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La enzima recombinante 3-hidroxi-3-metil glutaril coenzima A reductasa de Candida glabrata (rec-HMGRCg) como blanco para el estudio de compuestos sintéticos con posible actividad antifúngica Andrade- Pavón D., Ibarra- J. A., Hernández –Rodríguez C., *Villa-Tanaca L. Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, Plan de Ayala y Prol. Carpio, Col. Casco de Santo Tomás, México D. F. CP 11340, Phone (+52 55) 57 29 63 00 Ext. 62373. E mail: [email protected]. INTRODUCCIÓN: La enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMGR) es una glicoproteína involucrada en el inicio de la ruta de biosíntesis del colesterol en humanos y de ergosterol en hongos. Candida glabrata es una levadura de especial importancia debido a su resistencia innata a los azoles (también inhibidores de la síntesis de esteroles, aunque a otro nivel en la ruta de síntesis).En nuestro grupo de trabajo hemos demostrado que una serie de compuestos análogos a la α-asarona inhiben la síntesis de ergosterol, así como la viabilidad, en C. También se demostró que estos compuestos inhiben específicamente a la enzima HMGR de C. glabrata (HMGRCg) en extractos enriquecidos de la enzima. En el grupo de investigación se clonó y expresó la HMGR de C. glabrata en el sistema heterólogo de Pichia pastoris y Escherichia coli. También se probó la actividad de HMGRCg en un extracto celular, así como su inhibición con simvastatina y compuestos sintéticos. Debido a que el dominio catalítico de las HMGRs de organismos eucariotes se encuentra altamente conservado, se decidió tomar como modelo de estudio a la enzima HMGR de Candida glabrata. El estudio de la misma nos permitirá probar distintos compuestos hipolipemiantes con uso potencial en humanos. Además, al ser un patógeno oportunista con resistencia natural a antifúngicos, también se puede estudiar a la HMGR de este hongo como un blanco para su tratamiento. MATERIAL Y MÉTODOS: Se utilizó la cepa CBS138 de C. glabrata y vectores de expresión de la serie pPICZ de la casa comercial invitrogen y vectores pET de la casa Novagen. 1.-Diseño de iniciadores para amplificar la secuencia que codifica para la fracción soluble de HMGRCg. 2.-Amplificar el gen HMGRCg por PCR. 3.-Clonar el gen HMGRCg en vector de clonación pJET 1.2/blunt. 4.-Subclonar el gen HMGRCg en los vectores de expresión pPICZB, pPICZαB y pET-15b. 5.-Transformación de las construcciones pPICZB-HMGRCg y pPICZαBHMGRCg en P. pastoris. 6.-Inducción y expresión de la rec-HMGRCg. 7.-Medición de la actividad enzimática de la rec-HMGRCg en extractos crudos. 8.-Inhibición con estatinas y los compuestos sintéticos de la rec-HMGRCg. RESULTADOS: Se logró obtener un extracto enzimático de la HMGR de C. glabrata, en el cual se demostró su expresión en un gel de proteínas, así también su actividad e inhibición con una estatina (simvastatina) y una serie de compuestos sintéticos considerados inhibidores de la HMGR. CONCLUSIONES: En nuestro grupo se logró clonar y expresar la proteína HMGR de C. glabrata en el sistema heterólogo de P. pastoris y E. coli. Se demostró su actividad e inhibición en un extracto enzimático. Por lo cual se sugiere que la HMGR puede servir como modelo para el estudio de compuestos sintéticos por su actividad antifúngica.
