Download genotipificación basado en dna de semillas y selección de alelo

DIVISIÓN DE BIOTECNOLOGÍA
“GENOTIPIFICACIÓN BASADA EN DNA DE
SEMILLAS Y SELECCIÓN DE ALELO
FAVORABLE PARA HIDROXILASA B EN EL
PROGRAMA DE MAIZ DEL CIMMYT”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA:
JESÚS EMMANUEL BAÑOS GALINDO
ASESOR INSTITUCIONAL: DR. RAMAN BABU.
IA. CARLOS MARTÍNEZ FLORES.
ASESORES ACADÉMICOS: BIÓL CRISTIAN GILBERTO ÁLVAREZ CÁRDENAS.
M. EN C. FLORENCIA DEL CARMEN SALINAS PÉREZ.
INSTITUCIÓN: CENTRO INTERNACIONAL DE MEJORAMIENTO DE MAÍZ Y TRIGO.
(CIMMYT)
ENERO 2010 – AGOSTO 2011
Autorización de impresión
ii
Este trabajo se realizó en el Departamento de Biotecnología del Centro Internacional
de Mejoramiento de Maíz y Trigo, bajo la dirección del
Dr. Babu Raman
iii
AGRADECIMIENTOS
Son muchas las personas que debería nombrar en estas líneas, pero me quedaré con las
más trascendentales... con aquellas que no han bajado la guardia y siempre me han
apoyado, tanto a lo largo del desarrollo de esta Tesis como a lo largo de mi vida. Primero y
antes que nada, dar gracias a Dios, por estar conmigo en cada paso que doy, por fortalecer
mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en mi camino a aquellas personas que
han sido mi soporte y compañía durante todo el periodo de estudio.
Gracias a mis Padres.
Esta tesis está dedicada a mis Padres, a quienes agradezco de todo corazón por su amor,
cariño y comprensión. En todo momento los llevo conmigo.
Gracias a mi Marlen y Oscar
A mi hermana y cuñado, por haberme apoyado y estar conmigo en los momentos más
importantes, y sabiendo que ellos están igual en una etapa importante de estar casados,
gracias por ser así.
Thanks to my advisors CIMMYT
Especially Dr. Babu Raman for letting me be part of the working group and my advisors in the
laboratory for their tips, patience and opinions served to make me feel satisfied with my
participation in the research project.
Gracias a mis Asesores de la UTTEC
Gracias por los consejos que me dieron y gracias por ayudarme en la búsqueda de mis
objetivos, por lograr la tesis y gracias por hacerme crecer en el ámbito profesional.
Gracias a Noemí
A ti que has estado conmigo en las buenas y en las malas que nunca me has dejado, que
cuando sentí caer sostuviste mi mano para que no desmayara, y que ahora vemos juntos
esto hecho realidad, tú que siempre has estado conmigo.
Jesús Emmanuel
iv
ÍNDICE DE CONTENIDO
Pág.
PORTADILLA.
AUTORIZACIÓN DE IMPRESIÓN.
AGRADECIMIENTOS.
INDICE DE CONTENIDO.
ÍNDICE DE CUADROS.
ÍNDICE DE FIGURAS.
ÍNDICE DE ABREVIATURAS.
RESUMEN.
ABSTRACT.
I.
ii
iv
v
vii
viii
ix
1
2
INTRODUCCIÓN.
3
1.1. Objetivo general.
4
1.1.1. Objetivos particulares.
1.2. Hipótesis.
II.
4
4
1.2.1. Justificación.
4
PROGRAMA Y CRONOGRAMA.
5
2.1 Cronograma de actividades correspondientes al trabajo experimental
5
2.2 Programa de actividades correspondientes al trabajo de tesis.
6
III.
REVISIÓN DE LITERATURA.
7
3.1. Desnutrición y Biofortificación de los alimentos
7
3.2. Carotenos: biosíntesis y uso
8
3.3. Licopeno y β-criptoxantina
IV.
i
10
3.3.1. Licopeno
10
3.3.2. β-criptoxantina
10
3.4. Marcadores STS para β-criptoxantina
11
3.5. MAS (Marker Assisted Selection)
12
MATERIALES Y MÉTODOS.
13
4.1. Inspección del campo.
13
v
4.2. Selección de semilla.
13
4.3. Extracción de ADN genómico de endospermos (en tiras de tubos de 1.1 ml
Neptune catalogo #2600.8).
14
4.3.1. Colecta y disrupción de tejido.
14
4.3.2. Extracción del ADN de endospermos.
14
4.3.3. Cuantificación de DNA.
15
4.4. PCR.
15
4.5. Electroforesis en bis-agarosa.
16
4.6. Foto documentación.
17
4.7. Siembra de semilla.
17
4.8. Extracción de ADN de hoja (en tiras de tubos de 1.1 ml Neptune).
18
4.8.1. Colecta y disrupción de tejido vegetal.
18
4.8.2. Extracción de ADN de tejido vegetal.
18
4.9. Diagrama Experimental.
V.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
19
20
5.1. Características del material
20
5.2. Familias a analizar
20
5.3. Extracción de ADN
21
5.4. Obtención de PCR
22
5.5. Obtención de electroforesis de las familias a analizar
22
5.6. Dificultades con la extracción y alternativas
23
5.7. Siembra de material, colecta y extracción
24
5.8. Comparación de las amplificaciones basadas en hoja y de semilla
26
VI.
CONCLUSIONES.
34
VII.
BIBLIOGRAFÍA.
36
VIII.
ANEXOS.
38
vi
ÍNDICE DE CUADROS
Pág.
Cuadro 1. Programa TD6454
16
Cuadro 2. Fertilizantes utilizados en la tierra
17
Cuadro 3. Selección de semilla
20
Cuadro 4. Cuantificación, rangos de pureza, concentración de ADN y dilución a
realizar (70 µl a utilizar)
21
Cuadro 5. Cuantificación de ADN de semilla segunda extracción
23
Cuadro 6. Cuantificación de ADN de semilla tercera extracción
24
Cuadro 7. Cuantificación de ADN de hoja
26
Cuadro 8. Individuos totales de la genotipificación y sobrevivientes después de la
plantación.
28
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura. 1 Ruta mevalónica independiente de los tetraterpenoides.
9
Figura. 2 Estructura química del Licopeno.
10
Figura. 3 Estructura química de Criptoxantina.
11
Figura. 4 Escalerilla de peso molecular y marcador molecular de 543 pb. y 875 pb.
11
Figura. 5 Banda positiva 1 y negativa 2 en gel de bis-agarosa.
23
Figura. 6 Charola 1, características fenotípicas de la familia 16, 181 plantas
24
Figura. 7 Charola 2, características fenotípicas de la familia 23, 188 plantas.
24
Figura. 8 Charola 3, características fenotípicas de la familia 27,182 plantas.
25
Figura. 9 A. Amplificación ADN de semilla.
27
Figura. 9 B. Amplificación ADN de hoja.
27
Figura. 10 Coloración de hojas de la familia 20.
28
Figura. 11 Planta trasplantada a campo.
29
Figura. 12 Semilla seleccionada en laboratorio y crecimiento en campo.
29
Figura. 13 A. Comprobación de muestras en campo.
30
Figura. 13 B. Comprobación de muestras en campo
31
Figura. 14 Individuos después de helada.
32
Figura. 15 Mazorcas resultantes de genotipificación en plántulas.
32
Figura. 16 Mazorcas resultantes de genotipificación en semilla.
33
viii
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
ADN
ácido desoxirribonucleico
BME
ß-mercaptoetanol
CTAB
bromuro de alquiltrimetilo mixto-amonio
dNTPs:
Desoxinucleótidos
HydB
Hdroxilasa B
MAS
Marker Assisted Selection
N/A
No aplica
QPM:
MAÍZ CON CALIDAD PROTEICA
PCR:
Reacción en cadena de polimerasa
REDTaq:
Taq comercial
Sarcosil
Sodio Lauroil Sarcosina
SGB:
Sample gel buffer. Amortiguador para cargar muestras en el gel.
TA
temperatura ambiente
TBE
tris-borato EDTA
TE
tris-EDTA (amortiguador)
Tris
tris(hidroximetil) aminometano
UV
Ultravioleta
ix
V
Voltios
ºC
grado Celsius
µg
microgramo (-s) = 10-6 gramo
µl
microlitro (-s) = 10-6 litro
∑H2O
Agua desionizada de alta pureza
µM
MicroMolar
x
RESUMEN
Uno de los objetivos del mejoramiento vegetal es desarrollar grupos de plantas
genéticamente uniformes para características de interés económico, como el contenido
nutricional, la resistencia al estrés y la resistencia a los microorganismos. Además de ello, el
mejoramiento también busca que las plantas tengan un rendimiento alto y estable. En el
caso de la calidad nutricional, algunos mejoradores han empleado la biofortificación para
lograr cultivares de mejor calidad, ya sea mediante el mejoramiento convencional, la
selección asistida con marcadores moleculares (MAS, Marker Assisted Selection) o la
manipulación genética.
Para maíz, el CIMMYT, Int., ha considerado dos características para generar cultivares de
alta calidad; una de ellas se enfoca en el mejoramiento de maíces con un contenido elevado
de lisina y triptófano (maíces QPM), y la otra característica se enfoca a la generación de
poblaciones con valores altos de moléculas precursoras de vitamina A.
En este estudio, se consideraron nueve familias de maíz BC3F2 en las que se combinaron
ambas características. Estas familias denominadas QPM x Provitamina A tenían fijado el
alelo recesivo responsable de la condición QPM (opaque-2). Estas se emplearon para
encontrar individuos con el alelo favorable del gen crtRB1 responsable de la síntesis de la βcaroteno-hidroxilasa 1, enzima involucrada en la síntesis del caroteno β–criptoxantina, que
junto con el α–caroteno y el β–caroteno, son convertidos a vitamina A. La búsqueda y
selección de los individuos con el alelo favorable se realizó mediante PCR de punto final, con
detección de fragmentos en geles de agarosa. La molécula molde de ADN provino de
endospermos y representa otro ejemplo exitoso de selección asistida con marcadores
moleculares.
1
ABSTRACT
One of the aims of the vegetable improvement is to develop groups of genetically uniform
plants for characteristics of economic interest, as the nutritional content, the resistance to the
stress and the resistance to the microorganisms. Besides it, the improvement also looks that
the plants have a high and stable performance. In case of the nutritional quality, some
breeders have used the biofortification to manage you will cultivate of better quality, already
be by means of the conventional improvement, the molecular marker-assisted selection
(MAS, Marker Assisted Selection) or genetic manipulation.
For maize, the CIMMYT, Int., it has considered to be two characteristics to generate you will
cultivate of high quality; one of them focuses in the improvement of corns with a high content
of lysine and tryptophan (corns QPM), and another characteristic focuses on the generation
of populations with high values of precursor molecules of vitamin A.
In this study, they were considered nine families of maize BC3F2 in which both characteristics
were combined. These families named QPM x Provitamin A had fixed the recessive allele
responsible for the condition QPM (opaque-2). These were used to find individuals with the
favorable allele of the gene crtRB1 responsibly for the synthesis of her β-carotene
hydroxylase 1, enzyme involved in the synthesis of the carotene ß-criptoxantina, that together
with α - carotene and ß-carotene, are converted to vitamin A. The search and selection of the
individuals with the favorable allele was realized by means of PCR of final point, with
detection of fragments in agarose gels. The molecule mold of DNA from endosperm and it
represents another successful example of the molecular marker-assisted selection.
2
I. INTRODUCCIÓN
El maíz es uno de los cultivos más importantes a nivel mundial. En México, el principal uso
es hacia el consumo humano seguido por el uso pecuario (SIAP, 2012). Este cultivo es una
fuente de energía y a baja escala, también provee minerales, proteínas y vitaminas. A pesar
de estas aportaciones, se conoce que el grano de maíz tiene un deficiente valor nutricional y
se ha buscado, mediante la biofortificación, elevar su calidad nutricional. Dentro de los
enfoques que buscan modificar esta condición se encuentran aquellos que buscan modificar
el contenido de proteínas y el contenido de vitaminas.
El pobre nivel nutricional del maíz, en el caso de las proteínas, se debe a la alta proporción
de zeínas en el endospermo. Las zeínas son proteínas de almacenamiento deficientes en los
residuos lisina y triptófano, razón que ha motivado a la búsqueda de mutantes que alteren su
contenido en el endospermo y se favorezca la presencia de otras proteínas como las
glutelinas. Uno de esos mutantes es el gen opaque-2, el cual en condición homocigótica
recesiva (o2/o2) afecta la transcripción de las zeínas. El CIMMYT ha empleado este gen,
junto con otros modificadores/enhancers, para generar los maíces QPM (Quality Maize
Protein, maíz con calidad de proteína por sus siglas en inglés).
El CIMMYT también ha generado los "maíces amarillos", los cuales contienen valores
elevados de los carotenos licopeno y β-criptoxantina respecto al maíz normal. En ambos
casos, la generación de cultivares con mejor calidad nutricional, ha empleado marcadores
moleculares y otros características fenotípicas para mejorar genéticamente la alfalfa. Estas
metodologías complementarias ha hecho que estos casos de mejoramiento sean ejemplos
notables de selección asistida por marcadores moleculares (MAS, Marker Assisted Selection)
En este estudio se emplearon marcadores moleculares para detectar la presencia de los
alelos del gen crtRB1, responsable de la síntesis de la enzima asociada con la producción de
β-criptoxantina. Para ello, se buscaron en nueve familias aquellos individuos que portaran el
alelo favorable del gen crtRB1. La búsqueda se hizo mediante la detección de un fragmento
de 543 pb, el cual se amplificó por PCR utilizando DNA extraído de endospermo. Se discuten
las ventajas y limitaciones de este ejemplo de MAS.
3
1.1. Objetivo general

Realizar genotipificación en ADN de endospermo de nueve familias BC3F2 QPM x
Provitamina A para identificar y seleccionar individuos portadores del alelo favorable
del gen crtRB1 de maíz (fragmento de PCR de 543 pb),
1.1.1. Objetivos particulares

Seleccionar semilla de maíz agrupando por tamaño, color y forma para identificar
material en condición germinal.

Realizar la extracción del ADN de una fracción del endospermo para posterior
análisis.

Amplificar un fragmento del gen crtRB1 para visualizarlo en geles de agarosa.

Seleccionar 20 individuos que contengan el alelo favorable para realizar siembra.
1.1.2. Hipótesis
En maíces BC3F2 (QPM x Provitamina A), es posible encontrar el gen crtRB1 segregado en
una proporción 1:2:1, empleando DNA extraído de endospermo.
1.2. Justificación
Como consecuencia de la pobreza y marginación, en regiones de África, América y Asia, la
desnutrición es un problema de salud pública que se agrava por el empleo del maíz como
alimento básico. Es necesario desarrollar cultivares con calidad nutricional como los maíces
QPM, los maíces provitamina A, o una combinación de ambos.
La MAS ofrece la oportunidad de identificar la presencia de alelos favorables de opaque-2 y
crtRB1, responsables de la condición QPM y un alto contenido de provitamina A,
respectivamente. Como los marcadores moleculares pueden ser detectados en cualquier
estado fenológico de la planta, la MAS ofrece la oportunidad de realizar genotipificación a
nivel de semilla de genes de interés. La MAS también reduce costos e incrementa la escala y
eficiencia del mejoramiento genético. Por lo tanto, la aplicación de MAS a nivel de semilla, es
una alternativa flexible que permitirá identificar el alelo favorable del gen crtRB1.
4
II. PROGRAMA Y CRONOGRAMA
2.1. Cronograma de actividades correspondientes al trabajo experimental
2011
Actividades
Mayo Junio Julio Agosto
Revisión de
bibliografía
Selección de
semilla
Trabajo
experimental
Análisis de
resultados
Conclusiones de
tesis
Escritura de
tesis
5
2.2. Programa de actividades correspondientes al trabajo de tesis
Revisión
1 Avance
Contenido







2 Avance




3 Avance



4 Avance


5 Avance



6 Avance

Titulo
Objetivos
Introducción
Hipótesis
Justificación
Programa y
Cronograma
Avance
”Revisión de
literatura”
Calificación de
Estadía
Correcciones
“Primer avance”
Revisión de
Literatura
Completo
Avance de
Material y
Métodos
Corrección del
Segundo
Avance
Calificación de
Estadía
Corrección del
Primer Avance
Avance de
Resultados y
Discusión
Corrección del
Cuarto Avance
Resultados y
Discusión
completos
Conclusiones
Corrección del
Quinto Avance
Bibliografía
Día
Semana
1 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 1
1
2
1
3
1
4
1
5
20 de
Mayo
3 de
Junio
24 de
Junio
8 de
Julio
19 de
Julio
12 de
Agosto
6
III.
REVISIÓN DE LITERATURA
3.1. Desnutrición y Biofortificación de los alimentos
La desnutrición es uno de las enfermedades principales a nivel mundial, es causa principal
de morbilidad y mortalidad infantil, diminución en la actividad del adolecente y en el adulto
causa una baja productividad laboral. La desnutrición es una enfermedad multisistémica
que afecta a órganos y sistemas del ser humano, ocasionada por diminución drástica,
aguda o crónica en la disponibilidad de los nutrientes.
La gravedad del problema varía dependiendo el país y las diferentes áreas geográficas del
mismo, la mitad de las muertes que pasan cada año en nuestro planeta es atribuida a esta
enfermedad, la falta de nutrientes como la vitamina A en la dieta de países en vías de
desarrollo es alarmante ya que es esencial en el crecimiento y desarrollo de los huesos y
dientes, también es indispensable para otros procesos como la reproducción, integridad de
las superficies mucosas, tejido epitelial y la asimilación de otros compuestos como el
colesterol y esteroides, en gran medida es indispensable para la visión nocturna y visión
normal ya que es uno de los principales pigmentos en la retina llamado rodopsina (Lane,
1999).
La falta de ésta puede afectar de manera importante a los ojos, las manifestaciones
oftálmicas graves producen destrucción de la córnea y se observan principalmente en niños
de corta edad ocasionando posible ceguera. La falta de vitamina A tiene además un papel en
varios cuadros clínicos no relacionados con los ojos, y puede contribuir a aumentar la tasa de
mortalidad infantil. Se ha demostrado dietas carentes de vitamina A pueden influir en la
presencia de infecciones agudas, también afecta adversamente las superficies epiteliales, y
se asocia con un aumento en la incidencia de ciertos tipos de cáncer, incluso el cáncer de
colon (Kliegman et al., 2008).
Dentro de las enfermedades oftálmicas como la Queratomalacia que afecta a los niños, el
sector más vulnerable de la población ocasionando problemas de pérdida de vista y de gran
manera la facilidad de adquirir enfermedades. Las enfermedades atacan a niños pequeños
que mantienen los párpados cerrados por períodos largos y debido a que las tasas de
mortalidad de la xeroftalmía avanzada son altas, pocos niños ciegos sobreviven en las
7
comunidades marginadas, lo que aumenta la importancia social del problema (Kliegman et
al., 2008)
La existencia de altas cantidades de vitamina A en maíz va creciendo ya que se ha
catalogado como un cereal
base en la alimentación, de manera que se ha propuesto
biofortificación del mismo ya que se encuentra esta vitamina pero en cantidad menor. La
biofortificación de las plantas es una estrategia viable para la erradicación de una serie de
deficiencias
nutricionales,
para
la
modificación
del
regulador
importante
para
carotenogénesis y la hidroxilación de β-caroteno. Este paso es catalizado por non-heme y
carotenoides heme Hidroxilasa, las modificaciones son específicamente naturales ya que
utilización de transgénicos no son aceptados por algunos países (Diretto G., 2007).
En el CIMMYT se cuentan con 60 líneas de maíz QPM, pero con carencia de provitamina A
ha llevado a investigar la fijación del gen para mejorar el grano (Vasal, 2001; Srinivasan et
al., 2004).
3.2. Carotenos: biosíntesis y uso
En la plantas los carotenoides son pigmentos orgánicos en organismos fotosintéticos. En
las plantas se percibe de un color amarillo a rojo, principalmente se puede apreciar en flores
y frutos. Estos pigmentos se involucran en la fotosíntesis durante la captación de luz y la
foto-oxidación, a su vez son precursores de señales de estrés biótico y abiótico.
Los carotenos son encargados de disipar el exceso de energía al liberar calor sin provocar
daño en la disipación no fotosintética, si las plantas pueden incrementar dicha
fotoprotección o de recuperarla fácilmente después de un alto estrés lumínico, puede
tomarse como alternativa en el mejoramiento del rendimiento fotosintético.
En los animales su uso es principalmente en precursores de vitamina A y también son
utilizados para protección de los radicales libres; los radicales libres son causantes de
problemas como el cáncer por lo que se ha observado que los humanos de los 600
carotenoides que hay podrán encontrarse a nivel sanguíneo 14 de éstos ya que fueron
absorbidos por alimento externos al cuerpo. Dentro de la dieta los carotenoides principales
son los β-carotenos, α-carotenos, la luteína y el licopeno, al momento de ingerir algún tipo
de carotenoides nos beneficiamos de sus propiedades antioxidantes para la prevención de
8
radicales libres; una de los beneficios del β-caroteno es la eliminación de un radical libre
denominado oxígeno singlete (Brown L., 2010).
La biosíntesis de los carotenos en plantas sucede en las membranas internas;
cloroplastos, cromoplastos, amiloplastos y su síntesis es por Ruta mevalónica
independiente (Figura 1) (Silva-Pérez et al., 2012).
GA3P
+
PIRUVATO
DXS
DXP
DXR
IPP
DMAPP
GPP
GGPP
PSY
PDS
Z-ISO
ZDS
CRTISO
LCY-E
Licopeno
LCY-B
δ-caroteno
LCY-E
ε.ε-caroteno
ϒ-caroteno
LCY-B
LCY-B
α-caroteno
β-caroteno
HYD-E
HydB
α-criptoxantina β-criptoxantina
HYD-B
HydB
zeaxantina
Luteína
ABA
Figura 1. Ruta mevalónica independiente de los tetraterpenoides.
GA3P: D-gliceraldehído-3-fosfato; DXS: 1-deoxi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa;DXP:1-deoxi-D-xilulosa 5-fosfato;
DXR: reductoisomerasa; DMAPP: dimetilalil pirofosfato; IPP: isopentenil bifosfato; GPP: geranil pirofosfato;
GGPP: geranil geranil pirofosfato; PSY: fitoeno sintasa; PDS: fitoeno desaturasa; ZDS: z-caroteno desaturasa;
CRTISO: caroteno isomerasa; LCY-E: ε-licopeno ciclasa; LCY-B: β-licopeno ciclasa; HYD-E: ε-hidroxilasa;
HYD-B: β-hidroxilasa;ABA: ácido abscísico (SILVA-PÉREZ et al.,2012).
9
3.3. Licopeno y β-criptoxantina
3.3.1. Licopeno
Licopeno es un pigmento que da color rojizo a los frutos y vegetales, en ocasiones este
pigmento queda opacado por otras coloraciones verdes clorofílicas; es un carotenoide de
estructura acíclica abierta (Figura 2) conformado por 13 dobles enlaces, de los cuales 11
están conjugados dando a su fórmula química C40H56. Éste es un isómero del β-caroteno
pero sin actividad provitamina A por la falta del anillo de –ionona, el licopeno no es de fácil
asimilación por lo que algún tipo de preparación en los alimentos puede hacer este
compuesto biodisponible; una forma fácil de ser asimilado es la combinación con lípidos, así
estimulan las sales biliares y la lipasa pancreática favoreciendo la absorción dando a lugar al
transporte del licopeno por los quilomicrones desde la mucosa intestinal hasta la corriente
sanguínea.
Figura 2. Estructura química del Licopeno
Así mismo la ingesta en altas dosis de licopeno reduce el riesgo de padecer enfermedades
crónicas como enfermedades cardiovasculares y el cáncer; considerando al licopeno como
uno de los principales antioxidantes (Murray, 2004; IFPRI, 2006).
3.3.2. β-criptoxantina
Este pigmento se encuentra en algunas variedades de maíz, de igual manera está
acompañado con β-carotenos que contiene capacidad de provitamina A y antioxidante.
La enzima β-hidroxilasa es responsable la síntesis de la β-criptoxantina (Figura 3) por lo que
es de gran importancia en el maíz para la búsqueda del gen crtRB1 codifica esta enzima y
presenta varios alelos, uno de los cuales está vinculado con una alta producción de
provitamina A.
10
Figura 3. Estructura química de Criptoxantina
3.4. Marcadores STS para β-criptoxantina
Los marcadores moleculares con mayor presencia en el mejoramiento de maíz son RFLPs,
RAPDs, AFLPs, SSRs y STSs. Dentro de éstos para la detección de las variantes alélicas del
gen crtRB1 vinculado con la enzima β-hidroxilasa que sintetiza a la β-criptoxantina, son
marcadores STS (identificados por el Dr. Jianbin Yang y equipo de colaboradores del
CIMMYT), el desarrollo de las secuencias de los oligonucleótidos para amplificar fragmentos
del gen crtRB1 fueron las Universidades de Cornell e Illinois, esta secuencia es de gran
importancia ya que puede determinar la variante alélicas o alelo favorable, el cual tiene un
tamaño de 543 pb. y 875 pb. Estas variantes se utilizan como marcadores (Figura 4)
moleculares para identificar los individuos homocigóticos y heterocigóticos del gen crtRB1 de
maíz.
Figura 4. Escalerilla de peso molecular y
marcador molecular de 543 pb. y 875 pb.
11
3.5. MAS (Marker Assisted Selection)
La selección asistida por marcadores moleculares
es una herramienta utilizada para el
mejoramiento de plantas y animales, ésta radica en la utilización de marcadores moleculares
para la identificación de patrón hereditario de interés.
La utilización de MAS ayuda en gran medida a:

El mejoramiento de características productivas en plantas ha sido muy socorrido por
la ayuda en la selección fenotípica de éstas.

Clonación de genes de interés.

Bases genéticas de características de interés agronómico.

Diversidad genética.

Comparación por mapeo.
Ventajas de utilizar MAS:

Manejo de características difícil de medir, esto ahorra tiempo y costos.

Se pueden realizar selecciones independientes lugar, etapa de crecimiento de la
planta y selección de planta o semilla.

Son neutros, con relación a los efectos fenotípicos con efecto epistático o
pleiotrópico, mínimo o nulo.

En su mayoría son codominantes y contienen mayor información genética por locus
que los morfológicos (son dominantes o recesivos).

Debido a su alto nivel de polimorfismos ayuda a la construcción de mapas genéticos.
12
IV.
MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Inspección del campo
El Batán (la sede del CIMMYT) está ubicado en la Carretera México-Veracruz Km. 45 El
Batán, Texcoco, Estado de México, tiene una extensión de 78 ha de las cuales tiene 55
plantadas, se encuentra a una altitud 2240 msnm, latitud 19 ° N, la precipitación media anual
de 625 mm, rango de temperatura de -7 a 31 °C, la estación de crecimiento es entre abril y
diciembre, la característica de los suelos es arcillo limoso
que hacen que el
pH se
mantenga en un rango de 6,8 a 7,8.
La estrategia experimental involucró cinco etapas: clasificación, extracción, cuantificación,
amplificación y selección.
Por otra parte las familias de las que no se ha podido realizar una amplificación la estrategia
fue distinta e involucró nueve etapas: siembra, colección de material (hoja), liofilización,
extracción, cuantificación, amplificación y selección.
4.2. Selección de semilla
La selección de semilla se llevó a cabo por medio del tamaño, ya que es una forma de
separarla potencialmente latente para la germinación, posteriormente se separó por color
naranja o amarilla y se separó en grupos para su especificación en la utilización de dicha
semilla:
a) Buena (extracción de DNA y siembra).
b) Regular (solo siembra).
c) Mala (no se puede utilizar).
13
4.3. Extracción de ADN genómico de endospermos (en tiras de tubos de 1.1 ml
Neptune catálogo #2600.8)
4.3.1. Colecta y disrupción de tejido
1. Cortar trozos de endospermo de aproximadamente 1.0 x 0.3 cm, con tijeras para
cortar uñas de caninos, procurando no tocar el embrión ni fracturar el resto de la
semilla.
2. Colocar 2 balas de acero 5/32” marca Gimex por tubo. Usar 2-3 minutos por 24 1/s
de frecuencia en disruptor celular Tissuelyser (Quiagen).
3. Verificar si no existe rotura de tubos y retirar los balines.
4. Mantener las muestras tapadas y molidas hasta el momento de la extracción.
4.3.2. Extracción del ADN de endospermos
*Centrifugar a 3750 rpm
1. Agregar 400 µL a cada tubo de solución con CTAB+Sarcosil (calentar la solución de
CTAB a 65 oC antes de agregar el sarcosil). Usar una pipeta multicanal para tal
propósito. Mezclar por inversión y si es necesario emplear vortex para homogenizar.
2. Mantenerlas en agitación rotativa vertical suave, constante y a Temperatura Ambiente
(TA) por 90 minutos. Asegurar las placas con ligas y tapas de madera o tapas de
silicón para evitar fugas.
3. Retirar las muestras de agitación rotativa vertical, dar un breve mezclado y luego
destaparlas. Adicionar 400 µL de fenol:cloroformo (1:1 v/v). Mezclar por agitación
rotativa vertical constante por 15 min a TA. Nuevamente asegurar las placas con ligas
y tapas de madera o tapas de silicón.
4. Centrifugar por 15 min a TA.
5. Transferir 300 µL del sobrenadante a tubos nuevos.
6. Agregar 300 µL de isopropanol frío (previamente incubado a -80 ° C durante 15
minutos). Mezclar suavemente por inversión. Incubar a -20 o C durante 90 min.
7. Centrifugar por 30 min a 4 o C.
8. Decantar el isopropanol y adicionar 400 µl de etanol al 70%. Centrifugar por 15 min.
9. Realizar un segundo lavado. Pero solo agregar 200 μl y centrifugar.
14
10. Decantar y evaporar remanente de los tubos en campana de flujo laminar hasta el día
siguiente.
11. Re-suspender el ADN en 70 a 100 µl de ∑H2O o TE pH 8.0.
4.3.3. Cuantificación de DNA
1. Para la cuantificación se resuspendió el ADN en H2O marca Sigma o TE, (la cantidad
dependió del material y la calidad del mismo).
2. Se realizó una homogenización con agitación orbital durante 3 horas a TA.
3. Centrifugar por pulso hasta llegar a 2000 rpm.
4. Iniciar el programa de computadora para el NANODROP 8000 THERMO Scientific.
5. Limpiar los pocillos perfectamente con 2 µL agua y secar con toalla de la marca
Kimwipes KIMTECH Science.
6. Tomar 2 µL del blanco (se colocó agua ya que fue con lo que se resuspendió el
ADN).
7. Limpiar perfectamente con toallas los pocillos y colocar 2 µL de la muestra para tomar
lectura.
8. Promediar las cuantificaciones obtenidas por cada lectura para observar la cantidad
de ADN en la placa y verificar la pureza del mismo.
4.4. PCR
La observación de la cantidad y calidad de ADN es importante, ya que puede influir en la
amplificación del fragmento de interés.
1. Realizar diluciones correspondientes dentro de un rango de 25 y 30 ng/µl para
obtener una amplificación clara.
2. Realizar mezcla madre para HydB:
La mezcla madre comprende de agua, Red Taq (contiene un buffer que mantiene el pH,
dNTPs correcto además de ADN polimerasa termoestable para catalizar el elongación de la
hebra de ADN), cantidad adecuada de primers HydB63 R, HydB65 F y HydB66 R (identifica
la región que codificara). Posterior a realización de la mezcla se agregan 2.0 µl a analizar.
3. Identificar placa para PCR y colocar la mezcla madre dentro de los pocillos.
15
4. Colocar la placa en el termociclador marca MJ Resecrch PTC-225 y cerrarla, colocar
programa TD6454 mostrado en el cuadro 1. El programa éste concluye en 2 horas 48
minutos 43 segundos (Se programan la tapa caliente para evitar evaporación).
Cuadro 1. Programa TD6454
Programa: TD6454
94 oC x 5´
94 oC x 1´
64 oC x 30´´ - 0.5 por ciclo
72 oC x 1´
Ir 2.19 x 25 ciclos
94 oC x 1´
54 oC x 30 ´´
72 oC x 1´
Ir 6.25 x 25 ciclos
72 oC x 10´
10 °C
5. Terminado el programa aflojar la tapa y centrifugar durante 1 minuto a 70 gravedades
para que los vapores situados en las paredes bajen.
4.5. Electroforesis en bis-agarosa
1. Colocar amortiguador TBE 1X pH 8.0 dentro del tanque de electroforesis.
2. Agregar 12 µL de muestras amplificadas previamente en PCR a los pocillos del gel de
bis-agarosa al 2.2 %, colocando en los primeros pocillos la escalerilla molecular y en
los siguientes los controles para la observación de la banda de interés.
3. Colocar una potencia de 120 V (para obtener bandas mejor definidas) por un tiempo
estimado de 1 hora (dependiendo de la distancia del polimorfismo).
4. Teñir los geles en bromuro de etidio 0.01 % durante 5 a 10 minutos.
5. Retira y enjuagar durante 3 minutos en H2O destilada y tomar la foto inmediatamente
(Kodak MI).
4.6. Foto documentación
1. Al tomar la foto se seleccionaron las especificaciones de acuerdo al material con que
se trabajó. Las características se deberán especificar en el programa KODAK MI.
16
2. Colocar la base para poner el gel en transiluminador UV de marca FOTO/PREP1 y
prender la luz UV.
3. En el programa abierto tomar foto y esperar unos segundos antes de apagar la UV.
4. Editar la imagen para observar mejor los amplicones.
4.7. Siembra de semilla
4.8.
1.
Seleccionar semillas para la siembra, se utilizó semilla de características aceptables
para germinación y se analizaron visualmente para la elección de éstas.
2.
Utilizar charolas de 200 cavidades para la germinación de las semillas.
3.
Colocar tierra estéril y fertilizada (proporción de la tierra a utilizar 82.4 % de tierra
tamizada y 17.6% de turba) en las charolas hasta el máximo nivel de los pocillos sin
compactarla.
Cuadro 2. Fertilizantes utilizados en la tierra
Fertilizantes
4.
Tambos 200L
1
5
10
15
20
Urea
22
110
220
330
440
Scat
11
55
110
165
220
KCl
5
25
50
75
100
Sulfato-magnesio
10
50
100
150
200
Ultra mix
0.3 g
1.5
3
4.5
6
Sembrar creando un orificio en la tierra o presionando la semilla contra la tierra con el
embrión hacia abajo.
5.
Al colocar la semilla se regó sin golpear directamente la tierra para evitar que la
semilla salga de los pozos.
17
4.8. Extracción de ADN de hoja (en tiras de tubos de 1.1 ml Neptune)
4.8.1. Colecta y disrupción de tejido vegetal
1. Colectar 15 mg de hoja, con perforadora para hojas de papel o tijeras teniendo en cuenta
el tamaño estimado de 12 discos colocándolos en tubos de 1.1 ml sobre hielo.
2. Colocar las muestras en ultra congelador (-80 ° C) por un lapso de 3 horas o más tiempo
para ser liofilizado (la liofilización tardó 3 días en liofilizador marca labconco según el
fabricante; esto también dependió de la cantidad de material).
3. Colocar 2 balas de acero 5/32” marca Gimex por tubo. Usar 2-3 minutos por 24 1/s de
frecuencia en disruptor celular Tissuelyser marca Quiagen.
4. Verificar si no existe rotura de tubos y retirar las balas.
5. Mantener las muestras tapadas y molidas hasta el momento de la extracción.
4.8.2. Extracción de ADN de tejido vegetal
*Centrifugar a 3750 rpm
1. Adicionar 400 μl a cada muestra de solución con CTAB+ BME a 65 ° C .Usar pipeta
multicanal de 8-12 puntas.
2. Mezclar perfectamente con vortex suave todo el tejido con el amortiguador y colocarlos
en agitación rotativa vertical por 90 minutos a 65 ° C.
3. Adicionar 400 μl de cloroformo/octanol (24:1 v/v), mezclar muy bien, y mantenerlos en
agitación rotativa vertical 15 minutos TA.
4. Centrifugar por 15 minutos a TA
5. Tomar del sobrenadante, 300 μl y colocarlos en tubos nuevos.
6. Adicionar 300 μl de isopropanol frío.
7. Mezclar por inversión, centrifugar por 30 minutos a 4 °C.
8. Decantar el sobrenadante y lavar con 400 μl de etanol 70 %. Se agitó ligeramente por
inversión y se centrifugó 15 minutos a 4 °C.
9. Realizar un segundo lavado. Decantar el etanol al 70% y agregar 200 μl de etanol al 70%
y centrifugar 15 minutos a 4 °C.
10. Secar el pellet en campana de flujo laminar hasta el día siguiente.
11. Re-suspender el pellet en 200 μl ∑H20 o TE pH 8.0.
12. Incubar 15 minutos a 65 °C y agitar suavemente por 20 minutos en orbital Shaker.
18
4.9. Diagrama Experimental
19
V.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Características del material
El material previamente se separó por familias y se descartaron las familias que contaban
con material no favorables para extracción, dentro del formato se ubicó el número de
semillas existentes; se realizó una segunda evaluación, ya que el material utilizado para la
extracciones de ADN de endospermo presenta mala calidad; éste se colectó en el 2010
después de que se había presentado una helada lo que pudo haber alterado su desarrollo
así mismo su calidad.
Características del material:
- Material harinoso
- Bajo pesos
- Tamaño considerablemente pequeño
5.2.
Familias a analizar
En el Cuadro 3 se observan las familias, número de semillas cosechadas así como la
persona contador que realizó el análisis visual para el agrupamiento de las semillas.
Cuadro 3. Selección de semilla
No.
Semilla Semilla Semilla
No.
Mazorcas,
Entrada seleccionadas Contador buena regular
fea
HydB
155
5
AV
189
895
H
7
8
154
5
AV
75
488
H
3
11
3
AB
29
472
H
12
14
5
AB
0
922
H
15
15
5
AB
93
1218
H
16
205
6
AB
232
1068
H
19
0
1
AB
0
448
1
395
20
9
AV
361
1700
1
22
90
5
IR
621
626
H
355
23
9
AV
248
1832
H
27
157
4
AV
601
494
H
584
29
24
IR
2925
2246
NK
906
31
6
AB
503
336
H
33
361
4
AV
0
536
1
Semilla seleccionada para extracción de ADN
20
Seleccionando solo la familia 7, 8, 16, 20, 23, 27, 29,31 y 33, para la extracción de ADN se
utilizaron 200 semillas por familia y en aquellos casos donde no se completó el material
necesario; se agregó semilla regular.
Se muestra en el cuadro 3 un número o letra a HydB en este caso 1 es la familia que
contiene el alelo positivo fijo y por otra parte H son las familias que son heterocigotos.
5.3. Extracción de ADN en semilla
La extracción de ADN fue minuciosa, porque en la extracción de endospermo se obtiene
menor cantidad y existe mayor contenido de carbohidratos que interfiere en la PCR.
Posteriormente de las extracciones de ADN se realizó una cuantificación en nanodrop 8000
THERMO Scientific. En el Cuadro 4 se observar los rangos de lectura de 230/260 que es la
longitud de onda donde absorbe luz el ADN y la longitud de onda de 260/280 se observa la
pureza (también se observa si existe ensuciamiento por proteínas, fenoles o amino ácidos
aromáticos). La concentración de ADN se expresa en ng/µl.
Cuadro 4. Cuantificación, rangos de pureza, concentración de ADN y dilución a realizar
(70 µl a utilizar)
ID de la placa
Familia
Concentración.
260/280
260/230
Dilución a trabajar
BA 10 2124-P1
7
116.8
1.8
1.1
1:3
BA 10 2124-P2
7
114.5
1.8
1.1
1:3
BA 10 2124-P1
8
139.5
1.9
1.3
1:6
BA 10 2124-P2
8
157.4
1.9
1.2
1:3
BA 10 2124-P1
16
121.4
1.7
0.9
1:2
BA 10 2124-P2
16
123.2
1.8
0.9
1:2
BA 10 2124-P1
20
121.2
1.7
0.9
1:3
BA 10 2124-P2
20
107.6
1.7
0.8
1:3
BA 10 2124-P1
23
95.8
1.8
1.2
1:2
BA 10 2124-P2
23
95.9
1.8
1.1
1:2
BA 10 2124-P1
27
95.3
1.8
1.1
1:2
BA 10 2124-P2
27
97.0
1.8
1.2
1:2
BA 10 2124-P1
29
157.9
1.8
1.1
1:3
BA 10 2124-P2
29
200.2
1.8
1.1
1:4
BA 10 2124-P1
33
180.1
1.8
1.0
1:3
BA 10 2124-P2
33
250.4
1.8
1.2
1:5
BA 10 2124-P1
31
23.2
1.6
0.7
Directo
21
BA 10 2124-P2
31
131.3
1.7
0.9
1:3
BA 10 2124-P3
31
153.8
1.8
0.9
1:2
BA 10 2124-P4
31
122.9
1.7
0.9
1:2
Aunque las concentraciones son elevadas se debe tomar precaución en la pureza de dichas
muestras ya que podrían afectar la amplificación dentro de la técnica de PCR.
5.4. Obtención de PCR
En la técnica de PCR existen variantes a tomar en cuenta que pueden interferir en la
amplificación; esto se debe a que el ADN a partir de semilla contiene exceso de
carbohidratos que no se eliminaron en la extracción.
Posteriormente en la electroforesis se observó la calidad
y amplificación. En las
amplificaciones se utilizó Taq comercial Red Taq SIGMA manejándola con indicaciones del
proveedor para su amplificación correcta; pero existieron interferencias en la amplificación.
Para la amplificación de este material se probaron variantes a modificar como: la reutilización
de las placas, cantidades y concentración de oligonucleótidos, ADN e interferencias en el
contenido del material como carbohidratos.
Se observó que las placas que se utilizan para amplificar han sido reutilizadas desde el 2008
sin problema, pero la limpieza no fue adecuada por lo que existió interferencia, las
cantidades de ADN se modificaron tomando como base la cuantificación, de igual manera se
realizó con los oligonucleótidos y modificando la concentración µM para las amplificaciones.
5.5. Obtención de electroforesis de las familias a analizar
En la lectura de electroforesis se observó una amplificación no definida, esto se puede
observar en la formación inespecífica de las bandas. De las familias seleccionadas para la
amplificación se realizaron diversas PCR’s para intentar amplificar los fragmentos.
Para la identificación de las mismas en la Figura 5 se muestra la banda de interés,
arbitrariamente para hidroxilasa se toma como 1 la banda positiva y 2 la banda negativa.
22
Figura 5. Banda positiva 1 y negativa 2 en gel de bis-agarosa.
5.6. Dificultades con la extracción y alternativas
Se realizó una segunda extracción de DNA de las familias 29, 31 y 33 que no amplificaron,
en esta extracción de las familias se encontraron varios individuos excepto de la familia 29
que requirió una tercera extracción a partir de semilla.
El Cuadro 5 muestra las cuantificaciones de la segunda extracción de las cuales se observa
las características del ADN y las características de pureza.
Cuadro 5. Cuantificación de ADN de semilla segunda extracción
ID de la placa
BA 10
BA 10
BA 10
BA 10
BA 10
BA 10
2124-P1
2124-P2
2124-P1
2124-P2
2124-P1
2124-P2
Familia
29
29
31
31
33
33
Concentración.
260/280
260/230
93.7
273.1
1.9
1.9
1.9
1.8
1.9
1.2
0.4
0.8
1.9
1.8
1.5
0.9
24.2
31.2
108.5
42.7
Dilución a
trabajar
Directo
Directo
Directo
Directo
Directo
Directo
El Cuadro 6 muestra las cuantificaciones de la tercera extracción en las que se observa la
calidad del ADN; ha causado trabajo amplificar por una mala extracción del material y así
provocar contaminación del ADN creando interferencia en la PCR.
23
Cuadro 6. Cuantificación de ADN de semilla tercera extracción
ID de la placa
Familia
BA 10 2124-P1
BA 10 2124-P2
29
29
Concentración.
260/280
260/230
275.6
201.5
1.9
1.9
1.7
1.6
Dilución a
trabajar
1:5
1:5
5.7. Siembra de material, colecta y extracción de ADN en hoja
Se sembraron la familias 16, 23 y 27 faltantes de identificación de más individuos y así
poder completar los necesarios para siembra en un surco, por lo que se generó un formato
para la siembra de 1200 semillas equivalentes a 6 charolas utilizadas para la germinación,
las cuales se colocaron en el invernadero 11 del CIMMYT. Se sembraron 200 semillas por
familia, en la Figura 6, 7 y 8. Se observa las características de las plantas con germinación
por charola y el número de individuos germinados.
Figura 6. Charola 1, Características
fenotípicas de la familia 16, 181
plantas.
Figura 7. Charola 2, Características
fenotípicas de la familia 23, 188
plantas.
24
Figura 8. Charola 3, Características
fenotípicas de la familia 27,182 plantas.
Dentro de esta colecta se tomó material que tenía poco tiempo de crecimiento. Para la
colecta se esperó que las plantas tuvieran 2 hojas para tener material necesario para las
extracciones y tomar un promedio de 8 discos, ya que el material estaba pequeño, se colectó
menor cantidad.
La amplificación fue de menor complejidad; se ha observado que la extracción y
amplificación de ADN en hoja es relativamente sencilla porque no existe tanta interferencia
como en semilla que presentan alto contenido de carbohidratos, la desventaja de ésta es que
se realizan gastos mayores para la obtención del material como la creación de condiciones
en invernadero lo que genera gastos de electricidad , renta del invernadero, mejoramiento de
la tierra a utilizar (mejoramiento con turba, esterilización y fertilización) y charolas.
En el Cuadro 7 se muestran las cuantificaciones de extracción de hoja la cual muestra
mejores contenidos de ADN y mejor pureza ya que no se encuentra con una cantidad alta de
ácidos fenólicos.
25
Cuadro 7. Cuantificación de ADN de hoja
ID de la placa
BA 10
BA 10
BA 10
BA 10
BA 10
BA 10
BA 10
BA 10
BA 10
BA 10
2124-P1
2124-P2
2124-P1
2124-P2
2124-P1
2124-P2
2124-P1
2124-P2
2124-P3
2124-P4
Familia
16
16
23
23
27
27
29
29
29
29
Concentración.
260/280
260/230
2739.4
1709.6
825.4
865.9
941.6
1056.5
491.61
678.28
898.50
874.61
2.1
1.9
2.0
2.1
1.8
1.9
1.6
1.8
1.9
1.8
2.1
1.9
1.9
2.0
1.8
1.9
1.8
1.4
1.6
1.4
Dilución a
trabajar
1:34
1:23
1:12
1:12
1:13
1:14
1:6
1:8
1:12
1:12
5.8. Comparación de las amplificaciones basadas en hoja y de semilla
La Figura 9 A y 9 B muestra la comparación de la amplificación de ADN extraído de hoja y de
semilla. Como se observa, en el endospermo existe un alto contenido de carbohidratos que
interfieren en la amplificación de PCR propiciando una amplificación débil, en cambio en
hoja existen una mínima cantidad de estas macromoléculas y se puede observar una
amplificación aceptable.
Debido a la amplificación no favorable de la semilla, se optó por sembrar las semillas
regulares para realizar extracciones, estos resultados fueron adecuados aunque no es lo
más apropiado por el tiempo de crecimiento, monitoreo de plantas y el espacio utilizado;
provocando que el trasplante a campo no sea en un estadio adecuado.
26
Familia 33 placa 2 Mayo 4
Figura. 9 A. Amplificación ADN de semilla.
F
Familia 23 placa 1 Mayo 30
Figura 9 B. Amplificación ADN de hoja.
La población de la familia 20 en el ciclo anterior 2010 ya contaba con el alelo fijo para
HydB, por lo que solo se realizó la extracción de media placa para confirmar los datos;
aunque el alelo ya se encuentra fijo, en amplificaciones a partir de ADN de semilla no se
obtuvieron resultados y se optó por sembrar el material y así poder corroborar los datos.
El material de la familia 20 al germinar contiene características fenotípicas diferentes a las
familias analizadas (7, 8, 16, 23, 27, 29, 31 y 33), en la Figura 10 se muestra el fenotipo la
cual presenta hojas con coloración vino, evidencia de gran contenido de antocianinas.
27
Figura 10. Coloración de hojas de la familia 20.
En el Cuadro 8 se muestran el número de individuos que se pudieron localizar con la
genotipificación y su posterior ubicación si existían individuos que sobrevivieron a la
trasplantación.
Cuadro 8. Individuos totales de la genotipificación y sobrevivientes después de la
plantación.
HydB
7
Primer
Extracción
(semilla)
38
Segunda
extracción
(semilla)
N/A
Tercer
extracción
(semilla)
N/A
Primer
Extracción
(hoja)
N/A
8
21
N/A
N/A
N/A
16
22
N/A
N/A
20
0
N/A
23
11
N/A
27
19
29
Familia
TOTAL sobrevivientes
38
26
21
5
61
35
97
90
N/A
39
SIN
AMPLIFICAR
36
47
31
N/A
N/A
27
46
25
0
8
14
53
75
66
31
17
14
N/A
N/A
31
9
33
8
43
N/A
N/A
51
20
N/A
En el cuadro 8 se observan los resultados del material analizado
con características
inadecuadas para los análisis, buscando por tanto diferentes alternativas como sembrar
28
para obtener ADN de hoja, la familia 20 no obtuvo amplificación correcta, por lo que se
sembró la población en campo para su posterior comprobación de alelos.
La Figura 11 muestra las características de las plantas trasplantadas al campo ya que al
momento de la aclimatación las plantas pueden tener adormecimiento.
Figura 11. Planta trasplantada a campo.
La Figura 12 muestra las características de las plantas sembradas en campo ya que al
momento del crecimiento puede no ser favorable por las características de la semilla y
latencia, sin embargo se puede observar un crecimiento favorable a las 3 semanas.
Figura 12. Semilla seleccionada en laboratorio y crecimiento en campo.
La comprobación de alelo se realizó teniendo una respuesta adecuada al trasplante y las
plantas sembradas a base de semilla tuvieran un tamaño adecuado para colectar, y si
existió algún error corregirlo antes de la polinización.
29
En la Figura 13 A y B se muestran la amplificación de los individuos colectados en el campo
lo que permitió retirar algunos especímenes. En la figura observamos los controles positivo y
negativo para tener referencia; para delimitar entre una familia y otra contiene agua como
control. Las que contienen una letra R son muestras que se tendrían que repetir pero al
mismo tiempo se realizó un copia del gel y se observa las muestras que no amplificaron
anteriormente por lo que los geles al ser iguales son complementarios verificando cuáles son
las muestras que contiene el alelo positivo para provitamina A.
Figura 13 A. Comprobación de muestras en campo.
30
Figura 13 B. Comprobación de muestras en campo
En la comprobación de alelo en la familia 20, la cual no se había podido amplificar, existió
amplificación favorable en un crecimiento adecuado esto es a que en primeros estadios se
concentra gran cantidad de antocianinas, conforme va efectuándose el crecimiento se van
hidrolizando los carbohidratos por enzimas como la α-amilasa y la β-amilasa existentes en la
planta, permitiendo la amplificación de dichas muestras.
31
El tiempo de siembra se retrasó por selección asistida así como por los ingenieros
encargados de la siembra; provocando que se tuviera riesgo debida a condiciones climáticas
como heladas que afectan el desarrollo. La Figura 14 muestra las plantas después de la
primera helada el día 8 de septiembre de 2011, se observa que existen plantas con
mazorcas sobrevivientes que contienen poco contenido de endospermo.
Figura 14. Individuos después de helada.
En la Figura 15 se muestran las mazorcas cosechadas de las familias a partir de plántulas
con poca semilla y poco endospermo, éstas son resultado de la alteración causada por las
heladas.
32
Figura 15. Mazorcas resultantes de genotipificación en plántulas.
La Figura 16 muestra mazorca con maíz resultante a partir de genotipificación realizada en
endospermo.
Figura 16. Mazorcas resultantes de genotipificación en semilla.
33
VI.
CONCLUSIONES
La identificación de los individuos con alelo favorable a HydB dentro de las familias
analizadas fue compleja por el material con el que se trabajó, en algunas placas no se
obtuvo ninguna amplificación ya que contenía alta cantidad de carbohidratos considerado en
la naturaleza del grano de maíz esto se fundamenta por estudios realizados en grano de
maíz de diferentes lugares (Méndez, G.M, 2005), por lo que se propone adicionar una
enzima para la eliminación de los carbohidratos (amilosa y amilopectina) cuando ya haya
sido realizada la extracción para obtener amplicones de mejor calidad.
En la PCR se observó que se tenía que modificar la cantidad de ADN dependiendo la calidad
y cantidad del mismo, modificando la mezcla madre de 2.0 a 3.0 µl de ADN con
concentración entre 30 ng/µl a 70 ng/µl dependiendo de la calidad. También la modificación
de la concentración µM de los oligonucleótidos de 1 µM, 2.0 µM y 2.5 µM de las cuales se
recomienda 1 µM.
La familia 20 ya se encontraba en generación BC3 donde ya se encontraba el alelo fijo, pero
se observó segregación de heterocigotos, por lo que no se realizó una selección adecuada
en el ciclo agrícola anterior y existieron 22 individuos que no resultaron con el alelo positivo
pertenecientes a la familia, el corte de las plantas con el alelo negativo fue cambiado por
algún individuo de alelo positivo, así mismo se propone llevar un control más estricto y hacer
una comprobación final en campo.
La mortandad fue de un 25 % de las plántulas ya que el riego para su desarrollo no fue el
adecuado, el riego se realizó 5 días después manualmente porque las plantas adultas se
regaban cada semana y no de acuerdo a la edad de nacencia reflejando la necesidad de
realizar la selección asistida de acuerdo a la programación de siembra del lote.
La selección asistida basada en semillas es lo recomendado ya que no se gastan tantos
recursos como en hoja, ya que se utilizan charolas para germinación y poder obtener
material para extracción de ADN, además el costo de la renta de invernadero con servicios
es de 700 dólares (tierra enriquecida, energía eléctrica, agua) y sobre todo el tiempo, un
factor importante de riesgo para quedar propensos a las inclemencias climáticas y así perder
el experimento.
34
Lo tardío de la selección, siembra y trasplante de estos individuos propició el riesgo a
inclemencias climáticas que las plantas murieran y obteniendo poco material con el cual
trabajar haciendo que se repita el experimento para el próximo ciclo 2012 por lo que es
indispensable una planeación correcta para no tener estos contratiempos.
Finalmente podemos concluir que la identificación de individuos con el alelo de interés fue
exitosa, dando a notar que en la amplificación de PCR influye el tipo de material, ya que
ocasiona impureza en el ADN por la cantidad excesiva de carbohidratos y contenido de
antocianinas. Las características del material está ligada a condiciones climatológicas como
heladas, observando la existencia de más individuos con alelo no favorable para HydB por
medio de la selección asistida ya que el ciclo pasado también fueron afectados por helada,
los individuos con alelo favorable para HydB no tienen resistencia adecuada a heladas.
35
VII.
BIBLIOGRAFÍA
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vínculos
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36
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37
VIII.
ANEXOS
Anexo 1. Preparación de TBE 10X
STOCK
1 litro
2 litros
3 litros
4litros
Tris Base (MW=121.10)
108.0 g
216.0 g
324.0 g
432.0 g
Ácido Bórico (MW=61.83)
55.0 g
110.0 g
165.0 g
220.0 g
0.5 M EDTA pH 8.0
40.0 ml
80.0 ml
120.0 ml
160.0 ml
Ajuste el pH a 8.0 con ácido acético glacial o HCl (ácido acético para PAGE).
Anexo 2. Solución Sarcosil 10%
La preparación del sarcosil va ser en una solución acuosa por lo que si se quiere preparar
100 ml:
Medir 90 ml de agua.
Adicionar 10g de sarcosil.
Anexo 3. Solución con CTAB para la extracción de ADN2 de semilla de maíz usando
tiras de tubos de 1.1 ml
SOL. CONC.
[FINAL]
dH20
5 rxn
10 rxn
20 rxn
50 rxn
60 rxn
50 ml
100 ml
200 ml
500 ml
600 ml
32.5 ml
65.0 ml
130.0 ml
325.0 ml
390.0 ml
1 M Tris-7.5
100 mM
5.0ml
10.0 ml
20.0 ml
50.0 ml
60.0 ml
5 M NaCl
700 mM
7.0 ml
14.0 ml
28.0 ml
70.0 ml
84.0 ml
50 mM
5.0 ml
10.0 ml
20.0 ml
50.0 ml
60.0 ml
CTAB3
1%
0.5 gr
1.0 gr
2.0 gr
5.0 gr
6.0 gr
10% Sarcosil
1%
5.0 ml
10.0 ml
20.0 ml
50.0 ml
60.0 ml
0.5 M EDTA 8.0
1
Usar la solución recién preparada, calentarla a 60-65 oC antes de agregar el CTAB y el
lauril-sarcosil. Se puede preparar un día antes pero no agregar el CTAB ni el lauril-sarcosil
(Sigma L5125).
38
2
CTAB es el bromuro mixto de alquil-trimetil-amonio (Sigma M-7635).
Anexo 4. Preparación del gel de agarosa
Geles grandes a 1.5%:
Agregar 2 gr. Metaphose agarosa y 1 gr Tesaphose agarosa a un matraz de 1L para evitar
derramamiento en el calentamiento.
Agregar 200 ml TBE 1x.
Calentar en microondas hasta disolver la agarosa.
Enfriar al vacío a fin de eliminar burbujas en el vaciado.
En la base del gel colocar las ligas y vaciar la agarosa evitando que existan burbujas.
Colocar los peines y dejar que polimerice. Ya polimerizado cargar o guardar en bolsa sellada
en refrigeración a 5 oc.
Anexo 5. Preparación de bromuro de etidio.
En una charola con capacidad de 5L:
Agregar 1.5 L H2O y 150µl de Bromuro de Etidio para obtener una solución al 0.01 %.
Anexo 6. Preparación de primers
C1V1 =C2 V2
200 V1 = (2) 100 = 2000 = 10 + 990 de H2
200
F
C1V1 =C2 V2
200 V1 = (2) 100 = 2000 = 10 + 990 de H2
200
R
39
Anexo 7. Solución con CTAB para la extracción de ADN2 de hoja en tiras de tubos de
1.1 ml.
SOL. CONC.
[FINAL]
dH20
5 rxn
10 rxn
20 rxn
50 rxn
60 rxn
50 ml
100 ml
200 ml
500 ml
600 ml
32.5 ml
65.0 ml
130.0 ml
325.0 ml
390.0 ml
1 M Tris-7.5
100 mM
5.0ml
10.0 ml
20.0 ml
50.0 ml
60.0 ml
5 M NaCl
700 mM
7.0 ml
14.0 ml
28.0 ml
70.0 ml
84.0 ml
50 mM
5.0 ml
10.0 ml
20.0 ml
50.0 ml
60.0 ml
1%
0.5 gr
1.0 gr
2.0 gr
5.0 gr
6.0 gr
140mM
0.5 ml
1.0 ml
2.0 ml
5.0 ml
6.0 ml
0.5 M EDTA 8.0
CTAB3
14 M BME
1
Usar la solución recién preparada, calentarla a 60-65 oC antes de agregar el CTAB y el
lauril-sarcosil. Se puede preparar un día antes pero no agregar el CTAB ni el BME.
2
3
CTAB es el bromuro mixto de alquil-trimetil-amonio (Sigma M-7635).
Adicione BME (β-mercaptoetanol Sigma M-7635) justo antes del empleo, hágalo bajo
campana de extracción.
40