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Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnología
INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA AGRICOLAS
ADAPTACION DE UN METODO DE EMBRIOGENESIS SOMATICA
PARA LA REGENERACION DE EMBRIONES ASEXUALES DE
PINABETE
(Abies guatemalensis Redher) (FASE II)
INFORME FINAL
2003
2
INDICE
Lista de Cuadros y Figuras
Resumen
I. Identificación del proyecto
1.1. Nombre del proyecto
1.2. Responsable del proyecto
1.3. Unidad ejecutora
1.4. Fecha de inicio y finalización
II. Informe del proyecto
2.1. Introducción
2.2. Palabras clave
2.3. Antecedentes
2.4. Objetivos
2.4.1. General
2.4.2. Específicos
2.5. Metodología
2.5.1. Hipótesis
2.5.2. Material Vegetal y condiciones de cultivo
2.5.3. Etapas de la investigación
2.6. Resultados y Discusión
2.6.1. Selección de las semillas
2.6.2. Inducción de callo
2.6.3. Proliferación de callo
2.6.4. Generación y desarrollo de embriones somáticos
2.6.5. Discusión de resultados
2.7. Conclusiones
2.8. Recomendaciones
2.9. Bibliografía
2.10. Anexos
Pág.
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LISTA DE CUADROS Y FIGURAS
CUADRO 1.
RESPUESTA DE LOS EMBRIONES ZIGÓTICOS DE Abies
guatemalensis A LA INDUCCIÓN DE CALLO EN EL CULTIVO IN VITRO
CUADRO 2.
PROLIFERACIÓN DE CALLO EN CULTIVOS DE Abies
guatemalensis EN DIFERENTES COMBINACIONES DE 2,4-D Y BAP DURANTE
DOS CICLOS DE CULTIVO.
CUADRO 3. PORCENTAJE DE OXIDACIÓN Y FORMACIÓN DE EMBRIONES
GLOBULARES DE Abies guatemalensis.
FIGURA 1. Semilla de pinabete
FIGURA 2. Embrión sexual de pinabete
FIGURA 3. Callo formado a partir de un embrión sexual de pinabete
FIGURA 4. Callos inducidos sobre medio MCM adicionado con 2,4-D y BAP
FIGURA 5. Cultivo en suspensión de callos embriogénicos de pinabete
FIGURA 6. Agregados celulares del cultivo en suspensión de pinabete
FIGURA 7. Cultivo de callos embriogénicos sobre medio MCM adicionado con ABA
FIGURA 8. Efecto de la intensidad de luz sobre callos embriogénicos
FIGURA 9. Agregados celulares observados bajo microscopio
FIGURA 10. Agregados con células alargadas y redondas
FIGURA 11. Agregados con células suspensorias y células pequeñas citoplasmáticas
FIGURA 12. Embrión somático inmaduro
ii
4
RESUMEN
Esta investigación tuvo como fin principal continuar con la adaptación de un método de
embriogénesis somática para la producción de embriones asexuales de pinabete (Abies
guatemalensis Redher). En este estudio se procedió la inducción de embriogénesis
somática en Abies guatemalensis, evaluando diferentes combinaciones hormonales y
factores físicos como la intensidad de luz, ya que en la inducción de embriogénesis es
bien sabido que éste es un factor que afecta el crecimiento de tejido embriogénico
provocando oxidación en muchas especies vegetales, particularmente en las coníferas.
También se evaluó diferentes concentraciones de ácido Abscícico y clases de azúcar
para lograr la generación y desarrollo de embriones somáticos de pinabete. Al final se
determinó que la mejor combinación hormonal para la proliferación de callo es 2.0 mg/l
de ácido 2,4-Diclorofonoxiacético más 1.0 mg/l de Bencil Aminopurina. En cuanto al
efecto de la luz sobre la formación de embriones somáticos se encontró que los
tratamientos establecidos bajo condiciones de obscuridad y semiobscuridad fueron
efectivos sobre la generación de embriones somáticos de Abies guatemalensis Redher,
evitando la fotooxidación de los callos embriogénicos. No se encontró diferencia entre
los tipos de azúcar evaluados pero si se encontró diferente respuesta en la formación de
embriones somáticos de acuerdo con la concentración de ácido Abscícico. Se determinó
que el tratamiento con ácido Abscícico (10 mg/l) + Maltosa (40 g/l) presentó un mayor
porcentaje de formación de proembriones globulares de Abies guatemalensis Redher,
seguido del tratamiento con ácido Abscícico (10 mg/l) + Sacarosa (20 g/l), tanto bajo
condiciones de obscuridad así como de semi-obscuridad. Los embriones aun no
alcanzaron su maduración, hasta la fecha de este informe, pero se consideró que se
avanzó una gran parte en el proceso de inducción de embriones somáticos por lo que se
recomienda continuar la investigación para lograr la maduración de los embriones
somáticos generados.
iii
5
2.9. BIBLIOGRAFÍA
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Washington. p. 95.
8
I. IDENTIFICACIÓN DEL PROYECTO
1.1. NOMBRE DEL PROYECTO
ADAPTACION DE UN METODO DE EMBRIOGENESIS SOMATICA PARA
LA REGENERACION DE EMBRIONES ASEXUALES DE PINABETE
(Abies guatemalensis Redher) (FASE II)
CODIGO: 30-00
1.2. RESPONSABLE DEL PROYECTO: AIDA ELEONORA RAMÍREZ
1.3. UNIDAD EJECUTORA:
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA,
INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
AGRÍCOLAS -ICTAKm. 21.5 carretera hacia Amatitlán-Bárcena, Villa
Nueva. Telefax (502) 6305697, 6305799 y
6305702
E-mail: [email protected]
INVESTIGADORA PRINCIPAL: Ing. Agr. M. Sc. Aída Eleonora Ramírez Rodas
Laboratorio de Biotecnología, ICTA, Labor Ovalle,
Olintepeque, Quetzaltenango. Tel. 7635097/
7635436
E-mail:[email protected]
[email protected]
INVESTIGADORA ASOCIADA: Ing. Agr. Glenda Edelmira Pérez García
ICTA, Labor Ovalle, Olintepeque, Quetzaltenango.
Tel. 7635097/ 7635436
1.4. FECHA DE INICIO Y FINALIZACION DEL PROYECTO:
INICIO: 03/09/2001
FINALIZACIÓN: 28/02/2003
9
II. INFORME
2.1. INTRODUCCION
La presente investigación tuvo como fin principal continuar con la adaptación de
un método de embriogénesis somática para la producción de embriones asexuales de
pinabete (Abies guatemalensis Redher). La Fase I de esta investigación se realizó en el
período 1999-2000 logrando la inducción de callo embriogénico a partir de embriones
sexuales maduros de pinabete(Informe final presentado a CONCYT, Proyecto 20-98,
febrero 2000).
En esta investigación se procedió la inducción de embriogénesis somática en Abies
guatemalensis, evaluando diferentes combinaciones hormonales y factores físicos como
la intensidad de luz, ya que en la inducción de embriogénesis es bien sabido que éste es
un factor que afecta el crecimiento de tejido embriogénico provocando oxidación en
muchas especies vegetales, particularmente en las coníferas (9,13,17). También se
evaluó diferentes concentraciones de Acido Abscícico (ABA) y clases de azúcar para
lograr la generación y desarrollo de embriones somáticos de pinabete.
Al final se determinó que la mejor combinación hormonal para la proliferación de callo
es 2.0 mg/l de 2,4-D más 1.0 mg/l de BAP. En cuanto al efecto de la luz sobre la
formación de embriones somáticos se encontró que los tratamientos establecidos bajo
condiciones de obscuridad y semiobscuridad fueron efectivos sobre la generación de
embriones somáticos de Abies guatemalensis Redher, evitando la fotooxidación de los
callos embriogénicos. El cultivo líquido en suspensión bajo condiciones de obscuridad,
fue efectivo en la inducción de embriones somáticos de Abies guatemalensis Redher,
evitando la fotooxidación de los callos embriogénicos.
No se encontró diferencia entre los tipos de azúcar evaluados pero si se encontró
diferente respuesta en la formación de embriones somáticos de acuerdo con la
concentración de ABA. Se determinó que el tratamiento con ABA (10 mg/l) + Maltosa
(40 g/l) presentó un mayor porcentaje de formación de proembriones globulares de
Abies guatemalensis Redher, seguido del tratamiento con ABA (10 mg/l) + Sacarosa
(20 g/l), tanto bajo condiciones de obscuridad así como de semi-obscuridad.
Los embriones aun no alcanzaron su maduración, hasta la fecha de este informe, pero se
considera que se avanzó una gran parte en el proceso de inducción de embriones
somáticos por lo que se recomienda continuar la investigación para lograr la maduración
de los embriones somáticos generados.
2.2. PALABRAS CLAVE
Pinabete, Abies guatemalensis, callo, embriogénesis somática, cultivo de tejidos.
2.3. ANTECEDENTES
El género Abies constituye uno de los grupos más grandes dentro de la coníferas,
comprendiendo cerca de 50 especies (11), las cuales integran las regiones boscosas altas
del hemisferio norte y, se pueden encontrar respectivamente, en masas puras o asociadas
con otras coníferas como Picea, Tsuga, Pseudotsuga, Larix, Juniperus y Pinus(6). El
género Abies tiene su habitat natural en Europa, Asia, Norte América y la parte norte de
Africa (11).
10
El pinabete (Abies guatemalensis Redher) es la especie más austral y se
establece en poblaciones aisladas en las montañas de Guatemala y México entre
latitudes de 14 y 15 N.(4) Incluso se le puede encontrar en las partes altas de Honduras
y El Salvador(22).
La madera de Abies, es preferida entre otras coníferas debido a su suavidad y a
su utilidad como combustible (16) además se comercializa como arbolitos navideños
(22).
La explotación de los rodales por parte de los exportadores de madera, de las
personas que lo utilizan como leña y ornamento y de los campesinos que buscan la
ampliación de la frontera agrícola, ha permitido que las poblaciones de esta especie se
reduzcan considerablemente en Guatemala, a tal punto que en 1941 se colocó a esta
especie dentro de la lista de protección de especies arbóreas y de fauna, en 1979 el
Servicio de Pesca y Fauna Silvestre declaró a Abies guatemalensis como una especie en
vías de extinción (8), y también CITES (Convención sobre Comercio de Especies en
Peligro de Extinción) ha declarado esta especie en peligro de extinción(16)
La especie presenta alta variación en la producción de frutos y semillas, los
cuales muestran porcentajes altos de embriones inmaduros, semillas vanas y baja
germinación (22) En un estudio reciente se determinó que el porcentaje de semilla con
embrión es únicamente del 8.1%, en semilla proveniente de los bosques de Totonicapán,
además el daño provocado por la larva del insecto Megastigmus spp. es considerable ya
que se alimenta de los embriones del pinabete (15).
Esta situación limita la posibilidad de conservar esta especie y utilizarla en todo
su potencial. De ahí que el desarrollo de un protocolo para la propagación de pinabete a
través de embriogénesis somática, como un método de propagación clonal, es planteado
en este proyecto.
Embriogénesis somática se define como una vía de diferenciación vegetal,
inducida en células, tejidos, o cultivo de órganos mediante un apropiado control de las
condiciones nutricionales y hormonales que resulta en la formación de estructuras
organizadas denominadas embrioides. Bajo condiciones apropiadas de cultivo, estas
estructuras pueden desarrollarse hasta formar plantas completas. La producción de una
planta completa (hojas y raíces verdaderas) a partir de un embrión somático se
denomina conversión (34). Embriogénesis somática ha sido también definida como la
formación de una estructura en la cual un punto de crecimiento foliar y uno radicular
desarrollan en la misma secuencia temporal tal y como se observa en el desarrollo de un
embrión zigótico. En la practica esta definición es virtualmente imposible de aplicar
completamente, y normalmente una estructura en la cual el desarrollo de brotes y raíces
ocurre mas o menos al mismo tiempo es considerada un embrión (26).
Los embriones somáticos desarrollan a partir de células embriogénicas de tejido
vegetativo para formar pro-embriones globulares y continúan en las etapas de corazón y
torpedo presentando una morfología similar a sus contrapartes zigóticos (17).
La producción masiva de embriones en cultivo de células provee un excelente
sistema para el estudio de la iniciación de embriones y el subsecuente proceso de
embriogénesis. En efecto, Komamine y sus asociados fueron capaces de establecer un
sistema sincronizado de embriogénesis somática de alta frecuencia, en zanahoria,
mediante la selección de células aisladas. Estas células eran pequeñas, redondas y con
abundante citoplasma, y llegaron a producir agregados de células embriogénicas al ser
tratadas con auxina, zeatina, manitol y una alta concentración de oxígeno (18).
En la embriogénesis somática, el desarrollo organizado de embriones puede
ocurrir directamente sobre el explante o indirectamente a través de callo, el cual es un
11
tejido de parénquima herido. Aunque, embriogénesis somática y callogénesis son vistos
como dos vías distintas de reorganización, estas representan una continuidad, como se
evidencia en los tejidos que diferencian después de un grado pequeño de formación de
callo. Esto puede ser interpretado como el tiempo que toma establecer la competencia
de ser capaz de responder a las señales inductivas (4). Esta teoría, expresada como la
teoría de la determinación en embriogénesis somática, sostiene que las células que
pasan por la iniciación de embriones son embriogénicas desde el principio y que las
condiciones de cultivo in vitro simplemente proveen la oportunidad para que ocurra la
embriogénesis (25).
Las células somáticas, embriogénicas o no, que son removidas del estado
embriogénico son generalmente mas fácilmente inducidas a pasar por embriogénesis
somática que las células vegetativas diferenciadas. En contraste, células altamente
diferenciadas parecen requerir grandes cambios epigéneticos. La implicación de estos
enunciados es que el programa para desarrollo organizado es de tipo intrínseco, en el
cual condiciones externas precisas, a las que las células están sujetas son necesarias para
permitir esta diferenciación. El resultado neto es que las células pasan por patrones
precisos de división celular llegando a la formación de agregados de células
proembriogénicas y por último a un embrión (21).
Usualmente, lo que promueve la embriogénesis en los cultivos es la remoción de
auxina, o la sustitución de una auxina menos potente, como por ejemplo ANA, por una
mas potente, por ejemplo 2,4-D. Muchos cultivos necesitan tratamiento con una auxina
fuerte (usualmente 2,4-D), previo a este paso de promoción, con el fin de lograr una tasa
de división celular alta requerida para la iniciación de embriones. Las últimas etapas de
embriogénesis son usualmente independientes de las hormonas (p. ej. hay producción
suficiente de hormonas endógenas). De hecho, la adición de hormonas en este tiempo,
usualmente interrumpe el desarrollo del embrión (26).
Es claro que aunque los reguladores de crecimiento exógenos juegan un papel
crucial en la manipulación del desarrollo organizado, esto ocurre en concordancia con
otros factores. A pesar de que la tendencia de un tejido establecido en un medio para
formar embriones es aparentemente dependiente de la especie. Por ejemplo, el tabaco
generalmente forma órganos y raramente embriones, mientras que la zanahoria muestra
una tendencia inversa. Una excepción parece ser los tejidos embriogénicos de
coníferas, los cuales pueden ser diferenciados por organogénesis o embriogénesis (31).
Factores tales como, régimen de iluminación, concentraciones del medio basal,
sacarosa, composición y nivel de nitrógeno, elementos minerales, agar, reguladores de
crecimiento y pH afectan la inducción de embriogénesis somática. De ahí que, la
selección propiamente empírica del medio nutritivo y las condiciones ambientales del
cultivo permiten a las células competentes demostrar su capacidad intrínseca para el
desarrollo organizado, lo cual es en última instancia un reflejo de la actividad genética
de selección (10).
La embriogénesis somática puede ser inducida a partir de callos, células en suspensión y
protoplastos, o directamente desde células de estructuras organizadas tales como
segmentos de tallos o embriones cigóticos. Este método esta siendo aplicado a un
amplio rango de géneros y especies como una herramienta para la obtención rápida de
grandes números de plantas élite o resistentes a enfermedades. Aún más, un proceso
bien controlado de embriogénesis somática podría ser útil para la selección in vitro de
plantas resistentes a enfermedades y/o transformación genética (12).
La embriogénesis somática provee un sistema ideal de experimentación para la
investigación sobre diferenciación de plantas tanto como de los mecanismos de
12
totipotencia en células vegetales. Los embriones somáticos son también fuente
importante de protoplastos totipotentes que pueden ser útiles para conservación de
germoplasma a largo plazo, por ejemplo, dormancia inducida, semillas artificiales,
almacenamiento en frío, almacenamiento en seco o para crioconservación(29).
La embriogénesis somática es actualmente vista como un método alternativo de
propagación para varias especies. Una vez que un protocolo in vitro es definido, este
puede probar ser un método más efectivo para la propagación acelerada de plantas
seleccionadas. La secuencia de pasos que conduce a la producción de plantas incluye
inducción, mantenimiento del tejido, maduración y germinación de embriones
somáticos, y aclimatización de plantas (10).
Como un método de regeneración de plantas, embriogénesis somática tiene
varias ventajas sobre organogénesis, aunque aun no está tan desarrollado. Las ventajas
incluyen la eficiencia del proceso asociado con un sistema rápido de multiplicación de
plantas (la formación de plántulas en pocos pasos, con una reducción inherente en mano
de obra, tiempo y costos), y el potencial para la producción de un número mucho más
grande de plantas. También el potencial para generar semillas artificiales y
eventualmente para usarlo en un sistema automatizado, y sistemas de suspensiones que
pueden proveer protoplastos embriogénicos que pueden ser usados para ingeniería
genética (31).
La tecnología par la producción de semillas artificiales y cultivo de suspensiones
embriogénicas a gran escala esta progresando. Semillas artificiales, obtenidas a través
de la encapsulación de embriones somáticos después de desecación o hidratación,
provee un medio de reducir los costos de producción de material clonal, incrementando
la conservación a largo plazo de embriones somáticos y un mecanismo a través del cual
el proceso de establecimiento en el campo puede ser mecanizado (10).
Desde que la embriogénesis somática tuvo éxito con coníferas en 1985,
numerosos investigadores alrededor del mundo han aplicado la tecnología a una amplia
variedad de especies de coníferas. Las investigaciones se han enfocado principalmente
en el desarrollo de métodos de inducción y maduración de embriones somáticos con la
subsecuente regeneración de plantas (3).
En angiospermas, el primer reporte de embriogénesis somática en especies
forestales, es de Santalum album (Rao, 1965), pero no se desarrollaron plantas
funcionales. Fue aproximadamente 20 años más tarde que se tuvo éxito con una
gimnosperma, llamada Picea abies (3). Inducción de embriogénesis somática
incluyendo la producción exitosa de plantas ha sido reportada en varias especies de
Picea, Larix, y Pinus, también para Pseusotsuga menziesii y Sequoia sempervirens.
Trabajos de embriogénesis somática en el género Abies han sido reportados con Abies
alba, Abies nordmanniana y Abies fraseri. Con Abies alba fue posible la regeneración
de plantas completas (11).
En angiospermas, varios explantes han sido usados para generar callos
embriogénicos, pero el éxito con coníferas se ha conseguido mayormente con embriones
inmaduros y maduros. En la mayoría de los casos los embriones somáticos provienen de
callos embriogénicos, pero esto no es siempre un prerequisito. En general, el medio
usado contiene altos niveles de sales, ambos Amonio y Nitrato. En adición hay un
requirimiento específico de Potasio. Una auxina, usualmente 2,4-D ó NAA (arriba de
50 uM), y en algunos casos una citoquinina (arriba de 25 uM), son necesarios. Otras
fitohormonas no son frecuentemente necesarias durante la inducción de embriones, pero
el ácido abscísico permite la maduración de los embriones, particularmente en
gimnospermas (5).
13
Mientras el número de especies que pueden ser propagadas a través de este
método ha ido incrementando, el porcentaje de recuperación de plantas es todavía bajo;
sin embargo, el potencial de una tasa alta de éxito existe desde que los investigadores
estimaron una media de 700 embriones somáticos por gramo de callo. Claramente, para
la adopción de esta tecnología, una tasa más alta de conversión es necesaria, pero ya se
han hecho muchos progresos en todos los aspectos de embriogénesis somática de
coníferas (33).
Respecto a trabajos de micropropagación con Abies guatemalensis Redher, en
Guatemala existe un estudio de tesis en el cual se evalúa la respuesta de pinabete a la
reproducción vegetativa in vitro utilizando diferentes combinaciones hormonales (9).
En este estudio no se llega a la regeneración de plantas completas debido a que no hubo
respuesta favorable en la formación de plantas con ninguno de los tratamientos.
También se ha intentado con poco éxito el cultivo in vitro de ápices vegetativos ya que
no se ha podido producir plantas enraízadas (14). Además han existido intentos por
enraizar microestacas de pinabete, bajo condiciones de invernadero, pero con muy poco
éxito.
En lo que se refiere a la inducción de embriogénesis somática en Abies
guatemalensis, el único trabajo en el que se emplea este método corresponde a la FASE
I de esta investigación. Se determinó el porcentaje de contaminación de los explantes,
el porcentaje de formación de callo, el tiempo para la formación de callo, el mejor
medio de cultivo y tipo de explante con mejor respuesta a la inducción de callo. El
principal problema que se encontró fue la oxidación debida la producción de fenoles
que provocaban la muerte del callo embriogénico. En esta investigación se continuó con
la inducción de embriogénesis somática en Abies guatemalensis, evaluando factores
físicos como la intensidad de luz, ya que en la inducción de embriogénesis es bien
sabido que éste es un factor que afecta el crecimiento de tejido embriogénico
provocando oxidación, en muchas especies vegetales, particularmente en las coníferas
(11,17,23). También se evaluó diferentes tipos de hormonas vegetales y clases de azúcar
para lograr la generación y desarrollo de embriones somáticos de pinabete.
Al final se determinó que la mejor combinación hormonal para la proliferación de callo
es 2.0 mg/l de 2,4-D más 1.0 mg/l de BAP. En cuanto al efecto de la luz sobre la
formación de embriones somáticos se encontró que los tratamientos establecidos bajo
condiciones de obscuridad y semiobscuridad fueron efectivos sobre la generación de
embriones somáticos de Abies guatemalensis Redher, evitando la fotooxidación de los
callos embriogénicos.
No se encontró diferencia entre los tipos de azúcar evaluados pero si se encontró
diferente respuesta en la formación de embriones somáticos de acuerdo con la
concentración de ABA. Se determinó que el tratamiento con ABA (10 mg/l) + Maltosa
(40 g/l) presentó un mayor porcentaje de formación de proembriones globulares de
Abies guatemalensis Redher, seguido del tratamiento con ABA (10 mg/l) + Sacarosa
(20 g/l), tanto bajo condiciones de obscuridad así como de semi-obscuridad.
Los embriones no alcanzaron su maduración, al final de esta investigación, pero se
considera que se avanzó en gran parte en el proceso de inducción de embriones
somáticos por lo que se recomienda continuar la investigación para lograr la maduración
de los embriones generados.
2.4. OBJETIVOS
14
2.4.1. GENERAL
ƒ
Adaptar un método de embriogénesis somática para la producción de embriones
somáticos de Abies guatemalensis Redher.
2.4.2. ESPECIFICOS
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
Evaluar diferentes combinaciones hormonales para la proliferación de callo
generado a partir de embriones sexuales de pinabete.
Evaluar diferentes combinaciones hormonales para la generación de embriones
somáticos.
Evaluar el efecto de diferentes intensidades de luz y condiciones de obscuridad
en la formación de embriones somáticos.
Evaluar el efecto de diferentes clases de azúcar separados, y combinados con
ácido Abscícico sobre el desarrollo y maduración de los embriones somáticos
generados.
Evaluar la respuesta de formación de embriones somáticos.
Determinar la etapa de maduración de los embriones generados.
2.5. METODOLOGIA
2.5.1 HIPOTESIS
1. Por lo menos una de las combinaciones hormonales evaluadas será efectiva en la
proliferación de callo embriogénico de Abies guatemalensis Redher.
2. Por lo menos una de las combinaciones hormonales evaluadas será efectiva en la
generación de embriones somáticos de Abies guatemalensis Redher.
3. Por lo menos uno de los tratamientos con intensidades de luz y condiciones de
obscuridad evaluados será efectivo sobre la generación de embriones somáticos
de Abies guatemalensis Redher.
4. Al evaluar diferentes clases de azúcar sobre el desarrollo de embriones
somáticos se encontrará una respuesta positiva en por lo menos uno de los
tratamientos, ya que se observará una etapa más avanzada de desarrollo en
comparación con la etapa inicial.
2.5.2. MATERIAL VEGETAL Y CONDICIONES DE CULTIVO
15
Se utilizó semilla proveniente de un área en donde se encuentra en forma natural
la especie objeto de esta investigación (Totonicapán). Se dispuso de dos lotes de
semillas, uno colectado a finales del año 2000 y el otro a finales del 2001. Se
identificaron como lote 2000 y lote 2001. El medio basal de cultivo fue MCM
(Bornman & Jansson, 1981), solidificado con Agar TM (Sigma Chemical Co.) en una
concentración de 0.7 %. En todos los experimentos el pH del medio fue ajustado a 5.8
previo a ser autoclaveado a 121 grados centígrados durante 20 minutos. Cuando se
utilizó fitohormonas, éstas fueron adicionadas antes de ajustar el pH. Dependiendo de
las especificaciones, algunas hormonas fueron autoclaveadas y otras filtradas.
Al menos que sea específicamente indicado las condiciones de cultivo, en el
cuarto de crecimiento fueron las siguientes: Temperatura, 24± 2oC, bajo un fotoperíodo
de 16 horas de luz y 8 de obscuridad con luz blanca fluorescente (50 µmol m-2s-1 ).
2.5.3. ETAPAS DE LA INVESTIGACIÓN
2.5.3.1. SELECCIÓN Y TRATAMIENTO DE SEMILLAS
Se obtuvieron las semillas, se eliminaron aquellas que presentaban daño
mecánico, daño por insectos y síntomas de microorganismos (hongos). Las semillas
seleccionadas se colocaron bajo tratamiento en frío a 4 grados centígrados, en
recipientes plásticos, herméticos, durante 4 semanas (figura 1).
Después de este período de tiempo se procedió a eliminar una de las cubiertas
exteriores para realizar la desinfección superficial de las semillas, previo al cultivo in
vitro.
SELECCION DE SEMILLAS
Se separó la semilla de los conos y se colocó en bolsas de plástico, se obtuvo
aproximadamente 1kg de semilla.
Seguidamente se procedió a obtener las semillas con embrión, para esto se eliminó la
cubierta superior y se procedió a abrir uno de los extremos de cada una de las semillas
para comprobar si tenían embrión.
2.5.3.2. DESINFECCIÓN SUPERFICIAL E INDUCCIÓN DE CALLO
Desinfección de las semillas. Se procedió a la desinfección de las semillas con
Etanol al 70% y a una inmersión en solución de Hipoclorito de Sodio al 1% ia, seguido
por varios lavados en agua destilada estéril para la eliminación de los residuos de los
desinfectantes.
Disección de las semillas. Se diseccionaron las semillas para la obtención de
embriones bajo condiciones completamente asépticas, dentro de la cámara de flujo
laminar. La obtención de los embriones se realizó bajo un microscopio-estereoscopio
(figura 2).
Inducción de callo. A partir de los resultados obtenidos en la FASE I de esta
investigación se decidió utilizar el medio MCM (Bornman & Jansson, 1981) ya que de
16
acuerdo con nuestros resultados y la literatura consultada este medio ha sido efectivo en
la inducción de embriogénesis somática de varias especies coníferas.
El medio MCM fue suplementado con 2,4-D + BAP (1.0 mg/l + 0.1 mg/l);
Sacarosa (30 g/l);) Agar (0.7 %). El pH fue ajustado a 5.8.
Se establecieron 300 embriones in vitro para la inducción de callo. Se colocó 1
embrión en un tubo de ensayo (150 x 25 mm) sobre la superficie del medio de cultivo.
2.5.3.3. PROLIFERACIÓN DE CALLO
Los callos que se obtuvieron de la fase de inducción se establecieron en un
medio de proliferación para aumentar el volumen inicial de callo e inducir la
diferenciación celular. En este experimento y en los posteriores solo se utilizó los callos
provenientes del lote 2001.
Se utilizó el medio MCM con las mismas concentraciones de Sacarosa y Agar
como en la etapa de Inducción.
Se evaluaron diferentes niveles y combinaciones de auxina (2,4-D) y citoquinina (BAP).
Las concentraciones de las hormonas fueron las siguientes:
0.1, 1.0, 2.0 y 5.0 mg/l de 2,4-D
0.1 y 1.0 mg/l de las citoquinina BAP
Se establecieron 10 repeticiones por tratamiento, 5 porciones de callo en cada
caja petri, considerando cada plato petri como una unidad experimental
Diseño experimental: Factorial en un arreglo completamente al azar.
Variables de respuesta: Incremento en volumen y peso de callo
Parámetros:
- Volumen relativo de callo*
- Peso de callo
*El volumen relativo de callo se refiere al incremento en el volumen inicial de
callo medido en mm3 por cada subcultivo
Con el fin de mejorar las características embriogénicas de los callos en
proliferación, éstos fueron colocados en cajas petri conteniendo el medio MCM
suplementado con 2,4-D + BAP (2.0 mg/l + 1.0 mg/l) y sacarosa 20 g/l. Se evaluó el
uso de dos tipos de gelificante: Agar (6g/l) y Phytagel (3g/l) bajo condiciones de semiobscuridad y obscuridad completa.
Se tomaron datos de otras características visuales de los callos generados: Color,
compacidad, apariencia externa. Se realizaron observaciones en el estereoscopio para
determinar la morfología de las células y montajes microscópicos para establecer el
estado celular de los callos obtenidos.
17
2.5.3.4. GENERACIÓN Y DESARROLLO DE EMBRIONES
Se transfirieron los callos a cultivo en suspensión tomando el mejor tratamiento de la
etapa anterior. Se escogieron los callos que presentaron mejor respuesta en proliferación
y características morfológicas y celulares propias de un tejido embriogénico. Se colocó
aproximadamente 1 g de callo embriogénico en medio líquido dispensado en
erlenmeyer de 100 ml (50 ml de medio), utilizando un rotador para cultivos en líquido a
5 RPM. Para establecer la proliferación en cultivo en suspensión se utilizó el medio
MCM + 2,4-D 2.0 mg/l + BAP 1.0 mg/l y para continuar con la etapa de desarrollo de
embriones se utilizó el Medio MCM libre de hormonas, con el objetivo de eliminar el
efecto de las fitohormonas utilizadas en la etapa de proliferación.
A partir de que uno de los problemas de la FASE I fue la muerte de los callos
debido a la oxidación producida por fenoles se evaluaron diferentes intensidades de luz
y condiciones de obscuridad para resolver este problema, ya que en la mayor parte de
las investigaciones de la literatura consultada se estableció que intensidades muy altas
de luz provocan oxidación de los tejidos embriogénicos en muchas especies vegetales
incluyendo las especies de coníferas.
Los tratamientos fueron los siguientes:
- Dos intensidades de luz
o
Alta: 50 µmol m-2s-1
o
Baja: 10 µmol m-2s-1
- Tratamiento en obscuridad
Se evaluaron dos tipos de azúcar para inducir el desarrollo de los embriones
generados. Los azucares que se evaluaron son: Sacarosa y Maltosa, en concentraciones
de 20.0 y 40.0 mg/l, combinados con el medio de cultivo MCM. Los azucares se
evaluaron en combinación con ABA, en concentraciones de 5.0 y 10.0 mg/l. También
se adicionó PEG en concentración de 5 g/l, previo a autoclavear el medio de cultivo.
Se establecieron 10 repeticiones por tratamiento, 5 porciones de callo (5 mm de
diámetro) por caja petri.
Variables de respuesta: Oxidación del callo embriogénico y
Formación de embriones
Parámetros:
-
- % de oxidación*
% de embriones formados
Etapa de desarrollo de los embriones **
*El % de oxidación se determinó con un índice visual de oxidación que estuvo
dado por el color que presenta el tejido embriogénico, de esta manera:
No oxidación= color blanco a crema, o verde.
Oxidación baja= color café claro (beige) (+)
Oxidación media= color café (++)
Oxidación alta= color café obscuro a negro (+++)
** Las etapas de desarrollo se refieren a las fases: globular, corazón y torpedo.
18
Todos los experimentos se repitieron por lo menos 3 veces para darle confiabilidad a los
resultados y asegurar la repetibilidad de los resultados.
2.6. RESULTADOS Y DISCUSION
2.6.1. SELECCIÓN DE LAS SEMILLAS
En el lote 2000, se encontró aproximadamente un 5% de semillas con embrión y
un 15% de semillas con larvas de insecto las cuales fueron eliminadas, así como
aquellas semillas que presentaban signos de hongos.
En el lote 2001, se encontró aproximadamente un 10% de semillas con embrión
y un 5% de semillas con larvas de insecto las cuales fueron eliminadas así como
aquellas semillas que presentaban signos de hongos.
2.6.2. INDUCCIÓN DE CALLO
De acuerdo con las observaciones realizadas se obtuvo los siguientes resultados
en la etapa de Inducción de Callo:
CUADRO1. RESPUESTA DE LOS EMBRIONES ZIGÓTICOS DE Abies
guatemalensis A LA INDUCCIÓN DE CALLO EN EL CULTIVO IN VITRO
RESPUESTA
LOTE 2000 LOTE 2001
Explantes formando callo
20%
40%
Explantes contaminados hongos
15%
10%
Explantes contaminados bacterias
5%
5%
Sin respuesta (no callo)
60%
45%
Fuente: Laboratorio de Cultivo de Tejidos, Sub-Programa de Biotecnología,
ICTA, Quetzaltenango, 2003.
Con el lote 2000, se obtuvo un porcentaje de inducción de callo relativamente
bajo (20%), esto se debió en gran parte al tiempo que tenía la semilla de haber sido
cosechada (10 meses) ya que esta semilla pierde su viabilidad progresivamente. El
porcentaje de explantes que formaron callo afecta en alguna medida los experimentos,
ya que en esta etapa inicial es necesario disponer de cierta cantidad de explantes con
callo para evaluar en la Etapa de Proliferación las diferentes concentraciones
hormonales previstas en esta etapa.
La semilla de pinabete, conservada a temperatura ambiente por más de 6 meses
pierde considerablemente su viabilidad y por ende la capacidad de formación de callo
(20%).
De acuerdo con los resultados anteriores se decidió seleccionar los árboles
semilleros de pinabete para la recolección de semilla nueva con el fin de asegurar un
porcentaje alto de inducción de callo y una mejor respuesta embriogénica, ya que de
19
acuerdo con la experiencia que se tiene sobre esta área y según la literatura consultada,
la capacidad embriogénica es mayor en los embriones de semillas recién cosechadas
(embriones jóvenes), capacidad que declina marcadamente con el tiempo (meses).
Con el lote 2001, se obtuvo un porcentaje de inducción de callo más alto (40%)
que el que se obtuvo con el lote de semillas (2000) ya que como se señaló anteriormente
esto se debió en gran parte al tiempo que tenía la semilla de haber sido cosechada (10
meses) ya que esta semilla pierde su viabilidad progresivamente. El porcentaje de
explantes que formaron callo afecta en alguna medida los experimentos, ya que en esta
etapa inicial es necesario disponer de cierta cantidad de explantes con callo para evaluar
en la Etapa de Proliferación las diferentes concentraciones hormonales previstas en esta
etapa.
Observaciones al microscopio:
En la figura 3, se puede observar un explante formando callo. La apariencia morfológica
de este callo indica que posee las características de un callo blancuzco, friable, con
capacidad embriogénica.
En las figuras 6 y 7, se observa un tipo de célula redonda, isodiamétrica, propia de un
callo con capacidad embriogénica.
2.6.3. PROLIFERACIÓN DE CALLO
Se encontró una mayor respuesta en la formación relativa de callo, con la
combinación hormonal 2,4-D (2.0 mg/l) más BAP (1.0 mg/l).
Se observó una mayor proliferación de callo en el tratamiento bajo condiciones de
obscuridad sobre agar (figura 4), en comparación con el callo que proliferó bajo
condiciones de semi-obscuridad que presenta una coloración verde debido a la
formación de pigmentos causada por la presencia de luz indirecta. Es importante hacer
énfasis en el hecho de que si bien se persigue la proliferación de callo también se trata
de evitar otros problemas colaterales, en este caso la oxidación de los callos es un
problema serio ya que provoca la muerte de las células impidiendo el crecimiento, por
lo que se trata de evitar este problema en la medida de lo posible.
20
CUADRO 2.
PROLIFERACIÓN DE CALLO EN CULTIVOS DE Abies
guatemalensis EN DIFERENTES COMBINACIONES DE 2,4-D Y BAP
DURANTE DOS CICLOS DE CULTIVO.
%
EXPLANTES
CON CALLO
FORMACION
RELATIVA DE
CALLO*
INCREMENTO
DE CALLO*
TRATAMIENTO
COMBINACIÓN
DE
FITOHORMONA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2,4-D+BAP
(mg/l)
0.1 + 0.1
0.5 + 0.1
1.0 + 0.1
2.0 + 0.1
5.0 + 0.1
0.1 + 1.0
0.5 + 1.0
1.0 + 1.0
2.0 + 1.0
5.0 + 1.0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
+
++
+++
+++
+
Menos de +
Menos de +
+
++++
+
+
++
+++
++
++
Menos de +
Menos de +
++
+++
+
*Cantidad relativa de callo + = 5 mm 2
Fuente: Laboratorio de Cultivo de Tejidos, Sub-Programa de Biotecnología, ICTA,
Quetzaltenango, 2003.
2.6.4. GENERACIÓN Y DESARROLLO DE EMBRIONES SOMATICOS
Se transfirieron los callos a cultivo en suspensión tomando el mejor tratamiento de la
etapa anterior. Se escogieron los callos que presentaron mejor respuesta en proliferación
y características morfológicas y celulares propias de un tejido embriogénico. Se colocó
aproximadamente 1 g de callo embriogénico en medio líquido dispensado en
erlenmeyer de 100 ml (50 ml de medio), utilizando un rotador para cultivos en líquido a
5 RPM. Para establecer la proliferación en cultivo en suspensión se utilizó el medio
MCM + 2,4-D 2.0 mg/l + BAP 1.0 mg/l y para continuar con la etapa de desarrollo de
embriones se utilizó el Medio MCM libre de hormonas, con el objetivo de eliminar el
efecto de las fitohormonas utilizadas en la etapa de proliferación. Se determinó que el
cultivo en suspensión fue efectivo en la generación de pro-embriones somáticos así
como en la reducción de oxidación cuando los cultivos se mantuvieron en la obscuridad,
tanto para proliferación como para desarrollo de embriones (figuras 5 y 6).
De acuerdo con las observaciones que se realizaron, se determinó que con los
tratamientos T2O, T2L, T4O y T4L se encontró una mayor acumulación de substancias
de reserva, bajo condiciones de microscopio-estereoscopio se encontró un tipo de
estructura consideradas pro-embriones globulares hialinos o de color blanco a blancocrema (Cuadro 1). Tanto los tratamientos bajo condiciones de obscuridad, así como de
semi-obscuridad (10 µmol m-2s-1), dieron porcentajes similares de formación de
embriones inmaduros (figuras 11 y 12), mientras que en la intensidad de luz alta (50
µmol m-2s-1) no se observó la formación de estructuras globulares debido a que la
oxidación inhibió totalmente el desarrollo de embriones (figuras 7 y 8).
21
CUADRO 3. PORCENTAJE DE OXIDACIÓN Y FORMACIÓN DE
EMBRIONES GLOBULARES DE Abies guatemalensis.
TRATAMIENTO
OXIDACIÓN
ÍNDICE
%
FORMACIÓN
EMBRIONES
GLOBULARES %
Obscuridad
T1O
+
60
-T2O
+
40
40
T3O
+
80
10
T4O
+
50
30
Semi-obscuridad
T1L
+
100
-T2L
+
60
30
T3L
+
80
-T4L
++
80
20
Luz
T1LL
+++
100
0
T2LL
+++
100
0
T3LL
+++
100
0
T4LL
+++
100
0
Fuente: Laboratorio de Cultivo de Tejidos, Sub-Programa de Biotecnología,
ICTA, Quetzaltenango, 2003.
Identificación de los tratamientos
Condiciones de obscuridad:
T1O = ABA ( 5mg/l) + Maltosa (40 g/l)
T2O = ABA (10 mg/l) + Maltosa (40 g/l)
T3O = ABA (5 mg/l) + Sacarosa (20 g/l)
T4O = ABA (10 mg/l) + Sacarosa (20 g/l)
Condiciones de semi-obscuridad (luz)
T1L = ABA ( 5mg/l) + Maltosa (40 g/l)
T2L = ABA (10 mg/l) + Maltosa (40 g/l)
T3L = ABA (5 mg/l) + Sacarosa (20 g/l)
T4L = ABA (10 mg/l) + Sacarosa (20 g/l)
Condiciones de luz
T1LL = ABA ( 5mg/l) + Maltosa (40 g/l)
T2LL= ABA (10 mg/l) + Maltosa (40 g/l)
T3LL = ABA (5 mg/l) + Sacarosa (20 g/l)
T4LL = ABA (10 mg/l) + Sacarosa (20 g/l)
El % de oxidación se determinó con un índice visual de oxidación que estuvo
dado por el color que presenta el tejido embriogénico, de esta manera:
No oxidación= color blanco a crema, o verde.
Oxidación baja= color café claro (beige) (+)
22
Oxidación media= color café (++)
Oxidación alta= color café obscuro a negro (+++)
2.6.5. DISCUSION DE RESULTADOS
Hasta la fecha no existen reportes en la literatura científica de haber obtenido
éxito en la propagación vegetativa de Abies guatemalensis. Se ha intentado algunos
métodos, como por ejemplo cultivo de ápices vegetativos, yemas apicales y axilares
(8,14). Sin embargo los resultados han sido negativos en la regeneración de plantas
completas.
El método de embriogénesis somática se ha aplicado con éxito en muchas
especies vegetales, en algunos casos directamente a partir de embriones cigóticos y en
otros pasando por una etapa intermedia de callo. Embriogénesis somática ha sido
reportada en varias especies de coníferas como Picea, Larix y Pinus(29), y
específicamente para el género Abies, se ha reportado éxito con el uso de este método
en Abies alba y Abies nordmanniana (23, 24, 11, 29).
De acuerdo con la literatura el uso de diferentes hormonas vegetales, solas y
combinadas, es necesario para la inducción de embriogénesis somática en el género
Abies(24).
Se sabe que hay varios factores que afectan el comportamiento in vitro de las
especies vegetales, principalmente el genotipo, la etapa de desarrollo del explante inicial
y el potencial del medio de cultivo (21). Hay que dejar en claro que la embriogénesis
somática no se induce solo artificialmente, también se da en la naturaleza, por ejemplo a
partir del tejido de nucela de Citrus. Este ejemplo también ilustra sobre el efecto del
genotipo sobre la formación de embriones somáticos. De ahí que especies del género
Citrus que son naturalmente poliembriónicas, producen cultivos que son altamente
embriogénicos y las especies que son naturalmente monoembriónicas, usualmente
producen pocos embriones somáticos(26). La inducción de embriogénesis somática en
Pinus, esta influenciada por el origen de las semillas, el logro de un sola línea
embriogénica podría deberse a una mayor competencia de algunas de las semillas (21).
Se han reportado resultados muy variables para Pinus nigra, dependiendo tanto
del año de la recolección de la semilla así como de la etapa del embrión zigótico, estos
factores afectan no solo la inducción de tejido embriogénico, sino también la inducción
de callo no embriogénico (21). En el presente estudio, se encontró que la semilla de
Abies guatemalensis, conservada a temperatura ambiente por más de 6 meses pierde
considerablemente su viabilidad y por ende la capacidad de formación de callo (20%)
(Cuadro 1). Esto concuerda con lo reportado en Eucalyptus dunni, ya que se determinó
que los explantes provenientes de embriones cigóticos jóvenes, poseen una mayor
capacidad para le inducción de embriones somáticos (30).
En la inducción de embriogénesis, está claro que existen dos componentes del
medio de cultivo que tienen un papel crucial, auxina y nitrógeno (31). La importancia de
las auxinas, fue reconocida por primera vez por Halperin y Wetherell (27), quienes
encontraron que la transición de callo en proliferación a tejido embriogénico puede ser
inducida por una sola clase de hormona, las auxinas, en el cultivo de células de
zanahoria cultivada y silvestre. En presencia de una auxina exógena adicionada al
medio de cultivo, usualmente 2,4-D, la proliferación de los callos puede mantenerse,
mientras que cuando la auxina es removida del medio, la mayoría de las células
diferencia hacia embriones asexuales (zanahoria).
23
Varios estudios han demostrado que el proceso de inducción de embriogénesis
somática conlleva dos etapas, primero la inducción de células con competencia
embriogénica (denominadas también masas embriogénicas, proembriones, tejido
embriogénico, etc.), en la presencia de altas concentraciones de auxina; y segundo, el
desarrollo de las masas embriogénicas hacia embriones somáticos, en ausencia de
auxina o a una baja concentración de ésta. 2,4-D, es la más comúnmente usada (31).
Se sabe que los reguladores del crecimiento tienen un papel muy importante en la
generación de callo y en la inducción de embriogénesis somática (29, 32). En general
una combinación de auxina con una concentración más baja de citoquinina, ha sido
ampliamente usada para la iniciación de callo embriogénico. Una respuesta activa de
proliferación fue encontrada en Abies alba Mill, con la combinación de 2,4-D más BAP
o Kinetina ( 28). Una respuesta similar fue encontrada en Eryngium foetidum (13) y
Aesculus glabra Willd, ya que callo embriogénico se formó en medio conteniendo 2,4D más Kin, y se encontró que el 2,4-D solo, no fue suficiente para la inducción de tejido
embriogénico.
Varias publicaciones reportan que la inducción de embriones somáticos fue
llevada a cabo a partir de varios tipos explantes en un medio adicionado con 2,4-D, pero
un desarrollo posterior de los embriones fue posible después de la remoción de esta
auxina (1).
Los resultados de este estudio, confirman la efectividad en el uso de una auxina
(2,4-D) combinada con una citoquinina (BAP) en la proliferación de callo embriogénico
de Abies guatemalensis. El tratamiento más efectivo en la proliferación de callo fue 2.0
mg/l de 2,4-D más 1.0 mg/l de BAP. Se presentaron las características asociadas con un
tipo de callo embriogénico, células isodiamétricas y células suspensorias (figuras 9, 10
y 11), el desarrollo de embriones tempranos ocurrió después de la remoción de 2,4-D
del medio de cultivo (figura 12). La combinación de 2,4-D y BAP, mejoró la
proliferación de los callos y al parecer el potencial embriogénico de estos.
De acuerdo con algunos investigadores, las citoquininas parecen estar
implicadas como un factor necesario para promover embriogénesis somática, en algunas
especies, particularmente en las coníferas (23 ). El uso de BAP en combinación con 2,4D, promovió la proliferación de callo con características embriogénicas.
De acuerdo con la literatura, se distinguen dos tipos de embriogénesis, a saber,
embriogénesis directa, en la cual una sola célula inicia un crecimiento meristemático y
todas las descendientes de ésta llegan a formar parte de un embrión, este es un caso muy
raro. Más común es la embriogénesis indirecta, en la cual un embrión desarrolla a partir
de una célula o de un grupo de células provenientes de un grupo meristemático
previamente formado. En el caso de esta investigación, la embriogénesis somática que
presentó Abies guatemalensis es indirecta, ya que agregados celulares, dieron lugar a
células suspensorias y a pequeños agregados de células, este patrón se asemeja al
descrito por Ogita (19), en esa investigación, masas de células embriogénicas, estaban
compuestas de pequeños agregados de células densas y ricas en citoplasma y de células
suspensorias.
En lo relacionado con el nitrógeno como un componente del medio de cultivo,
se ha reportado que en Abies alba, de 61 líneas iniciadas, 36 han sido propagadas en
medio de proliferación adicionado con nitrógeno orgánico (caseína) por más de dos
años. La mitad de estas líneas de células mostraron un incremento en su potencial
embriogénico que fue evidente por la formación de embriones globulares en el medio de
proliferación. La adición de 500 mg de caseína hidrolizada (CH) llevó el desarrollo de
los embriones a la etapa globular. Estos resultados indican que el desarrollo de
24
embriones somáticos en etapas avanzadas es altamente dependiente de una fuente
externa de nitrógeno orgánico (11). En Pinus nigra, se logró un desarrollo
embriogénico transfiriendo los agregados celulares sobre un medio de cultivo libre de
hormonas pero suplementado con 30 g/l de sacarosa y 0.5 g/l de CH (21). Los
resultados mencionados apoyan los de esta investigación, ya que la adición de caseína
hidrolizada fue muy importante en la promoción de los cambios morfológicos
observados en los callos embriogénicos a lo largo de los experimentos.
La concentración de ABA, para el desarrollo de embriones somáticos, está
determinada por el genotipo, así, para Abies alba se determinó un rango entre 20 a 80
μM. En este estudio se determinó que la mejor concentración de ABA fue 10.0 mg/l
(40 μM).
En varios estudios, con diferentes especies vegetales, el efecto de la intensidad
de luz sobre la embriogénesis somática, ha sido demostrado. Se sabe que la luz afecta
desde la inducción de embriogénesis somática y sobre las características morfológicas
de embriones somáticos diferenciados. La embriogénesis es muy sensible a la luz y a la
temperatura. Por ejemplo en Podophyllum hexadrum, la embriogénesis fue
completamente suprimida si la temperatura era elevada a arriba de los 27 ºC o los
cultivos eran trasnferidos a la luz. La embriogénesis volvia a tomar lugar si los cultivos
eran regresados a acondiciones de obscuridad (2). La formación de embriones en
Dysosma pleiantha es altamente sensitiva a la luz. Los callos que fueron mantenidos
bajo condiciones de luz por un período de un mes, se oxidaron, tomando una coloración
café y perdiendo el potencial para diferenciar embriones (2). De acuerdo con los
resultados del presente estudio, la intensidad de luz afectó el desarrollo del tejido
embriogénico, causando el ennegrecimiento de los callos debido a fotooxidación.
Cuando los callos fueron transferidos a medio MCM, bajo total obscuridad o
semiobscuridad (10 µmol m-2s-1 ), fue posible observar cambios morfológicos en las
estructuras formadas, se observaron embriones en su etapa globular y una acumulación
de substancias de reserva. Los callos mantenidos bajo condiciones de luz, oxidaron
después de 2 subcultivos y no fue posible observar cambios posteriores. La intensidad
de la luz más que la calidad de la misma, parece ser uno de los factores más importantes
que afecta el desarrollo de los embriones somáticos.
En esta investigación fue posible observar diferentes tipos de células, esféricas y
alargadas, además se observaron agregados celulares formados por células suspensorias
y grupos de células pequeñas isodiamétricas, estos agregados se separaban fácilmente
cuando se colocaban en medio líquido para cultivo en suspensión. Estos agregados
diferenciaron en embriones jóvenes, globulares y ligeramente alargados, que
comenzaron a acumular substancias de reserva y perdieron su aspecto hialino para pasar
a ser opacos.
De acuerdo con la literatura, los cultivos embriogénicos se caraterizan por
sectores de callo embriogénico, blancuzco, con cuerpos compactos, que son definidos
como embriones somáticos (30). Estas características corresponden con las presentadas
en los cultivos de Abies guatemalensis inducidas por los tratamientos descritos en este
estudio.
Basándose en las similitudes que presentan los cultivos embriogénicos descritos
en la literatura, se considera que los cultivos a Abies guatemalensis poseen el potencial
para continuar desarrollando a etapas más avanzadas de la embriogénesis somática y
llegar a regenerar plantas completas.
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2.7. CONCLUSIONES
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1. La combinación hormonal más efectiva para la proliferación de callo
embriogénico de Abies guatemalensis Redher fue 2.0 mg/l de 2,4-D más 1.0
mg/l de BAP.
2. El cultivo líquido en suspensión bajo condiciones de obscuridad, fue efectivo en
la inducción de embriones somáticos de Abies guatemalensis Redher, evitando
la fotooxidación de los callos embriogénicos.
3. Se determinó que el tratamiento con ABA (10 mg/l) + Maltosa (40 g/l) presentó
un mayor porcentaje de formación de embriones globulares de Abies
guatemalensis Redher, seguido del tratamiento con ABA (10 mg/l) + Sacarosa
(20 g/l), tanto bajo condiciones de obscuridad así como de semi-obscuridad.
4. Se determinó que los embriones desarrollados se encontraban en las etapas
globular y torpedo, pero no se observó suficiente acumulación de substancias de
reserva ya que en las observaciones microscópicas aún se veían transparentes.
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2.8. RECOMENDACIONES
1. Se recomienda utilizar semilla nueva de pinabete (mantenida por un tiempo no
mayor de seis meses) con el fin de asegurar un porcentaje alto de inducción de
callo.
2. En cuanto a la proliferación de callo, se recomienda mantener cultivos de callos
en proliferación, que puedan ser utilizados en experimentos de generación de
embriones somáticos.
3. Se recomienda establecer el tiempo para sub-cultivos en un período de dos
semanas para evitar la acumulación de fenoles que pueden causar la oxidación
de los cultivos.
4. Se recomienda utilizar otros tratamientos como la incubación a bajas
temperaturas (4 ˚C) y el uso de PEG (polyetilenglicol) para lograr un mayor
almacenamiento de substancias de reserva y la maduración de los embriones
formados.
5. Se recomienda continuar con la investigación para lograr la maduración de los
embriones generados en este estudio y la regeneración de plantas completas de
pinabete.
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FIGURAS
Figura 1. Semilla de pinabete
Figura 3. Callo formado a partir de
un embrión sexual de pinabete
Figura 2. Embrión sexual de pinabete.
A la izquierda hipocotilo, a la derecha
cotiledones
Figura 4. Callos inducidos sobre medio
MCM adicionado con 2,4-D y BAP
29
Figura 5. Cultivo en suspensión de
callos embriogénicos de pinabete.
Figura 7. Cultivo de callos embriogénicos
sobre medio MCM adicionado con ABA.
obscuridad, abajo callos incubados
en semi-obscuridad.
Figura 6. Agregados celulares del
cultivo en suspensión de pinabete.
Figura 8. Efecto de la intensidad
de luz sobre callos embriogénicos.
Arriba, callos
incubados en
30
Figura 9. Agregados celulares observados
bajo microscopio
Figura 11. Agregados con células
suspensorias y células pequeñas
citoplasmáticas.
Figura 10. Agregados con células
alargadas y redondas, características
de tejidos embriogénicos.
Figura 12. Embrión somático inmaduro
con poca acumulación de substancias
de reserva.