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Caracterización de actinomicetos desde suelos eriazos de la región Lambayeque, productores de compuestos bioactivos, contra fitopatógenos de quinua. Dra. Heidi Horna Inga Lima, 15 de agosto de 2013 Valor proteico elevado, aminoácidos esenciales. formado por Presenta grasas mono y poliinsaturadas y ácidos grasos omega beneficiosos para el organismo. Rico en fibra y libre de gluten. Contiene minerales en un nivel superior a los cereales, como fósforo, calcio, hierro, potasio, magnesio, manganeso, zinc, litio y cobre. Posee un alto contenido de vitaminas del complejo B, C y E. Útil en las etapas de desarrollo y crecimiento del organismo. Fácil de digerir, no contiene colesterol y se presta para la preparación de dietas completas y equilibradas. PLAGAS DE LA QUINUA Insectos Cortadores de plantas tiernas (Copitarsia incommoda) Insectos de follaje y granos (Eurysacca melanocampta) Masticadores de follaje (Epicauta latitarsis) Minadores de hojas (Lyriomiza braziliensis) Nemátodes Aves ENFERMEDADES DE LA QUINUA Mildiu (Perenospora farinosa) Podredumbre marrón del tallo (Phoma exigua var. foveata) Podredumbre radicular: Rhizoctonia solani Fusarium sp Clase Esporas Rhizoctonia Hyphomycetes Basidiosporas (sexuales) Conidias No Hifas Marrón Oscuro, anastomáticas, multinucleadas Esclerocios si Enfermedad Costra negra, cancro del tallo zonas de ataque Raíz y Tallo Síntomas causa : ahogamiento de las plántulas y la pudrición de la raíz, así como la pudrición y la cancrosis del tallo de las plantas adultas y en proceso de crecimiento, así como tizones o manchas en el follaje cuando éste se encuentra cerca del suelo Fusarium Soradariomycetes Clamidosporas (asexuales) Microconidios, Macroconidias fusiformes, Conidióforos algodonoso con tonalidades de blanco rosado, púrpura o amarillo no Chupadera fungosa “damping off” Raíz y Tallo causa: amarillamientos, clorosis, marchitez, retardo en el crecimiento y decoloración de la corona, rizoma y raíces, debido a un colapso y a una completa pudrición radical Resistencia a los antibióticos Pérdida de campos de cultivo Aparición de nuevos patógenos Escasos compuestos biodegradables Eliminación de enemigos naturales Aparición de plagas secundarias Poca actividad biológica Tóxicos, inespecíficos y bioacumulable NECESIDAD DE NUEVOS COMPUESTOS BIOACTIVOS 76% Actinomicetos De los metabolitos bioactivos producidos por actinomicetos, el 74% son producidos por el género Streptomyces. Espora Bacterias Gram-positivas Herbicida Maduración Germinación de la espora Alto contenido de G+C Pesticida Insecticida Degradadores de materia orgánica Antitumoral Segmentación Micelio sustrato Antibacteriana Complejo ciclo de vida Antifúngica Micelio aéreo La muestra de 100g a partir de una capa de suelo que no excedía los 20 cm de profundidad. Fueron extraídas de 9 tipos de suelos del Campo Experimental de la USS (25 ha). Ubicado en el Km3 de la carretera a Puerto Eten Chiclayo a 20m.s.n.m Posteriormente fueron analizadas en el laboratorio de Microbiología Molecular de la Universidad Señor de Sipán. Nº7 110 cepas de actinomicetos Las muestras de suelo se dejaron secar durante 48 horas a Tº ambiente. Se tamizó 25 g. por muestra en mallas metálicas: de 160µm y la otra de 250 µm de diámetro. Se pesó 10 g. de cada una y se vertió en matraces con 90 ml de agua peptonada al 0.1% p/v, utilizando la técnica de diluciones seriadas. Se sembraron por triplicado en superficie, 0.1 ml de la dilución, sobre Agar Nutritivo suplementado con actidiona (20mg/l) y ácido nalidíxico (100 mg/l) para minimizar el crecimiento de hongos y bacterias respectivamente. Las placas se incubaron a 28°C durante 7 - 10 días. Posteriormente se seleccionaron las colonias con características morfológicas correspondientes a los actinomicetos (textura, coloración del micelio aéreo y de sustrato, forma y tamaño de la colonia y la producción de pigmentos. El efecto antagónico y la producción antibiótica de los actinomicetos se evaluaron utilizando el método del cultivo dual (Landa et al., 1997). En una placa se sembró un inóculo de 1,3x107 UFC/g de cada hongo fitopatógeno en un extremo y en el otro extremo se colocó un inóculo de 1,3x107 UFC/g de cada actinomiceto. Se sembró al mismo tiempo una placa control sólo con los hongos fitopatógenos. Las placas inoculadas serán incubadas durante 3, 5 y 7 días a 30º C. Los halos de inhibición se midieron en mm. Teniendo en cuenta el radio de mayor distancia y usando una fórmula para calcular el efecto inhibitorio: Actinomiceto IR (%) = (Dc – Dt / Dc) x 100 Donde: IR= rango de inhibición (%) Hongo patógeno Dc= diámetro de control negativo (mm) Dt= diámetro de tratamiento o control positivo Cepa control de Fusarium sp Q002 Q033 Q019 Q026 Q043 Q027 Q067 Q030 Q074 Cepa control de Rhizoctonia solani Q007 Q008 Q090 Q099 Cepa control de Fusarium sp. Q019 Cepa control de Rhizoctonia solani Q026 Q043 Q033 Q067 NÚMERO DE ACTINOMICETOS ANTAGONISTAS .vs Fusarium sp. Cepa 19 Cepa 27 Cepa 33 3 días 59 64 67 5 días 48 56 67 7 días 55 61 55 10 días 61 72 70 5 días 45 45 52 7 días 52 55 52 10 días 53 59 63 .vs Rhizoctonia solani Cepa 19 Cepa 27 Cepa 33 3 días 55 58 60 Se observaron las características de crecimiento a nivel macroscópico de las cepas cultivadas en agar nutritivo durante 8 días. Se tomó en cuenta la textura de la colonia, color del anverso y producción de pigmentos difusibles al medio. Q045 Se sembraron en agar avena, suplementado con nistatina al 0.1%. Se introdujeron en el medio, laminillas cubreobjetos estériles, con una inclinación de 45° aprox. Las placas se incubaron a 22°C durante 15 días. Se utilizó un microscopio óptico marca Leica ICC50HD y el software 3.0. Se realizaron microfotografías y videos microscópicos. Q019 100X 100X Q056 Q030 100X 100X Se utilizó Citrato de Simons y los siguientes carbohidratos: fructosa, glucosa, arabinosa, manitol, rafinosa, sacarosa, inositol, lactosa, sorbitol y xilosa. No asegura un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Ayuda a dilucidar la actividad de una vía metabólica que permitan reconocer a microorganismos que fermente o no algún sustrato. No se observa uniformidad en los resultados y por el contrario se evidencia que los microorganismos utilizan diversas fuentes azucaradas. Cepa Q105 Se seleccionaron 36 actinomicetos de suelos eriazos del campo experimental de la Universidad Señor de Sipán, con actividad antagónica de amplio y limitado espectro contra fitopatógenos de quinua como Rhizoctonia solani y Fusarium sp. Algunos de los actinomicetos en estudio, son capaces de utilizar a los hongos como sustrato, sugiriendo producción de quitinasas. Los actinomicetos en estudio presentan una variabilidad morfológica y fisiológica, según el medio de cultivo utilizado, influenciando en el efecto antagónico, observado y reportado. Dr. Ángel Manteca Fernández Dr. Carlos Sialer Guerrero Lic. Adita Hernández Centurión Lic. Marianella Incio Granthon Caracterización de actinomicetos desde suelos eriazos de la región Lambayeque, productores de compuestos bioactivos, contra fitopatógenos de quinua. Dra. Heidi Horna Inga Lima, 15 de agosto de 2013 Valor proteico elevado, aminoácidos esenciales. formado por Presenta grasas mono y poliinsaturadas y ácidos grasos omega beneficiosos para el organismo. Rico en fibra y libre de gluten. Contiene minerales en un nivel superior a los cereales, como fósforo, calcio, hierro, potasio, magnesio, manganeso, zinc, litio y cobre. Posee un alto contenido de vitaminas del complejo B, C y E. Útil en las etapas de desarrollo y crecimiento del organismo. Fácil de digerir, no contiene colesterol y se presta para la preparación de dietas completas y equilibradas. PLAGAS DE LA QUINUA Insectos Cortadores de plantas tiernas (Copitarsia incommoda) Insectos de follaje y granos (Eurysacca melanocampta) Masticadores de follaje (Epicauta latitarsis) Minadores de hojas (Lyriomiza braziliensis) Nemátodes Aves ENFERMEDADES DE LA QUINUA Mildiu (Perenospora farinosa) Podredumbre marrón del tallo (Phoma exigua var. foveata) Podredumbre radicular: Rhizoctonia solani Fusarium sp Clase Esporas Rhizoctonia Hyphomycetes Basidiosporas (sexuales) Conidias No Hifas Marrón Oscuro, anastomáticas, multinucleadas Esclerocios si Enfermedad Costra negra, cancro del tallo zonas de ataque Raíz y Tallo Síntomas causa : ahogamiento de las plántulas y la pudrición de la raíz, así como la pudrición y la cancrosis del tallo de las plantas adultas y en proceso de crecimiento, así como tizones o manchas en el follaje cuando éste se encuentra cerca del suelo Fusarium Soradariomycetes Clamidosporas (asexuales) Microconidios, Macroconidias fusiformes, Conidióforos algodonoso con tonalidades de blanco rosado, púrpura o amarillo no Chupadera fungosa “damping off” Raíz y Tallo causa: amarillamientos, clorosis, marchitez, retardo en el crecimiento y decoloración de la corona, rizoma y raíces, debido a un colapso y a una completa pudrición radical Resistencia a los antibióticos Pérdida de campos de cultivo Aparición de nuevos patógenos Escasos compuestos biodegradables Eliminación de enemigos naturales Aparición de plagas secundarias Poca actividad biológica Tóxicos, inespecíficos y bioacumulable NECESIDAD DE NUEVOS COMPUESTOS BIOACTIVOS 76% Actinomicetos De los metabolitos bioactivos producidos por actinomicetos, el 74% son producidos por el género Streptomyces. Espora Bacterias Gram-positivas Herbicida Maduración Germinación de la espora Alto contenido de G+C Pesticida Insecticida Degradadores de materia orgánica Antitumoral Segmentación Micelio sustrato Antibacteriana Complejo ciclo de vida Antifúngica Micelio aéreo La muestra de 100g a partir de una capa de suelo que no excedía los 20 cm de profundidad. Fueron extraídas de 9 tipos de suelos del Campo Experimental de la USS (25 ha). Ubicado en el Km3 de la carretera a Puerto Eten Chiclayo a 20m.s.n.m Posteriormente fueron analizadas en el laboratorio de Microbiología Molecular de la Universidad Señor de Sipán. Nº7 110 cepas de actinomicetos Las muestras de suelo se dejaron secar durante 48 horas a Tº ambiente. Se tamizó 25 g. por muestra en mallas metálicas: de 160µm y la otra de 250 µm de diámetro. Se pesó 10 g. de cada una y se vertió en matraces con 90 ml de agua peptonada al 0.1% p/v, utilizando la técnica de diluciones seriadas. Se sembraron por triplicado en superficie, 0.1 ml de la dilución, sobre Agar Nutritivo suplementado con actidiona (20mg/l) y ácido nalidíxico (100 mg/l) para minimizar el crecimiento de hongos y bacterias respectivamente. Las placas se incubaron a 28°C durante 7 - 10 días. Posteriormente se seleccionaron las colonias con características morfológicas correspondientes a los actinomicetos (textura, coloración del micelio aéreo y de sustrato, forma y tamaño de la colonia y la producción de pigmentos. El efecto antagónico y la producción antibiótica de los actinomicetos se evaluaron utilizando el método del cultivo dual (Landa et al., 1997). En una placa se sembró un inóculo de 1,3x107 UFC/g de cada hongo fitopatógeno en un extremo y en el otro extremo se colocó un inóculo de 1,3x107 UFC/g de cada actinomiceto. Se sembró al mismo tiempo una placa control sólo con los hongos fitopatógenos. Las placas inoculadas serán incubadas durante 3, 5 y 7 días a 30º C. Los halos de inhibición se midieron en mm. Teniendo en cuenta el radio de mayor distancia y usando una fórmula para calcular el efecto inhibitorio: Actinomiceto IR (%) = (Dc – Dt / Dc) x 100 Donde: IR= rango de inhibición (%) Hongo patógeno Dc= diámetro de control negativo (mm) Dt= diámetro de tratamiento o control positivo Cepa control de Fusarium sp Q002 Q033 Q019 Q026 Q043 Q027 Q067 Q030 Q074 Cepa control de Rhizoctonia solani Q007 Q008 Q090 Q099 Cepa control de Fusarium sp. Q019 Cepa control de Rhizoctonia solani Q026 Q043 Q033 Q067 NÚMERO DE ACTINOMICETOS ANTAGONISTAS .vs Fusarium sp. Cepa 19 Cepa 27 Cepa 33 3 días 59 64 67 5 días 48 56 67 7 días 55 61 55 10 días 61 72 70 5 días 45 45 52 7 días 52 55 52 10 días 53 59 63 .vs Rhizoctonia solani Cepa 19 Cepa 27 Cepa 33 3 días 55 58 60 Se observaron las características de crecimiento a nivel macroscópico de las cepas cultivadas en agar nutritivo durante 8 días. Se tomó en cuenta la textura de la colonia, color del anverso y producción de pigmentos difusibles al medio. Q045 Se sembraron en agar avena, suplementado con nistatina al 0.1%. Se introdujeron en el medio, laminillas cubreobjetos estériles, con una inclinación de 45° aprox. Las placas se incubaron a 22°C durante 15 días. Se utilizó un microscopio óptico marca Leica ICC50HD y el software 3.0. Se realizaron microfotografías y videos microscópicos. Q019 100X 100X Q056 Q030 100X 100X Se utilizó Citrato de Simons y los siguientes carbohidratos: fructosa, glucosa, arabinosa, manitol, rafinosa, sacarosa, inositol, lactosa, sorbitol y xilosa. No asegura un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Ayuda a dilucidar la actividad de una vía metabólica que permitan reconocer a microorganismos que fermente o no algún sustrato. No se observa uniformidad en los resultados y por el contrario se evidencia que los microorganismos utilizan diversas fuentes azucaradas. Cepa Q105 Se seleccionaron 36 actinomicetos de suelos eriazos del campo experimental de la Universidad Señor de Sipán, con actividad antagónica de amplio y limitado espectro contra fitopatógenos de quinua como Rhizoctonia solani y Fusarium sp. Algunos de los actinomicetos en estudio, son capaces de utilizar a los hongos como sustrato, sugiriendo producción de quitinasas. Los actinomicetos en estudio presentan una variabilidad morfológica y fisiológica, según el medio de cultivo utilizado, influenciando en el efecto antagónico, observado y reportado. Dr. Ángel Manteca Fernández Dr. Carlos Sialer Guerrero Lic. Adita Hernández Centurión Lic. Marianella Incio Granthon Quinua: alimento altamente nutritivo Valor proteico elevado, formado por aminoácidos esenciales. Presenta grasas mono y poliinsaturadas y ácidos grasos omega beneficiosos para el organismo. Rico en fibra y libre de gluten. Contiene minerales en un nivel superior a los cereales, como fósforo, calcio, hierro, potasio, magnesio, manganeso, zinc, litio y cobre. Posee un alto contenido de vitaminas del complejo B, C y E. Útil en las etapas de desarrollo y crecimiento del organismo. Fácil de digerir, no contiene colesterol y se presta para la preparación de dietas completas y equilibradas. Quinua: atacada por plagas y enfermedades PLAGAS DE LA QUINUA Insectos Cortadores de plantas tiernas (Copitarsia incommoda) Insectos de follaje y granos (Eurysacca melanocampta) Masticadores de follaje (Epicauta latitarsis) Minadores de hojas (Lyriomiza braziliensis) Nemátodes Aves ENFERMEDADES DE LA QUINUA Mildiu (Perenospora farinosa) Podredumbre marrón del tallo (Phoma exigua var. foveata) Podredumbre radicular: Rhizoctonia solani Fusarium sp Hongos fitopatógenos: rhizoctoniaFusarium y fusarium Rhizoctonia Clase Esporas Hyphomycetes Basidiosporas (sexuales) Conidias No Hifas Marrón Oscuro, anastomáticas, multinucleadas Esclerocios si Enfermedad Costra negra, cancro del tallo zonas de ataque Raíz y Tallo Síntomas causa : ahogamiento de las plántulas y la pudrición de la raíz, así como la pudrición y la cancrosis del tallo de las plantas adultas y en proceso de crecimiento, así como tizones o manchas en el follaje cuando éste se encuentra cerca del suelo Soradariomycetes Clamidosporas (asexuales) Microconidios, Macroconidias fusiformes, Conidióforos algodonoso con tonalidades de blanco rosado, púrpura o amarillo no Chupadera fungosa “damping off” Raíz y Tallo causa: amarillamientos, clorosis, marchitez, retardo en el crecimiento y decoloración de la corona, rizoma y raíces, debido a un colapso y a una completa pudrición radical Resistencia a los antibióticos Pérdida de campos de cultivo Aparición de nuevos patógenos Escasos compuestos biodegradables Eliminación de enemigos naturales Aparición de plagas secundarias Poca actividad biológica Tóxicos, inespecíficos y bioacumulable NECESIDAD DE NUEVOS COMPUESTOS BIOACTIVOS Compuestos bioactivos de origen natural Microorganismos productores de compuestos bioactivos 76% Actinomicetos Actinomicetos Actinomicetos De los metabolitos bioactivos producidos por actinomicetos, el 74% son producidos por el género Streptomyces. Espora Bacterias Gram-positivas Herbicida Maduración Germinación de la espora Alto contenido de G+C Pesticida Insecticida Degradadores de materia orgánica Antitumoral Segmentación Micelio sustrato Antibacteriana Complejo ciclo de vida Antifúngica Micelio aéreo Recolección de las muestras de suelos La muestra de 100g a partir de una capa de suelo que no excedía los 20 cm de profundidad. Nº7 Fueron extraídas de 9 tipos de suelos del Campo Experimental de la USS (25 ha). Ubicado en el Km3 de la carretera a Puerto Eten Chiclayo a 20m.s.n.m Posteriormente fueron analizadas en el laboratorio de Microbiología Molecular de la Universidad Señor de Sipán. AISLAMIENTO DE ACTINOMICETOS Las muestras de suelo se dejaron secar durante 48 horas a Tº ambiente. Se tamizó 25 g. por muestra en mallas metálicas: de 160µm y la otra de 250 µm de diámetro. Se pesó 10 g. de cada una y se vertió en matraces con 90 ml de agua peptonada al 0.1% p/v, utilizando la técnica de diluciones seriadas. 110 cepas de actinomicetos Se sembraron por triplicado en superficie, 0.1 ml de la dilución, sobre Agar Nutritivo suplementado con actidiona (20mg/l) y ácido nalidíxico (100 mg/l) para minimizar el crecimiento de hongos y bacterias respectivamente. Las placas se incubaron a 28°C durante 7 - 10 días. Posteriormente se seleccionaron las colonias con características morfológicas correspondientes a los actinomicetos (textura, coloración del micelio aéreo y de sustrato, forma y tamaño de la colonia y la producción de pigmentos. Selección de actinomicetos productores de compuestos antifúngicos contra hongos fitopatógenos. El efecto antagónico y la producción antibiótica de los actinomicetos se evaluaron utilizando el método del cultivo dual (Landa et al., 1997). En una placa se sembró un inóculo de 1,3x107 UFC/g de cada hongo fitopatógeno en un extremo y en el otro extremo se colocó un inóculo de 1,3x107 UFC/g de cada actinomiceto. Se sembró al mismo tiempo una placa control sólo con los hongos fitopatógenos. Las placas inoculadas serán incubadas durante 3, 5 y 7 días a 30º C. Los halos de inhibición se midieron en mm. Teniendo en cuenta el radio de mayor distancia y usando una fórmula para calcular el efecto inhibitorio: IR (%) = (Dc – Dt / Dc) x 100 Donde: Actinomiceto IR= rango de inhibición (%) Dc= diámetro de control negativo (mm) Dt= diámetro de tratamiento o control positivo Hongo patógeno Técnica de enfrentamiento dual frente a Fusarium sp Cepa control de Fusarium sp Q002 Q033 Q019 Q026 Q043 Q027 Q067 Q030 Q074 Técnica de enfrentamiento dual frente a Rhizoctonia solani Cepa control de Rhizoctonia solani Q007 Q008 Q090 Q099 Cepas de actinomicetos AntagónicOs frente a rhizoctonia solani y fusarium sp. Cepa control de Fusarium sp. Q019 Cepa control de Rhizoctonia solani Q026 Q043 Q033 Q067 NÚMERO DE ACTINOMICETOS ANTAGONISTAS Evaluación de la actividad antagónica según el tiempo de producción de los compuestos bioactivos .vs Fusarium sp. Cepa 19 Cepa 27 Cepa 33 3 días 59 64 67 5 días 48 56 67 7 días 55 61 55 10 días 61 72 70 5 días 45 45 52 7 días 52 55 52 10 días 53 59 63 .vs Rhizoctonia solani Cepa 19 Cepa 27 Cepa 33 3 días 55 58 60 Caracterización macroscópica de los actinomicetos seleccionados Se observaron las características de crecimiento a nivel macroscópico de las cepas cultivadas en agar nutritivo durante 8 días. Se tomó en cuenta la textura de la colonia, color del anverso y producción de pigmentos difusibles al medio. Caracterización microscópica de los actinomicetos seleccionados Se sembraron en agar suplementado con nistatina al 0.1%. Q045 avena, Se introdujeron en el medio, laminillas cubreobjetos estériles, con una inclinación de 45° aprox. Q019 Las placas se incubaron a 22°C durante 15 días. 100X 100X Se utilizó un microscopio óptico marca Leica ICC50HD y el software 3.0. Q056 Q030 Se realizaron microfotografías y videos microscópicos. 100X 100X Caracterización bioquímica de los actinomicetos seleccionados Se utilizó Citrato de Simons y los siguientes carbohidratos: fructosa, glucosa, arabinosa, manitol, rafinosa, sacarosa, inositol, lactosa, sorbitol y xilosa. No asegura un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Ayuda a dilucidar la actividad de una vía metabólica que permitan reconocer a microorganismos que fermente o no algún sustrato. No se observa uniformidad en los resultados y por el contrario se evidencia que los microorganismos utilizan diversas fuentes azucaradas. Utilización de fuentes de carbono Acción de los actinomicetos sobre el sustrato Cepa Q105 conclusiones Se seleccionaron 36 actinomicetos de suelos eriazos del campo experimental de la Universidad Señor de Sipán, con actividad antagónica de amplio y limitado espectro contra fitopatógenos de quinua como Rhizoctonia solani y Fusarium sp. Algunos de los actinomicetos en estudio, son capaces de utilizar a los hongos como sustrato, sugiriendo producción de quitinasas. Los actinomicetos en estudio presentan una variabilidad morfológica y fisiológica, según el medio de cultivo utilizado, influenciando en el efecto antagónico, observado y reportado. agradecimiento Dr. Ángel Manteca Fernández Dr. Carlos Sialer Guerrero Lic. Adita Hernández Centurión Lic. Marianella Incio Granthon