Download ESTUDIOS ANATOMICOS Y MORFOLOGICOS DE LA INICIACION

BOTANICA
Acta Científica Venezolana, 51: 78–83, 2000
ESTUDIOS ANATOMICOS Y MORFOLOGICOS DE LA
INICIACION DE EMBRIONES SOMATICOS OBTENIDOS A
PARTIR DE APICES MERISTEMATICOS DE Musa sp.
María del Carmen Vidal, Teresa Edith Vargas y Eva de García
Centro de Botánica Tropical, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela,
Apartado 47114, Los Chaguaramos 10490, Caracas, Venezuela.
Recibido: 13/07/99 ; Revisado: 01/12/99 ; Aceptado: 08/02/00
RESUMEN: El origen de embriones somáticos obtenidos de ápices meristemáticos del clon de Musa (AAA) ’Gran enano’, fue analizado
mediante estudios histológicos y morfológicos durante las diferentes fases de desarrollo del proceso. La investigación reveló que los
embriones somáticos se originaron directamente de células del parénquima perivascular de las hojas. Secciones histológicas de los embriones globulares mostraron una disposición radial de las células y la presencia de una epidermis que rodea completamente al embrión.
Con la adición de citocinina (Z o BA), algunos embriones permanecieron en estado globular, con ligeros signos de agrandamiento sin un
posterior desarrollo de la invaginación. Otros lograron alcanzar el estado de embrión globular con invaginación; otros el estado alargado,
con una clara diferenciación entre el extremo apical y basal y con tejidos fotosintéticamente activos, pero no se logró la regeneración de
plantas completas. Tratamientos adicionales, como es el someter a los embriones a un "shock osmótico" o la adición de GA3 , fueron
también probados sin éxito. Al presente, no tenemos una explicación para la no regeneración de las plantas, por lo tanto sugerimos que
se deben realizar experimentos adicionales, como lo son estudios histológicos y bioquímicos en estados tempranos, intermedios y tardíos
de la embriogénesis somática, para tratar de entender en que momento y porque, son interrumpidos los procesos fisiológicos normales
del desarrollo del embrión. Palabras clave: Anatomía, morfología, histología, ontogenia, embriogénesis somática, Musa sp., banano.
ANATOMIC AND MORPHOLOGICAL STUDIES ON THE INITIATION OF SOMATIC EMBRYOS OBTAINED FROM
MERISTEMATIC APEXES OF Musa sp.
ABSTRACT: The origin of somatic embryos obtained from meristematic apexes of the Musa (AAA) clone "Gran enano" was analyzed
through histological and morphological studies during the various development phases of the process. The research point out that somatic
embryos developed directly from perivascular parenchyma cells of the leaves. Histological sections of globular embryos showed a radial
disposition of cell and the existence of an epidermal layer that surrounds the embryo completely. When citocinine (Z or BA) was added,
some embryos remained in globular stage with mild signs of enlargement but with no later development of invagination. Other’s embryos
reached the invagination stage; and some reached the enlargement stage with active photosynthetic tissues. Howevere there were no
to generation of complete plant regardless of additional treatment, such as "osmotic shock" or the additions of GA3 . At present do
not have an explanations for this results. Therefore, additional experiment should be in early, intermediate and later stages of somatic
embryogenesis, in order to understand the mechanisms underlying the lack of development of plants from somatics embryos. Key Words:
Anatomy, morphology, histology, ontogeny, somatic embryogenesis, Musa sp., banana.
INTRODUCCION
El creciente interés por la obtención de embriones somáticos en diversos cultivos de plantas, se debe a que el
proceso de embriogénesis somática facilita dos aspectos
importantes en el mejoramiento genético de los cultivos:
la propagación clonal a gran escala, vía "semilla artificial"
y la variabilidad genética, vía variación somaclonal. En
un mismo proceso, se puede asegurar la estabilidad genética de un cultivo (embriogénesis directa) o inducir su
cambio (embriogénesis indirecta), con el objeto de obtener nuevas variedades. En Musa, los métodos de cultivo
de tejidos ofrecen una alternativa a los sistemas de entrecruzamiento clásicos, los cuales han sido, hasta ahora,
poco exitosos24 . No obstante, la regeneración de plantas completas a partir del cultivo de embriones somáticos,
ha constituido un paso limitante en la aplicación de técnicas biotecnológicas para el mejoramiento de clones de
banano con importancia económica19 . Varios autores han
realizados esfuerzos para obtener embriones somáticos
de Musa, ya sea a partir de tejido vegetativo como son:
la base de las hojas20;23;28 , la parte superior de las yemas en proliferación1;5;17;22 , segmentos de cormos7;20;23 ,
y de tejido reproductivo: flores masculinas7;9 ; embriones
cigóticos inmaduros7;8;15 , y semillas inmaduras16 . En varios de estos trabajos, se ha logrado la regeneración de
plantas completas vía embriogénesis somática, siguiendo
un patrón que muestra una gran similitud con la embriogénesis cigótica. Sin embargo, la obtención de embriones
somáticos a partir de embriones cigóticos y semillas inmaduras presenta una limitación en los esquemas de mejoramiento, ya que solo se puede aplicar a especies silvestres
de Musa y no a los cultivares económicamente importantes, los cuales, por su condición partenocárpica, carecen
de semillas. Adicionalmente, en los clones de Musa sp.
que se ha logrado regenerar plantas a partir de embriones somáticos, la frecuencia de conversión (proceso de
obtención de plantas a partir de embriones) es baja5;20 y
depende del genotipo.
Hasta ahora, no se ha reportado una descripción del ori-
Anatomía y morfología de la embriogénesis somática en Musa sp.
Tabla 1. Composición de medios usados para la regeneración
de plantas vía embriogénesis somática directa del clon de Musa
(AAA) ’Gran enano’.
Composición Sacarosa Mioinositol 2,4-D BA
Z
GA3 Gelrite
del medio de: (gl 1 )
(mgl 1 ) (M) (M) (M) (mgl 1 ) (gl 1 )
Iniciación
Maduración
Germinación:
G1
G2
G3
G4
G5
G6
30
30
100
5
40
40
40
40
40
80
100
100
100
100
100
100
1
1
1
10
1
0.1
1
2
2
2
2
2
2
Abreviaturas: 2,4-D (2,4 Diclorofenoxiacético), BA (6-Belcilaminopurina), Z (Zeatina), GA3 (Acido giberélico)
gen y desarrollo de embriones somáticos de Musa sp. a
partir del cultivo de ápices meristemáticos en medio líquido. Un estudio ontogénico de la embriogénesis somática, en el que se determine cuales tejidos en particular se
derivan en meristemas embriogénicos o en que estados
posteriores de desarrollo se detiene el proceso, podría suministrar información adicional para aumentar o manipular
la respuesta embriogénica. El objetivo del presente trabajo fue investigar la ontogenia y estados de desarrollo
de embriones somáticos de un clon de Musa (AAA) ’Gran
enano’, obtenidos a partir del cultivo de ápices meristemáticos en medio líquido.
79
(2,4-D) y 1M zeatina (Z). El pH de los medios fue ajustado a 5.8.
Los cultivos se mantuvieron bajo agitación constante a
100 r.p.m., una temperatura de 27Æ C y luz continua, con
una intensidad de 50 Em 2 seg 1 . Cada 2 ó 3 semanas, se decantaba el medio viejo y se agregaba el medio
fresco, hasta la obtención de los embriones somáticos.
Para la maduración de los embriones somáticos, estos
fueron transferidos a un medio líquido igual al medio de
inducción, pero con la sustitución de 2,4-D por citocinina.
Las citocinina usada fue 6-bencilaminopurina (BA) a una
concentración de 1M. La sacarosa se usó a una concentración de 30 g/l. El pH de los medios fue ajustado a 5.8.
Para la germinación de los embriones, estos fueron
transferidos a un medio sólido (2 g/l gelrite) igual en composición al medio de maduración, pero varió el tipo (citocinina o giberelina) y concentración de los reguladores de
crecimiento usados. Las citocininas utilizadas fueron BA
(1 M ó 10 M) y zeatina (1 M). La giberelina usada fue
el ácido giberélico (GA3 ) a una concentración de 0.1 mg/l.
La sacarosa fue usada a una concentración de 40 y 80 g/l.
El pH de los medios se ajustó a 5.8. La composición de
los medios utilizados y los seis tratamientos para la inducción de la germinación de los embriones somáticos (G1,
G2, G3, G4, G5, y G6) se indican en la Tabla 1. Se realizaron 3 réplicas por tratamiento, usando 20 embriones
globulares en cada réplica. A estos embriones se les hizo
un seguimiento durante la fase conversión de embriones
en estado globular hasta alcanzar la fase de embrión alargado.
MATERIALES Y METODOS
Material vegetal
Para establecer el proceso de embriogénesis somática directa en Musa sp., se utilizaron vitroplantas del clon ’Gran
enano’, un clon triploide (AAA) del sub-grupo Cavendish.
Las vitroplantas fueron seleccionadas del banco de germoplasma del Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la
Facultad de Ciencias, U.C.V.
Inducción de la Embriogénesis somática
En la iniciación del proceso de embriogénesis somática
del clon ’Gran enano’, se seleccionó el método de Dhed’a
y col.5 , con las siguientes modificaciones: la inducción de
embriones somáticos se inició a partir de ápices meristemáticos de aproximadamente 1 cm2 , con 3 a 4 primordios
foliares y un peso promedio de 0.43 g. Los ápices fueron
seccionados por la mitad antes de sembrarlos en el medio
de cultivo.
Los ápices meristemáticos (dos ápices por fiola) fueron
colocados en una fiola de 250 ml que contenían 50 ml de
medio Murashige & Skoog18 (MS) líquido con las siguientes modificaciones: macroelementos y hierro reducidos a
la mitad, con la adición de 0.4 mg/l tiamina, 50 mg/l ácido
ascórbico, 30 g/l sacarosa, 5M 2,4 diclorofenoxiacético
Estudios anatómicos
Para evaluar los eventos histológicos del proceso de embriogénesis somática en el clon de banano ’Gran enano’,
se emplearon ápices meristemáticos fijados a diferentes
tiempos de cultivo (0, 15, 30 y 45 días). La fijación se realizó en FAA (37% formaldehído: 100% ácido acético: 70%
etanol, en una proporción 5:5:90). El material preservado en FAA se deshidrató en una serie alcohólica ascendente, con las siguientes proporciones de agua destilada,
etanol y alcohol butílico terciario (ABT): 50% (50:40:10),
70% (30:50:20), 85% (15:50:35), 95% (0:45:55), 100%
(0:25:75), ABT (0:0:100).
Posteriormente, el material se infiltró en paraplast fundido y ABT, manteniéndolo en la estufa a 60Æ C por dos o
tres días hasta que no quedaran restos de ABT. Luego se
hicieron cortes seriados a un grosor de 10-12m utilizando un microtomo de rotación, y finalmente se realizó una
coloración con safranina al 0.5% y fast-green al 0.1%, diferenciando la coloración con una solución de ácido pícrico
(en etanol al 95%). Las secciones de los distintos tejidos
fueron registradas microfotográficamente con una cámara
Nikon FDX-35.
80
Vidal, Vargas y García
a
b
Figura 1. Corte longitudinal de secciones de primordios foliares del clon de Musa (AAA) ’Gran enano’, luego de cultivarlos en medio
de inducción de la embriogénesis somática directa. a) Células meristemáticas (CM) y proembriones esféricos (PE) en la región del
parénquima adyacente a los haces vasculares (HV). b) Proembriones esféricos con una disposición radial de las células internas y
rodeados por una epidermis continua.
Análisis estadístico
Los resultados obtenidos en este estudio fueron analizados estadísticamente, mediante la prueba paramétrica
ANOVAR, con el fin de determinar el grado de significancia entre los tratamientos aplicados. Los datos porcentuales fueron analizados luego de hacer una conversión
angular [arcosen (%/100)] ya que con los datos originales
no se cumple el supuesto de homogeniedad de varianza.
Dichas pruebas están incluidas en el paquete estadístico
"Statistica for Window", versión 5.0.
RESULTADOS Y DISCUSION
Anatomía y morfología de la iniciación de la embriogénesis
somática
Luego de una semana de iniciado el cultivo de ápices meristemáticos del clon de banano ’Gran enano’ en medio
líquido, los explantes presentaron cambios morfológicos
perdiendo su organización como ápices. Los primordios
foliares se engrosaron marcadamente, y luego de 5 a 6
semanas de cultivo, aparecieron embriones globulares de
color blanquecino sobre la superficie de la hoja.
El análisis de alícuotas del medio líquido a los 15 días
de cultivo, evidenció la presencia de células grandes y
alargadas con características típicas de células no embriogénicas, así como células pequeñas, redondeadas, con citoplasma denso, las cuales son características de células
embriogénicas. También se observaron células en divi-
Figura 2. Embrión es estado alargado del clon de Musa (AAA)
’Gran enano’, con una clara diferenciación entre el extremo apical y basal.
sión y estructuras proembriónicas (resultados no mostrados). Estos hallazgos podrían reforzar el origen unicelular
de los embriones somáticos en el clon de banano ’Gran
enano’.
El estudio histológico de secciones de primordios foliares del clon de banano ’Gran enano’ a los 30 días de cultivo, muestran proembriones esféricos y células meristemáticas en la región del parénquima adyacente a los haces
vasculares del explante (Figura 1a). Estas células meristemáticas se originaron directamente, sin la formación de
callo, a partir de células del parénquima perivascular de
81
Anatomía y morfología de la embriogénesis somática en Musa sp.
las hojas. Las células meristemáticas se caracterizan por
ser pequeñas, redondeadas y con contenido citoplasmático denso. Estas células son competentes para la embriogénesis, y por tanto, sólo requieren de reguladores de
crecimiento o de condiciones favorables para ser determinadas como células embriogénicas30 . Resultados similares han sido obtenidos por otros autores, tanto en banano
como en otras especies, donde señalan que las células
embriogénicas se derivan directamente de células de la
región perivascular del explante5 , mientras que en la embriogénesis somática indirecta, donde está involucrado el
parénquima perivascular, son las células del callo las que
se originan a partir de este tejido9;10;13;21 . Las subsecuentes divisiones de éstas células meristemáticas del parénquima adyacente al tejido vascular, conduce a la formación de embriones globulares.
Algunos reportes hacen referencia de la activación preferencial inducida por las auxinas de las células perivasculares. Este evento ha sido relacionado, con la presencia
de altos niveles de reguladores de crecimiento y nutrientes en las células de este tejido29 . Otra posible explicación
de la iniciación de la actividad meristemática de las células del parénquima perivascular, aún en especies monocotiledóneas, es su relativamente bajo grado de especialización fisiológica y morfológica6 . También se ha señalado, que las células del parénquima perivascular de la hoja
poseen alta actividad mitótica, la cual puede favorecer la
producción de embriones somáticos, ya que las células en
división continua, poseen una mayor capacidad para dediferenciarse y redeterminarse en células embriogénicas21 .
Son pocas las publicaciones que han descrito el proceso de embriogénesis somática en Musa sp. basado
sobre el análisis histológico12 . La comparación morfológica e histológica de los embriones somáticos obtenidos
en esta investigación, revelan similitudes con los obtenidos previamente en Musa accuminata, M. balbisiana, y los
clones ’Bluggoe’ y ’Grand Nain’5;8;14 . El análisis histológico de los eventos del proceso de embriogénesis somática directa en el clon de banano ’Gran enano’ muestra la
presencia de una epidermis que rodea completamente al
embrión, lo cual ha sido considerado un paso importante
en la embriogénesis somática5 . Secciones histológicas de
los embriones globulares revelaron una disposición radial
de las células, lo cual ha sido anteriormente reportado por
Swennen27 en Musa sp. (Figura 1b).
Inducción de la germinación de embriones somáticos
La regeneración de plantas funcionales a partir del cultivo de células o tejidos, es el principal paso limitante en
la aplicación de métodos biotecnológicos para el mejoramiento de los cultivos14 . En nuestra investigación, los
tratamientos con citocininas (medios G3 y G4) fueron los
que permitieron promover el desarrollo de mayor número de embriones somáticos en estado globular, hasta alcanzar el estado alargado (Tabla 2). En estos embriones,
se pudo observar una clara diferenciación entre el extremo apical y basal (Figura 2) y la presencia de tejidos fo-
Tabla 2. Efecto de la composición del medio de germinación (G)
sobre el desarrollo de embriones somáticos en estado globular
del clon de Musa (AAA) ’Gran enano’.
% de embriones somáticos en los
diferentes estados de desarrollo a las
4 semanas de cultivo
Tratamiento Globular Globular con Alargado
invaginación
G1
(control)
G2
G3
G4
G5
G6
90.83
5.77
3.40 a
46.22
11.45
5.04
86.41
78.23
37.22
26.42
2.4
8.15
15.35
16.56 a
62.13 b
92.56 c
5.44 a
6.42 a
Valores de Porcentajes seguidos por diferentes letras difieren significativamente (P
<
0,05) de acuerdo con la prueba de Rango Múltiple de Duncan. Se utilizaron 20
embriones globulares por tratamiento aplicado.
tosintéticamente activos. En esta investigación también
encontramos que algunos embriones permanecieron en
estado globular por un período de 4 semanas, con ligeros signos de agrandamiento, mientras que otros lograron
desarrollarse hasta el estado de embrión globular con invaginación. Los resultados muestran que ninguno de los
tratamientos probados fueron efectivos para lograr que los
embriones somáticos en estado alargado se desarrollaran
hacia plantas completas. Tratamientos adicionales, como
es el someter a los embriones a un "shock osmótico" (con
la adición de 80 g/l de sacarosa), el uso de GA3 o de BA (1
M) fueron también probados sin éxito. No tenemos una
explicación para los resultados obtenidos, pero se podría
especular que estos tratamientos, además de no tener una
composición y concentración de las sustancias utilizadas
adecuadas para la germinación de los embriones de Musa sp., puede que no hayan sido aplicados en el estado
apropiado de desarrollo del embrión somático para que
pudieran ser efectivos.
La obtención de estructuras similares que nunca se desarrollaron hacia plantas completas ha sido previamente
reportado tanto en Musa4;14;20 como en otras especies2 .
En Ipomea batatas, Chée y Cantlife2 encontraron una diversidad de estados embrionarios, de los cuales solo algunos de ellos fueron capaces de desarrollarse hacia plantas completas; los embriones incompletos tenían forma redondeada y se caracterizaron por tener el extremo apical
cerrado, sin la presencia de una hendidura o invaginación
que indique la iniciación cotiledonar; estos autores plantean que estos embriones posiblemente crezcan mediante alargamiento del estado globular reteniendo un estado
primitivo de desarrollo, posiblemente como resultado de
un establecimiento retardado de la polaridad. Otra posible causa de la falla en la conversión de embriones somáticos a plantas, puede ser la inhibición del desarrollo de un
meristemo funcional en el vástago11 .
El fracaso en lograr la germinación de embriones somá-
82
Vidal, Vargas y García
ticos con el uso de reguladores de crecimiento convencionales, sugiere que el bloqueo del proceso puede tener su
origen en etapas tempranas del desarrollo3 . El balance
hormonal en cada estado del proceso, es un factor importante que controla el crecimiento, la diferenciación y el
desarrollo del embrión11 . Por ejemplo, el papel de las auxinas en la inducción de la embriogénesis somática y el
posterior desarrollo de los embriones globulares, no está
completamente establecido, pero se ha demostrado que el
uso de inhibidores del transporte de auxinas son capaces
de bloquear la capacidad de los embriones somáticos de
sufrir la transición morfogenética hacia los subsecuentes
estados de desarrollo: por ejemplo, los embriones globulares sufren una expansión esférica persistente sin elongación del eje, mientras que en los embriones en estado
intermedio se produce una continua elongación del eje, sin
iniciación del desarrollo cotiledonar25 .
Por otro lado, se ha evidenciado que la presencia de
macromoléculas extracelulares en el medio de cultivo de
embriones somáticos, están involucradas en el bloqueo de
los embriones en el estado de corazón en Vitis sp.3 . Por lo
expuesto anteriormente, sugerimos que se deben realizar
experimentos adicionales, como lo son estudios histológicos y bioquímicos en estados tempranos, intermedios y
tardíos de la embriogénesis somática de Musa sp., para
tratar de entender en que momento y porque, son interrumpidos los procesos fisiológicos normales del desarrollo del embrión.
La embriogénesis somática directa es considerada como un sistema conveniente para la propagación de plantas elites, debido a que es un proceso que no involucra
una fase de callo, y por ende, se evita una fuente importante de variación genética. Por tal motivo, el cultivo de
embriones somáticos de Musa en medio líquido, obtenidos por la vía directa a partir de primordios foliares, puede
ser considerado como un sistema opcional para el cultivo
de plantas con características agronómicas sobresalientes. Aún cuando, con la metodología empleada en esta
investigación, sólo se logró la obtención de embriones en
sus diferentes etapas de desarrollo, estos hallazgos abren
el camino para futuras investigaciones relacionadas con
el mejoramiento del proceso de embriogénesis somática
directa en Musa sp.
AGRADECIMIENTOS
Al Programa Nuevas Tecnologías, BID-CONICIT quien
subvencionó esta investigación a través del proyecto BTA03. Al Lic. Luis Hermoso por su colaboración en el procesamiento de las muestras para el estudio histológico.
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