modelo que
permite determinar el lugar de procedencia a partir de una prueba química.
Los altos %inhibición (superiores al %60) sobre el crecimiento miceliar de F. oxysporum
de los extractos VeM2, VcfH, VeC y VeC13 los presenta como promisorios antifúngicos.
Teniendo en cuenta que se evaluó un extracto etanólico completo, se puede inferir que
tales extractos se componen de metabolitos mayoritarios activos o minoritarios muy
activos que, individualmente o en conjunto, podrían considerarse en futuros estudios para
su aislamiento. En tal contexto, mediante el análisis supervisado, tales compuestos
88
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
objetivo para esos estudios futuros serían aquellos compuestos promisorios encontrados
como aquellos correlacionables con la actividad antifúngica, los cuales fueron
identificados
tentativamente
como:
hidroxibiochanina
A,
Compuesto
C5,
hidroxybiochanina A, formononetin, trimetoxiflavona, virolano, cagayanina, biochanina A,
xenognosina B, virolanol C, dimetoxiflavona, hidroxiflavanona, 6-hidroxi-3,4-dihidro-1oxo-β-carbolina, 6-hidroxi-1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-β-carbolina, oleiferina F y 6-hidroxi-1metil-1,2,3,4-tetrahidro-β-carbolina.
El uso de técnicas de análisis estadístico de datos multivariados, además de simplificar la
información, facilitar la interpretación de datos y permiten encontrar relaciones entre
diferentes variables, como la composición y la actividad, ayudando a crear un modelo de
clasificación o discriminación de muestras basados en varias características/propiedades
de las mismas en un proceso racional de selección.
5.2 Recomendaciones
Para mejorar y hacer aún más confiable los modelos generados, se recomienda ampliar
el número de muestras incluyendo un número mayor de especies diferentes, esto con el
fin de mejorar la población mediante un muestreo representativo.
Se recomienda continuar con la purificación de compuestos, en especial aquellos que
presentan una alta correlación con la actividad y no se identificaron, así como realizar la
evaluación independiente o en conjunto de la actividad antifúngica de estos y otros ya
aislados y así corroborar/validar la información encontrada a partir del análisis
estadístico. Adicionalmente, realizar otros estudios de actividad biológica para determinar
si es posible encontrar compuestos promisorios cuando se tiene una variable de
supervisión diferente a partir de los datos de composición aquí generados.
Con el objetivo de reunir la mayor cantidad de información en un solo análisis se
recomienda utilizar otras metodologías de fusión o concatenación de información ya sean
de nivel medio o incluso de nivel alto.
5.3 Productividad Científica
5.3.1 Participación en Eventos
15th Annual Meeting of the American Society of Pharmacognosy - Julio 14 al 17 de
2013 - St Louis, Missouri EE.UU
Conclusiones
89
Luisa Lorena Orduz Diaz, Luis Cuca Suarez, Ericsson David Coy Barrera, "A Novel
Flavone, LC-MS-Based Profiling, Phenol and Flavonoid Content, and Antioxidant Activity
of Virola carinata" (Poster)
61st International Congress and Annual Meeting of The Society for Medicinal Plant
and Natural Product Research (GA) - Septiembre 1 al 5 de 2013. Münster,
Alemania
Luisa Lorena Orduz Diaz, Luis Cuca Suarez, Ericsson David Coy Barrera, "Virola plants
from
colombian
amazon;
LC-DAD
and
LC-MS-based
chemical
profiling
and
antileishmanial and cytotoxic activities" (Poster)
4th Brazilian Conference on Natural Products (BCNP) and the XXX Annual Meeting
on Micromolecular Evolution, Systematics and Ecology (RESEM). Octubre 28 al 31
de 2013 - Natal, Rio Grande do Norte – Brasil
Luisa Lorena Orduz Diaz, Luis Cuca Suarez, Ericsson David Coy Barrera “LC-DAD and
LC-MS-based chemical profiling and antioxidant, antileishmanial and cytotoxic activities
from Virola plants from Colombian Amazon” (Poster)
4th International Congress of Ethnopharmacology ISE 2014 y VIII Simposio
Internacional de Química de Productos Naturales y sus aplicaciones - Septiembre
23 al 26 de 2014 - Puerto Varas- Chile
Luisa Lorena Orduz Diaz, Luis Cuca Suarez, Ericsson David Coy Barrera “Extracts of
plants of the Virola genus from the Colombian Amazon: their chemical profiles and the
promising antifungal activity against Fusarium oxysporum “(Poster)
XXIV SILAE Congreso Italo-Latinoamericano de Etnomedicina 8 - 12 septiembre
2015 Punta Cana, República Dominicana
Luisa Lorena Orduz Diaz, Luis Cuca Suarez, Ericsson David Coy Barrera “Antifungal
activity of Virola plants against Fusarium oxysporum” (Poster)
5th Brazilian Conference on Natural Products (BCNP) and the XXX Annual Meeting
on Micromolecular Evolution, Systematics and Ecology (RESEM). Octubre 26 al 29
de 2015 – Atibaia- SP/Brasil
90
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Luisa Lorena Orduz Diaz, Luis Cuca Suarez, Massuo J. Kato, Lydia F. Yamaguchi,
Ericsson David Coy Barrera “Virola PLANTS FROM COLOMBIAN AMAZON; LC-HRMS,
1
H-NMR,
ACTIVITY”
AND
GC-MS-BASED
CHEMICAL
(Presentación
PROFILING
Oral
AND
y
ANTIFUNGICAL
Poster)
A.
Anexo: Curvas de Calibración
métodos cuantitativos.
Para fenoles totales se construyó la curva a partir de una disolución stock de 200 ppm de
Acido Gálico y se evaluaron en total 7 concentraciones (0, 1.00, 2.00, 5.00, 8.00, 12.00,
14.00 ppm) cada una por quintuplicado siguiendo la metodología descrita en el ítem
2.2.3. La ecuación de la recta se presenta en la Figura A1.
Figura A1. Curva de calibración construida para la cuantificación de fenoles totales, usando Acido
Gálico como patrón.
Para flavonoides totales se construyó la curva a partir de una disolución stock de 200
ppm de Quercetina y se evaluaron en total 7 concentraciones (0, 2.00, 4.00, 7.00, 8.00,
11.00, 13.00 ppm) cada una por quintuplicado siguiendo la metodología descrita en el
ítem 2.2.4. La ecuación de la recta se presenta en la Figura A2.
92
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Figura A2. Curva de calibración construida para la cuantificación de flavonoides totales, usando
Quercetina como patrón.
Para la determinación de poder reductor por el método FRAP se construyó la curva a
partir de una disolución stock de 5 mM de TROLOX y se evaluaron en total 11
concentraciones (0, 0.0250, 0.0500, 0.0750, 0.1000, 0.1250, 0.1500, 0.1750, 0.2000,
0.2250, 0.2500 mM) cada una por quintuplicado según al metodología descrita en el ítem
2.2.7. La ecuación de la recta se presenta en la Figura A3
Figura A3. Curva de calibración construida para la cuantificación de evaluación del poder reductor,
usando TROLOX como patrón.
Anexos
93
B. Anexo: Análisis estadístico de
datos cuantitativos
Análisis estadístico de Normalidad, ANOVA y Tukey para los datos obtenidos en la
cuantificación de fenoles totales.
Shapiro-Wilk normality test
W = 0.9901, p-value = 0.7769
Datos normales.
Análisis de la varianza
Variable N
R²
FENOLES 84 1.00
R² Aj CV
0.99 6.03
Cuadro de Análisis
F.V.
SC
Modelo. 2185029.70
Muestra 2185029.70
Error
10735.09
Total
2195764.79
de la Varianza
gl
CM
F
p-valor
27 80927.03 422.16 <0.0001
27 80927.03 422.16 <0.0001
56
191.70
83
Test:Tukey Alfa=0.05 DMS=44.20977
Error: 191.6980 gl: 56
Muestra Medias n E.E.
VCAWD
5.56 3 7.99 A
VCPWD
16.34 3 7.99 A B
VCHWD
21.96 3 7.99 A B
VCFWC
21.97 3 7.99 A B
VEH
54.47 3 7.99
B C
VEM
67.59 3 7.99
C D
VPH13
68.50 3 7.99
C D
VEH13
74.19 3 7.99
C D
VCHPL
86.99 3 7.99
C D
VEH2
104.09 3 7.99
D
VCFH
143.09 3 7.99
VEM2
181.25 3 7.99
VPH
213.06 3 7.99
VPM
220.36 3 7.99
VCFH2
250.70 3 7.99
VCH
253.34 3 7.99
VCM
272.19 3 7.99
VEM13
278.66 3 7.99
VPM13
297.95 3 7.99
VEC13
304.30 3 7.99
VPC13
327.88 3 7.99
VCM2
337.04 3 7.99
VCCWD
426.00 3 7.99
VCC
433.82 3 7.99
VCFM
466.28 3 7.99
VCFC
487.26 3 7.99
E
E
F
F
G
G
G
H
H
H
H
I
I
I
I
J
J
J
J
K
K
K
K
L
L
L
M
M
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
94
VEC
VPC
506.46
507.31
3 7.99
3 7.99
M
M
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05)
Análisis estadístico de Normalidad, ANOVA y Tukey para los datos obtenidos en la
cuantificación de flavonoides totales.
Shapiro-Wilk normality test
W = 0.9277, p-value = 0.061 Datos normales
Análisis de la varianza
Variable
N
R² R² Aj CV
FLAVONOIDES 84 1.00 1.00 3.55
Cuadro de Análisis de la Varianza
F.V.
SC
gl
CM
F
p-valor
Modelo. 12697.34 27 470.27 1080.17 <0.0001
Muestra 12697.34 27 470.27 1080.17 <0.0001
Error
24.38 56
0.44
Total
12721.72 83
Test:Tukey Alfa=0.05 DMS=2.10687
Error: 0.4354 gl: 56
Muestra Medias n E.E.
VCPWD
4.04 3 0.38 A
VPM13
5.83 3 0.38 A B
VCAWD
6.18 3 0.38
B
VCC
6.56 3 0.38
B C
VCM
7.58 3 0.38
B C D
VEM13
7.91 3 0.38
B C D
VEM2
8.67 3 0.38
C D
VPC13
9.52 3 0.38
D
VEC
13.63 3 0.38
VPM
13.69 3 0.38
VEC13
14.03 3 0.38
VEH2
14.30 3 0.38
VPC
14.52 3 0.38
VCCWD
15.75 3 0.38
VEM
16.11 3 0.38
VCFWC
16.60 3 0.38
VCFM
17.36 3 0.38
VCHWD
17.58 3 0.38
VCFH
18.69 3 0.38
VCFH2
20.26 3 0.38
VPH
22.35 3 0.38
VCM2
22.84 3 0.38
VCFC
24.76 3 0.38
VCH
27.19 3 0.38
VCHPL
29.79 3 0.38
VPH13
39.85 3 0.38
VEH13
49.76 3 0.38
VEH
54.96 3 0.38
E
E
E
E
E
F
F
F
F
F
G
G
G
G
G
H
H
H
H
I
I
I
I
I
J
J
J
J
K
K
L
L
M
M
N
N
O
P
Q
R
S
Anexos
95
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05)
Análisis estadístico de Normalidad, ANOVA y Tukey para los datos obtenidos en la
cuantificación de fenoles totales.
Shapiro-Wilk normality test
W = 0.9746, p-value = 0.095 Datos normales
Análisis de la varianza
Variable N
R² R² Aj CV
FRAP
84 1.00 1.00 3.62
Cuadro de Análisis de
F.V.
SC
Modelo. 1453640841.88
Muestra 1453640841.88
Error
2468804.19
Total
1456109646.07
la Varianza
gl
CM
F
p-valor
27 53838549.70 1221.22 <0.0001
27 53838549.70 1221.22 <0.0001
56
44085.79
83
Test:Tukey Alfa=0.05 DMS=670.43817
Error: 44085.7891 gl: 56
Muestra Medias
n
E.E.
VCPWD
459.91 3 121.22 A
VCHWD
645.67 3 121.22 A B
VCAWD
731.60 3 121.22 A B C
VCFWC
926.05 3 121.22 A B C
VCHPL
1136.60 3 121.22
B C
VEH
1329.68 3 121.22
C
VEH13
1414.36 3 121.22
VEM
1478.66 3 121.22
VEH2
1743.26 3 121.22
VEM2
3132.08 3 121.22
VPH
4857.71 3 121.22
VPM
5353.51 3 121.22
VCFH2
5834.05 3 121.22
VCH
5860.30 3 121.22
VCFH
6124.07 3 121.22
VCM2
6126.71 3 121.22
VEM13
6224.09 3 121.22
VPH13
6396.50 3 121.22
VPM13
6597.07 3 121.22
VEC13
7273.78 3 121.22
VCM
7593.14 3 121.22
VPC13
7731.65 3 121.22
VCFM
9840.06 3 121.22
VCCWD
11208.30 3 121.22
VCFC
11595.17 3 121.22
VCC
13193.10 3 121.22
VEC
13194.57 3 121.22
VPC
14558.95 3 121.22
D
D
D
D
D
E
E
E
E
E
F
G
G
H
H
H
I
I
I
I
I
I
J
J
J
J
J
K
K
K
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05)
L
M
M
N
N
O
96
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
C.
Anexo: Datos espectroscópicos
de los compuestos aislados
Para el proceso de elucidación estructural fueron utilizados los espectros de resonancia
magnética nuclear 1H y 13C así como los experimentos unidimensionales (DEPT 135) y
bidimensionales (COSY, HMQC y HMBC) tomados en un equipo Bruker Avance III 500
MHz utilizando disolventes deuterados (CDCl3 y CD3OD)
En los espectros de NMR 1H y NMR13C (Figura C1 y C2), se observa por comparación
con los datos de literatura la presencia de dos grupos metoxilo (y dos sistemas orto-meta
caracterizados por sus multiplicidades y constantes de acoplamiento en 1H RMN; en 13C
RMN se observan 17 carbonos diferentes, 5 carbonos aromáticos oxigenados, 8
carbonos cuaternarios y se comprueba la presencia de los grupos metoxilo y del grupo
carbonilo de una cetona α,β-insaturada.
Anexos
97
Figura C1. Espectro 1H-NMR del compuesto C5 (CDCl3)
Figura C2. Espectro 13C-NMR del compuesto C5 (CDCl3)
El compuesto C5 corresponde a la estructura 1 4’-hidroxi-7,3’-dimetoxiflavona.
1
4’-hidroxi-7,3’-dimetoxiflavona. Solido amarillento, pf 191-193 °C; NMR 1H (500 MHz, CDCl3) 
ppm 8,15 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,47 (dd, J = 8,50, 2,2 Hz, 1H), 6,96-7,02
(m, 3H), 6,70 (s, 1H), 5,86 (s, 1H), 4,00 (s, 3H), 3,95 (s, 3H); NMR 13C  ppm 177,9(C-4), 164,1(C7), 162,9(C-2), 157,9(C-8a), 149,3(C-3’), 146,0(C-4’), 127,0(C-5), 125,1(C-1’), 118,9(C-6’),
117,8(C-4a), 114,3(C-5’), 112,3(C-6), 110,7(C-2’), 106,5(C-3), 100,4(C-8’), 56,1(OMe-3’),
55,8(OMe-7).
98
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Figura C3. Espectro 1H-NMR del compuesto D8 (CDCl3)
Figura C4. Espectro 13C-NMR del compuesto D8 (CDCl3)
El compuesto D8 (2) corresponde a un isómero de C5
Anexos
99
2
3’-hidroxi-7,4’-dimetoxiflavona. Solido amarillento; NMR 1H (500 MHz, CDCl3)  ppm 8.09 (d, J =
8.8 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 8.4, 2.2 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H),
6.96 (dd, J = 7.0, 5.5 Hz, 1H), 6.68 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H).; NMR 13C (100 MHz, CDCl3)
 ppm 178,3(C-4), 164,1(C-7), 163,2(C-2), 157,9(C-8a), 149,8(C-4’), 146,1(C-3’), 127,0(C-5),
124,8(C-1’), 118,9(C-6’), 117,6(C-4a), 114,4(C-5’), 112,4(C-6), 110,8(C-2’), 106,1(C-3), 100,4(C8’), 56,1(OMe-3’), 55,8(OMe-7).
Por comparación de los desplazamientos químicos, en 1H-RMN principalmente, de este
compuesto y los datos de LC HRMS, se proponen las siguientes estructuras para D5 (3)
y D10 (4)
3
3’,4’-metilendioxi-7-metoxiflavona
4
3’, 4’-dihidroxi-7-metoxiflavona.
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
100
D.
Anexo: Análisis estadístico de
datos de actividad antifúngica
Análisis estadístico de Normalidad, ANOVA y Tukey para los datos obtenidos en la
evaluación de la actividad biológica. Concentración de Extracto 1.00 µg/mL
Shapiro-Wilk normality test
W = 0.9841, p-value = 0.8059
Datos normales.
Análisis de la varianza
Variable N
R² R² Aj CV
1000
84 0.96 0.94 18.65
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)
F.V.
SC
gl
CM
F
p-valor
Modelo. 356958.00 27 13220.67 51.76 <0.0001
Muestra 356958.00 27 13220.67 51.76 <0.0001
Error
14302.71 56
255.41
Total
371260.71 83
Test:Tukey Alfa=0.05 DMS=51.02988
Error: 255.4055 gl: 56
Muestra Medias n E.E.
VCM2
11.55 3 9.23 A
VCFH
23.81 3 9.23 A B
VEC
40.50 3 9.23 A B C
VCC
40.55 3 9.23 A B C
VEC13
42.50 3 9.23 A B C
VCM
42.64 3 9.23 A B C
VCCWD
48.18 3 9.23 A B C
VCH
48.85 3 9.23 A B C
VEM2
51.79 3 9.23 A B C
VCHWD
53.73 3 9.23 A B C D
VEH
54.94 3 9.23 A B C D
VCPWD
67.31 3 9.23
B C D
VEM
71.27 3 9.23
B C D
VCHPL
71.39 3 9.23
B C D
VPH
73.99 3 9.23
B C D
VPH13
76.42 3 9.23
C D
VCFWD
78.27 3 9.23
C D
VCFM
79.19 3 9.23
C D
VCFC
80.32 3 9.23
C D
VCAWD
84.77 3 9.23
C D
VPC
103.88 3 9.23
D
VPM
105.33 3 9.23
VPC13
106.31 3 9.23
VEH2
107.53 3 9.23
VPM13
107.76 3 9.23
VCFH2
150.60 3 9.23
VEM13
229.46 3 9.23
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
G
G
G
G
G
G
H
Anexos
VEH13
101
346.25
3 9.23
I
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05)
Análisis estadístico de Normalidad, ANOVA y Tukey para los datos obtenidos en la
evaluación de la actividad biológica. Concentración de Extracto 0.10 µg/mL
Shapiro-Wilk normality test
W = 0.8901, p-value = 0.6700
Datos normales.
Análisis de la varianza
Variable N
R² R² Aj CV
100
84 0.91 0.87 21.90
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)
F.V.
SC
gl
CM
F
p-valor
Modelo. 342118.18 27 12671.04 21.86 <0.0001
Muestra 342118.18 27 12671.04 21.86 <0.0001
Error
32464.58 56
579.72
Total
374582.76 83
Test:Tukey Alfa=0.05 DMS=76.88123
Error: 579.7246 gl: 56
Muestra Medias n E.E.
VCFH
38.43 3 13.90 A
VCM2
59.54 3 13.90 A B
VCPWD
62.05 3 13.90 A B C
VCH
62.32 3 13.90 A B C
VCHWD
68.55 3 13.90 A B C
VCCWD
70.15 3 13.90 A B C
VCC
71.67 3 13.90 A B C
VCFWD
72.16 3 13.90 A B C
VEC
76.48 3 13.90 A B C D
VCAWD
78.66 3 13.90 A B C D
VEC13
78.81 3 13.90 A B C D
VEH2
79.19 3 13.90 A B C D
VCM
83.55 3 13.90 A B C D
VEM2
88.68 3 13.90 A B C D
VPM
88.90 3 13.90 A B C D
VPM13
91.33 3 13.90 A B C D
VCHPL
100.81 3 13.90 A B C D
VPH
103.41 3 13.90 A B C D
VPH13
105.84 3 13.90 A B C D
VEM
106.80 3 13.90 A B C D
VEH
107.81 3 13.90 A B C D
VCFM
126.44 3 13.90
B C D
VCFH2
138.50 3 13.90
C D
VCFC
152.65 3 13.90
D
VPC
182.36 3 13.90
VPC13
184.79 3 13.90
VEH13
254.99 3 13.90
E
E
E
E
E
E
E
F
F
F
F
F
G
G
G
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
102
VEM13
343.88
3 13.90
H
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05)
Análisis estadístico de Normalidad, ANOVA y Tukey para los datos obtenidos en la
evaluación de la actividad biológica. Concentración de Extracto 0.01 µg/mL.
Shapiro-Wilk normality test
W = 0.9359, p-value = 0.8100
Datos normales.
Análisis de la varianza
Variable N
R² R² Aj CV
10
84 0.94 0.91 15.10
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)
F.V.
SC
gl
CM
F
p-valor
Modelo. 340758.00 27 12620.67 32.78 <0.0001
Muestra 340758.00 27 12620.67 32.78 <0.0001
Error
21557.79 56
384.96
Total
362315.79 83
Test:Tukey Alfa=0.05 DMS=62.64949
Error: 384.9605 gl: 56
Muestra Medias n E.E.
VCPWD
76.35 3 11.33 A
VCFH
82.11 3 11.33 A
VCCWD
83.84 3 11.33 A
VCC
86.13 3 11.33 A
VEM2
86.92 3 11.33 A
VCH
86.95 3 11.33 A
VCFWD
88.77 3 11.33 A
VEH2
91.32 3 11.33 A B
VCAWD
95.27 3 11.33 A B
VCHWD
95.64 3 11.33 A B
VEH
115.40 3 11.33 A B C
VEM
119.52 3 11.33 A B C
VCHPL
120.32 3 11.33 A B C
VPM
120.63 3 11.33 A B C
VEC13
120.74 3 11.33 A B C
VEC
121.08 3 11.33 A B C
VCM2
122.55 3 11.33 A B C
VPH
122.92 3 11.33 A B C
VPM13
123.06 3 11.33 A B C
VPH13
125.35 3 11.33 A B C
VCM
130.63 3 11.33 A B C
VCFH2
135.12 3 11.33 A B C
VCFC
135.18 3 11.33 A B C
VCFM
152.16 3 11.33
B C
VPC
158.90 3 11.33
C
VPC13
161.33 3 11.33
C
VEH13
294.04 3 11.33
D
VEM13
384.86 3 11.33
E
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05)
Anexos
103
E.
Anexo: Validación del modelo de
predicción de actividad por OPLS.
Para la validación del método estadístico se usó validación cruzada, se calcularon los
valores predichos a partir del modelo y se compararon con los valores reales para cada
modelo creado.
Figura E1. Regresión a partir de los datos predichos con el modelo OPLS a partir de datos LC-DAD y
los datos reales.
104
Perfilado metabólico de plantas del género Virola spp.
Figura E2. Regresión a partir de los datos predichos con el modelo OPLS a partir de datos LC-LRMS
y los datos reales.
Figura E3. Regresión a partir de los datos predichos con el modelo OPLS a partir de datos LC-HRMS
y los datos reales.
Anexos
105
Figura E4. Regresión a partir de los datos predichos con el modelo OPLS a partir de datos 1H-NMR y
los datos reales.