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La enzima recombinante 3-hidroxi-3-metil glutaril coenzima A reductasa de Candida glabrata (HMGRCg) como modelo para el estudio de inhibidores sintéticos Dulce María-Andrade Pavón, Lourdes-Villa Tanaca, José Antonio-Ibarra, César Hugo-Hernández Rodríguez Instituto Politécnico Nacional, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Departamento de Microbiología. Laboratorio de Genética Microbiana. [email protected] INTRODUCCIÓN: La enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMGR) es una glicoproteína que interviene en el inicio de la ruta de biosíntesis del colesterol en humanos y de ergosterol en hongos. En la actualidad, una manera de controlar los factores de riesgo que conllevan a alteraciones en el metabolismo de lípidos es el empleo de compuestos inhibidores de la HMGR como las estatinas. Además, estos compuestos se han propuesto como nuevos antifúngicos. Por otro lado, Candida glabrata es una levadura de especial importancia debido a su resistencia innata a los azoles (también inhibidores de la síntesis de esteroles, aunque a otro nivel en la ruta de síntesis). ANTECEDENTES: En nuestro grupo de trabajo hemos demostrado que una serie de compuestos análogos a la α-asarona sintetizados por el Dr. Joaquín Tamariz Mascarúa, inhiben la síntesis de ergosterol, así como la viabilidad, en C. glabrata (Sánchez–Sandoval, 2010). También se demostró que estos compuestos inhiben específicamente a la enzima HMGR de C. glabrata (HMGRCg) en extractos enriquecidos de la enzima. Sin embargo, la purificación de HMGRCg a partir de la fracción membranal resultó ser laboriosa y la enzima fue poco estable. La HMGR humana ha sido clonada y expresa en E. coli y de ésta se ha mostrado su actividad in vitro (Mayer et al., 1988). En el grupo de investigación se clonó y expresó la HMGR de C. glabrata en el sistema heterólogo de P. pastoris. También se probó la actividad de HMGRCg en un extracto celular, así como su inhibición con simvastatina y compuestos sintéticos (Andrade- Pavón D. 2013). JUSTIFICACIÓN: Debido a que el dominio catalítico de las HMGRs de organismos eucariotes se encuentra altamente conservado, se decidió tomar como modelo de estudio a la enzima HMGR de Candida glabrata. El estudio de la misma nos permitirá probar distintos compuestos hipolipemiantes con uso potencial en humanos. Además, al ser un patógeno oportunista con resistencia natural a antifúngicos, también se puede estudiar a la HMGR de este hongo como un blanco para su tratamiento. OBJETIVO: Clonar la fracción soluble de la enzima HMGR de C. glabrata en los vectores de expresión heteróloga pPICZB y pPICZαB para la sobreexpresión en P. pastoris. MÉTODOS: 1.-Diseño de iniciadores para amplificar la secuencia que codifica para la fracción soluble de HMGRCg. 2.-Amplificar el gen HMGRCg por PCR. 3.Clonar el gen HMGRCg en vector de clonación pJET 1.2/blunt. 4.-Subclonar el gen HMGRCg en los vectores de expresión pPICZB y pPICZαB. 5.-Transformación de las construcciones pPICZB-HMGRCg y pPICZαB-HMGRCg en P. pastoris. 6.-Inducción y expresión de la rec-HMGRCg. 7.-Medición de la actividad enzimática de la rec-HMGRCg en extractos crudos. 8.-Inhibición con estatinas y los compuestos sintéticos de la rec-HMGRCg. RESULTADOS: Se logró obtener un extracto enzimático de la HMGR de C. glabrata, en el cual se demostró su expresión en un gel de proteínas, así también su actividad e inhibición con una estatina (simvastatina) y una serie de compuestos sintéticos considerados inhibidores de la HMGR. CONCLUSIONES: Hemos sido capaces de clonar y expresar la proteína HMGR de C. glabrata en el sistema heterólogo de P. pastoris. Se demostró su actividad e inhibición en un extracto enzimático. Con lo cual se sugiere que la HMGR puede servir como modelo para el estudio de compuestos sintéticos por su actividad antifúngica. BIBLIOGRAFÍA: 1.-Andrade-Pavón D. 2013. Expresión heteróloga de la enzima 3-hidroxi-3metilglutaril-CoA reductasa (HMGR) de Candida glabrata. Tesis de maestría. ENCB-IPN. 2.-Friesen J.A., Rodwell V.W. 2004. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A (HMG-CoA) reductases. Bio. Med. Central. 5: 248-254. 3.Mayer J.R., Debouck I.C., Metcalf B.W. 1988. Purification and properties of the catalytic domain of human 3-hydroxy3-methylglutaryl-CoA reductase expressed in Escherichia coli. Arch Biochem Biophys. 267(1): 110-118. 4.-SánchezSandoval M. 2010. Efecto de inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGR) sobre Candida albicans y Candida glabrata. Tesis de maestría. ENCB, IPN.
