Download análisis funcional del gen dopamina beta hidroxilasa (dbh)

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
DOCTORADO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA
POSGRADO DE LA RED INSTITUCIONAL DE BIOTECNOLOGÍA
ANÁLISIS FUNCIONAL DEL GEN DOPAMINA BETA HIDROXILASA
(DBH) Y SU ASOCIACIÓN A TEMPERAMENTO EN BOVINOS
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTORA EN CIENCIAS EN
BIOTECNOLOGÍA
Presenta:
M. en C. Diana Lelidett Lourenco Jaramillo
Cd. Reynosa, Tamaulipas. México
Mayo 2013
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
CARTA DE CESIÓN DE DERECHOS
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
ACTA DE REVISIÓN DE TESIS (SIP-14)
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
La presente tesis se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Animal del
Centro de Biotecnología Genómica (CBG) del Instituto Politécnico Nacional
(IPN), bajo la dirección de la Dra. Ana María Sifuentes-Rincón y la co-dirección
del Dr. Carlos Galavíz-Hernández.
DEDICATORIA
Mi tesis de doctorado la dedico
D
:
ios por darme la fortaleza para continuar adelante pese a las adversidades.
M
L
A
is padres por su apoyo incondicional y darme las alas para llegar muy lejos.
os que están en el cielo que siempre llevaré conmigo en el corazón y la mente.
G
racias por el privilegio de poder hacer lo que quiero y ser inmensamente feliz.
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
AGRADECIMIENTOS
-Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) de México por el gran apoyo de estos
cuatro años otorgado mediante el Programa de Becas para Estudios de Posgrado en el Programa
Nacional de Posgrados de Calidad (PNPC).
-Al Programa Integral de Fortalecimiento Institucional (PIFI) de la Secretaría de Educación
Pública, a través del Instituto Politécnico Nacional (IPN) por las becas otorgadas en cada semestre
para la realización de mis estudios de doctorado.
-Al banco Santander y al Instituto Politécnico Nacional (IPN) con el programa de Becas
Santander-ECOES, por el apoyo económico para la realización de la movilidad académica en el
Instituto de Neurobiología de la UNAM en Querétaro.
-Al Dr. Ataúlfo Martínez-Torres por su gran colaboración, orientación y su tiempo, para realizar
los ensayos in vitro en su laboratorio de Neurobiología Celular y Molecular, en el Instituto de
Neurobiología de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en Querétaro.
-Al Dr. Bulmaro Cisneros-Vega, del Departamento de Genética y Biología Molecular del
CINVESTAV por su gran ayuda al facilitarme desinteresadamente las líneas celulares productoras
de catecolaminas.
-Al Centro de Biotecnología Genómica (CBG) y al Doctorado en Red en Biotecnología del
Instituto Politécnico Nacional (IPN) por toda la cooperación prestada siempre en su momento
oportuno mediante su personal académico y administrativo.
-Al Dr. Jorge Quiroz-Valiente y al M.C. Lorenzo Granados-Zurita del Centro Experimental
Huimanguillo, INIFAP (Villahermosa, Tabasco) por su gran colaboración en la logística, y la toma
de muestras de los animales de raza Brahman y a los propietarios de estas ganaderías Brahman, el
Sr. Carlos Cruz-Mondragón y el Sr. Felipe Casanova-Lastra, por la receptividad para facilitar el
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
material biológico y las bases de datos para este estudio. Por la colaboración de los propietarios de
las ganaderías Charolais al facilitar el material biológico y sus bases de datos.
-A mi comité revisor: Dra. Ana María Sifuentes-Rincón, Dr. Carlos Galavíz-Hernández, Dr.
Gaspar Manuel Parra-Bracamonte, Dr. Ataúlfo Martínez-Torres y Dr. Juan Manuel GonzálezPrieto, por estos cuatro años siendo mis guías, orientarme y enseñarme tantas cosas en lo
profesional y en lo personal.
-A mi laboratorio de Biotecnología Animal en el CBG, donde compartimos tantos momentos de
alegrías con la Dra. Ana, el Dr. Parra, el Dr. Victor Moreno, Xochitl, William, Paz, Pacheco, Luis,
Ana, Paco y Gaby.
-A mis buenos compañeros del Doctorado por su amistad y por todo lo que hemos compartido,
Arlette Marín, Fernando Vázquez, Siblie González, Leandro Páramo, Susana Frías, Claudia Soto,
Hemma Gopal y Yajuan Fu.
-A mis amigos del CBG, de México y otras latitudes que siempre me han apoyado: familia Almora,
familia Ramírez-Vega, familia Gil-Arcos, Ana María Conforto y familia, Ana María Quintela,
Elaiza Díaz, Mary Jane, Rodolfo Torres, Elma Laura Salazar, Rosita, Norita Rodríguez, Maxito,
Alex, Sussy Fernández, así como los que olvidé en este momento.
-A mis grandes amigas Paty Juárez y Areli Huanosta, por ser como mis hermanas, gracias por
ayudarme en todo momento.
-A los integrantes del D-15, Laboratorio de Neurobiología Molecular y Celular de la UNAM en
Querétaro, en especial por su gran ayuda para la culminación de mis experimentos, a Ernesto Mora,
Marianne Mendoza y Edith Espino, gracias por todos sus consejos y su tiempo.
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
CONTENIDO
ABREVIATURAS............................................................................................................... IV
INDICE DE CUADROS ...................................................................................................... V
INDICE DE FIGURAS ....................................................................................................... VI
RESUMEN .........................................................................................................................VII
SUMMARY ......................................................................................................................... IX
1.-INTRODUCCION ............................................................................................................. 1
2.-ANTECEDENTES ............................................................................................................ 3
2.1-GEN DOPAMINA BETA HIDROXILASA (DBH) .................................................. 3
2.2.-EL GEN DBH EN BOVINOS ................................................................................... 6
2.3.-EL GEN DBH COMO CANDIDATO PARA EL TEMPERAMENTO BOVINO .. 8
3.-JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................ 13
4.-HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 15
5.-OBJETIVOS .................................................................................................................... 15
5.1.-OBJETIVO GENERAL........................................................................................... 15
5.2.-OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................. 15
6.-MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................................ 16
6.1.-MATERIALES BIOLÓGICOS ............................................................................... 16
6.1.1.-MUESTRAS DE SANGRE PARA EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO
...................................................................................................................... 16
6.1.2.-MUESTRAS DE PLASMA SANGUINEO PARA CUANTIFICACIÓN DE
NORADRENALINA ................................................................................... 16
6.1.3.-MUESTRAS DE GLÁNDULAS SUPRARRENALES PARA
EXTRACCIÓN DE ARN ............................................................................ 16
I
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
6.1.4.-LINEAS DE CULTIVO CELULAR PARA LAS TRANSFECCIONES..... 16
6.2.-MÉTODOS EXPERIMENTALES .......................................................................... 18
6.2.1-DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS ESPECÍFICOS ................................ 18
6.2.2.-EXTRACCIÓN DEL DNA GENÓMICO..................................................... 20
6.2.3.-TIPIFICACIÓN DE LOS nsSNPS ................................................................ 21
6.2.4.-CUANTIFICACIÓN PLASMÁTICA DE NORADRENALINA ................. 21
6.2.5.-EXTRACCIÓN DEL ARN TOTAL ............................................................. 24
6.2.6.-REACCIÓN DE RT-PCR PARA LA OBTENCIÓN DEL cDNA DE DBHb
...................................................................................................................... 24
6.2.7.-CLONACIÓN MOLECULAR PARA LOS PRODUCTOS DE RT-PCR.... 25
6.2.8.-SECUENCIACIONES BIDIRECCIONALES.............................................. 26
6.2.9.-EXTRACCIÓN DEL DNA PLASMÍDICO .................................................. 26
6.2.10.-SUBCLONACIÓN MOLECULAR EN EL VECTOR DE EXPRESIÓN DE
MAMÍFERO ................................................................................................ 26
6.2.11.-MUTAGENESIS SITIO DIRIGIDA (MSD) PARA LA INCORPORACIÓN
DEL INICIO KOZAK .................................................................................. 28
6.2.12.-TRANSFECCIONES EN CULTIVO CELULAR ...................................... 28
6.2.13.- EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES.... 29
6.2.14.-CUANTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE DBH POR WESTERN
BLOT ........................................................................................................... 29
6.2.15.-CUANTIFICACIÓN DE NORADRENALINA EN CULTIVO CELULAR
...................................................................................................................... 30
6.3.-MÉTODOS ESTADÍSTICOS ................................................................................. 31
6.3.1.-ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS GENOTIPOS .................................... 31
6.3.2.-EVALUACIÓN DEL TEMPERAMENTO BOVINO .................................. 32
6.3.2.1.-COMPORTAMIENTO EN LA MANGA Y EN LA SALIDA ...... 32
6.3.2.2.-VELOCIDAD DE SALIDA ........................................................... 33
6.3.3.-ELISA CUANTITATIVO DE NORADRENALINA ................................... 34
6.3.4.-DETERMINACIÓN DE LAS ASOCIACIONES GENOTIPO-FENOTIPO 34
7.-RESULTADOS ............................................................................................................... 36
7.1.-ENSAYOS IN VIVO ............................................................................................... 36
7.1.1.-DIVERSIDAD ALÉLICA Y HAPLOTÍPICA EN DBH EN POBLACIONES
DE BOVINOS .............................................................................................. 36
7.1.2-EVALUACIÓN DEL TEMPERAMENTO BOVINO ................................... 41
7.1.3.-MEDICIONES DE NORADRENALINA EN PLASMA BOVINO............. 43
II
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
7.1.4.-ESTIMACIONES
DE
LAS
ASOCIACIONES
ENTRE
LAS
CARACTERÍSTICAS EVALUADAS ........................................................ 44
7.2.-ENSAYOS IN VITRO ............................................................................................ 50
8.-DISCUSIÓN .................................................................................................................... 53
8.1.-ENSAYOS IN VIVO ............................................................................................... 53
8.2.-ENSAYOS IN VITRO ............................................................................................ 63
9.-CONCLUSIONES ........................................................................................................... 64
10.-PERSPECTIVAS .......................................................................................................... 65
11.-BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 66
12.-GLOSARIO ................................................................................................................... 81
13.-ANEXOS ....................................................................................................................... 84
III
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
ABREVIATURAS
ADN
Ácido desoxirribonucléico (desoxyrribonucleic acid)
ACRS
Amplificación de sitios de restricción creados (amplification created restriction site)
ARN
Ácido ribonucléico (ribonucleic acid)
BTA
Autosoma de Bos taurus (Autosome of Bos taurus)
CA
Catecolaminas (catecholamines)
°C
Grados Celsius (Celsius degrees)
DA
Dopamina (Dopamine)
DBH
Dopamina beta hidroxilasa (Dopamine beta hydroxylase)
dNTPs
Desoxirribonucleótidos trifosfatados (triphosphatade desoxyrribonucleotides)
EP
Epinefrina o adrenalina (epinephrine or adrenaline)
He
Heterocigoto (heterozygote)
Ho
Homocigoto (homozygote)
µL
Microlitro (microliter)
mM
Milimolar (milimolar)
mL
Mililitro (mililiter)
MAO A Monoamino oxidasa A (monoamine oxidase A)
MAO B
Monoamino oxidasa B (monoamine oxidase B)
mDBH
Forma unida a la membrana de la enzima DBH (membrane bound form of DBH)
NE
Noradrenalina o norepinefrina (noradrenaline or norepinephrine)
nsSNP
Polimorfismo de un solo nucleótido no sinónimo (non-synonymous single nucleotide
polymorphisms)
pb
Pares de bases (base of pare)
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction)
RFLP
Fragmentos de restricción de longitud polimórfica (restriction fragment
polymorphisms)
rpm
Revoluciones por minuto (revolutions by minute)
sDBH
Forma soluble de la enzima DBH (soluble form of DBH)
SNPs
Polimorfismos de un solo nucleótido (single nucleotide polymorphisms)
sSNP
length
Polimorfismos de un solo nucleótido sinónimo (synonymous single nucleotide
polymorphisms)
IV
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Iniciadores para la amplificación de los exones I, II y XII del gen DBH y
condiciones de PCR. ............................................................................................ 19
Cuadro 2. Iniciadores para la amplificación del cDNA del gen de DBH bovino por RT-PCR.
.............................................................................................................................. 19
Cuadro 3. Estrategias de detección de los genotipos para cada nsSNPs de DBH. .............. 21
Cuadro 4. Frecuencias genotípicas y alélicas de los 8 SNPs del gen DBH. ........................ 36
Cuadro 5. Equilibrio de Hardy-Weinberg por locus de DBH en cada raza bovina............. 38
Cuadro 6. Frecuencias de los haplotipos de DBH observados en dos razas bovinas. ......... 39
Cuadro 7. Frecuencias de los haplotipos mayoritarios observados en DBH con los ocho
SNPs en dos razas bovinas contrastantes por su fondo genético. ........................ 40
Cuadro 8. Clasificación de la población Brahman por temperamento en la velocidad de
salida..................................................................................................................... 42
Cuadro 9. Resumen de los porcentaje de individuos por temperamento en las tres técnicas
de evaluación. ....................................................................................................... 43
Cuadro 10. Selección por haplotipos en la población tipificada de Brahman. .................... 43
Cuadro 11. Medias de cuadrados mínimos de las concentraciones de noradrenalina por
haplotipos. ............................................................................................................ 43
Cuadro 12. Medias de cuadrados mínimos y error estándar por genotipos en las 3 técnicas
de evaluación del comportamiento bovino........................................................... 45
Cuadro 13. Medias de cuadrados mínimos y error estándar por rasgo productivo para los
genotipos del nsSNP 8 y el temperamento evaluado en tres pruebas (n=67). ..... 49
V
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Ruta biosintética y metabólica de las catecolaminas. ........................................... 3
Figura 2. Estructura del gen DBH y ubicación de los ocho nsSNPs. .................................... 7
Figura 3. Células PC12. ....................................................................................................... 17
Figura 4. Células HEK-293. ................................................................................................ 17
Figura 5. Células SH-SY5Y. .............................................................................................. 18
Figura 6. Estructura del vector de expresión pcDNA 3. .................................................... 27
Figura 7. Análisis de correspondencia que muestra la segregación de los 21 haplotipos en
las dos razas bovinas de diferente fondo genético. ................................................. 39
Figura 8. Frecuencias de los siete haplotipos mayoritarios en DBH para dos razas bovinas
contrastantes por su fondo genético........................................................................ 40
Figura 9. Clasificación de la población general de Brahman por el temperamento en la
velocidad de salida. Se estimó que los grupos son significativamente diferentes
(p<0.05). ................................................................................................................. 41
Figura 10. Medias de cuadrados minimos del comportamiento en la manga por genotipos
del SNP 6. ............................................................................................................... 46
Figura 11. Análisis de contingencia de los genotipos del SNP 6 para el temperamento en la
manga...................................................................................................................... 46
Figura 12. Análisis de correspondencia en el manejo en manga para el SNP 6. ................. 47
Figura 13. Análisis de contingencia de comportamiento por genotipos del SNP 7. ........... 47
Figura 14. Medias de cuadrados mínimos para el SNP 7 en el comportamiento en la manga.
................................................................................................................................ 48
Figura 15. Productos del cDNA de DBH bovino obtenido por RT-PCR. ........................... 50
Figura 16. Gel de proteínas teñidos con Azul de Coomasie. ............................................... 51
Figura 17. Western Blot de células transfectadas ................................................................ 52
VI
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
RESUMEN
La Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) es la enzima clave para la producción de
noradrenalina. En un estudio previo de este gen se han encontrado 62 polimorfismos, entre
los cuales, ocho son no sinónimos (nsSNPs) y constituyen el eje central del presente estudio.
Donde primeramente se establecieron las frecuencias alélicas y genotípicas para la validación
de los polimorfismos, observándose significativas diferencias inter-razas bovinas según su
fondo genético siendo los genotipos sin mutaciones (AA) más frecuentes en Charolais (0.731
a 1.0), mientras que en Brahman las frecuencias alélicas son a favor del alelo que posee siete
de los nsSNPs (0.851-0.967). En los ocho nsSNPs existe desviación del EHW, con
deficiencia de heterocigotos e inclinación hacia un homocigoto en específico; y la prueba de
DL muestra que con excepción del SNP6 todos los loci están ligados. Se obtuvieron 21
haplotipos con una distribución específica, haplotipos exclusivos y divergencia haplotípica
en las dos razas bovinas por su fondo genético.
Para el análisis in vivo, se realizaron tres pruebas de temperamento (velocidad de salida,
comportamiento en la manga y comportamiento a la salida) en 67 bovinos Brahman de élite.
La población de análisis fue clasificada con base a los resultados de cada prueba, en la
velocidad de salida la mayoría de la población es de temperamento intermedio y toda la
población presenta una distribución normal, mientras que en la evaluación de
comportamiento en la manga el grupo más numeroso es calmado con el 76% y en la
evaluación del comportamiento en la salida los tres grupos presentan valores más semejantes
estando repartidos equitativamente.
La asociación de estos parámetros de comportamiento con el genotipo de DBH mostró
que los genotipos del SNP 6 en las evaluaciones del comportamiento en la manga, muestran
un efecto significativo (p=0.0326) encontrándose que son más calmados los individuos de
genotipo AA, y esto podria explicarse por la selección empírica del ganado, hacia aquellos
de comportamiento más manejable y calmado.
VII
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Se observaron también dos tendencias entre el SNP 7 en el temperamento medido en la
manga (P=0.136) siendo más calmados los homocigotos del alelo G, y para los genotipos del
SNP 8 en el temperamento medido en la salida (p=0.1).
Adicionalmente, en esta población se determinaron las concentraciones plasmáticas de
noradrenalina, las cuales fueron inferiores a 550 pg/ml, los animales que portan el haplotipo
1/1 poseen 514.13 pg/ml de noradrenalina, para el haplotipo 1/3 se obtuvo 485.84 pg/ml y
para el haplotipo 3/3 (homocigotos mutados AA) 371.20 pg/ml. Las concentraciones de
noradrenalina en los tres haplotipos no son estadísticamente significativos (P>0.05), pero la
diferencia entre los dos genotipos homocigotos presento una tendencia (P=0.1803).
En los ensayos in vitro se realizó la construcción de plásmidos recombinantes del
cDNA de DBH con y sin los nsSNPs, los cuales se transfectaron en tres lineas celulares de
mamifero (HEK 293, PC12 y SH-SY5Y). El análisis de Western Blot no mostró señales de
expresión de los plasmidos transfectados lo cual fue corroborado mediante la cuantificación
de noradrenalina con una prueba de ELISA, este resultado puede deberse a la inestabilidad
de la proteína y por la inestabilidad estructural del gen de DBH.
VIII
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
SUMMARY
Dopamine beta hydroxylase (DBH) is the key enzyme for the production of
noradrenaline. In a previous study of this gene have been found 62 polymorphisms, among
which eight are non-synonymous (nsSNPs) and are central to this study. Where first settled
allelic and genotypic frequencies for validation of polymorphisms, significant differences
observed inter-breeds of cattle according to their genetic background genotypes being
without mutations (AA) more frequent in Charolais (0.731 to 1.0), while Brahman the allelic
frequencies are in favor of the allele that has seven of the nsSNPs (0.851-0.967). In the eight
nsSNPs EHW deviation exists, and heterozygous deficient homozygote tilt specific, and DL
test sample except SNP6 all loci are linked. Twenty one haplotypes were obtained with a
specific distribution, exclusive haplotypes and divergence haplotype in the two cattle breeds
by their genetic background.
For in vivo analysis, there were three tests of temperament (exit velocity, behavior in
chute and behavior in exit) in 67 elite Brahman cattle. Analysis population was classified
based on the results of each test, the exit velocity in most of the population is intermediate
temperament the entire population has a normal distribution, whereas the assessment of
behavior in chute 76% of population is calm, and the assessment of behavior in exit, the three
groups have similar values being shared fairly.
The association of these behavioral parameters with DBH genotype showed, that
genotypes of SNP 6 in the behavior in chute, show a significant effect (p = 0.0326) were
found to calmer AA genotype individuals, and this could be explained by the empirical
selection of cattle, to those of more manageable and calm behavior. Two trends were also
observed, between SNP 7 with the behavior in chute (P = 0.136) being calmer G
homozygotes, and genotypes SNP 8 with temperament measured in exit (p = 0.1).
IX
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Additionally, in this population, plasma concentrations of noradrenaline, which were
less than 550 pg/ml, animals carrying the haplotype 1/1 possess 514.13 pg/ml of
norepinephrine, for haplotype 1/3 was obtained 485.84 pg/ml and for the haplotype 3/3
(mutant homozygous AA) 371.20 pg/ml. Noradrenaline concentrations in the three
haplotypes are not statistically significant (P> 0.05), but the difference between the two
homozygous genotypes presented a trend (P = 0.1803).
In assays performed in vitro, construction of cDNA recombinant plasmids with and
without DBH nsSNPs, which were transfected three mammalian cell lines (HEK 293, SHSY5Y and PC12). Western Blot analysis showed no evidence of expression of transfected
plasmids which was confirmed by quantification of noradrenaline with ELISA test, this result
may be due to protein instability and structural instability DBH gene.
X
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
1.-INTRODUCCION
Las razas bovinas en su mayoría se encuentran genéticamente aisladas por la selección que
ha realizado el hombre hacia rasgos de interés económico, como características productivas,
resistencia a enfermedades y facilidad de manejo. La variabilidad fenotípica es el reflejo de la
varianza genotípica inter-razas bovinas, la cual, en las últimas décadas ha comenzado a ser
explorada, encontrándose genes de gran importancia que determinan el fenotipo, la productividad
y la salud de los animales, siendo así, una herramienta que incorporada en los programas de
mejoramiento permite seleccionar animales élite con el más alto valor genético para la próxima
generación y obtener un aumento exponencial en la productividad ganadera.
Entre las características fenotípicas que afectan la productividad, el temperamento animal,
es fundamental en la regulación biológica y manifiesta el bienestar del animal, por lo tanto, afecta
directamente su productividad (Mormède, 2005), sin embargo, actualmente existen pocos estudios
del temperamento a nivel genético-molecular, debido al complejo sistema epistático que lo debe
enmarcar, pero el análisis de genes candidatos y polimorfismos nucleotídicos inter-razas es una
estrategia que se ha propuesto como alternativa para elucidar algunos de los genes con efecto
mayor en este rasgo.
Se ha demostrado que existen diferencias significativas en el temperamento entre razas de
fondo genético Bos taurus taurus (B.t. taurus) y razas Bos taurus indicus (B.t. indicus) (Hearnshaw
et al., 1984), es mayor la distancia de fuga en ganado Brahman que en razas taurinas (Grandin,
1980b) y estas diferencias fenotípicas pueden ser el efecto de las variaciones genéticas que
repercuten en las funciones biológicas en genes candidatos.
Estudios en diversas razas bovinas indican que el comportamiento afecta varias
características de la eficiencia productiva, como el crecimiento, la eficiencia alimenticia en ganado
de carne (Nkrumah et al., 2007b), la respuesta inmunológica, el crecimiento y la reproducción
(Burdick et al., 2011b) y la producción láctea (Hiendleder et al., 2003). En resumen, se considera
que el comportamiento refleja el bienestar del animal y afecta directamente su productividad, al
modificar su balance general y gasto energético diario, si los animales se enfrentan a diversos
1
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
agentes estresantes, los que pueden ser agudos o crónicos, siendo estos últimos los que impactan
más significativamente en los rasgos de productividad bovina.
Hasta ahora, se han realizado estudios en especies como ratón (Brodkin et al., 2002), (Turri
et al., 2001), perros (Hejjas et al., 2007b), (Maejima et al., 2007), (Ito et al., 2004), (Topál, 2009),
(Arata et al., 2008), lobos (Hejjas et al., 2007a), caballos (Momozawa et al., 2005), gallinas
(Sugiyama et al., 2004), monos (Arnsten et al., 2000; Bailey et al., 2007), la mosca de la fruta
(Edwards et al., 2006) y aves (Korsten et al., 2010), donde se han estudiado variaciones del
comportamiento y sus causas genéticas, analizando diversos polimorfismos en genes que codifican
enzimas biosintéticas, receptores o enzimas del metabolismo (Tochigi et al., 2006) de los
neurotransmisores de las rutas tanto dopaminérgica como serotoninérgica.
Entre estos, destaca el gen que codifica para la Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH), enzima
indispensable para la síntesis de noradrenalina. El gen DBH ha sido estudiado ampliamente en
humanos y diversas especies animales. En particular en bovinos, se han encontrado 62
polimorfismos (Lourenco-Jaramillo et al., 2012), entre los cuales, ocho SNPs son no sinónimos
(rs109440428,
rs109353933,
rs110234325,
rs110606764,
rs109388371,
rs109805094,
rs110864292 y rs110796564) y constituyen el eje central del presente estudio, para determinar la
variabilidad genética y evaluar su efecto en rasgos productivos de dos razas bovinas de fondo
genético contrastante.
2
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
2.-ANTECEDENTES
2.1-GEN DOPAMINA BETA HIDROXILASA (DBH)
El sistema catecolaminérgico ha sido estudiado por más de un siglo, tiempo durante el cual,
numerosos estudios han permitido clarificar diversos aspectos acerca de este complejo sistema. En
1897, la adrenalina (A) fue la primera catecolamina identificada (Abel, 1897), luego en 1946 fue
descubierta la noradrenalina (NA) (Von Euler, 1946) como el precursor de la adrenalina, por
último, en 1958 fue identificada la dopamina (Carlsson, 1959).
La enzima DBH sintetiza de norepinefrina o noradrenalina (N) a partir de la hidroxilación de
dopamina (DA) en los gránulos cromafines (Kirshner, 1962) (figura 1).
Figura 1. Ruta biosintética y metabólica de las catecolaminas.
La biosíntesis de las catecolaminas es regulada por diferentes enzimas como la de DBH,
que se encuentra en las vesículas cuando la dopamina es transformada en noradrenalina y liberada
por exocitosis, este proceso de biosíntesis se incrementa bajo condiciones particulares como los
cambios en la expresión genética de las enzimas, splicing alternativo del RNA y modificaciones
post-traduccionales que generan variaciones de la actividad enzimática (Garland et al., 2002).
3
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
La enzima DBH (E.C. 1.14.17.1) a través de su producto (la noradrenalina) realiza
importantes funciones a nivel del sistema nervioso central (SNC) y a nivel hormonal por ser un
modulador fisiológico, por ejemplo, en el desarrollo fetal y en el sistema inmune mediado por las
células T (Thomas et al., 1998). La noradrenalina es el mayor neurotransmisor post-ganglionar
del sistema nervioso simpático, liberándose en la médula suprarrenal en respuesta a situaciones de
estrés, fuga o defensa; su liberación masiva tiene efectos hormonales en todo el organismo, como
el incremento en la liberación de glucosa, el mantenimiento de la homeotermia y el aumento de
las respuestas cardíaca y respiratoria. En resumen, la noradrenalina es vital para la homeostasis
corporal por su participación en amplias funciones fisiológicas, cognitivas y de comportamiento
(Arnsten, 2000b), (Grace et al., 1998a).
La DBH se localiza en las neuronas noradrenérgicas en dos formas soluble (sDBH) y unida
a la membrana (mDBH) de las vesículas secretoras de noradrenalina y adrenalina en las células
neurosecretoras (Winkler, 1976), (Cubells, 1998). Estas células se concentran principalmente en
el locus ceruleus y se proyectan a numerosas áreas subcorticales y neocorticales del cerebro que
están enriquecidas con las fibras que contienen noradrenalina (Amaral et al., 1977; Moore et al.,
1979c).
En ratones, se ha estudiado que los comportamientos sociales y la agresividad poseen una
influencia de la vía dopaminérgica, ya que mediante una disminución de las funciones
noradrenérgicas específicamente en ratones knock-out del gen dopamina beta hidroxilasa (DBH/-) se demostró la deficiencia en la discriminación social y la disminución de la agresividad
(Marino et al., 2005). Por otro lado, en ratones doble knock-out para MAOA y MAOB
(Monoamino oxidasa A y B), se observó alteraciones del comportamiento como ansiedad,
persecución y escape aunado al incremento de las catecolaminas, sustratos de MAOA y MAOB
(Chen et al., 2004), previa comprobación de que en situaciones de estrés decrece sustancialmente
la actividad metabólica de MAO A y B (Obata et al., 1994).
En los últimos años, los estudios genéticos de DBH asociados a enfermedades humanas
han sido el centro de algunas investigaciones, permitiendo descubrir la secuencia del gen, sus
elementos reguladores, polimorfismos y la variabilidad genética del gen en diferentes especies.
En el caso particular de los humanos, los polimorfismos del gen DBH han sido asociados a las
4
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
alteraciones en la actividad plasmática de DBH y a las concentraciones de noradrenalina,
relacionándose fuertemente a diferentes enfermedades neurológicas, como Parkinson (Weintraub
et al., 2006), (Kimber et al., 2008), (Voon, 2007), esquizofrenia (Grace et al., 1998b; Arrufat et
al., 2000), (Laruelle et al., 1996), (Reynolds, 1983), déficit de atención e hiperactividad (Muller
et al., 2010), (Viggiano et al., 2003), (Arnsten, 2000a).
Además, se ha establecido que existe una asociación alélica del gen de DBH con la
susceptibilidad a la migraña típica (Lea et al., 2000), (Todt et al., 2009) y se determinó que un SNP
ubicado en el promotor de DBH (-1021CT) afecta en un 52% la actividad plasmática de DBH y
se asocia a la migraña (Fernandez et al., 2009), (Cubells, 1998).
Asimismo, algunas variaciones genéticas en el gen de DBH han sido asociadas con
diversos comportamientos como la respuesta a drogas como las anfetaminas (Hoebel, 1985), el
comportamiento materno (Thomas et al., 1997), el comportamiento impulsivo (Adriani et al.,
2009), la motivación y aprendizaje (Luksys et al., 2009), así como la alimentación (Geiger et al.,
2009), (Szczypka et al., 1999), donde se ha determinado que existe una relación entre el
comportamiento de alimentación y la deficiencia de catecolaminas, porque el déficit de dopamina
deteriora la actividad motora, se disminuye la búsqueda de alimento y los animales no comen
suficiente, por ende no hay ganancia de peso (Marino et al., 2005).
Los análisis que se han ejecutado en esta temática han establecido que las neuronas
dopaminérgicas tienen un rol fundamental en el control del comportamiento de alimentación ya
que las lesiones en el sistema nigro-estriatal con 6-OHDA (6-hidroxidopamina) produce afagia y
adipsia, por lo tanto, el sistema nigro-estriatal es crítico para aspectos sensomotores del
comportamiento de alimentación (Ungerstedt, 1971), (Zis et al., 1975b), (Zis et al., 1975a).
Otros estudios con antagonistas dopaminérgicos indican que se reduce el efecto de
reforzamiento de la alimentación, otros reportan que se presenta un incremento en el metabolismo
central de dopamina con la alimentación de ratas después de un período de privación de alimentos,
esta ha sido la primera clara correlación entre el sistema mesolímbico dopaminérgico y la
alimentación, luego se han realizado otros estudios que determinan el incremento dopaminérgico
en áreas como el hipotálamo, el núcleo accumbens y la amígdala, así como aspectos específicos
5
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
de la alimentación como el tiempo de duración, el tipo de alimento y la cantidad (Biggio et al.,
1977), (Heffner et al., 1980), (Zigmond et al., 1980), (Blackburn et al., 1986), (Breese et al., 1973),
por lo cual, se vislumbra que probablemente el control genético de la alimentación se encuentre
en los genes implicados en la biosíntesis de las catecolaminas, como DBH.
De la misma manera, se han realizado varios estudios de DBH en diversas poblaciones
humanas en búsqueda que establecer asociaciones con diversas enfermedades, como por ejemplo,
la enfermedad congénita autosómica recesiva donde una serie de mutaciones en el gen de DBH
producen una deficiente actividad enzimática, ausencia plasmática de adrenalina y noradrenalina
aunado al incremento de dopamina y en consecuencia producen hipotensión ortostática severa y
desórdenes cardiovasculares (Weinshilboum et al., 1975), (Timmers et al., 2004), (Robertson et
al., 1986), (Senard et al., 2006), (Garland et al., 2002).
Recientemente el estudio génico de DBH se ha enfocado en determinar la correlación entre
la actividad plasmática de DBH y polimorfismos en el gen, realizando evaluaciones en diversas
poblaciones humanas como la Indú (Bhaduri et al., 2008), poblaciones Afroamericanas (Tang et
al., 2007), Europeas y Japonesas (Zabetian et al., 2001), Alemanes y Americanos-Europeos
(Zabetian et al., 2003), Croatas (Pal et al., 2009). También, se ha tratado de relacionar la
hipertensión y la diabetes con la actividad plasmática de DBH (Cubeddu et al., 1981).
2.2.-EL GEN DBH EN BOVINOS
El gen DBH bovino se localiza en el cromosoma 11, de la posición 104554824 a la
104572619 (NCBI Gene ID: 280758) el gen está formado por doce exones y once intrones, en la
figura 2 se observa que cada exón e intrón posee un tamaño variable.
Su secuencia está catalogada como AC_000168.1 en la base de datos del NCBI pero
estos registros de DBH tanto su gen, RNAm y proteína (EC 1.14.17.1) han cambiado en pocos
años, ya que en 2009 estaba reportado que el gen poseía 17798 pb y posteriormente fue modificado,
en la última actualización al 16 de marzo de 2013, se encuentra que tiene 17796 bp con cambios
en casi todos los exones, así mismo ha cambiado el codón de inicio y de stop, el RNA mensajero
(NM_180995.2), el cDNA reportado y más aún la proteína que anteriormente contaba con 597
aminoácidos (siendo 19 el péptido señal) y hoy en día se reporta que posee 610 aminoácidos con
6
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
31 aminoácidos que conforman el péptido señal (NP_851338.1), esto es debido a fuertes
discrepancias que existen en cuanto a la transcripción y traducción del RNA, por lo cual, para el
presente estudio empleamos la información más actualizada del NCBI.
A nivel molecular es importante destacar como antecedente más directo, el estudio
realizado por Lewis (Lewis et al., 1990), donde partiendo de una librería de cDNA de médula
adrenal se obtuvo la secuencia codificante completa de DBH bovina, con un cDNA de 2.4kb que
codifica para la proteína de DBH de 597 aminoácidos de 66KDa, adicionalmente obtuvieron un
segundo RNA de 5.5kb expresado en cuatro copias menos y que genera la proteína de 68kDa, la
cual, podría representar una forma alternativa de DBH como la forma de DBH que es unida a la
membrana. Además, observaron mediante Western Blot dos bandas inmunoreactivas de 75KDa,
que pueden corresponder a las dos formas de DBH reportadas por otros investigadores (Wallace
et al., 1973), (McHugh et al., 1985), (Sabban et al., 1983b), (Sabban et al., 1983a), (Saxena et al.,
1983).
Figura 2. Estructura del gen DBH y ubicación de los ocho nsSNPs.
En un estudio previo, realizado por Lourenco (Lourenco-Jaramillo, 2009) se secuenció el
gen DBH en once individuos de cuatro razas bovinas de diferente fin productivo y fondo genético.
El análisis de las secuencias nucleotídicas permitió identificar 62 cambios nucleotídicos, de estos,
41 cambios (66%) se ubican en los intrones y 21 SNPs (34 %) se localizan en los exones, donde
ocho son cambios no sinónimos modificándose la inserción aminoácidica (nsSNPs) y 13 son
cambios sinónimos (sSNPs), determinándose que en este gen la frecuencia de cambios exónicos
es de un SNP cada 85pb (1775 pb/21 SNPs).
7
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Los ocho cambios no sinónimos (nsSNPs) detectados en el gen de DBH se localizan en los
exones I, III y XII formando parte del dominio funcional enzimático. Por ello, son de gran
importancia y conforman el antecedente directo para la presente investigación, ya que los análisis
in silico empleando la base de datos PFAM 23.0 del Instituto Sanger (Punta et al., 2012), el
programa IPTREE-STAB (Huang et al., 2007) y la base de datos ELM (Puntervoll et al., 2003),
sugieren que se modifican las características de los aminoácidos incorporados en la proteína
funcional, todos los cambios son termodinámicamente desestabilizantes de la proteína DBH,
debido a que modifican la estabilidad de las hojas beta, esto podría implicar modificaciones
significativas en la funcionalidad biológica.
La presencia de dos nsSNPs (A17299G y G17300A en individuos analizados de la raza
Brahman, genera la pérdida del motivo funcional MOD_GSK3_1, el cual, es un sitio de
reconocimiento para la fosforilación Serina/Treonina, estas regiones en otras proteínas son muy
importantes para la funcionalidad y por lo cual, se podría decir hipotéticamente que estas
alteraciones generarían modificaciones en las características de la proteína y afecta la actividad
enzimática de DBH.
Por otra parte, se han realizado varios estudios donde se determina la concentración
plasmática de diversas catecolaminas y se ha establecido que se presentan en sangre de humanos
y animales experimentales con las mismas características inmunobioquímicas que en otros tejidos.
De igual forma, su volumen circulante en plasma se incrementa en situaciones de estrés y decrece
en ratas tratadas donde existe destrucción de las terminaciones nerviosas simpáticas, por lo tanto,
la medición de catecolaminas en sangre se correlaciona directamente con la concentración en otros
tejidos como el cerebro y con la actividad funcional de DBH y otros genes involucrados en la
biosíntesis de catecolaminas como TH (Weinshilboum et al., 1975).
Además, se ha determinado que la mayor variabilidad interindividual de la actividad de
DBH es determinada genéticamente (Ross et al., 1973), (Oxenstierna et al., 1986), (Weinshilboum
et al., 1973) según los estudios realizados en seres humanos y no se han analizado en bovinos, por
lo cual, es de gran importancia este análisis.
2.3.-EL GEN DBH COMO CANDIDATO PARA EL TEMPERAMENTO BOVINO
8
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
El temperamento bovino refleja el bienestar animal y afecta la producción, este rasgo tiene
un gran impacto económico en la industria ganadera mundial con pérdidas anuales en EEUU US$
120 Millones y en México US$ 31 Millones; ya que repercute en características como: el
crecimiento, eficiencia alimenticia, respuesta inmunológica, calidad de la carne y producción
láctea (Burrow, 1997b), (Cafe et al., 2011), (Hall et al., 2011), (Hulbert et al., 2011), (Sewalem et
al., 2011), (Sutherland et al., 2012).
El temperamento animal fue definido por Burrow como la respuesta de comportamiento
de un animal a la manipulación por humanos (Burrow, 1997b), lo cual, comprende un amplio rango
de reacciones desde la inhibición hasta la agresión, la docilidad, el miedo, el nerviosismo y el
intento de fuga, donde son observables diversos parámetros como el nivel de actividad locomotriz
general del animal, los hábitos persistentes, la emocionalidad, el grado de alerta y la reactividad al
estrés (Hurnik, 1995). Este rasgo es afectado por la edad, las experiencias previas del animal, el
sexo, la manipulación de los animales, efectos maternos, factores ambientales, la herencia, la
especie y la raza; lo que hace complejo su estudio (Burrow, 1997a; Mormède, 2005).
Otros autores restringen el concepto de temperamento a la expresión o forma en que los
animales perciben y reaccionan a los estímulos, principalmente aquellos que originan
miedo(Boissy, 1995), (Boissy et al., 1995) en esta temática son muy importantes los estudios para
valorar el bienestar animal, ya que puede tener efectos negativos en la productividad (Boissy et
al., 1997), (Adeyemo et al., 1982), (Boissy et al., 1988), (Rushen et al., 2010). Además, la
selección de ciertos comportamientos es considerado muy útil para los humanos, según las
actividades en que se empleen los animales como los perros (Schmutz et al., 1998).
De forma general, el temperamento es fundamental en la regulación biológica, refleja el
bienestar del animal, afecta directamente la producción animal y se encuentra estrechamente
relacionado a la expresión génica a diferentes niveles, ya que cuando el ganado bovino se encuentra
en condiciones de estrés, ya sea en períodos de traslado, manejo sanitario o revisión, presenta
importantes cambios psicobiológicos (Beatty et al., 2006). En algunos países como Estados Unidos
y Australia se realiza la selección de algunas razas de bovinos por su temperamento en la manga
9
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
de manejo, evaluando en una escala desde uno para la máxima docilidad, a cinco para la máxima
agresividad (Tier, 2001).
Esta reactividad psicobiológica posee un componente genético fundamental que contribuye
a las diferencias individuales, por ejemplo se ha evaluado la heredabilidad de la reacción de
defensa a los seres humanos en varias especies domésticas, como cerdos (Hemsworth et al., 1990),
bovinos lecheros de la raza Holstein (Khan, 1970), en la raza Limousin se han realizado varios
estudios, donde se ha observado alta correlación genética entre la edad y el comportamiento (0.84
± 0.20), con heredabilidades moderadas (0.11-0.31), observándose que las mediciones del
temperamento fueron reproducibles y heredables, lo cual, puede responder a la selección genética
del ganado, siendo el inicio del uso práctico de la evaluación genética del temperamento y la
apertura a mayores investigaciones genéticas del comportamiento bovino, en virtud de las metas
de los ganaderos para las diversas razas en relación a la agresividad o docilidad deseable para cada
raza (Le Neindre et al., 1995), (Phocas, 2006), (Benhajali et al., 2010), (Grignard, 2001).
En otro análisis de parámetros productivos cárnicos se observó una alta correlación con el
temperamento mediante la medición de la velocidad de salida en cruzas B. indicus, se indicó que
la velocidad de salida puede ser un buen predictor del desempeño ya que los animales con
temperamento nervioso presentan menores ganancias de peso, baja eficiencia en la conversión
alimenticia y en la condición corporal (Petherick et al., 2002).
En un estudio con 3594 animales de razas Brahman, Belmont Red y Santa Gertrudis,
relacionando la calidad de la carne y el temperamento medido por la velocidad de salida y el
comportamiento en la manga, determinaron post-destete de los animales que la heredabilidad del
comportamiento medido por la velocidad de salida es 0.34, mientras que para el comportamiento
en la manga fue de 0.21, con una correlación genética cruzada de las dos mediciones del
temperamento de 0.96 indicando la fuerte relación genética en estas características de
temperamento.
Adicionalmente, se observó que los animales con mayores tiempos de salida (más
calmados, con mejor temperamento) fueron genéticamente correlacionados con mejor calidad de
10
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
la carne, al presentar menor fuerza de corte y mayor suavidad con –0.42 y 0.33 respectivamente;
mientras que se observó para la evaluación en la manga y la calidad de la carne 0.39 y –0.47
respectivamente, por lo cual, la selección de bovinos mediante las mediciones del temperamento
podrían emplearse en el mejoramiento de la calidad de la carne producida de ganado adaptado al
trópico (Kadel et al., 2006).
Por lo tanto, la evidencia teórica sugiere que es posible realizar análisis genéticos del
temperamento e incluirlos en los programas de selección para mejorar el bienestar y la eficiencia
productiva animal. Para esto, es indispensable conocer los mecanismos fisicoquímicos que surgen
como respuesta fisiológica al estrés, por ejemplo, se ha registrado que en condiciones de estrés se
incrementa la actividad del sistema simpático-adrenal aumentando la liberación de catecolaminas
(adrenalina y noradrenalina) con mayor producción y transporte de los neurotransmisores, así
como mayor actividad del eje hipotálamo-hipofisiario-adrenal, donde el hipotálamo libera CRF
(Factor Liberador de Corticotropina), se aumenta la liberación de ACTH (Hormona
Adrenocorticotropa) que estimula la producción de glucocorticoides (Cortisol y Corticosterona)
en la glándula adrenal que actúan en retrocontrol de CRF y ACTH.
Al mismo tiempo, los temperamentos nerviosos o agresivos implican costos energéticos
que impactan la productividad animal (Deerenberg et al., 1999), estos comportamientos con alto
costo energético decrecen en los animales domésticos debido a la selección para incrementar la
productividad (Schutz et al., 2002). Los glucocorticoides aumentan la actividad enzimática de TH,
DBH y por ende, las catecolaminas, para que en conjunto se produzca mayor gluconeogénesis,
lipólisis, proteólisis, que afecta la productividad animal, generando menor cantidad de carne por
la proteólisis y menos volumen de leche por la disminución de oxitocina que se relaciona con el
incremento de cortisol; en general el catabolismo aumentado es productivamente negativo y puede
emplearse como herramienta de diagnóstico (Aguera et al., 2001), (Viskupic et al., 1994).
A nivel genético, no existen muchos estudios encaminados a la exploración de las
características del temperamento en modelos animales, debido principalmente a la complejidad
biológica del sistema, las dificultades en el manejo de estos modelos y en los análisis estadísticos.
11
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
En el ser humano la mayoría de los estudios se han basado en la búsqueda de polimorfismos
en genes que codifican las enzimas y receptores que participan en las principales vías
neuroquímicas. En ganado bovino, existen pocos estudios de mapeo de regiones genómicas
(Wegenhoft, 2005) en ganado destinado a la producción de carne y leche (Schrooten et al., 2000),
(Spelman et al., 1999).
Por ejemplo, en 130 bovinos Canadienses de carne se evaluó el
temperamento y se genotipificaron 162 microsatélites en todo el genoma bovino, determinaron la
heredabilidad del temperamento en 0.36 y detectaron seis QTLs para el temperamento, estos se
ubican en los cromosomas 1, 5, 9, 11, 14, 15; destacando que el gen DBH bovino está localizado
en el cromosoma 11 donde se detectó ILSTS036, siendo un microsatélite de importancia (Schmutz
et al., 2001).
En ganado Holstein evaluando 264 marcadores genéticos distribuidos en todo el genoma
bovino y evaluando el temperamento durante la ordeña por el nerviosismo, agresividad y docilidad
de las vacas, se detectó un QTL en el cromosoma 29 asociado a producción láctea y temperamento,
siendo el primer QTL de este tipo (Hiendleder et al., 2003).
Otro estudio realizado en bovinos de tres generaciones Holstein × Charolais, donde se
tipificaron 165 microsatélites y el temperamento, se identificaron 29 regiones genómicas
significativas en 17 cromosomas, obteniéndose un QTL en el cromosoma 11 donde se localiza el
gen DBH.
También, en el BTA 29 se ubica el gen de Tirosina Hidroxilasa (TH) indispensable en la
síntesis del sustrato para DBH, en este cromosoma localizaron tres QTLs de interés, uno de los
cuales fue significativo para los dos test de temperamento y puede relacionarse al QTL reportado
por Hiendleder. Y no se obtuvo traslape de los QTLs relacionados a los dos ensayos de
temperamento, lo cual, mantiene la hipótesis que existen diferentes factores genéticos que influyen
en las respuestas de temperamento en diferentes situaciones (Gutiérrez-Gil, 2008).
Además, un estudio en bovinos Angus identificó un QTL en el BTA 29 y señalan como
gen candidato al DRD4 para el temperamento en este tipo de ganado cárnico (Glenske et al., 2011).
Otro estudio de QTLs con 2194 marcadores evaluados (101 microsatelites y 2093 SNPs) en 20
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Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
familias y 400 crías de Angus y Charolais, determinó varios QTLs relacionados a la eficiencia
alimenticia y dos de ellos se ubican en el BTA 11 (Sherman et al., 2009).
Los escasos estudios genéticos en esta área hacen que el presente análisis sea innovador ya
que hasta la actualidad, no se encuentran reportes de análisis a nivel molecular de los genes que
participan en la vía dopaminérgica en ganado bovino.
3.-JUSTIFICACIÓN
El temperamento animal es un rasgo elemental en la regulación biológica y manifiesta el
bienestar del animal. En ganado bovino, este rasgo afecta la producción y tiene un considerable
impacto económico en la industria ganadera mundial.
Hasta ahora la disección del componente genético del temperamento en bovinos ha sido
escasa, por lo tanto es necesario su análisis extenso, para su posible aplicación como herramienta
en las estrategias de selección y manejo del ganado bovino.
La dopamina beta hidroxilasa (DBH) es la enzima clave en la producción de los
neurotransmisores noradrenalina y adrenalina, que juegan un papel importante para responder a
situaciones que requieren mayor desempeño físico como estrés, fuga o ataque; razón por la cual,
DBH es un excelente candidato para la búsqueda de polimorfismos que se asocien a rasgos de
temperamento.
Se ha reportado que el gen que codifica para DBH en diferentes especies animales muestra
variabilidad genética y se ha sugerido que está representada principalmente por SNPs que pueden
asociarse al comportamiento animal de las diversas razas.
En bovinos el gen DBH (DBHb) muestra una amplia variabilidad genética, reportándose
62 SNPs (anexo 1), de los cuales, ocho (13%) son del tipo no sinónimos (nsSNPs) y su análisis in
silico permite predecir posibles cambios desestabilizantes en la proteína. El estudio de los nsSNPs
en ganado bovino cobra gran importancia ya que DBH es una enzima fundamental en la vía
13
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
dopaminérgica, los resultados de este estudio se espera tengan importantes implicaciones en la
disección del componente genético del temperamento en bovinos.
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Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
4.-HIPÓTESIS
Los polimorfismos no sinónimos (nsSNPs) del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) tienen un
efecto en la función enzimática de DBH y se asocian a cambios en el temperamento bovino.
5.-OBJETIVOS
5.1.-OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto funcional de ocho polimorfismos no sinónimos (nsSNPs) del gen
dopamina beta hidroxilasa bovino (DBHb) y su asociación con el temperamento bovino.
5.2.-OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.-Determinar in vivo el efecto de las variantes haplotípicas del gen DBHb sobre el
temperamento en poblaciones de ganado bovino.
1.1.-Tipificar los ocho nsSNPs en las poblaciones bovinas bajo estudio.
1.2.-Determinar la concentración plasmática de noradrenalina en las poblaciones bovinas.
1.3.-Realizar las mediciones del temperamento bovino.
1.3.-Establecer las asociaciones entre los haplotipos de los ocho nsSNPs de DBH, las
concentraciones plasmáticas de noradrenalina y el temperamento bovino.
2.-Analizar in vitro el efecto funcional de los ocho SNPs del gen DBHb en tres líneas celulares
transfectadas (HEK293, PC12 y SH-SY5Y).
2.1.-Construir las recombinantes con las variantes haplotípicas del cDNA de DBHb.
2.2.-Transfectar las contrucciones en células HEK293, PC12 y SH-SY5Y.
2.3.-Cuantificar la proteína DBH por Western Blot.
2.2.-Establecer las asociaciones entre las contrucciones recombinantes y la expresión
protéica de DBH.
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Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
6.-MATERIALES Y MÉTODOS
6.1.-MATERIALES BIOLÓGICOS
6.1.1.-MUESTRAS DE SANGRE PARA EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO
Se tomaron muestras de sangre por venopunción de 330 individuos de las razas Charolais y
Brahman de diversos hatos ganaderos, las muestras de sangre hasta su procesamiento se
mantuvieron refrigeradas a 4 ᴼC en tubos vacutainer (que declaran 7.2mg de EDTA para muestras
de 4ml).
6.1.2.-MUESTRAS DE PLASMA SANGUINEO PARA CUANTIFICACIÓN DE
NORADRENALINA
Fueron seleccionados 29 individuos Brahman en virtud de los haplotipos presentes,
conformándose tres grupos. Por venopunción en tubos vacutainer con EDTA se extrajeron las
muestras de sangre, se mantuvieron refrigeradas a 4 ᴼC, hasta realizar la separación del plasma por
centrifugación a 1500g por 15 minutos y los plasmas obtenidos se mantuvieron congelados a -70
ᴼC hasta su análisis.
6.1.3.-MUESTRAS DE GLÁNDULAS SUPRARRENALES PARA EXTRACCIÓN
DE ARN
Las glándulas suprarrenales son por excelencia el órgano blanco productor de catecolaminas,
y para su obtención se realizaron varios muestreos en bovinos recientemente sacrificados para uso
comercial, en el rastro Tipo Inspección Federal (T.I.F.) que pertenece a la Integradora Ganadera
del norte de Tamaulipas y se ubica a las afueras de la ciudad de Reynosa, Tamaulipas.
6.1.4.-LINEAS DE CULTIVO CELULAR PARA LAS TRANSFECCIONES
Las cuatro líneas celulares fueron seleccionadas en función de sus características reportadas
en el American Type Culture Collection (ATCC®) y son las que se indican a continuación:
16
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
 PC-12 (ATCC® Catalogo No. CRL-1721™): proveniente de glándula adrenal
(feocromocitoma) de Rattus norvegicus (rata), son células de morfología irregular
(figura
3), pequeñas con crecimiento en suspensión agregadas en racimos que producen dopamina
y noradrenalina. El medio completo de crecimiento requerido para esta línea celular consiste
en medio DMEM 1X (Gibco, Cat. N° 11995-081), suplementado con 5% de suero fetal
bovino (Gibco, Cat. N° 10437-028), 1% de mezcla de antibióticos (penicilina y
estreptomicina. Invitrogen, Cat. N° 15140-163) y 10% de suero fetal de caballo (Gibco, Cat.
N° 16050130), previamente inactivado a 56 ºC por 30 minutos.
Figura 3. Células PC12.
 HEK-293 (ATCC® Catalogo No. CRL­ 1573™): se aislaron de riñón fetal de Homo
sapiens (humano), presentan morfología epitelial y adherentes (figura 4). Estas células no
producen endógenamente catecolaminas, por lo cual, se emplean como control negativo. El
medio completo de propagación incluyó medio DMEM 1X (Gibco, Cat. N° 11995-081),
suplementado con 5% de suero fetal bovino (Gibco, Cat. N° 10437-028) y 1% de mezcla de
antibióticos (penicilina y estreptomicina. Invitrogen, Cat. N° 15140-163).
Figura 4. Células HEK-293.
17
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
 SH-SY5Y (ATCC® Catalog No. CRL-2266™): células de cerebro de morfología corta,
fina y epitelial (figura 5), obtenida de neuroblastoma de Homo sapiens (humano) en 1970,
estas células exhiben un nivel moderado de actividad de dopamina beta hidroxilasa (DBH).
El medio completo de propagación incluyó medio DMEM 1X (Gibco, Cat. N° 11995-081),
suplementado con 5% de suero fetal bovino (Gibco, Cat. N° 10437-028) y 1% de mezcla de
antibióticos (penicilina y estreptomicina. Invitrogen, Cat. N° 15140-163).
Figura 5. Células SH-SY5Y.
Para estas cuatro líneas celulares el crecimiento se realizó en una incubadora NUAIRE
modelo NU-4750 a 37 ºC con 95% de atmosfera de aire y 5% de CO2. Se estableció un banco de
células y la criopreservación se realizó con el medio completo específico, sin antibiótico y
suplementado con dimetil sulfóxido (DMSO de Sigma, Cat. N° D2650) en cantidad óptima para
cada línea, siendo 5 % para las células SH-SY5Y, mientras que para las células PC-12 y HEK-293
se empleó DMSO al 10%, se conservaron en congelación a -80 ºC y en nitrógeno líquido a -176
ºC.
6.2.-MÉTODOS EXPERIMENTALES
6.2.1-DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS ESPECÍFICOS
Se diseñaron varios juegos de oligos para diversos fines como se indican a continuación:
Para la tipificación de los nsSNPs de DBH en los animales en estudio, se amplificaron los
fragmentos del gen DBH correspondientes a los exones I, III y XII, bajo las condiciones
previamente estandarizadas (Lourenco-Jaramillo, 2009) para cada exón empleando 60 ng ADN
molde, las condiciones que varían entre los exones se resumen en el cuadro 1.
18
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Cuadro 1. Iniciadores para la amplificación de los exones I, II y XII del gen DBH y condiciones de PCR.
Exón
I
III
XII
Nombre del Primer
DBH1F
Secuencia 5’-3’
TGGCCGTCTTCCTGGTCATC
DBH1R
DBH3F
GGGAGGGCGAGTGCAGAGAA
CCGGGCTTGGGGCTGTGAGT
DBH3R
GATGTGGTGCCGGGGGAAGC
DBH12F
TTTGGTTTGGGAGAAGG
DBH12R
TGCACCCGTCACACTCAA
Amplicón
Programa
MgCl
321
Touchdown 65 1.5 mM
296
Touchdown 65 1.5 mM
702
Touchdown 55 2.0 mM
Los programas de amplificación consisten en los siguientes ciclos:
Touchdown 65: incubar a 95ºC por 5 min, (95 ºC por 45 seg, 68ºC por 45 seg, disminuir 2ºC cada
ciclo, 72ºC por 45 seg) repetir por 5 veces, 95ºC por 45 seg, 65ºC por 45seg, 72ºC por 45 seg,
repetir por 30 ciclos e incubar a 72ºC por 10 min.
Touchdown 55: incubar a 95ºC por 5 min, (95 ºC por 45 seg, 62ºC por 45 seg, disminuir 2ºC cada
ciclo, 72ºC por 45 seg) repetir por 5 veces, 95ºC por 45 seg, 55ºC por 45seg, 72ºC por 45 seg,
repetir por 30 ciclos e incubar a 72ºC por 10 min.
-Para la obtención del cDNA del gen de DBH bovino por RT-PCR se diseñaron seis oligos (cuadro
2) que se optimizaron en diversas combinaciones y finalmente se seleccionó el juego constituido
por los oligos F1cDBH y R1cDBH, con 1.5 mM de MgCl, para amplificar el cDNA de 1937pb,
con el programa Touchdown 60: incubar a 95ºC por 5 min, (95 ºC por 45 seg, 65ºC por 45 seg,
disminuir 2ºC cada ciclo, 72ºC por 45 seg) repetir por 5 veces, 95ºC por 45 seg, 60ºC por 45seg,
72ºC por 45 seg, repetir por 30 ciclos e incubar a 72ºC por 10 min.
Cuadro 2. Iniciadores para la amplificación del cDNA del gen de DBH bovino por RT-PCR.
Nombre del Primer
Secuencia 5’-3’
Tm
F1cDBH
CCCAGCCATGCAGGTCCCCAGCC
73,5
F2cDBH
TCCATGTACGGCACCGCGGTGG
70,1
R1cDBH
GGCTATTCCATGGGGGTCTT
62,4
R2cDBH
TATTCCATGGGGGTCTTCAC
60,4
R3cDBH
TCTGCAGGGACACATTTA
55,3
RincDBH
CCTGGAAGCGGACGGCCGAG
70,6
19
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
-Para agregar el inicio de consenso Kozak de eucariotas se diseñó el oligonucleótido específico
para la mutagénesis sistemática que permite la incorporación de los nucleótidos circundantes al
codón de inicio de la transcripción, ya que según los estudios (Kozak, 1981), (Kozak, 1986),
(Lutcke et al., 1987) se ha determinado que estos nucleótidos modulan la tasa de síntesis de las
proteínas siendo en animales de 4 a 20 veces más con el inicio Kozak. El oligo empleado de 24
nucleótidos se indica a continuación indicándose en negritas minúsculas las bases agregadas y en
negritas mayúsculas las bases modificadas en torno al codón de inicio que se indica subrayado: 5’gccGcCAccATGGaggtccccagc-3’.
6.2.2.-EXTRACCIÓN DEL ADN GENÓMICO
De los animales seleccionados de las razas Brahman y Charolais se obtuvo el ADN de
acuerdo al protocolo del kit GeneEluteTM Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (SigmaAldrich, Cat. N° G1N350). Para este protocolo se emplearon 200 µL de sangre completa, que se
colocaron en un tubo eppendorf de 1.5 mL. Se agregó 180 µL de solución de lisis T y 20 µL de
proteinasa K, se mezcló al vortex por 15 s y se incubó a 55 ºC durante toda la noche. Se adicionó
200 µL de solución de lisis C, se mezcló en vortex 15 s y se incubó a 70 ºC durante 10 minutos.
Se agregó 20 µL de RNasa, se mezcló e incubó por 2 min a temperatura ambiente.
Se adicionó 500 µL de solución de preparación a la columna, se centrifugó a 12000 rpm
por 1 min y se descartó la solución. Se agregó 200 µL de etanol 100% al lisado, se agitó en vortex
por 20 s y se transfirió a la columna. Se centrifugó a 6500 rpm por 1 min, se transfirió la columna
a un nuevo tubo y se agregó 500 µL de solución de lavado. Se centrifugó a 6500 rpm por 1 min,
se trasladó la columna a un tubo nuevo y se adicionó 500 µL de solución de lavado.
Se centrifugó a 12000 rpm por 3 min, se transfirió la columna, se agregó 80 µL de solución
de elusión y se centrifugó a 6500 rpm por 1 min. Se verificó y cuantificó el ADN mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % empleando el marcador de peso molecular LAMBDA
DNA (GibcoBBL® Cat. N° 25250-010) a una concentración de 50 ng/µL, una vez obtenidos los
patrones electroforéticos, se calculó la concentración de cada muestra de ADN utilizando
el Fotodocumentador Kodak con transiluminador de luz UV adaptado a cámara Kodak G Logic
112 y con el software Molecular Imaging.
20
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
6.2.3.-TIPIFICACIÓN DE LOS nsSNPS
Para la determinación de los genotipos de los ocho SNPs en cada bovino se aplicaron tres
metodologías: PCR-RFLP, PCR-ACRS y secuenciación bidireccional para las regiones exónicas
I, III y XII donde se ubican los nsSNP, previamente descritas (Lourenco-Jaramillo, 2009),
(Lourenco-Jaramillo et al., 2012) y resumidas en el cuadro 3.
Cuadro 3. Estrategias de detección de los genotipos para cada nsSNPs de DBH.
EXÓN III
EXÓN I
Cambio Nucleotídico
A/G
(179 A >G)
A/G
(200 A >G)
T/G
(4438 T >G)
A/G
(4460 A >G)
EXÓN XII
A/C
(4504 A >C)
A/G
(17269 A >G)
A/G
(17299 A >G)
G/A
(17300 G >A)
Genotipos
AA
AG
GG
AA
AG
GG
TT
TG
GG
AA
AG
GG
AA
AC
CC
AA
AG
GG
AA
AG
GG
GG
GA
AA
Estrategia de detección
Secuenciación bidireccional
PCR-RFLP
con Acc I
PCR-RFLP
con Hinf I
PCR-RFLP
con Hha I
PCR-ACRS
con Pst I
PCR-RFLP
con Apa I
321 pb
321, 182 y 139 pb
182 y 139 pb
197, 70 y 29 pb
226, 197, 70 y 29 pb
226 y 70 pb
193, 86 y 17 pb
193, 124, 86, 69 y 17 pb
124, 86, 69 y 17 pb
152 pb
152, 127 y 25 pb
127 y 25 pb
702 pb
702, 488 y 212 pb
488 y 212 pb
Secuenciación bidireccional
Secuenciación bidireccional
6.2.4.-CUANTIFICACIÓN PLASMÁTICA DE NORADRENALINA
Para los análisis in vivo se tomaron muestras de sangre del ganado Brahman seleccionado,
se hizo la cuantificación de noradrenalina empleando la prueba de ELISA con el kit Tri-CAT EIA,
de ALPCO Diagnostics, Cat. N° 17-TCTHU-E01.
Las muestras plasmáticas con EDTA, almacenadas en refrigeración de 2-8°C se
cuantificaron por duplicado, con el kit de ELISA competitivo que posee un antígeno unido a la
21
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
fase sólida de la microplaca, por el cual compiten los anticuerpos de los analitos (el estándar, los
controles y las muestras).
Una vez que el sistema se equilibra, los remanentes de anticuerpos se eliminan por lavados
y aquellos que se encuentran unidos a la fase sólida son detectados por un anti-IgG de conejo
conjugado a peroxidasa usando TMB como sustrato y detectando la reacción a 450 nm con una
longitud de onda de referencia de 595 nm. La cuantificación de la muestras se realizó por
comparación contra la curva de referencia de los estándares medidos por duplicado.
Inicialmente se reconstituyeron los reactivos necesarios (buffer de lavado y la solución de
la enzima), para el buffer de lavado se diluyó los 20ml del buffer con 980ml de agua destilada para
un volumen final de 1000ml del buffer preparado y almacenar de 2-8⁰C.
La solución de la enzima de preparó al momento de ser utilizada en cada prueba, para ello,
se reconstituyó el vial de la enzima con 1ml de agua destilada, se mezcló, se agregó 0.3ml de Coenzima y 0.7ml de buffer para tener el volumen final de 2ml (para cada pozo se requiere 25µl de
la solución de la enzima).
Luego se procedió a preparar las muestras para la extracción y la acilación, en los pozos
de la placa de extracción se colocaron 10µl de los 6 estándares y 2 controles, mientras que por las
muestras 100µl, se agregó agua destilada en suficiente cantidad para tener en todos los pozos el
mismo volumen final de 100µl. Se agregaron 25µl del buffer TE en todos los pozos, se cubrió la
placa con la hoja adhesiva, se incubó por 60 min a 25⁰C en el agitador aproximadamente a 200rpm.
Se eliminó el exceso por inversión de la placa sobre papel absorbente, se agregó 1ml del
buffer de lavado en todos los pozos, se incubó por 5 min a 25⁰C con agitación, se limpió la placa
por inversión sobre papel absorbente, se repitió el lavado de los pozos una vez más, se agregó 50µl
del buffer de acilación, se agregó 25µl del reactivo de acilación en todos los pozos, se incubó por
20 min a 25⁰C en el agitador aproximadamente a 200rpm, se limpió la placa por inversión sobre
papel absorbente, se pipetió 1ml del buffer de lavado en todos los pozos, se incubó por 5 min a
25⁰C en el agitador, se limpió la placa por inversión sobre papel absorbente.
22
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Se lavaron los pozos una vez más, se agregó 100µl de ácido hidroclorídico, se cubrió la
placa con la hoja adhesiva, se incubó por 10 min a 25⁰C con agitación, se removió la hoja adhesiva
y se tomó del sobrenadante 90µl para la siguiente placa de microtitulación para la conversión
enzimática, se agregó 25µl de la solución de enzima, se cubrió la placa con la hoja adhesiva, se
incubó por 1min a 25⁰C en el agitador aproximadamente a 200rpm, se incubó por 2horas a 37⁰C.
Se agregaron 100µl del sobrenadante para la subsecuente placa enzimática, se agregó 50µl
del antisuero de norepinefrina en todos los pozos, se cubrió la placa con la hoja adhesiva, se incubó
por 1 min a 25⁰C en agitación, se incubó por 20 horas 4⁰C, se removió la hoja adhesiva, se eliminó
el líquido excedente, se lavó cuatro veces cada pozo con 300µl de buffer de lavado, se eliminó el
excedente de líquido colocando la placa invertida sobre papel absorbente.
Se adicionaron 100µl del conjugado de la enzima en todos los pozos, se cubrió la placa con
la hoja adhesiva, se incubó por 30min a 25⁰C en el agitador, se eliminó el excedente de líquido, se
lavó cuatro veces cada pozo con 300µl de buffer de lavado, se colocó la placa invertida sobre papel
absorbente, se agregaron 100µl de sustrato, se incubó por 30min a 25⁰C en el agitador, se permitió
la exposición directa a la luz solar, se agregó 100µl de la solución stop en cada pozo, se realizó la
lectura de la absorbancia de la solución en los pozos antes de los 10min a 450nm con una longitud
de onda de referencia a 595nm, usando el lector de placa de un solo canal Biotrak versión 1.3 de
Mersham Pharmacia Biotec.
23
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
6.2.5.-EXTRACCIÓN DEL ARN TOTAL
A partir de muestras de glándulas suprarrenales de bovinos se realizó la extracción de ARN
utilizando el estuche comercial de extracción total de ARN (Promega, Cat. N° Z3100) como se
indica a continuación: para cada extracción se empleó 0.10 a 0.04g de tejido, se agregó 175 µl de
buffer de lisis, se mezcló por inversión, se agregaron 350 µl de buffer de dilución de ARN, se
mezcló por inversión 3-4 veces, se incubó en el termomixer a 70 °C por 3 min y centrifugó durante
10 min a 14.000 x g, para proceder a la purificación, transfiriendo a un eppendorf nuevo el
sobrenadante de la solución del lisado centrifugada anteriormente (aproximadamente 500 µl).
Se agregó 200 µl de etanol al 95 % y se mezcló por pipeteo 3-4 veces, transfirió la mezcla
a la columna ensamblada, centrifugó a 14.000 x g durante 1 min, se descartó el líquido eluido,
agregó a la columna 600 µl de solución de lavado de ARN, se centrifugó a 14.000 x g durante 1
min, se descartó el líquido eluido y se preparó en un tubo estéril el mix de incubación de DNAasa
(40 µl Buffer Yellow Core, 5 µl de MnCl2 0.09M y 5 µl enzima DNAasa I (mantener en hielo y
mezclar el mix por pipeteo suave).
Luego se agregó 50 µl del mix de DNAasa directamente sobre toda la membrana, se incubó
durante 15 min a 23 °C, agregó 200 µl de la solución de stop DNAasa, se centrifugó a 14.000 x g
durante 1 min, se descartó el líquido eluido, se agregó 600 µl de la solución de lavado de ARN,
centrifugó a 14.000 x g durante 1 min, descartó el líquido eluido, agregó 250 µl de la solución de
lavado de ARN.
Se centrifugó a máxima velocidad durante 2 min, se colocó la columna en el tubo colector
final, se agregó a la membrana 100 µl de agua libre de nucleasas, se centrifugó a 14.000 x g
durante 1 min y se conservó a -70 °C el ARN purificado en alícuotas y para obtener la máxima
recolección se realizó una segunda elución. Se visualizó el ARN por electroforesis en agarosa al
1.2% con tiocianato de guanidina y se determinó el rendimiento y calidad del ARN purificado
espectrofotométricamente en absorbancias de 230, 260 y 280, generalmente el ARN presenta
radios de A260/A280= 1.7- 2.1 y A260/A230= 1.8- 2.2.
6.2.6.-REACCIÓN DE RT-PCR PARA LA OBTENCIÓN DEL cDNA DE DBHb
24
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Se empleó el kit de RT-PCR (Promega, Cat. N° A3500), con los oligos específicos
diseñados para el cDNA y en condiciones optimizadas que se detallan a continuación: para la
retrotranscripción se agregó de cada muestra el volumen equivalente a 1µg de ARN que se incubó
a 70 °C por 10 minutos antes de proceder a la síntesis de la primera cadena por retrotranscripción,
usando en la mezcla (2µl de Buffer de RT 10X, 4µl MgCl2 25mM, 2µl de mezcla de dNTPs 10mM,
0.5µl de ARNsin inhibidor recombinante de 40U/µl, 0.6µl de AMV transcriptasa reversa de
25U/µl, 1µl de random primers y agua en cantidad suficiente para completar 20µl de cada
reacción).
La reacción se realizó en el termociclador MJ Research con el programa 1cadena (10min
a 23°C, 60min a 42°C, 5min a 95°C, 5min a 2°C y enfriamiento mantenido a 4°C hasta su
conservación a -20°C y uso posterior en la PCR específica colocando 5µl del cDNA y 20µl de la
mezcla de reacción (5µL Buffer de PCR 10X + 1µL MgCl2 + 1µL dNTPs 10mM, 0.5µL de cada
oligo sentido y antisentido 20 µmol/ml , 0.5µL de Taq Polimerasa 5 U/mL + 11.5µL de agua), la
reacción de PCR se ejecutó en el termociclador con el programa RTPCR (94°C x 2min, 30 ciclos
de 94°C x 1min + 42°C x 2min + 72°C x 1min y un ciclo final de 72°C x 7min).
Los resultados se visualizaron en un gel de agarosa al 2 % y se tomaron las fotografías
correspondientes con el Fotodocumentador Kodak con transiluminador de luz UV adaptado a
cámara Kodak G Logic 112 y con el software Molecular Imaging.
6.2.7.-CLONACIÓN MOLECULAR PARA LOS PRODUCTOS DE RT-PCR
Los amplicones obtenidos de las suprarrenales de individuos de los diversos genotipos y
haplotipos fueron clonados primeramente usando el kit comercial StrataClone (Statagene, Cat. N°
240205).
Específicamente para el tamizaje de las clonas recombinantes se realizó la selección de
las clonas, su resuspensión en 20 µL de agua miliQ estéril, de los cuales se emplearon 10 µL para
la lisis por 15 minutos, luego se procedió a preparar el mix de PCR (5 µL Buffer de PCR 10X +
1.2 µL MgCl2 + 1 µL dNTPs 10mM, 1.2 µL de cada oligo sentido y antisentido de 5 µmol/ml, 0.7
µL de Taq Polimerasa 5 U/mL + 4.7 µL de agua + 5 µL de cada clona lisada), la reacción de PCR
25
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
se ejecutó en el termociclador MJ Research con el programa TAM, los resultados se visualizaron
en un gel de agarosa al 1.5 % y se tomaron las fotografías correspondientes con
el Fotodocumentador Kodak con transiluminador de luz UV adaptado a cámara Kodak G Logic
112 y con el software Molecular Imaging.
6.2.8.-SECUENCIACIONES BIDIRECCIONALES
Para cada clona tamizada que posee un amplicón de 2kb se procedió a realizar la
secuenciación para la genotipificación, para ello, se realizó la purificación con Exo-SAP-it, se
preparó la reacción de secuenciación utilizando el oligo forward del exón 3 de DBH, M13 forward
y reverse, para cubrir todas las regiones de interés, luego se purificó con Xterminator® y se tomó
20 L para cargar al secuenciador automático por capilaridad ABI PRISM 3100, las secuencias
nucleotídicas fueron analizadas en el programa MEGA 5.2 (Tamura et al., 2007; Tamura et al.,
2011).
6.2.9.-EXTRACCIÓN DEL ADN PLASMÍDICO
Se realizó de acuerdo al protocolo de Sambrook (Sambrook J., 1989), donde utilizando 3
mL del cultivo bacteriano se obtiene el pellet celular, luego del proceso las pastillas de ADN
plasmídico se secaron y se resuspendieron en 25 µL de agua miliQ estéril, se incubó a 37ºC por 5
min a 500 rpm en el termomixer y los productos se visualizaron por electroforesis en agarosa al
1.0%.
Posteriormente el vector de expresión y los ADN plasmídicos, fueron digeridos con Eco
RI durante 8 horas y ligados con Ligasa T4 ADN en proporción 1:5 toda la noche a 4ºC para
realizar la transformación en las células competentes TOP10F’.
6.2.10.-SUBCLONACIÓN MOLECULAR EN EL VECTOR DE EXPRESIÓN DE
MAMÍFERO
Cada muestra de cDNA seleccionada del proceso de tipificación fue empleada para la
subclonación en el vector de expresión de mamífero pcDNA3 (Invitrogen, Cat. No. V795-20,
26
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
(Figura 6), el cual, posee un tamaño de 5.4kb y posee un promotor de citomegalovirus humano
(CMV) que asegura el alto nivel de expresión en un amplio rango de células de mamífero.
El protocolo para la subclonación básicamente es similar al aplicado en la primera
clonación molecular, pero se parte de la ligación anteriormente mencionada del vector de
expresión y los ADN plasmídicos, que se transformaron en las células calcio competentes
preparadas de TOP10F’, posteriormente las clonas seleccionadas, fueron propagadas para la
extracción del ADN plasmídico, se secuenciaron y una vez verificadas, se realizó la propagación
en 50ml de medio LB para la obtención del ADN plasmídico a mediana escala (midipreps) para
ser transfectadas en las diversas líneas celulares.
Figura 6. Estructura del vector de expresión pcDNA 3.
27
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
6.2.11.-MUTAGENESIS SITIO DIRIGIDA (MSD) PARA LA INCORPORACIÓN
DEL INICIO KOZAK
Para la incorporación de la secuencia consenso Kozak de vertebrados, se utilizó el oligo
creado específicamente para el gen de DBH, y se realizó la amplificación usando como material
de partida la lisis de las clonas a mutar, la reacción de PCR se ejecutó en el termociclador MJ
Research con el programa Touchdown 60, los amplicones obtenidos de 2 Kb, se clonaron,
tipificaron, subclonaron y secuenciaron antes de propagar y realizar el midiprep con el estuche
para purificación plus de ADN plasmídico (Qiagen, Cat. No. 12945), los ADN plasmídicos fueron
cuantificados en un espectrofotómetro NanoDrop 1000 de Thermo Scientific y se visualizó por
electroforesis en agarosa al 0.8%.
6.2.12.-TRANSFECCIONES EN CULTIVO CELULAR
Las transfecciones se realizaron en el Instituto de Neurobiología de la Universidad
Nacional Autónoma de México. Se emplearon las cuatro líneas celulares anteriormente descritas,
transfectando 8µg de ADN plasmídico de cada clona de DBH y se co-transfectaron con 2.7µg de
ADNp de Cherry como reportero, con 20µl de lipofectamina
2000 (Invitrogen, Cat. No.
11668019) por reacción, estos se incubaron por 5minutos, se agregó la lipofectamina sobre el
medio DIMEN con ADN plasmídico, que se incubó por 25 minutos y en frascos T25 donde se han
generado los crecimientos celulares en monocapa al 60% de confluencia.
Se retiró el medio y se agregó 3.5ml de medio nuevo y la mezcla de transfección de 1.5ml,
se mezcló suavemente, se incubó a 37ºC por 48 horas en una incubadora NUAIRE modelo NU4750 a 37ºC con 95% de atmosfera de aire y 5% de CO2.
Se observó la fluorescencia a las 24 y 48 horas, en un microscopio Olympus CKX41 con
cámara acoplada DP70 y el programa DP Controller 2002, se estimó la eficiencia de la transfección
en cada procedimiento, a las 48horas post-transfección se recolectaron las células para realizar la
extracción de proteínas y su análisis posterior.
28
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
6.2.13.- EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES
A las 48 horas post-transfección, se retiró el medio de las células, se lavó con 3 ml de PBS,
se tripsinizaron con 1.5 ml por 3 minutos, se inactivó la tripsina con 1.5 ml de medio DIMEN
completo, se transfirió a eppendorff de 1.5 ml que se centrifugaron a 13000 rpm por 3 minutos
para obtener el pellet celular, se retiró el sobrenadante y se lavó el pellet con 1 ml de PBS frío, se
centrifugaron a 13000 rpm por 3 minutos, se eliminó el sobrenadante.
Se pesaron los pellets y por cada 0.5g obtenido se agregó 1.0 ml de buffer de lisis de glicina
pH=9.0, se realizó la homogenización de las células, se centrifugó a 13000 rpm por 20 minutos a
4 ºC, se cuantificaron los extractos crudos en el espectrofotómetro NanoDrop 1000 de Thermo
Scientific, se prepararon las alícuotas de 0.4 mg y se congelaron a -80 ºC para su uso posterior.
6.2.14.-CUANTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DE DBH POR WESTERN BLOT
Este protocolo se divide en tres secciones (PAGE, transferencia e inmunodetección) que
se explican a continuación:
-Electroforesis en gel SDS-Poliacrilamida: se preparó el gel de corrida al 15% y el gel de carga al
5%. Las muestras se desnaturalizaron a 96⁰C por 5 min en buffer de carga.
Se realizó la electroforesis con buffer de corrida 1X (pH=8.3) a 90V, 400mA por dos horas y
media. Posteriormente de cada prueba, se tiñó un gel con Azul de Comassie (al 0.1%) colocando
5 volúmenes de la solución de tinción por toda la noche y la solución de Desteñido (metanol/acido
acético glacial), se mantuvo en la plataforma de agitación por dos horas cambiando la solución 3
o 4 veces, hasta observarse correctamente y fotografiarse el gel.
-Transferencia: se preparó la cámara de transferencia vertical con el buffer Towbin (pH=8.3) en
frío. Se cortaron las membranas de PVDF y el papel de filtro a las dimensiones del gel, se
humedecieron las membranas en metanol y en el buffer de corrida.
Se preparó el sándwich (colocando el casette, una fibra pad, tres hojas de papel de filtro, el gel y
la membrana correctamente alineados sin burbujas, papel de filtro y fibra pad), se cerró el casette
y se colocó en el módulo de la cámara de electrotransferencia, se realizó la transferencia el cuarto
frío por dos horas a 30V y 400mA.
29
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
-Inmunodetección: se desmontó la transferencia para separar la membrana del gel y proceder al
bloqueo con BSA 1X en TBS por 2 horas. Se prepararon las diluciones de los anticuerpos primario
(anticuerpo monoclonal primario de DBH y actina) 1:4000 en buffer TBS-1X-Tw20 frío, se
incubaron las membranas con las diluciones de los anticuerpos primarios toda la noche (por 15
horas) en el cuarto frío en agitación constante.
Se lavaron las membranas tres veces en buffer TBS-1X-Tw20 por 20 min cada uno para
remover los anticuerpos no unidos, se prepararon las diluciones de los anticuerpos secundarios
(anti-IgG AP conjugado) a 1:2000 en buffer TBS-1X-Tw20 frío y se incubaron por dos horas con
gentil agitación. Se lavaron las membranas tres veces en buffer TBS-1X-Tw20 por 20 min cada
uno para remover el anticuerpo secundario no unido.
Se incubaron las membranas en la mezcla de solución reveladora para la fosfatasa alcalina
hasta que las bandas de interés mostraron la intensidad deseada protegiendo la solución de la luz
fuerte, las áreas reactivas se mostraran moradas después de 5 a 15 min, se detuvo la reacción
cuando se obtuvo la intensidad deseada, lavando la membrana con agua desionizada.
6.2.15.-CUANTIFICACIÓN DE NORADRENALINA EN CULTIVO CELULAR
Mediante un ELISA cuantitativo con el kit Tri-CAT EIA, de ALPCO Diagnostics, Cat. N°
17-TCTHU-E01. Se determinó la producción de noradrenalina en cada línea celular (PC12 y SHSY5Y) transfectadas con las dos construcciones (DBH sin mutaciones con inicio Kozak y la
recombinante de siete nsSNPs con inicio Kozak), así como las células control sin transfección para
la medición del nivel basal de producción de noradrenalina.
Para ello, todas las determinaciones se realizaron por triplicado y se aplicó el factor de
corrección pertinente en cada caso, después de realizar la curva de calibración y optimización de
los volúmenes requeridos de medio de cultivo para la cuantificación de noradrenalina excretada al
medio así como la catecolamina intracelular.
Se realizó la lectura de la absorbancia de la solución en los pozos antes de los 10min a
450nm con una longitud de onda de referencia a 595nm, usando el lector de placa de un solo canal
Biotrak versión 1.3 de Mersham Pharmacia Biotec.
30
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
6.3.-MÉTODOS ESTADÍSTICOS
Se realizaron diversos análisis estadísticos entre los ocho polimorfismos no sinónimos
evaluados de DBH, el temperamento bovino, la actividad funcional del gen representada
indirectamente por la actividad de la proteína y de noradrenalina.
6.3.1.-ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS GENOTIPOS
Mediante el programa Genepop (v 4.0.10) (Raymond, 1995), (Rousset, 2008) se estimaron
las frecuencias genotípicas y alélicas de los ocho nsSNPs de DBH por raza bovina, estas fueron
comparadas con las frecuencias esperadas, se realizó la prueba de ajuste al equilibrio de HardyWeinberg (EHW) (Guo et al., 1992) calculando el valor exacto de P, por el método de la cadena
de Markov y el test de probabilidad por el método de Fisher; se estimó el desequilibrio de
ligamiento genotípico para cada SNP con el método de Fisher, determinando X2, df y el valor de
P.
En el programa Arlequin (Excoffier et al., 1995), (Excoffier et al., 2005), (Excoffier et al.,
2010) versión 3.5.1.2, se realizó un análisis intrapoblacional calculando el número de loci
polimórficos y se estimaron las frecuencias haplotípicas con el algoritmo EM (Expectation
Maximization) estimador de máxima verosimilitud para los haplotipos en cada raza bovina
evaluada. Para evaluar la influencia de los haplotipos en cada raza de diverso fondo genético, se
realizó un análisis de correspondencia con el programa JMP versión 3.2.2 (SAS Institute Inc.,
Cary, North Carolina, USA) (Ye et al., 2000).
También, se analizaron los haplotipos con el programa computacional PHASE versión
2.1.1, a partir de la información genotípica se reconstruyeron los haplotipos por población
empleando en algoritmo Bayesiano (Stephens et al., 2001), (Stephens et al., 2005) y se construyó
el árbol filogenético con el método de Neighbor-Joining (Saitou et al., 1987), (Tamura et al.,
2004).
Para los análisis de asociación entre los locus y los rasgos productivos, se disponía de los
registros fenotípicos de Peso al Nacimiento (Moore et al.) y Peso al Destete (Struyf et al.). Se
realizó un análisis con el procedimiento de Modelos Lineales Generales (Generalized Linear
Models, GLM) del paquete estadístico SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC, USA), calculando las
31
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
medias de cuadrados mínimos de los genotipos para cada característica y aplicando el método de
mínima diferencia significativa (α=0.01) que tiene como objetivo describir el efecto de los
genotipos de DBH (variables independientes) sobres los valores genéticos disponibles por razas
(variables dependientes) y ajustado al modelo animal.
6.3.2.-EVALUACIÓN DEL TEMPERAMENTO BOVINO
La respuesta de comportamiento al manejo humano ha sido empleada en múltiples estudios
previos (Burrow, 1988), (Tulloh, 1961), (Petherick et al., 2009), (Grandin, 1993a), (Burrow,
1997a), (Hoppe et al., 2010b) evaluándose mediante el comportamiento en la manga,
comportamiento en la salida y la velocidad de salida, que se seleccionaron como indicadores del
temperamento bovino para este análisis.
La consistencia en la interacción entre los genotipos evaluados de DBH y las evaluaciones
del comportamiento se evaluaron con el procedimiento de Modelos Lineales Generales
(Generalized Linear Models, GLM) del paquete estadístico SAS (SAS Institute Inc., Cary, North
Carolina, USA) y mediante un análisis lineal que incluyó el efecto fijo por número de partos, ya
que solo se realizaron estas pruebas con vacas de una sola ganadería y los datos presentan una
distribución normal en el modelo empleado.
Se realizó un análisis comparándose las medias de cuadrados mínimos mediante la prueba
de Tukey (α= 0.05) en el paquete estadístico SAS y la correlación de Pearson, siendo significativo
con P<0.05 y se consideró como tendencia con P<0.10.
6.3.2.1.-COMPORTAMIENTO EN LA MANGA Y EN LA SALIDA
El temperamento se cuantificó mediante la observación de los animales por un evaluador
calificado mediante la determinación de la prueba de Kappa, la evaluación se realizó a través de
un cuestionario establecido por Grandin abarcando desde la docilidad hasta la agresión (Grandin,
1993b), cada individuo se observó cuatro veces en los videos, y se calificó en cada una de forma
independiente para posteriormente calcularse la media de estas evaluaciones. El comportamiento
en la manga se clasificó en 5 categorías donde los individuos clasificados con 1 ó 2 puntos son
calmados, 3 puntos para animales de comportamiento intermedio, valores de 4 y 5 para aquellos
temperamentales.
32
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Mientras que la evaluación en la salida se realizó con 4 categorías donde se clasifican con
un punto los calmados, 2 para los intermedios y animales temperamentales con 3 ó 4.
Estos cuestionarios previamente fueron estandarizados y validados para tal fin, por lo cual,
se calculó el alfa de Cronbach para estimar la consistencia interna del cuestionario. Los valores de
alfa de Cronbach mayores a 0.7 son considerados óptimos (Cronbach, 1951), (Bankstahl et al.,
2013).
Además, se realizó la prueba de Kappa para determinar la reproducibilidad y la consistencia
entre las mediciones, valores de kappa de 0.41-0.60 como moderados y valores de Kappa de 0.610.80 son sustanciales, considerándose en general que valores de Kappa superiores a 0.75 son
excelentes en estudios con alta reproducibilidad de las mediciones (Carletta, 1996), (Smeeton,
1985), (Landis et al., 1977), (Kirkwood, 2003).
6.3.2.2.-VELOCIDAD DE SALIDA
La velocidad de salida se cuantificó según lo reportado en la bibliografía (Burrow, 1988),
(Curley et al., 2006), (Curley et al., 2008) como el tiempo que tardan los animales en salir de la
prensa y recorrer una distancia fija de 1.83 mts. Para el análisis los datos se transformaron en
velocidad medida en metros sobre segundos (m/s) siendo la velocidad más baja la que corresponde
a los individuos calmados y la mayor velocidad a los individuos que salen más rápido de la manga
y que son nerviosos.
De las velocidades obtenidas se calculó la media poblacional y una desviación estándar,
clasificando a los animales en tres grupos: el grupo 1# más calmados son aquellos que tienen
velocidades por debajo de una desviación estándar de la media, el grupo 2# los animales
intermedios y el grupo 3# los temperamentales que son una desviación estándar más rápidos que
la media. Se realizó el análisis con el procedimiento de Modelos Lineales Generales (GLM)
calculando las medias de cuadrados mínimos con el paquete estadístico SAS (SAS Inst. Inc., Cary,
NC, USA).
33
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
6.3.3.-ELISA CUANTITATIVO DE NORADRENALINA
Estos resultados se analizaron mediante el programa GraphPad Prism 5 (GraphPad
Software Inc., La Jolla, CA 92037, USA), con las curvas de calibración de los seis estándares por
duplicado (R2=0.9995). A partir de las absorbancias obtenidas se calcularon las concentraciones
de los controles y las muestras de plasma bovino por extrapolación empleando una regresión no
lineal.
Los resultados son expresados en pg/ml; se determinó la precisión intra e inter ensayo con
coeficientes de variación de 7.54% y 9.56% respectivamente, la sensibilidad del método fue de
0.01ng/ml. Los resultados de las cuantificaciones de noradrenalina por grupos de haplotipos se
analizaron mediante un análisis de varianza de una vía (Makarova et al.) y prueba de comparación
múltiple de Tukey-Kramer, empleando el programa InStat versión 3.01 (GraphPad Software Inc.,
La Jolla, CA 92037, USA).
6.3.4.-DETERMINACIÓN DE LAS ASOCIACIONES GENOTIPO-FENOTIPO
Dada la disponibilidad de datos productivos (Peso al Nacimiento, Peso al Destete, Peso al
Destete Ajustado a los 205 días) para los individuos de raza Brahman y para los animales de raza
Charolais de Peso al Nacimiento, Peso al Destete, así como las DEP’s (Diferencias Esperadas de
la Progenie) estimadas para PN, PDA, PA, MT, L y T. Se realizó un análisis con el procedimiento
de Modelos Lineales Generales (GLM) calculando las medias de cuadrados mínimos de los
genotipos para cada característica y aplicando el método de mínima diferencia significativa
(α=0.1) del paquete estadístico SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC, USA), ajustado al modelo animal:
Yij = μ + Gi + ɛijk
Donde: Yij = Valores genéticos.
μ = Media general de cuadrados mínimos.
Gi = Efecto fijo del i-esimo genotipo de cada SNP en el gen de DBH.
ɛijk = Error aleatorio.
Se estableció por cada haplotipo la media y el error estándar de la concentración de
noradrenalina, manejando como covariable el parto y el efecto fijo los SNPs; mediante una
T-
34
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Student se evaluaron las respuestas al manejo por cada SNP y por un análisis lineal que incluyó el
efecto fijo por número de partos también se evaluó la respuesta al manejo por genotipo. Además,
se realizó un análisis de correspondencia con el programa JMP versión 3.2.2 (SAS Institute Inc.,
Cary, North Carolina, USA) (Ye et al., 2000) entre los SNPs y los temperamentos asignados por
los resultados de las evaluaciones de comportamiento durante el manejo.
35
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
7.-RESULTADOS
7.1.-ENSAYOS IN VIVO
7.1.1.-DIVERSIDAD ALÉLICA Y HAPLOTÍPICA EN DBH EN POBLACIONES
DE BOVINOS
En el cuadro 4, se presentan las frecuencias alélicas y genotípicas de los ocho nsSNPs de
DBH, como puede observarse los genotipos sin mutaciones (AA) son los más frecuentes en la
población de Charolais con frecuencias de 0.731 a 1.0; mientras que en la raza Brahman es inverso,
con altas frecuencias genotípicas de los homocigotos mutados (BB) en la mayoría de los SNPs,
con su valor máximo de 0.935 en los SNP 1, 2, 3 y 5 del gen de DBH, con excepción del SNP 6
(rs109805094), donde para las dos razas el genotipo más frecuente es AA, el cual se encuentra fijo
en Charolais con el 100% de la frecuencia y en Brahman con 0.805 de la frecuencia AA y continua
considerándose un SNP polimórfico ya que su frecuencia alélica es superior a 10% en Brahman.
Cuadro 4. Frecuencias genotípicas y alélicas de los 8 SNPs del gen DBH.
ID SNP
Razas
Frecuencias Genotípicas
Frecuencias Alélicas
AA
AB
BB
A
B
Charolais
0.814
0.172
0.014
0.900
0.100
rs109440428
Brahman
0.000
0.065
0.935
0.033
0.967
SNP 2
Charolais
0.814
0.172
0.014
0.900
0.100
rs109353933
Brahman
0.000
0.065
0.935
0.033
0.967
SNP 3
Charolais
0.731
0.200
0.069
0.831
0.169
rs110234325
Brahman
0.000
0.065
0.935
0.033
0.967
SNP 4
Charolais
0.828
0.152
0.020
0.903
0.097
rs110606764
Brahman
0.065
0.013
0.922
0.071
0.929
SNP 5
Charolais
0.820
0.159
0.021
0.900
0.100
rs109388371
Brahman
0.019
0.046
0.935
0.042
0.958
SNP 6
Charolais
1.000
0.000
0.000
1.000
0.000
rs109805094
Brahman
0.805
0.188
0.007
0.899
0.101
SNP 7
Charolais
0.855
0.145
0.000
0.928
0.072
rs110864292
Brahman
0.110
0.078
0.812
0.149
0.851
SNP 8
Charolais
0.951
0.049
0.000
0.976
0.024
rs110796564
Brahman
0.396
0.409
0.195
0.601
0.399
SNP 1
36
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
En el caso de la población Brahman, las frecuencias alélicas están notoriamente a favor del
alelo mutado (B) con valores entre 0.851-0.967, mientras que se invierte hacia el alelo A en la raza
Charolais con valores de 0.831 hasta 1.0, lo cual, se relaciona al fondo genético de ambas razas
bovinas. No se observaron diferencias en las frecuencias genotípicas y alélicas en las diferentes
ganaderías de las mismas razas bovinas.
En los ocho SNPs evaluados en DBH, se observa por razas la desviación del equilibrio de
Hardy-Weinberg (EHW) con deficiencia de heterocigotos e inclinación hacia un homocigoto en
específico, según sea el fondo genético (cuadro 5), donde se indica por locus con los valores de P,
el error estándar, X2 y probabilidad con df= 4.
Existe en Brahman una desviación significativa del equilibrio de H-W en el SNP 4
(rs110606764) (ᵡ2=infinito; df=8; p<0.0001) y en el SNP 7 (rs110864292) (ᵡ2=infinito; df=8;
p=0.00000) donde la estimación del valor exacto de P se realizó para todos los loci. En el EHW
por población se observa que en Charolais X2 =23.7558, calculado por el método de Fisher, df=14
y P=0.0490.
Mientras en Brahman se obtiene X2 =infinito, df=16 (ya que el SNP 6 si fue polimórfico en
esta población) y probabilidad altamente significativa. La prueba de (DL) muestra que con
excepción del SNP6 todos los loci están ligados (ᵡ2=infinito; df=4; p=0.0001). El SNP 6 que solo
se encuentra en DL con el locus 8.
37
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Cuadro 5. Equilibrio de Hardy-Weinberg por locus de DBH en cada raza bovina.
Razas
P-Val
S.E.
X2
Probabilidad
Charolais
0.6298
0.0015
0.9248
0.9210
Brahman
1.0000
0.0000
Charolais
0.6351
0.0017
0.9079
0.9234
Brahman
1.0000
0.0000
Charolais
0.0009
0.0002
14.0486
0.0071
Brahman
1.0000
0.0000
Charolais
0.1268
0.0024
∞
**
Brahman
0.0000
0.0000
Charolais
0.1538
0.0028
17.7479
0.0014
Brahman
0.0009
0.0002
Charolais
Brahman
1.0000
0.0000
Charolais
1.0000
0.0000
∞
**
Brahman
0.0000
0.0000
Charolais
1.0000
0.0000
5.4256
0.2463
Brahman
0.0663
0.0031
DF=4 en todos los SNPs. ∞ Valor infinito. **Altamente significativo.
ID SNP
SNP 1
rs109440428
SNP 2
rs109353933
SNP 3
rs110234325
SNP 4
rs110606764
SNP 5
rs109388371
SNP 6
rs109805094
SNP 7
rs110864292
SNP 8
rs110796564
Se calcularon las frecuencias haplotípicas, obteniéndose 21 haplotipos en DBH que se
presentan en el cuadro 6, donde la distribución haplotípica posee diferencias específicas entre las
dos razas estudiadas, se observan los haplotipos exclusivos minoritarios para cada raza donde seis
corresponden a Brahman y cuatro a Charolais. De esta información se deriva la figura 7, donde se
hace más notoria la divergencia haplotípica en las dos razas bovinas de fondo genético contrastante
mediante el análisis de correspondencia de los 21 haplotipos de DBH.
Existen muy altas frecuencias de ciertos haplotipos por razas, mientras que otros se
observan en muy baja proporción, por lo cual, se presentan en el cuadro 7 y en la figura 8 los siete
haplotipos más frecuentes, estos explican el 95% de las frecuencias haplotípicas tanto en Brahman
como en Charolais, en la cual, el 82% de la población posee el haplotipo #4, que se caracteriza por
la ausencia de los ocho polimorfismos en su estructura.
Mientras que en Brahman se presentan dos haplotipos mayoritarios #1 y #3, estos incluyen
seis y siete SNPs respectivamente y generan el 73% de la frecuencia, por lo cual, se emplean en
las cuantificaciones de noradrenalina. Estos haplotipos #1, 3 y 4, además del haplotipo #6 son
compartidos en las dos razas pero en baja frecuencia.
38
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Cuadro 6. Frecuencias de los haplotipos de DBH observados en dos razas bovinas.
ID
Haplotipo
Charolais
Brahman
1
GGGGCAGA
1.3793
27.9221
2
GGGGCGGA
0.0000
9.0909
3
GGGGCAGG
4.4828
45.1299
4
AATAAAAG
82.0689
2.9221
5
GGGACAGA
0.0000
1.2988
6
GGGGCAAG
1.7241
9.0909
7
GGGACGAA
0.0000
0.6494
8
AATACAAG
0.6897
0.3247
9
GGGGCAAA
0.3448
0.6494
10
GGGAAAGA
0.0000
0.3247
11
GGGGAAGG
0.0000
0.3247
12
GGGAAAAG
0.3448
0.3247
13
GGGGAAAG
0.0000
0.3247
14
GGGACAGG
0.6897
0.9740
15
GGGACAAG
0.0000
0.3247
16
GGGGCGAG
0.0000
0.3247
17
AAGAAAAG
6.2069
0.0000
18
AAGGAAAG
0.3448
0.0000
19
AAGGCAAG
0.6897
0.0000
20
GGGGAAGA
0.6897
0.0000
21
GGTAAAAG
0.3448
0.0000
Figura 7. Análisis de correspondencia que muestra la segregación de los 21 haplotipos en las dos razas
bovinas de diferente fondo genético.
39
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Cuadro 7. Frecuencias de los haplotipos mayoritarios observados en DBH con los ocho SNPs en dos razas
bovinas contrastantes por su fondo genético.
ID
Haplotipo
1 G G G G C A G
2 G G G G C G G
3 G G G G C A G
4 A A T A A A A
5 G G G A C A G
6 G G G G C A A
7 A A G A A A A
TOTAL
A
A
G
G
A
G
G
Frecuencia en Charolais
1.3793
0.0000
4.4828
82.0689
0.0000
1.7241
6.2069
95.8620%
Frecuencia en Brahman
27.9221
9.0909
45.1299
2.9221
1.2988
9.0909
0.0000
95.4547%
90,00
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
1
2
3
Frecuencia en Charolais
4
5
6
7
Haplotipos
Frecuencia en Brahman
Figura 8. Frecuencias de los siete haplotipos mayoritarios en DBH para dos razas bovinas contrastantes por
su fondo genético.
40
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
7.1.2-EVALUACIÓN DEL TEMPERAMENTO BOVINO
En este ensayo se evaluaron 67 bovinos puros de raza Brahman de exhibición, se
realizaron varias mediciones que se explicaron anteriormente como son la velocidad de salida y
las evaluaciones del comportamiento en la manga y en la salida de la prensa, para ello, el primer
aspecto fue realizar la formación del panel de cinco observadores y resultó la selección de un único
observador como la mejor estrategia, para observar y evaluar cuantitativamente el comportamiento
en cuatro repeticiones, para medir la consistencia interna del cuestionario se calculó el alfa de
Cronbach, obteniéndose en la manga 0.9280 y en la salida 0.9601, teniéndose que estos valores de
alfa de Cronbach son muy óptimos.
También, se calculó el valor de Kappa para determinar la consistencia entre las mediciones,
obteniéndose para las evaluaciones en la manga y en la salida 0.5897 y 0.8037 respectivamente,
siendo estos valores de kappa moderados y altos, es decir, que existe alta concordancia entre los
resultados obtenidos en las cuatro repeticiones para cada animal evaluado.
Específicamente en los resultados de velocidad de salida, en la población en general
(67
bovinos Brahman de un mismo hato ganadero) se obtuvo una media de 1.184±0.3942m/s (figura
9), se clasificó el temperamento en tres grupos siendo aquellos bovinos calmados los que tienen
una velocidad de salida por debajo del límite inferior 0.7898m/s, son animales temperamentales
los que poseen velocidades de salida mayores al límite superior de 1.5782m/s y los individuos de
temperamento intermedio presentan velocidades entre los dos limites 0.7898-1.5782m/s, entre
estos 3 grupos existen diferencias estadísticamente significativas (p<0.05).
Figura 9. Clasificación de la población general de Brahman por el temperamento en la velocidad de salida.
Se estimó que los grupos son significativamente diferentes (p<0.05).
41
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
También, se observó una diferencia significativa en los individuos según el grupo etario,
por lo cual, se clasificaron en 2 años y 4 años, donde se obtuvo que para los 42 animales de 2 años
de edad, la media de la velocidad de salida fue 1.2426m/s (DE±0.3402 y EE=0.05313), se
estableció el límite superior de 1.5828m/s y el límite inferior de 0.9024m/s.
Para los 25 individuos de 4 años se obtuvo una media de 0.9958m/s (DE±0.3036 y
EE=0.0647), el límite superior fue 1.2994m/s y el límite inferior de 0.6922m/s, en el cuadro 8 se
indican estos datos con el porcentaje específico de la población que se ubica en cada grupo, estos
datos siguen una distribución normal y la mayoría de los dos grupos etarios pertenecen al grupo
de temperamento intermedio.
Cuadro 8. Clasificación de la población Brahman por temperamento en la velocidad de salida.
Temperamento
Velocidad de salida (m/s)
Porcentaje de la población
Animales de 2 años (n=42):
(29 hembras)
(13 machos)
Calmado
< 0.9024
9.52
0
Intermedio
0.9025 - 1.5827
28.58
15.87
Temperamental
> 1.5828
6.34
4.76
Animales de 4 años (n=25):
(todas hembras)
Calmado
< 0.6922
7.94
Intermedio
0.6923 - 1.2993
22.23
Temperamental
> 1.2994
4.76
Posteriormente clasificando a todos los animales por los tres parámetros de evaluación del
temperamento, se observan diferencias en el número de individuos que se ubican en cada categoría,
como se indican en el cuadro 9, donde se observa que clasificados por la velocidad de salida la
mayoría de la población es de temperamento intermedio y toda la población presenta una
distribución normal, mientras que en la evaluación de comportamiento en la manga el grupo más
numeroso es calmado con el 76% y en la evaluación del comportamiento en la salida los tres
grupos presentan valores más semejantes estando repartidos equitativamente.
42
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Cuadro 9. Resumen de los porcentaje de individuos por temperamento en las tres técnicas de evaluación.
Técnica de evaluación / Categoría
Calmados
Intermedios
Temperamentales
Velocidad de salida
Comportamiento en la manga
Comportamiento en la salida
17.46%
76.19%
34.92%
65.08%
17.46%
44.44%
17.46%
6.35%
20.64%
7.1.3.-MEDICIONES DE NORADRENALINA EN PLASMA BOVINO
Para este ensayo el primer paso fue construir los conjuntos por haplotipos, debido a la poca
variabilidad que se encontró tanto en Charolais como Brahman, no fue posible formar grupos
haplotípicos con ausencia de SNPs y con todos los SNPs dentro de la misma raza, la mayor
variación se observó en Brahman y por ello, solo en esta raza se decidió realizar las mediciones de
noradrenalina, y se conformaron 3 grupos con un total de 29 animales, que varían solo en el octavo
SNP de DBH (cuadro 10).
Cuadro 10. Selección por haplotipos en la población tipificada de Brahman.
Haplotipo
Estructura
Número de individuos disponibles
1/1
GGGGCAG G
13
1/3
G G G G C A G g/a
9
3/3
GGGGCAG A
7
Los resultados de las concentraciones de noradrenalina (pg/ml) se presentan en el cuadro
11, se determinó la precisión intra e inter ensayo con coeficientes de variación de 7.54% y 9.56%
respectivamente, la sensibilidad del método fue de 0.01ng/ml.
Cuadro 11. Medias de cuadrados mínimos de las concentraciones de noradrenalina por haplotipos.
Haplotipo
1/1 (GG)
1/3 (GA)
3/3 (AA)
Concentración pg/ml
Error estandar
514.13
99.76
485.84
104.63
371.20
95.31
Pr>|t|
0.0001
0.0004
0.0016
43
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Las concentraciones plasmáticas de noradrenalina se analizaron en dos días consecutivos
que se tomaron las muestras a la misma hora como réplicas del ensayo, para todos los haplotipos
fueron inferiores a 550 pg/ml, los animales que portan el haplotipo 1/1 poseen 514.13 pg/ml de
noradrenalina, los portadores del haplotipo 1/3 presentan una media de 485.84 pg/ml, mientras que
los homocigotos mutados AA haplotipo 3/3 poseen 371.20 pg/ml, entre las concentraciones de
noradrenalina en los haplotipos comparados estos resultados no son estadísticamente significativos
(P>0.05), la diferencia entre los dos genotipos homocigotos presento una P=0.1803.
7.1.4.-ESTIMACIONES
DE
LAS
CARACTERÍSTICAS EVALUADAS
ASOCIACIONES
ENTRE
LAS
Posteriormente, se estimaron las posibles asociaciones entre los ocho nsSNPs de DBH, las
concentraciones de noradrenalina, las tres evaluaciones del comportamiento y los datos
productivos disponibles (peso al nacimiento, peso al destete y peso al destete ajustado a los 205
días), observándose que no existe correlación estadísticamente significativa (P>0.05) en las
poblaciones de Charolais y Brahman entre los genotipos, los rasgos productivos y la concentración
de noradrenalina en plasma.
En cuanto, a los análisis lineales en las evaluaciones de temperamento, se obtuvo para los
genotipos del SNP 6 versus las evaluaciones del comportamiento en la manga un efecto
significativo (P= 0.0326), así como, se observaron dos tendencias entre el SNP 7 versus el
temperamento medido en la manga y para los genotipos del SNP 8 versus el temperamento medido
en la salida (P= 0.1), todos los resultados se detallan a continuación en el cuadro 12.
44
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Cuadro 12. Medias de cuadrados mínimos y error estándar por genotipos en las 3 técnicas de evaluación del
comportamiento bovino.
AA
GG
Valor de P
AC
5
CC
Valor de P
0.9473 ± 0.1297
1.0862 ± 0.0486
0.3216
0.9729 ± 0.1480
1.0792 ± 0.0481
0.4983
Comportamiento en la
Manga (Escala de 1-5)
2.3121 ± 0.3347
2.0279 ± 0.1254
0.4305
2.4018 ± 0.3788
2.0270 ± 0.1231
0.3515
AA
1.0660 ± 0.0566
1.8849 a ± 0.1386
SNPs
Genotipo
1a4
6
AG
Valor de P
AA
7
AG
GG
1.0749 ± 0.0789
0.9276
1.0026 ± 0.1707
1.1646 ± 0.1213
1.0576 ± 0.0521
b
2.4082 ± 0.1932
0.0326
Comportamiento en la
Salida (Escala de 1-4)
1.5040 ± 0.2964
1.7608 ± 0.1110
0.4212
1.6488 ± 0.3384
1.7377 ± 0.1100
0.8039
1.6354 ± 0.1268
1.9115 ± 0.1767
0.2102
a
1.7192 ± 0.3917
a
1.6725 ± 0.2782
a
1.7406 ± 0.1195
2.6231 ± 0.4240
2.4367 ± 0.3012
AA
1.0674 ± 0.0823
1.9416 ± 0.1294
0.1360
1.9579 ± 0.2094
AG
1.0991 ± 0.0740
2.2309 ± 0.1882
1.9303 a ± 0.1615
GG
1.0305 ± 0.0857
1.9513 ± 0.2181
0.8328
0.5242
1.4098 a ± 0.1870
0.1151
Valor de P
8
Velocidad de salida (m/s)
Valor de P
0.6656
0.9747
1.7751 a ± 0.1796
Se observó un efecto significativo (p=0.0326) entre el temperamento medido en la manga
y los genotipos del SNP 6, encontrándose que son más calmados los individuos de genotipo AA
por las medias de cuadrados mínimos por genotipo (figura 10).
Mientras que en el análisis de contingencia de los genotipos del SNP 6 para el
temperamento en la manga se observa como es la distribución de los animales de cada
temperamento dentro de cada genotipo, teniéndose que los animales de genotipo AA son
mayoritariamente calmados y muy pocos temperamentales versus el genotipo AG donde son
menos los individuos calmados, con un grupo intermedio numeroso y más temperamentales, lo
cual, podría presumiblemente estar presentando un efecto aditivo pero para su confirmación se
requiere caracterizar individuos del genotipo GG, los cuales no se detectaron en la población
evaluada y el genotipo AA corresponde al 82% de la población de Charolais y el 80% de Brahman,
esto podría deberse a una selección empírica e indirecta de este genotipo por parte de los ganaderos
(figura 11).
45
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
A continuación en la figura 12 se presenta el análisis de correspondencia para los genotipos
AA y AG del SNP 6, con la clasificación del temperamento por la evaluación del comportamiento
en la manga, donde se observa que los individuos con genotipo AA son más calmados, mientras
que para el genotipo AG se reducen los animales calmados y se presentan más temperamentales.
Existe concordancia con los resultados de la tipificación, donde se observa una fuerte
presencia del genotipo AA en el SNP6, esto podria explicarse por la selección empírica del ganado,
hacia aquellos de comportamiento más manejable y calmado.
Figura 10. Medias de cuadrados minimos del comportamiento en la manga por genotipos del SNP 6.
Figura 11. Análisis de contingencia de los genotipos del SNP 6 para el temperamento en la manga.
46
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Figura 12. Análisis de correspondencia en el manejo en manga para el SNP 6.
Con respecto a la tendencia (P=0.136) observada entre los genotipos del SNP 7 de DBH y
las evaluaciones del comportamiento realizadas en la manga, en el análisis de contingencia (figura
13) se visualiza la variación del comportamiento por genotipos siendo más calmados los
homocigotos del alelo G.
Figura 13. Análisis de contingencia de comportamiento por genotipos del SNP 7.
47
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
En la figura 14 se presenta el gráfico de las medias de cuadrados mínimos por diferencias
calculadas por Tukey para el comportamiento evaluado en la manga para los genotipos del SNP
7, donde se observa que los individuos homocigotos A poseen valores más altos en la evaluación
del comportamiento, es decir, que son los animales más temperamentales, mientras que los
portadores del genotipo GG son los más calmados.
Figura 14. Medias de cuadrados mínimos para el SNP 7 en el comportamiento en la manga.
A continuación en el cuadro 13 de forma incipiente se pueden observar algunos
comportamientos de los datos que requerirán ser analizados en otras poblaciones con mayor
número de individuos, incluyendo poblaciones de fondo genético mixto que permitan obtener los
haplotipos más extremos con variación en la presencia de todos los ocho SNPs.
Para el SNP 8, se observan ciertas tendencias, ya que los individuos del genotipo GG
poseen los pesos más altos al nacimiento y PDA, en comparación a los animales de los otros
genotipos, en la clasificación por velocidad de salida los animales más rápidos son los
temperamentales y tienen menos pesos (PN, PD y PDA) al compararse con los calmados.
En el comportamiento en la manga para el PD los animales temperamentales pesan menos,
145.33 Kg versus los animales calmados que pesan 153.33Kg, de igual forma en el
comportamiento en la salida se observa que el PD es mayor en los animales calmados en
comparación a los animales intermedios y más aún respecto a los temperamentales, en este caso la
48
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
diferencia entre los pesos al destete de los animales calmados versus los temperamentales es de
21.36 kg y estadísticamente con una tendencia positiva por el 0.1 de valor de probabilidad.
Cuadro 13. Medias de cuadrados mínimos y error estándar por rasgo productivo para los genotipos del
nsSNP 8 y el temperamento evaluado en tres pruebas (n=67).
Genotipo del SNP 8
GG
GA
AA
Valor de P
PN
31.83 ± 0.76
31.68 ± 0.61
31.07 ± 0.71
0.7496
PD
143.92 ± 9.11
158.21 ± 7.33
152.14 ± 8.47
0.3732
PDA
126.66 ± 8.34
126.56 ± 6.72
126.45 ± 7.76
0.9987
Comportamiento por velocidad de salida
Calmado
Intermedio
Temperamental
Valor de P
32.36 ± 0.76
31.81 ± 0.49
31.66 ± 0.96
0.4241
153.79 ± 9.03
153.02 ± 5.85
140.61 ± 11.47
0.590
127.44 ± 8.28
126.92 ± 5.35
123.47 ± 10.51
0.9499
Comportamiento en la manga
Calmado
Intermedio
Temperamental
Valor de P
31.45 ± 0.44
31.56 ± 0.87
32.33 ± 1.46
0.8420
153.33 ± 5.24
148.59 ± 10.29
145.33 ± 17.30
0.8780
125.76 ± 4.74
126.85 ± 9.32
134.24 ± 15.66
0.8743
Comportamiento en la salida
Calmado
Intermedio
Temperamental
Valor de P
31.76 ± 0.61
30.88 ± 0.60
32.31 ± 0.82
0.3076
155.97 ± 7.02
155.50 ± 6.94
134.61 ± 9.49
0.1492
128.49 ± 6.52
128.36 ± 6.59
119.29 ± 8.91
0.6554
49
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
7.2.-ENSAYOS IN VITRO
7.2.1.-CONSTRUCCIÓN DE LAS RECOMBINANTES
Para construir las mutantes de DBH, se realizaron varios muestreos de suprarrenales, a las
cuales, se les extrajo el ADN para las tipificaciones de los ocho SNPs, y así determinar las
muestras candidatas para las extracciones de ARN y las RT-PCR, que se realizaron de acuerdo a
la técnica y concentraciones específicadas en la sección de materiales y métodos, para obtener el
producto del cDNA de DBH de 1937pb que se indica en la figura 15 con el marcador de 1Kb.
Figura 15. Productos del cDNA de DBH bovino obtenido por RT-PCR.
Los fragmentos de 1937pb se clonaron en el vector pSC-A, fueron secuenciados para
verificar su identidad; posteriormente se subclonaron en el plásmido pcDNA 3.0, las clonas
recombinantes se tamizaron de igual manera por secuenciación, estas se utilizaron como templado
para insertar el inicio consenso Kozak para vertebrados y se verificó por secuenciación el inicio
modificado y la presencia o ausencia de cada uno de los ocho SNPs de DBH (anexo 2).
50
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
7.2.2 VERIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LAS RECOMBINANTES
En la figura 16 se muestran los extractos crudos protéicos obtenidos a partir de los testigos
positivos (suprarrenales de ratón) así como de las líneas celulares con y sin transfección con dos
de las construcciones ensayadas, a saber pcDNA/DBH sin los nsSNPs y pcDNA/con siete de los
nsSNPs, ambas construcciones les fue adicionada la secuencia Kozak tal como se describe en
materiales y métodos.
Figura 16. Gel de proteínas teñidos con Azul de Coomasie.
(De izquierda a derecha: Control positivo 0.015mg de suprarrenales de ratón; Marcador Bench Marck
prestained protein ladder; control positivo 0.384mg de células PC12; Células HEK sin tratamiento 0.384mg;
Células HEK transfectadas con pcDNA 0.384mg; Células HEK transfectadas con DBH wild type-Kozak
0.384mg; Células HEK transfectadas con DBH 7SNPs-kozak 0.384mg).
Las transfecciones de DBH mostraron alta eficiencia de transfección (95%), la
cuantificación y visualización de los extractos protéicos crudos fue óptima, estos fueron probados
inicialmente realizando otro ensayo de Western Blot para actina como control y resultando
satisfactorios. Sin embargo, en los diferentes Western Blot específicos para DBH, realizados con
diversas concentraciones de proteínas en las tres líneas celulares, no se visualizan bandas
específicas que correspondan a DBH como se observa en los controles de DBH, proteínas extraídas
de suprarrenales de ratones y de células PC12 sin transfectar que se presentan en la figura 17, solo
se obtienen bandas específicas en el Western Blot de las células PC12 de las células transfectadas
pero esto corresponde a la expresión basal, que es intrínseca de esta línea celular, productora de la
proteína DBH nativa de rata.
51
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Figura 17. Western Blot de células transfectadas
(Panel A: células HEK 293; Panel B: células SHSY5Y; Panel C: células PC12).
Adicionalmente, para corroborar estos resultados, se realizó la medición de noradrenalina
excretada al medio extracelular mediante ELISA cuantitativo, en este caso, se optimizó el kit para
las mediciones del medio de cultivo, se realizaron las cuantificaciones de cada muestra por
triplicado y los resultados no demuestran la presencia de la catecolamina en el medio de cultivo
de las células transfectadas.
52
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
8.-DISCUSIÓN
8.1.-ENSAYOS IN VIVO
Los ocho polimorfismos evaluados en el gen DBH poseen frecuencias inter-razas bovinas
con diferencias significativas y fuerte predominio de un alelo específico, presentando desviación
del EHW, con desequilibrio de ligamiento y frecuencias haplotípicas diferentes según sea el fondo
genético taurino o cebuino,
siendo en estos resultados concordantes con los reportados
previamente (Lourenco-Jaramillo et al., 2012), lo cual, puede relacionarse con la divergencia
genética a partir del ganado primitivo, a los procesos de evolución, selección natural y artificial,
la domesticación y la adaptación específica para cada raza bovina, como se ha descrito en los
análisis masivos de SNPs en el genoma bovino en 47 razas (Gautier et al., 2010).
Asimismo, estos resultados se relacionan con el efecto que produce en el genoma la
selección positiva para determinado fin productivo, ya que los estudios masivos de polimorfismos
bovinos encuentran divergencia genética por fin productivo (Villa-Angulo et al., 2009).
Se ha estimado que cerca del 10% de los polimorfismos en el genoma taurino son antiguos
y el ganado doméstico posee un alto nivel de polimorfismos, que se segregan en conjunto
(MacEachern et al., 2009) generando los haplotipos específicos que se observan, en este caso en
el gen de DBH, con una divergencia significativa entre las razas estudiadas según su origen,
concordante con los resultados del Consorcio HapMap Bovino (Gibbs et al., 2009) y con el análisis
que indica un nivel de divergencia en la estructura de los haplotipos entre las razas Charolais y
Brahman de 52%, por lo cual, en el dendograma haplotípico se ubican en grupos diferentes entre
las 19 razas taurinas y cebuinas.
Esta organización específica de los haplotipos por razas bovinas se debe a los eventos de
recombinación, mutación y la contribución genética diferencial de los ancestros, que a través del
tiempo se han perfeccionado y que presentan puntos de interacciones protéicas que generan
fenotipos complejos, como el comportamiento bovino.
53
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
En este estudio los ocho SNPs valorados en el gen de DBH no presentan un efecto
estadísticamente significativo asociado a los diversos parámetros analizados, sin embargo, estos
polimorfismos podrían conformar diversas isoformas de DBH bovino y presentar un discreto
cambio en la funcionalidad, por lo cual, se realizarán más estudios al respecto.
Es pertinente realizar un análisis combinado entre los SNPs reportados en varios genes
como TH, DBH, receptores dopaminérgicos como DRD4, Monoamino Oxidasa A, Catecol-Ometiltransferasa y transportadores monoaminos específicos para dopamina, noradrenalina y
serotonina; para obtener un mayor acercamiento a las asociaciones en los rasgos complejos como
el comportamiento, ya que el efecto individual de cada SNP por gen puede ser pequeño y en
conjunto más visible su efecto fenotípico conductual.
Además, estos polimorfismos en el gen DBH son potencialmente importantes ya que
generan la perdida de tres residuos de serina en el dominio catalítico de la enzima. Estos residuos
son suceptibles a ser fosforilados, ya que en estudios del gen Tirosina Hidroxilasa (TH) se han
relacionado a la fosforilación enzimática por las múltiples proteinas kinasas que incrementan la
actividad de TH a nivel neuronal, ya que la fosforilación ocurre a la par de la hidroxilación de la
enzima de TH, puede ser diferencial y modificar la funcionalidad, eventualmente los SNPs de
DBH puede producir modificaciones en la actividad enzimática de DBH como se ha demostrado
en estudios de la proteína de Tirosina Hidroxilasa (Lew et al., 1999).
También, es necesario ampliar el estudio a otras razas como Charbray que por ser cruzas
de Brahman y Charolais, se espera que tengan frecuencias haplotípicas que permitan conformar
grupos numerosos con alta y baja presencia de la mayoría de SNPs en una misma raza ya que el
efecto de un solo SNP es muy pequeño, como se realizó en el diseño experimental para evaluar la
noradrenalina plasmática en los grupos formados de Brahman.
54
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Hasta ahora, bajo nuestras condiciones experimentales, los ocho SNPs valorados en DBH
no presentan asociación estadísticamente significativa con las mediciones de noradrenalina en
plasma extraído de ganado Brahman en condiciones de bienestar animal, solo se obtuvo una
tendencia en el efecto de los homocigotos del octavo SNP.
En este punto es importante destacar que no fue viable conformar grupos con ausencia y
presencia de todos los polimorfismos como se esperaba para formar los grupos contrastantes, la
diferencia entre los grupos radica solo en el octavo SNP. Además, por ser ganado de registro y
élite, es un ganado muy acostumbrado al manejo humano con fines sanitarios y para las
exhibiciones comerciales, y no podía generarse estrés de otro tipo como la utilización de sonidos
con altos decibeles, retirarles el alimento o el agua, lo cual, tal vez podría aumentar las diferencias
cuantificadas pero en respuesta al agente estresor.
En las mediciones de noradrenalina por el método inmunoenzimático se calculó la
precisión intra e inter ensayo obteniéndose coeficientes de variación de 7.54% y 9.56%
respectivamente, mientras que otros autores indican que con el mismo kit de ELISA de ALPCO
pero determinando concentraciones plasmáticas de adrenalina obtienen 17.7 y 10.4% de variación
inter e intra ensayo (Burdick et al., 2009), es decir, que nuestras mediciones son más exactas y
reproducibles.
En el presente estudio las concentraciones plasmáticas de noradrenalina se determinaron
por duplicado y en 2 días consecutivos a la misma hora como réplicas del ensayo, se obtuvo para
el haplotipo 1/1 una media de 514.13 pg/mL de noradrenalina, siendo en este grupo donde se
obtuvieron los titulos más elevados para todas las mediciones, mientras que se presentaron valores
intermedios de 485.84 pg/mL para el haplotipo 1/3 y los valores más bajos de 371.20 pg/mL para
los homocigotos mutados AA representados por el haplotipo 3/3.
Estos resultados no fueron significativos posiblemente debido a que la diferencia entre los
grupos radica solo en el octavo SNP, a las condiciones del muestreo, al reducido número de
muestras y por ser ganado de élite empleado en exhibiciones y exposiciones, no se podía manipular
ni generar estrés, los animales se mantuvieron en bienestar sin aplicación de ningún agente
55
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
estresante, como carencia de alimento o agua, estrés por transporte o cambios en el medio
ambiente, entre otros.
Comparando estos resultados con los datos disponibles en la escasa bibliografía del tema,
encontramos que los reportes en muchos casos no indican la raza evaluada, las condiciones de
estudio, la edad de los animales utilizados, el método de cuantificación, entre otros puntos de
interés que afectan significativamente las mediciones de las catecolaminas.
Estas se pueden detectar por quimioluminiscencia, fluorescencia, espectrofotometría de
masas, detección electroquímica, combinadas con técnicas inmunoenzimáticas o HPLC, las cuales,
poseen límites de detección diferentes. El más popular es el HPLC (Tsunoda, 2006), el cual, posee
excelente correlación con los resultados obtenidos para noradrenalina mediante el ELISA, según
datos del fabricante, ALPCO (HPLC = 1.27 ELISA - 0.04; r=0.96 y n=30). También, es muy
importante la metodología del muestreo ya que se ha comprobado en ratones que se pueden obtener
resultados muy diversos dependiendo de las condiciones de estudio (Grouzmann et al., 2003).
Algunos estudios relevantes indican lo siguiente, por ejemplo, en Holstein y sus cruzas con
negro Japonés (Uetake et al., 2011), se reportan niveles de noradrenalina con alta variabilidad pretratamiento de 79.7±70.3 pg/mL, a los 50 Km de transporte de 96.9±76.0 pg/mL, a los 100km
obtuvieron valores de 96.9±90.8 pg/mL y después del transporte a 150 km 107.4±114.8 pg/mL.
Estas diferencias pueden relacionarse al temperamento ya que en un estudio realizado en
toros Brahman, animales clasificados como calmados presentan concentraciones plasmáticas de
adrenalina cercanas a cero, mientras que toros de temperamento intermedio presentaron valores
inferiores a 50 pg/mL y los toros temperamentales concentraciones mayores de 60 pg/mL, con
niveles máximos de 350 pg/mL al aplicar estrés inmunológico (Burdick et al., 2011a).
En otro estudio donde se miden las catecolaminas bajo estrés (Mellor et al., 2002) no hay
diferencias entre los tres grupos evaluados, ya que en toros normales obtuvieron 347±24pg/mL,
toros castrados 334±21 pg/mL y en toros castrados con anestesia 344±26 pg/mL. En ganado
56
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
muestreado por la vena coccígea y analizado por cromatografía liquida con detección
electroquímica (Hardee et al., 1982), en 10 vacas Holstein se obtuvieron 452pg/mL (159-866
pg/mL) y en cinco toros de raza pura 598 pg/mL (192-1769 pg/mL) siendo estos datos muy
dispersos.
Otro estudio, también en ganado Holstein indica por HPLC-EC (Katti et al., 1991), valores
de noradrenalina de 119.7±10.9 pg/mL y a las 40 horas con una temperatura rectal de 40.8 ºC los
individuos poseen 111.50±11.9 pg/mL y una energía metabólica de 3025.10±226.0 kJ/h que es
estadísticamente significativa con respecto al valor en el tiempo cero de 4179.0±255.10 kJ/h, lo
cual, indica una reducción en el gasto energético por el estrés térmico, estos resultados de
concentración plasmática de noradrenalina con estrés térmico, tampoco presentan un efecto
estadísticamente significativo y son resultados menores a los obtenidos por nosotros.
Una evaluación de estrés térmico en Holstein (Alvarez et al., 1973) determinó que la
exposición al calor (40-43ºC) en tiempos cortos causa en promedio un incremento del 42% de la
noradrenalina en una hora, y el máximo aumento (84%) se registró a las 4.5 horas con 1900 pg/mL
y una exposición a 35 ºC por tres días genera un 35% más de noradrenalina, mientras que la
exposición prolongada por 24 días, produce 70% de aumento, es decir, que durante la aclimatación
al calor, se incrementa la actividad adrenal, aumentando considerablemente la noradrenalina
plasmática. En nuestro caso, los animales evaluados tienen estrés crónico térmico y están
adaptados a temperaturas elevadas de 45-55 ºC en Villahermosa, Tabasco, por lo cual, los valores
normales de catecolaminas son más altos que los correspondientes a otros bovinos de un clima
menos caluroso.
Un análisis en cruzas Hereford–Angus (Lefcourt et al., 1995) midiendo el estrés por destete
y las catecolaminas por HPLC, obtuvo como línea basal para las madres 200 pg/mL, para las crías
260 pg/mL y el mayor incremento por el estrés del destete fue de 82 pg/mL; mientras que en
Simmental (Blum, 1988) los valores reportados son de 235 pg/mL y cuando los animales corren a
60m/min se produce un incremento a 675 pg/mL.
57
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
En el presente análisis los animales fueron llevados desde el corral hasta la manga por lo
cual, puede explicarse el incremento desde la primera toma de muestra. Por otra parte, en ganado
Angus de un año de edad el valor inicial de noradrenalina es de 160 pg/mL y luego es 275 pg/mL
un minuto después de la simulación de venopunción como estrés (Rulofson et al., 1988); en nuestro
caso se tomó la primera muestra y una hora después se comenzó nuevamente la venopunción,
posiblemente, se requería tomar las muestras en tiempos más cortos, por ejemplo cada 10 minutos
o menos, para obtener las variaciones antes de que se metabolizará la noradrenalina y poder
construir curvas de concentración de noradrenalina en diferentes tiempos consecutivos.
Bajo el estrés del ejercicio por 30 minutos simulando altitud de 3500m (Blum et al., 1979),
se obtuvieron valores de noradrenalina de 1600 pg/mL, representando el triple del valor basal que
reportan en este estudio de 520 pg/mL, datos más aproximados a los obtenidos en nuestro caso.
El presente análisis es novedoso ya que en nuestro conocimiento, no existen reportes de
cuantificación de noradrenalina en ganado Brahman, solo existen algunos reportes en razas
taurinas como Holstein, y las cuantificaciones disponibles presentan variabilidad según la raza
analizada, el sexo, la edad, las condiciones del estudio y el método de cuantificación.
En este caso las frecuencias haplotípicas no permiten conformar grupos numerosos con alta
y baja presencia de la mayoría de los ocho polimorfismos en una misma raza (como los haplotipos
2 y 4); por lo cual, se propone como alternativa la tipificación de los ocho SNPs y la cuantificación
de noradrenalina en otras poblaciones como Charbray.
Por otra parte, en cuanto a los resultados de las evaluaciones del temperamento animal
mediante tres herramientas diferentes (velocidad de salida, comportamiento en la manga y en la
salida), tenemos que se obtuvo una excelente consistencia interna en el cuestionario y entre las
evaluaciones que se realizaron como repeticiones de las mediciones para cada animal objeto de
este estudio. Observamos en los últimos años un incremento en las investigaciones de etología
animal, ya que el temperamento animal refleja el bienestar del mismo y presenta implicaciones
directas sobre su salud y su rendimiento productivo y reproductivo.
58
Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Por ejemplo, algunos estudios demuestran que la novedad es un fuerte agente estresor
(Stephens et al., 1975), (Dantzer et al., 1983a) ya que en vacas Jersey se eleva la frecuencia
cardíaca y los niveles plasmáticos de corticosteroides, la inmobilización de los animales también
afecta varios parámetros fisiológicos como la concentración de corticosteroides de 7.7 ng/mL to
28.8 ng/mL. Es decir, que diversas prácticas comunes en el manejo animal pueden generar varias
respuestas emocionales (Grandin, 1980c; Grandin, 1980a) que dependerán de la magnitud y
tiempo del estímulo estresante y el grado de novedad (Grandin, 1993b), por lo cual, las condiciones
de manejo animal influyen fuertemente en el comportamiento de los bovinos y en su actividad
endocrina (Dantzer et al., 1983b). Además, el estrés durante el transporte de los bovinos y la forma
en que se manejan es muy importante para evitar el desarrollo del miedo que es un fuerte estresor
que puede afectar la sanidad (Grandin, 1997).
Los factores genéticos interactúan con el temperamento en formas complejas,
influenciado por las experiencias previas de manejo (Le Neindre et al., 1995) y la domesticación.
Se ha observado que las especies silvestres son más reactivas a los estímulos que aquellas
domesticadas y los fenotipos domésticos tienen una reducida la respuesta a los cambios del medio
ambiente (Price, 1984) ya que básicamente el hombre ha seleccionado empíricamente a los
fenotipos con una actitud más calmada y dóciles (Parsons, 1988), por ser más fáciles de manejar
y adaptar a los procesos productivos como la ordeña.
Asimismo, el temperamento es un rasgo estable y persistente a lo largo del tiempo, los
animales muy nerviosos o agresivos también representan un riesgo para sus manejadores, como se
evaluó en cruzas de Gelbvich×Simmental×Charolais por 30 días en la manga (Grandin, 1993a).
Un estudio del temperamento en razas europeas como Hereford, Charolais, Angus,
Limousin y Simmental (Hoppe et al., 2010a), donde evaluaron el comportamiento en la manga y
la salida, obtuvieron una significativa diferencia (p<0.01) entre el temperamento de los machos y
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Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
las hembras, en nuestro caso teníamos disponibles pocos individuos de cada sexo, por lo cual, no
es visible si existen diferencias significativas entre ellos.
En el mismo estudio, observaron diferencias significativas en las dos evaluaciones del
temperamento entre las diferentes razas bovinas y en cuanto a la media obtenidas del
comportamiento en la manga que varió de 1.98 puntos para machos Hereford hasta 2.92 para
machos Limousin, los cuales, son valores superiores a los obtenidos en nuestro estudio. Para las
evaluaciones de comportamiento en la salida reportaron valores de 1.40 para machos Hereford y
hasta valores máximos de 1.89 para Simmental, siendo este último dato similar al obtenido en
Brahman, sin embargo para esta raza en específico no se encontraron reportes previos de
evaluaciones del temperamento en la salida de la manga.
Otro reporte indica la media de la velocidad de salida de 2.52m/s y específicamente por
razas 2.61 m/s para Charolais, 2.50 m/s para Angus y de 2.45 m/s para razas híbridas, teniendo
una alta correlación con la frecuencia de alimentación y una correlación negativa con la calidad de
la carne, es decir, que los animales más temperamentales tienen velocidades de salida más rápidas
y se alimentan más pero el producto no es de la mayor calidad en peso, marmoleo, etc; por lo tanto,
la clasificación bovina por temperamento y comportamiento alimenticio puede ser una herramienta
que ayude a la selección de los animales con el mejor desempeño productivo con la menor
inversión, ya que al ser más calmados su gasto energético es menor (Nkrumah et al., 2007a).
En otros tres estudios que son los únicos que emplean ganado Brahman, se buscó relacionar
el temperamento bovino con diversos rasgos productivos, de eficiencia y de calidad; al igual que
en nuestro caso ellos miden la velocidad de salida y el comportamiento en la manga en ganado
Brahman (Cafe et al., 2011). Los valores que reportan son mayores a los nuestros, ya que indican
velocidades de salida de 1.54 a 2.09 m/s mientras que en este estudio se obtuvo 1.2426 m/s para
las individuos de 2 años y 0.9958 m/s para los de cuatro años, esta diferencia radica en la edad de
los animales que se analizaron, ya que trabajaron con vaquilla de 6 a 8 meses de edad, por lo cual,
al ser más jóvenes son más rápidos y ansiosos.
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Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Con respecto a la evaluación de comportamiento en la manga reportan medias de 1.58-2.12
para cada animal, en la escala del 1 al 5; nosotros obtuvimos un valor promedio de 2.0899. Esta
diferencia se puede deber al juicio de los observadores en cada experimento, en general en este
análisis las bovinos obtuvieron notas más altas que en el estudio comparativo (Cafe et al., 2011).
Aunado a esto, en el segundo estudio en Brahman, evaluaron la velocidad de salida y el
cortisol, obteniendo que la media de la velocidad de salida al día cero es 2.82 m/s y este valor
disminuye a los 60 días a 2.25 m/s y a los 120 días de 2.11 m/s, disminuyendo de igual forma la
concentración plasmática de cortisol, es decir, que el entrenamiento diario, disminuye el estrés,
baja la velocidad de salida por la adaptación al manejo (Curley et al., 2006).
En el tercer análisis con 31 animales neonatos Brahman (Burdick et al., 2009),
determinaron la velocidad de salida, para los animales calmados de 0.98±0.12 m/s, los intermedios
2.32±0.07 m/s y los temperamentales 3.64±0.14 m/s. Al compararlos, observamos que estos
valores son mayores que los obtenidos por nosotros ya que nuestro valor máximo fue de 1.58 m/s,
es decir, que el ganado Brahman que evaluamos es mucho más tranquilo, posiblemente debido a
que es ganado élite, utilizado en exhibiciones comerciales y acostumbrados a la interacción con
humanos.
Por otra parte, no existen hasta ahora reportes de análisis genéticos de DBH con
evaluaciones del comportamiento bovino y sus datos productivos; este es el primer reporte al
respecto, y los estudios deben ampliarse para obtener resultados más significativos.
Se obtuvo un efecto significativo (P=0.0326) entre los genotipos del SNP seis y la
evaluación del temperamento en la manga, esta misma evaluación mostró una tendencia (P=0.1)
para los genotipos del SNP 7. Donde es importante resaltar que los individuos con genotipo AA
tienen evaluaciones más altas en la manga (2.62 puntos), siendo más temperamentales que los
portadores del genotipo GG con evaluaciones de 1.94 puntos y correspondiendo este genotipo
principalmente a los individuos de raza Brahman que en este caso serían más tranquilos por estar
habituados al manejo humano y ser en este caso animales élite. Conjuntamente, para el SNP 7 se
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Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
obtuvieron representados los tres genotipos en los animales evaluados y se observa un efecto
aditivo por el alelo G favorable para la docilidad o comportamiento en la manga más manejable.
Así mismo, en la relación con los datos productivos se obtuvo una tendencia (P=0.1) para
el peso al destete y el comportamiento en la salida, donde los animales más calmados tienen para
el peso al destete una media de 155.97 kg, mientras que los animales de intermedios tienen 155.50
Kg y los temperamentales son los más delgados con 134.61 kg al destete. Se observó una
incremento gradual del peso en respuesta al nerviosismo y una disminución en el crecimiento
medido en el peso al destete, lo cual, afecta el rendimiento productivo y podría estar impactando
en otros parámetros de la salud animal con el funcionamiento del sistema inmune, ya que según
estudios existe una relación directa entre el estrés, el temperamento y el desempeño del sistema
inmune por la inhibición de la proliferación de linfocitos (Burdick et al., 2009; Burdick et al.,
2011b).
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Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
8.2.-ENSAYOS IN VITRO
Las transfecciones del cDNA de DBH realizadas en tres líneas de cultivo de células de
mamífero, mostraron alta eficiencia de transfección, de estas los extractos protéicos obtenidos
fueron adecuados en calidad y concentración, se realizaron Western Blot de control con el
anticuerpo de actina siendo óptima la detección, pero en los Western Blot de DBH con diferentes
concentraciones de proteínas, no se representan bandas específicas que correspondan a la proteína
de DBH reconocida por el anticuerpo primario, como se observa en los controles de proteínas
extraídas de suprarrenales de ratones y de células PC12 sin transfectar; lo cual podría deberse a
una nula o baja producción de la proteína exógena de DBH en las células, para la confirmación se
realizó la prueba de ELISA, ya que siendo cuantitativo y más sensible, este ensayo permitía una
mejor detección de las variaciones sutiles en la producción de noradrenalina como medida
indirecta de cambios en la funcionalidad enzimática por la presencia o ausencia de los siete nsSNPs
del gel DBH.
Al respecto de estos resultados, en el ELISA no se detectó una variación en la cantidad de
catecolamina generada en el sistema in vitro entre las diferentes construcciones ensayadas y los
controles, por lo cual, se determina la ausencia de expresión de la DBH transfectada, debido a
diversos factores como la inestabilidad de la enzima tetramérica generada y por discrepancias en
la síntesis protéica in vitro versus la nativa, ya que aún existen fuertes controversias en la
información disponible en el NCBI, donde en menos de cuatro años se han dado codificaciones
sustanciales a la proteína incorporándose más aminoácidos, cambiando el codón de inicio,
modificándose el tamaño del péptido señal y los exones, para estos estudios se empleó la
información más actualizada y la secuencia del cDNA transfectado fue verificada varias veces por
secuenciación, correspondiendo totalmente a la secuencia reportada en el NCBI.
Sin embargo, en estos momentos no conocemos con certeza la causa de la ausencia de
expresión de la DBH, puede haber errores en la transcripción o en la traducción, insuficiencia de
algún cofactor o enhancer, modificaciones del splicing, error en el codón de inicio y alteraciones
en el marco de lectura, por lo cual, a posteriori se realizarán más estudios.
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Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
9.-CONCLUSIONES
En relación a los análisis in vivo, se validan los ocho SNPs no sinónimos (SNPs) evaluados
en el gen DBH, estos son polimórficos con significativas diferencias de sus frecuencias genotípicas
y alélicas con fuerte predominio de un alelo según el fondo genético cebuino o taurino.
En cuanto a las frecuencias haplotípicas existen diferencias significativas según sea el
fondo genético y fin productivo de la raza bovina, por ello, la diversidad genética observada en
DBH provee la base para más amplias y futuras investigaciones del temperamento, ya que a largo
plazo estos SNPs podrían considerarse marcadores genéticos para diferentes fenotipos del
comportamiento bovino que repercuten en los rasgos de importancia económica y que en el futuro
podrían incluirse en las estrategias de selección asistidas por marcadores moleculares.
En los ocho polimorfismos evaluados en el gen de DBH no se observó efectos mayores en
los rasgos productivos, posiblemente al efecto menor que estos ejercen en las características y se
preveé su futuro análisis en conjunto a otros SNPs de otros genes.
Por otra parte, en los estudios in vitro se realizó la construcción de las recombinantes de
DBH y estas se transfectaron a tres líneas celulares, sin detectarse la producción de la enzima de
DBH ni su producto, debido a diversos factores como la inestabilidad de la proteína, y es
importante destacar que el gen de DBH es complejo por su alto contenido de GC y por los cambios
que se han dado en la determinación de su codón de inicio, péptido señal y tamaño de los exones,
lo cual, dificulta su análisis; sin embargo seguramente otros investigadores continuarán
estudiándolo por ser un gen biológicamente importante.
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Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
10.- PERSPECTIVAS
El presente estudio sienta las bases para futuros análisis genéticos del temperamento
bovino, a su vez que plantea en perspectiva la realización de análisis con poblaciones más amplias
de fondos genéticos mixtos y la evaluación in vitro de las construcciones recombinantes acoplando
al cDNA transfectado la proteína verde fluorescente y repeticiones de adeninas posteriores al
codón de paro, así como evaluar la utilización del segundo codón de inicio.
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Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
11.-BIBLIOGRAFÍA
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Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
12.-GLOSARIO
ADN: Ácido desoxirribonucleico, polinucleótido con una secuencia específica de unidades de
desoxirribonucleótidos unidos covalentemente mediante enlaces 3’,5’-fosfodiéster, actúa como
portador de la información genética.
Catecolaminas: son derivados aminados del catecol, que actúan como hormonas en los
organismos desempeñando variadas funciones biológicas importantes.
Codón: en un ácido nucleico es la secuencia de tres nucleótidos que codifican para un aminoácido
específico según el uso del código genético.
Corticosteroides: son hormonas segregadas por la corteza adrenal y son del tipo esteroidal.
Enzima: es una proteína que cataliza una reacción química específica.
Exón: segmento de un gen eucariótico que permanece después de la maduración
postranscripcional y se transcribe en proteína.
Fenotipo: características observables de un organismo.
Gen: segmento de un cromosoma que codifica una sola cadena polipeptídica funcional o molécula
de RNA.
Gen candidato: aquel gen que presenta un efecto funcional conocido y puede influir en
características de interés.
Genoma: toda la información genética en forma codificada contenida en una célula o virus.
Genotipo: constitución genética de un organismo a diferencia de sus características físicas.
Intrón: en un gen es la secuencia de nucleótidos que se transcribe pero no se traduce.
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Leche (L): es la diferencia esperada en el peso por la habilidad genética de las hijas del semental
para producir leche se expresa en kilogramos de peso al destete de los hijos de las hembras del
semental.
Locus: localización cromosomal de un marcador genético o de ADN.
Manejo asistido: conducir la selección de los animales según las características deseables para las
próximas generaciones, frecuentemente se realiza el manejo asistido empleando marcadores
moleculares dentro de los programas de mejoramiento genético.
Materno Total (MT): es la diferencia esperada en el peso, se estima sumando la mitad del valor
de la DEP Peso al Destete al total del valor de la DEP Leche.
Mutación: es un cambio o alteración en la estructura del DNA, de forma permanente y heredable.
Neurotransmisor: es un compuesto indispensable para la transmisión del impulso nervioso y la
comunicación neuronal, es secretado en la terminal de la neurona presináptica y transportado a su
receptor específico en la neurona posináptica.
Nucleótido: nucleósido fosforilado en uno de los grupos hidroxilo de su pentosa.
Oligo: secuencia corta de oligonucleótidos que se une por complementaridad a una hebra de ADN
para generar el punto de inicio de la síntesis de la hebra complementaria.
QTL: área de un cromosoma donde reside un gen para un rasgo particular, locus genético asociado
con una característica de importancia, en su mayoría son rasgos multifactoriales y son
influenciados por poligenes.
PCR: es la amplificación de una secuencia específica de ADN.
Peso al Nacimiento (PN): es la diferencia esperada en el peso promedio del becerro tomado
durante las primeras 24 horas después de haber nacido.
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Análisis funcional del gen Dopamina Beta Hidroxilasa (DBH) y su asociación a temperamento en bovinos. 2013
Peso al Destete (PD): es el peso promedio al destete de la progenie.
Peso al Destete ajustado a los 205 días (PDA): es la diferencia esperada en el peso promedio al
destete de la progenie, resultante de multiplicar la ganancia diaria predestete por 205 días y sumarle
el peso al nacimiento ajustando el valor según la edad de la madre y el sexo del animal.
Peso al Año a los 365 días (PA): es la diferencia esperada en el peso promedio al año de la
progenie, producto de multiplicar la ganancia diaria post destete por 160 días y sumarle el peso
ajustado al destete.
RFLP: son cambios en las secuencias que se emplean en la amplificación por PCR, y que afectan
el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, originando diferencias en los tamaños de
los fragmentos de DNA producidos por digestión con la enzima de restricción especifica.
SNP: mutación puntual que ocurre en algunos individuos de una población, generalmente por
transición, transversión o deleción de una única base.
Talla (T): es la diferencia esperada en talla calculada como la altura a la cadera ajustada a los 365
días.
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13.-ANEXOS
Anexo 1: Artículo “Genetic diversity of tyrosine hydroxylase (TH) and dopamine βhydroxylase (DBH) genes in cattle breeds”.
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Anexo 2: Imágenes de los electroferogramas de las secuenciaciones de las clonas.
Inicio consenso Kozak para vertebrados insertado en las clonas recombinantes:
Ejemplos de secuencias de las clonas obtenidas sin mutaciones para los 8SNPs:
Ejemplo de la secuencia de la clona recombinante portadora de los SNPs:
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