Download Objetivo del Proyecto Genoma Humano

Proyecto Genoma Humano
1. Desarrollo del proyecto
1 Objetivos
2 Génesis y desarrollo del proyecto
3 Estrategias de secuenciación del genoma:
secuenciación aleatoria y jerárquica
4 Genotecas de BACs
5 Mapa físico
6 Selección y secuenciación de un BAC
7 Ensamblaje
8 Finalización
Referencias: Lander et al. 2001, Nature 409:860-891. International
Human genome Sequencing Consortium 2004, Nature 431: 931945.
Objetivo del Proyecto
Genoma Humano
• Elaborar un inventario de todos los genes
• Identificar todas las secuencias
reguladoras
• Describir sus patrones de expresión
• Averiguar la función de la proteína que
codifican
• Determinar cómo estas proteínas
interactúan unas con otras en las células
del organismo completo
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El Proyecto Genoma Humano
1. Consorcio de 20 laboratorios públicos pertenecientes a 6
países. Liderado por F.S.Collins y E. Lander.
2. Discusión y debate en la comunidad científica 1984-1990.
Iniciativa: Departament of Energy y National Institutes of
Health (US). Comienzo del proyecto: 1990. Borrador: Oct
2000. Publicación: Feb 2001. Finalización: Octubre 2004.
3. Secuenciación aleatoria jerárquica (Hierarchical Shotgun
Sequencing).
4. Material: DNA obtenido de donantes anónimos. La
identidad de los donantes no es conocida (ni siquiera por
ellos mismos).
5. Los datos se han hecho públicos a través de los bancos
públicos de datos sin ninguna restricción a medida que se
progresaba en el proyecto.
6. Publicación: Nature 409: 860-921 (15 febrero 2001); Nature
431: 931-945 (21 Octubre 2004).
Celera Sequencing Project
1. Celera Genomics. Empresa privada de biotecnología que
dirige J. Craig Venter y cotiza en bolsa.
2. Anuncio del proyecto: 1998. Comienzo de la secuenciación:
8 Sep 1999. Finalización de la secuenciación: 17 Jun 2000.
Ensamblaje del borrador: 1 Oct 2000.
3. Estrategia: Secuenciación aleatoria del genoma (Wholegenome shotgun sequencing).
4. Material: Se reclutaron 21 donantes voluntarios. De ellos se
seleccionaron 5 sujetos (dos hombres y tres mujeres): 2
caucásicos, un afroamericano, un asiático (chino) y un
hispano (mejicano).
5. Condiciones para el acceso a los datos mediante acuerdo
entre Science y Celera Genomics. Los datos está a
disposición de los investigadores a partir de la fecha de
publicación a través de la Web de Celera y con ciertas
restricciones.
6. Publicación: Science 291: 1304-1351 (16 febrero 2001).
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Características de una genoteca
genómica
•
•
•
•
Número de clones (N).
Tamaño promedio (a) y varianza del inserto.
Redundancia teórica (R = Na/b).
Aleatoriedad (randomness): representación
de secuencias genómicas diana.
• Completa (completeness): si todas las
secuencias diana en el genoma está
representadas en la genoteca.
• Fidelidad (fidelity): medida en que los
insertos de los clones son copias fieles de
las secuencias del genoma.
P = 1 - (1 – a/b)N ≈ 1 – e-Na/b = 1 – e-R
N = ln (1 – P)/ln (1 – a/b)
R ≈ - ln (1 – P)
donde N = número de clones; a = tamaño promedio del inserto;
b = tamaño del genoma; R = redundancia teórica (Na/b); P =
probabilidad de que una región dada esté incluida en la
genoteca.
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Shuttle vector pTARBAC2.1
(Zeng et al. 2001)
Vector híbrido BAC/YAC que
contiene:
Centrómero y marcador His3
de levadura
Replicón del plásmido F
Gen de resistencia al
cloranfenicol (CM-R)
Gen sacB que codifica la
levansucrasa (convierte la
sucrosa en tóxico)
Segmento de relleno pUClink eliminado durante la
clonación
Lugar de clonación
flanqueado por primers
universales T7 y SP6
RPCI = Roswell Park Cancer Institute, Buffalo (NY)
Caltech= California Institute of Technology, Pasadena (California)
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Genoteca ordenada:
8 x 12 = 96 pocillos
16 x 24 = 384 pocillos
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Hibridación in situ de fluorescencia (FISH) de un paciente que
presenta una translocación no-recíproca de un pequeño
fragmento distal del cromosoma 10 en el cromosoma 9. (a) Sonda
obtenida por microdisección del fragmento anormal del
cromosoma 9. (b) Sonda procedente del brazo cromosómico 10p.
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FISH en núcleos interfásicos
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Análisis de la región del locus Rh mediante fiber-FISH. El locus Rh
contiene 2 genes RHD y RHCE altamente homólogos. La
hibridación con sondas de los intrones 3 (verde) y 7 (rojo) revela la
presencia de deleciones y otras reordenaciones de la región.
Figura 6.15. Dos métodos de cartografía física
para detectar solapamiento entre clones
genómicos
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Ensamblaje de clones mediante fingerprinting
Figure 6.2 Chain termination DNA sequencing
(Sanger et al. 1977)
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Secuenciación automática del DNA
Secuenciación de un clon
100-200 kb
• Fase 1. Secuenciación aleatoria
– Construcción de una genoteca aleatoria en
plásmido -> colección de clones 1-2 kb de tamaño
promedio.
– Secuenciación de uno o ambos extremos de un
cierto número de clones -> colección de lecturas
(“reads”).
– Ensamblaje de las lecturas -> un cierto número de
“contigs” con huecos (“gaps”) entre ellos.
• Fase 2. Finalización (corrección de errores y
rellenado de huecos mediante secuenciación
dirigida)
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Calidad de una secuencia
(PHRAP score)
•
•
•
•
P = Probabilidad de error de cada base
Q = Calidad de una base
Q = - 10 log P
Al iniciar un proyecto de secuenciación es
conveniente fijar cual es el objetivo: la
calidad de la secuencia final a obtener. De
ella depende la redundancia necesaria.
• Q = 20, 30 y 40 corresponden a P = 1%, 0,1%
y 0,01%.
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Secuenciación
de un clon 100-200 kb
• Base-calling. PHRED permite obtener la
probabilidad de error de cada base.
• Ensamblaje. PHRAP permite ensamblar
las lecturas en contigs.
• Edición. CONSED permite visualizar el
ensamblaje y la secuencia consenso así
como calcular la probabilidad de error de
cada base en la secuencia consenso.
• Finalización. AUTOFINISH permite dirigir
toda la operación de finalización
basándose en la calidad de cada base.
Borrador 7 Octubre 2000
• Cartografía. Ensamblaje de los clones
BAC (por fingerprinting) en 1246 contigs.
• Secuenciación y ensamblaje de 29.298
clones que representan un total de 4,26
Gb de secuencia.
• Las secuencias brutas subyacentes
suponen un total de 23 Gb (promedio
7.5x).
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Fingerprint
Sequenced-
Gaps between
clone contigs
clone contigs
draft clones
El borrador del genoma humano (7-10-2000) representa el 88% de todo
el genoma y un 93% de la eucromatina
Genoma Humano (versión 21-Oct-2004)
• Se han conseguido secuenciar 2.850 Mb (99%
de la eucromatina).
• La tasa de error es 1/100.000 bases (Q = 50).
• Se ha reducido el número de “gaps” (huecos)
de ~150.000 a sólo 341.
• De ellos, 33 (total ~198 Mb) en la
heterocromatina y 308 (total ~28 Mb) en la
eucromatina.
• Tamaño total: 2.850 + 198 + 28 = 3.080 Mb.
• Número de genes: 20.000-25.000 (19.600 genes
conocidos + 2.200 predicciones).
• Pseudogenes: ~20.000.
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