Download Sistemas Analíticos Avanzados para Estudios de

SEMINARIO 2014
“TECNOLOGÍA DE ÚLTIMA GENERACIÓN EN LOS
LABORATORIOS DE CROMATOGRAFÍA Y ESPECTROMETRIA”
Sistemas Analíticos Avanzados para Estudios de
Metabolómica no Dirigida Aplicados a Alimentos
Fernando Vallejo Mellado ([email protected])
http://www.cebas.csic.es/general_spain/metabolomica.html
CEBAS - CSIC
El CEBAS-CSIC es un Instituto de Investigación singular pues se trata de un centro multidisciplinar que
lleva a cabo investigaciones en tres áreas científico-técnicas relacionadas (Ciencias Agrarias, Ciencia y
Tecnología de los Alimentos, y Recursos Naturales)
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RECIENTE CREACION SERVICIO DE METABOLOMICA
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SOLICITUD DEL SERVICIO DE METABOLOMICA
INICIOS DE LA METABOLOMICA
J.K. Nicholson (1999) “Metabonómica como la medida cuantitativa de la
respuesta metabólica a los estímulos fisiológicos o modificaciones genéticas”
Oliver Fiehn (2001) “Análisis global y cuantitativo de todos los metabolitos, las
moléculas de medio y bajo peso molecular (entre 30 y 1.500 Da), que dan
cuenta de distintas reacciones de las células en un entorno”
Bill Lasley (2004) “La Genómica y Proteómica te dicen lo que
podría pasar pero la Metabolómica te dice que es lo que esta
pasando en realidad”
¿POR QUE METABOLITOS?
“Lo que puede pasar”
Genómica
(~20.000 genes)
“Lo que parece estar pasando”
“Lo que va a pasar”
“Lo que ha pasado y esta pasando”
Transcriptómica
(~100.000 transcriptos)
Proteómica
(~106 proteínas)
Metabolómica
(~2500 metabolitos)
- Fenotipo
+ Fenotipo
- El metaboloma da lugar a los fenotipos (Dieta, Estado Fisico, Edad, Sexo)
- Los metabolitos son mejores biomarcadores que genes y proteínas
- Regulan los diferentes niveles de proteínas y la transcripción de genes y proteínas
Nº publicaciones ISI web Metabolomica
TOMA, CONSERVACION Y EXTRACCION DE METABOLITOS DE LA MUESTRA (KEY-STEP)
!! IMPOSIBLE EVITAR PERDIDAS !!
OBJETIVO: AISLAMIENTO DE TODOS LOS METABOLITOS PRESENTES EN LA CELULA
RETOS: TAMAÑOS Y POLARIDADES DIFERENTES. INESTABILIDAD DE LOS METABOLITOS
REALIDAD: NO HAY UN UNICO PROTOCOLO DE EXTRACCION QUE CUBRA TODO EL METABOLOMA
Ph
Temperatura
Solventes
SPE
PLATAFORMAS ANALITICAS-METABOLOMA COMPLETO
Human Metabolome Project: “The Human Serum Metabolome”
Nikolaos Psychogios et al. Plos One (2011)
100-200
METABOLITOS
APCI 200-300
ESI 800-1000
METABOLITOS
50-100
METABOLITOS
GC-MS
RESOLUCION
ROBUSTEZ
SENSIBILIDAD
BASES DE DATOS
CUANTIFICACION
DERIVATIZACION
LC-MS
EXCELENTE SENSIBILIDAD
MASA EXACTA Y ROTURAS
LIBRERIAS/DB
COBERTURA
METABOLOMA
SUPRESION IONIZACION
CUANTIFICACION
ng/ml
LC-MS
RMN
DESVENTAJAS
SENSIBILIDAD
SOLAPAMIENTO PICOS
RMN
pg/ml
UPLC-QTOF
VENTAJAS
REPRODUCIBILIDAD
ROBUSTEZ
CUANTITATIVO
AUTOMATIZACION
RMN
µg/ml
GC-QTOF
APROXIMACION EN METABOLOMICA
CLASIFICACION GLOBAL ANALISIS RAPIDO
(FINGERPRINTING)
ANALISIS GRUPO METABOLITOS
(PROFILING)
ANALISIS
NO DIRIGIDO
METABOLÓMICA NO DIRIGIDA
TOF Profiling
Profinder
Mass Profiler
Professional
Intensidad
Masa Exacta
Tiempo
UPLC-QqQ
Rutas Metabólicas
Molecular Structure
Correlator
Cuantificación
Biomarcador
METLIN; HMDB; KEGG; METFRAG
QTOF (MS/MS)
ANALISIS ESTADISTICO (MASS PROFILER PROFESIONAL)
1. Datos Profinder
2. Alineamiento, Normalización,
3. QC Features Filtros
(Algoritmo Recursivo)
Transformación línea base
Frecuencia/Abundancia
4. QC Muestra
Análisis No supervisados (PCA-3D)
ANALISIS ESTADISTICO (MASS PROFILER PROFESSIONAL)
5. Análisis Estadístico
6. QC Muestra
(T-test; ANOVA; MTC; Post-Hoc; FC)
(Cluster; Diagrama Venn)
7. Modelos Predictivos
Análisis Supervisados (PLS-DA)
Y HASTA AQUÍ EL 50% DEL TRABAJO….Y ADEMAS EL
MAS FACIL !!
METABOLÓMICA NO DIRIGIDA. IDENTIFICACION
Patrón
disponible
Identificación Metabolitos
(Molecular Structure Correlator)
METLIN; HMDB; KEGG; METFRAG
Metabolic Pathway
ALTERNATIVAS PARA LA IDENTIFICACION
Flash-Crom.
TENER CERCA UN BUEN QUIMICO
SemiPrep (Amb/Sephadex)
EJEMPLO ESTUDIO DE METABOLOMICA EN
ALIMENTOS
NO DIRIGIDA
UPLC-QTOF (6550)
TRATAMIENTOS TECNOLOGICOS PARA INCREMENTAR LA
BIODISPONIBILIDAD DE ZUMOS DE NARANJA
CITRUS JUICE EXTRACTOR
AND PADDLE FINISHER
PAST 92-40 FRESH SQUEEZED HPH 150-68
HIGH PRESSURE
HOMOGENIZER
LANE LATE
VALENCIA LATE
ORTANIQUE
MODELOS NO SUPERVISADOS (PCA, CLUSTER)
MODELOS SUPERVISADOS DISCRIMINATORIOS (PLS-DA)
Cross-Validation (N-Fold=3). 2 partes validar modelo; 1 parte construir modelo
IDENTIFICACION. LIBRERIAS PUBLICAS
KEGG, CHEMSPIDER, MASS BANK
EJEMPLO ESTUDIO DE METABOLOMICA EN
ALIMENTOS
DIRIGIDA
UPLC-QqQ (6460)
METABOLOMICA DIRIGIDA. METABOLITOS
DE FASE II. BIOMARCADORES DE INGESTA.
Gluc-O
HO3SO
3’
3’
OCH3
B
B
HO3SO
O
7
A
C
5
OH O
HESPERETIN 7-O-SULPHATE
HESPERETIN 3’-O-SULPATHE
O
Gluc-O
7
A
C
OH
O
5
HESPERETIN 7-O-GLUCURONIDE
HESPERETIN 3’-O-GLUCURONIDE
OCH3
METABOLITOS DE FASE II EN ORINA ANALIZADOS POR
UPLC-QqQ (AGILENT 6460)
HESPERETIN DIGLUCURONIDE
NARINGENIN DIGLUCURONIDE
HESPERETIN SULFOGLUCURONIDE
HESPERETIN GLUCURONIDE
NARINGENIN GLUCURONIDE
HESPERETIN SULPHATE
CITOSINAS HIDROXIMETILADAS DE ADN ANALIZADAS
POR UPLC-QqQ (AGILENT 6460)
5hmdC → 5hmC
5mdC → 5mC
dC → C
ALCALOIDES EN TOMATE ANALIZADOS POR UPLC-QqQ
(AGILENT 6460)
METODOS EN PREPARACION PARA UPLC-QqQ
S-AMe/S-Ah EN PLASMA
LACTULOSA/MANITOL EN ORINA
EICOSANOIDES
AA/DHAA EN MUESTRAS VEGETALES/MODELOS IN VIVO
TAURINA EN ATUN
AMIGDALINA (VIT B17) EN EXTRACTOS DE ALMENDRA
GRACIAS POR VUESTRA ATENCION,
¿¿PREGUNTAS??