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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias Agrarias
Escuela de Agronomía
Detección de mutaciones asociadas a dureza de grano a
113 genotipos de trigo (Triticum aestivum L.) por medio
de herramientas biotecnológicas
Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Agronomía.
Profesor Patrocinante: Sr. Ricardo Riegel S. – Ing. Agr., Mg. Sc., Dr. rer.
Nat. – Instituto de Producción y Sanidad Vegetal.
Mónica Lorena Mathias Ramwell
Valdivia Chile 2004
Profesores Informantes
Sr. Javier Zuñiga R. – Bioq. – Instituto de Producción y Sanidad Vegetal.
Sr. Claudio Jobet F. – Ing. Agr., Mg. Cs., Ph. D. - Instituto de Producción y Sanidad
Vegetal.
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RESUMEN
La elaboración de productos con harinas de trigo, dependiendo del tipo de
procesamiento, exige diferentes tipos de calidad. La textura del endosperma es uno de
los requerimientos más importantes. En general, las harinas provenientes de trigos duros
son preferidas para la panificación, mientras que las de trigos blandos se usan en la
elaboración de galletas y queques.
El trigo es alohexaploide (AABBDD) y se estima que hasta un 80% de la variación en
textura está controlada por el locus HARDNESS, ubicado en el cromosoma 5D; ligados a
éste se encuentran los genes de puroindolinas pina y pinb, proteínas del endosperma. La
variación alélica en genes pin, producida por mutaciones, ha sido asociada a textura
dura.
Con el objetivo de facilitar el mejoramiento genético para calidad industrial del trigo
harinero, se adaptaron y desarrollaron métodos basados en PCR para la detección de los
alelos de puroindolina: pina-D1b, pinb-D1c y pinb-D1d. Se analizó un grupo de 113
genotipos pertenecientes al germoplasma del programa de mejoramiento de INIACarillanca y se encontró que el 55% contenía las mutaciones estudiadas; pinb-D1b
representó el 40%, le siguieron en importancia pinb-D1c y pina-D1b, con un 8% y 7%
respectivamente. El análisis de la textura medida por NIRS, demostró que el 94% del
total de genotipos mutados perteneció a la categoría de textura de grano dura y el 6%
restante a la de textura semidura.
SUMMARY
The product elaboration with wheat flours, depending on the type of processing, need
different types of quality.
The endosperm texture is one of the most important
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requirements. In general, flours originated from hard wheat are preferred for bread
making whilst that of soft wheat is best suited for cakes and cookies.
The wheat is allohexaploid (AABBDD) and up to 80% of texture variation in this
species is controlled by the HARDNESS (Ha) locus, located on the 5DS chromosome
arm. Closely to Ha are the puroindoline pina and pinb genes, a pair of proteins from the
endosperm tissue. The allelic variation in these genes as been associated with texture
variation, and all the non wild-type alleles are strongly linked to hard endosperm.
Whit the objective to facilitate the breeding for industrial quality in Triticum aestivum
L., PCR-based methods for the detection of the puroindoline alleles: pina-D1b, pinbD1c and pinb-D1d were adapted and developed. A group of 113 genotypes from the
program of wheat improvement of INIA-Carillanca was analyzed. Fifty five percent
contained the studied mutations; pinb-D1b represented 40%, followed by pinb-D1c and
pina-D1b, with a 8% and 7% respectively. The analysis of the texture measured by
NIR, demonstrated that 94% of the total of mutated genotypes belonged to the category
of hard grain texture and 6% to the intermediate texture.
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1. INTRODUCCION
El trigo harinero (Triticum aestivum L.) es fuente primaria de alimentación y uno de los
cereales más cultivados en el mundo. Una propiedad única de las harinas obtenidas a
partir del trigo es su capacidad para formar una estructura proteica viscosa y elástica
llamada gluten. Esta cualidad hace que la harina del trigo se emplee en la manufactura
de diferentes productos entre los que destacan distintos tipos de pan, galletas y
biscochos.
La manufactura de los variados productos basados en harina de trigo requiere
características industriales específicas.
La textura del grano es uno de los
requerimientos de calidad más importante, puesto que define el uso final: en general, las
harinas provenientes de trigos de textura dura son preferidas para la panificación,
mientras que las provenientes de trigos de textura blanda son preferidas para la
elaboración de galletas y queques.
Las diferencias en textura de grano que presentan las distintas variedades de trigo,
pueden estar asociadas a variación en el grado de interacción entre los gránulos de
almidón y la matriz de proteínas del endosperma.
Aunque genéticamente el trigo es alohexaploide (genomas AA BB DD), hasta un 80%
de la variación en textura de grano está controlada por un solo locus, denominado Ha
(HARDNESS), que se ubica en el brazo corto del cromosoma 5D. Otros factores como el
contenido de arabinoxilano (un pentosano) y de proteína influencian la textura en menor
medida.
Recientemente, la variación alélica en la secuencia aminoacídica de unas proteínas
conocidas como puroindolinas, asociadas a la superficie de los granos de almidón en el
endosperma, ha sido fuertemente asociada con la variación en textura de grano. Los
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genes de puroindolinas se encuentran estrechamente ligados al locus Ha, sugiriendo un
rol primario de estas proteínas en la determinación de la textura, o que ellas están ligadas
genéticamente a los factores determinantes codificados por el locus Ha.
Los distintos alelos de puroindolinas pueden detectarse por medio de técnicas como la
Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR), electroforesis desnaturante de proteínas
(SDS-PAGE) y Cleavage Amplified Polymorphic Sequence (CAPS). Esta cualidad
tiene enorme impacto en el mejoramiento genético del trigo, pues permite reconocer con
precisión y rapidez las plantas que los portan, evitándose así la variación por efecto del
medioambiente y el avance de plantas sin mérito genético. Las técnicas mencionadas
requieren pequeñas cantidades de material vegetativo o grano, con lo cual es posible
analizar tempranamente plántulas en desarrollo de poblaciones segregantes o líneas
doblehaploides.
En 1999, INIA-Carillanca comenzó a aplicar este enfoque en la
caracterización de progenitores y la selección para el alelo pinb-D1b en poblaciones
doblehaploides de trigo. Sin embargo, plantas fenotípicamente duras no mostraban
reacción positiva en el ensayo, al tiempo que nuevos alelos y métodos para su
diagnóstico eran reportados en la literatura.
Como hipótesis de este trabajo de tesis, se plantea que existen distintas variantes alélicas
de los genes de puroindolinas en el pool genético de trigos de textura dura del Programa
de Fitomejoramiento de Trigos de INIA Carillanca.
El objetivo general corresponde a la adaptación y el desarrollo de métodos que permitan
y faciliten el diagnóstico molecular de alelos condicionantes de textura dura en granos
de trigo harinero.
Con el fin de lograr el objetivo general y probar la hipótesis planteada, se establecieron
los siguientes objetivos específicos:
Adaptar y desarrollar métodos basados en PCR para la detección de los alelos de
puroindolina pina-D1b, pinb-D1c y pinb-D1d.
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Caracterizar los alelos de puroindolina presentes en el pool genético de trigos de textura
dura, del Programa de Fitomejoramiento de Trigos de INIA Carillanca.
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2. REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1. Antecedentes del trigo
El trigo es el cereal más cultivado en el mundo y su importancia radica en que es una
fuente de alimentación primaria, aportando a la dieta mundial con más calorías y más
proteínas que ningún otro cultivo alimenticio (HANSON et al., 1985).
La harina del trigo es única entre las de los cereales por su capacidad para formar una
masa visco-elástica cuando se mezcla con el agua. Además, las masas de trigo tienen la
posibilidad particular de retener el gas que se produce durante la fermentación o aquél
liberado por aditivos químicos, dando origen a productos esponjosos (HOSENEY,
1991).
El trigo es utilizado en la alimentación humana, animal y con propósitos industriales,
siendo el ingrediente principal en una variedad de productos que incluyen: el pan,
tortillas, chapaties, galletas, queques, noodles, pastas y alimentos de desayuno. En
muchas áreas es utilizado como empastadas, heno y silo. En menores cantidades el trigo
es usado en la obtención industrial de almidón, aceite y gluten (ALLAN, 1980).
En Chile, el trigo en la alimentación humana representa aproximadamente el 34% de la
ingesta calórica, y el 50% de las proteínas que consume en promedio el habitante chileno
(MELLADO, 1998). Por otro lado Chile es uno de los países que presenta un mayor
consumo de pan (principal producto elaborado con harina de trigo) en el mundo, el que
se estima en 91,5 kilos per capita al año (CHILE-OFICINA DE ESTUDIOS Y
POLITICAS AGRARIAS (ODEPA), 2002).
A nivel nacional, el trigo es el cultivo de mayor superficie, alcanzando en la temporada
2001/2002 las 412.000 ha y un rendimiento promedio de 42,7 qm/ha (ODEPA, 2002).
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Según GONZALEZ y VELAZCO (2001), la producción de trigo en Chile no alcanza a
cubrir la demanda interna, por lo que parte importante del trigo consumido en Chile es
importado fundamentalmente desde Argentina, Estados Unidos y Canadá.
2.1.1. Origen y evolución
El trigo se originó en Asia Menor, en el valle de los ríos Tigris y Eufrates, en donde está
representado por una enorme diversidad de tipos silvestres y cultivados. Este cereal fue
cultivado en Grecia, Persia, Egipto y en toda Europa desde los tiempos prehistóricos
(ALLARD, 1967). El trigo fue introducido en América en el año 1529, con la llegada de
los conquistadores españoles a Nuevo México (FELDMAN, 1976).
El origen genético del trigo constituye un ejemplo clásico de cómo especies diploides
íntimamente relacionadas entre sí pueden combinarse para dar lugar a especies
poliploides más complejas (ALLARD, 1967). Según POEHLMAN (1965), las especies
del género Triticum se pueden clasificar en diploides (2n=2x=14), tetraploides
(2n=4x=28) y hexaploides (2n=6x=42).
Las especies con 2n=28 y 2n=42 habrían
surgido por hibridación de dos o más especies con 2n=14.
Según HUANG et al. (2002), el trigo harinero hexaploide se habría originado por
hibridación entre Triticum urartu Thum, donador del genoma A, y una especie de trigo
diploide desconocida que habría aportado el genoma B. Luego de una duplicación
espontánea de los cromosomas, el híbrido estéril AB habría dado origen a la especie
tetraploide Triticum turgidum var. dicoccum (AABB). Posteriormente, se habría
producido la adición del genoma D proveniente de Triticum tauschii (Coss.), al
hibridarse éste con el tetraploide Triticum turgidum var. dicoccum, dando origen al trigo
harinero Triticum aestivum L. (AABBDD) ver Figura 1. A su vez, el trigo candeal o
Triticum durum Dest. deriva de Triticum turgidum var dicoccum (Emmer), debido a una
acumulación de mutaciones que facilitaron la separación del grano en la trilla
(POEHLMAN, 1965).
FIGURA 1. Presunta evolución del trigo a través de hibridaciones y poliploidía.
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FUENTE: Elaborado con información de HUANG et al. (2002).
Los distintos genomas que coexisten en los trigos poliploides no recombinan entre sí,
debido a la presencia del gen Phd en el cromosoma 5B. Por esta razón los poliploides se
comportan genéticamente como un organismo diploide a pesar de su complejidad
genómica (LELLEY, 1976).
2.1.2. Características botánicas
El trigo es una gramínea anual, cuyo ciclo completo de siembra a cosecha demora de
siete a diez meses, dependiendo de si se trata de variedades primaverales, alternativas o
invernales (FAIGUEMBAUM, 1987).
El trigo cultivado Triticum aestivum L., alcanza una altura entre 60 y 120 cm (HILL,
1965). Su tallo es un rizoma corto que posee de cinco a siete nudos, los nudos inferiores
están ubicados subterráneamente. Las hojas son lineares, de nervadura paralela y están
constituidas por: lámina, vaina, lígula y aurículas (LERSTEN, 1987). A partir de yemas
ubicadas en las axilas de las hojas basales, se desarrollan tallos laterales o macollos
(LEONARD y MARTIN, 1963).
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Según HILL (1965) la inflorescencia del trigo corresponde a una espiga terminal que
consta de 15 a 20 espiguillas que nacen de un eje, cada espiguilla es sésil, solitaria y
contiene de una a cinco flores. Las flores están formadas por un ovario, tres estambres y
dos lodículas que regulan la apertura de la flor durante la antesis. Todas éstas estructuras
se encuentran encerradas al interior de un par de brácteas escamosas llamadas lemma y
pálea (ALLAN, 1980).
El trigo es una planta de autopolinización y las anteras se abren antes de su salida,
produciéndose la polinización a flor cerrada. Ello conduce a la cleistogamia. Sin
embargo, existe una pequeña frecuencia de cruzamientos que normalmente no supera el
uno por ciento (ALLARD, 1967).
El desarrollo floral femenino y masculino están estrechamente sincronizados y la
diferenciación del pistilo sigue a la del estambre (ALLAN, 1980). El estigma puede
permanecer receptivo hasta por aproximadamente 13 días después de la antesis, pero el
polen es viable por un período corto que normalmente no supera los 30 minutos. El
polen sobre el estigma germina rápidamente y el tubo polínico crece dentro de los 15 a
120 minutos (ALLAN, 1980).
Según KENT (1987), el fruto del trigo corresponde a una cariópside o grano, el que se
caracteriza por ser: seco, indehiscente y monospermo. Su forma es oval y levemente
curvado en su parte dorsal. Antes de la madurez fisiológica del trigo, el grano pasa por
los estados acuoso, lechoso, pastoso y finalmente a grano seco.
El grano está formado por una cubierta del fruto o pericarpio que rodea a la semilla y se
adhiere fuertemente a la cubierta de ella. La semilla está constituida a su vez por
embrión o germen y endospermo encerrados dentro de una epidermis nucelar y de la
cubierta de la semilla, ver Figura 2 (HOSENEY, 1991).
FIGURA 2. Representación esquemática de la estructura de un grano de trigo.
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FUENTE: Elaborado con información de HOSENEY (1991).
El contenido y paredes celulares del endosperma, que corresponde al 81% del grano,
pasan a constituir la harina después del procesamiento de los granos en el molino. Las
células del endospermo están repletas de granos de almidón embebidos en una matriz
proteica, que al entrar en contacto con el agua dan lugar a la formación del gluten
(HOSENEY, 1991).
La mayor parte de la matriz proteica que rodea los gránulos de almidón corresponde al
gluten, complejo que está compuesto por dos grupos principales de proteínas: gliadinas y
gluteninas.
El gluten es sintetizado en los cuerpos proteicos al madurar el trigo.
Posteriormente, con la maduración del grano, los cuerpos proteicos se comprimen unos
con otros formando una matriz como de barro o arcilla (HOSENEY, 1991).
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2.1.3. Clasificación comercial del trigo
Son varios los tipos de trigo que se cultivan alrededor del mundo. Según ADSULE y
KADAM (1986), dentro del género Triticum hay 15 especies reconocidas, pero cerca del
90% de la producción de trigo proviene de las especies Triticum aestivum L., Triticum
compactum Host. y Triticum durum Dest.
Los trigos se clasifican comercialmente con base a características que afectan su uso en
la manufactura de diversos alimentos procesados, dentro de las cuales se encuentran:
dureza o textura del endosperma, color del grano y fuerza/ extensibilidad del gluten, ver
Cuadro 1 (PEÑA et al., 1998).
Con respecto a la dureza del endosperma, el trigo tetraploide durum (Triticum durum
Dest.), también conocido como “macarronero” “candeal” o “cristalino”; posee un
endospermo muy duro adecuado para la producción de pastas alimenticias, macarrones y
sémolas. Triticum compactum Host., por su grano de textura blanda, es utilizado en la
elaboración de galletas y productos de repostería. El trigo harinero (Triticum aestivum
L.) se clasifica en: blando, adecuado para la galletería y pastelería; y semiduro a duro,
deseable para el proceso de panificación (PEÑA et al., 1998).
En base al color de grano, Triticum durum posee granos de color ámbar, Triticum
compactum Host. de color blanco y el trigo harinero Triticum aestivum L. de color rojo y
blanco. El color de grano es especialmente importante en productos elaborados con
harina integral o en los productos conocidos como cereales de desayuno (el trigo inflado
o el trigo hojuelado), para los que se prefiere el trigo blanco (PEÑA et al., 1998).
CUADRO 1. Clasificación del trigo con base en sus características generales de calidad
y uso industrial.
Grupo de
calidad
Grupo 1
(F)
Fuerza de gluten
Fuerte/ extensible
Textura de
endosperma
Duro a semi-duro
Uso industrial
Panificación mecanizada.
Mejorador de trigos de menor
fuerza de gluten.
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Grupo 2
(M)
Medio/ extensible
Duro a semi-duro
Panificación manual y semimecanizada.
Grupo 3
(S)
Débil/extensible
Blando
Galletería y repostería.
Panificación artesanal.
Grupo 4
(T)
Medio/tenaz
Duro a semi-duro
Algunos productos de
repostería.
No panificable.
Grupo 5
(C)
(T. durum)
Fuerte/tenaz
Muy duro y
cristalino
Elaboración de pastas
alimenticias.
FUENTE: (PEÑA et al., 1998).
De acuerdo a la fuerza del gluten y a la dureza del endosperma, los trigos se clasifican
en cinco grupos: gluten fuerte/extensible con endosperma duro a semiduro (grupo 1),
gluten medio/extensible con endosperma duro a semiduro (grupo 2), gluten
débil/extensible con endosperma suave (grupo 3), gluten medio/ tenaz con endosperma
duro a semiduro (grupo 4) y gluten fuerte/ tenaz con endosperma muy duro y cristalino
(grupo 5), ver Cuadro1.
Los trigos aptos para el proceso de panificación son los que pertenecen a los grupos 1, 2
y 3. Los trigos del grupo 1 son necesarios en los procesos mecanizados de panificación,
en los cuales las masas deben tolerar el trabajo intenso al cual son sometidas. Los trigos
del grupo 2 son aptos para la producción semi-mecanizada y manual de pan a partir de
masas fermentadas (pan blanco o pan dulce moldeados manualmente y horneados sin
molde). Los trigos del grupo 3 son aptos para la panificación artesanal. Finalmente, los
trigos del grupo 4 y 5 no son panificables, ver Cuadro 1 (PEÑA et al., 1998).
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2.2. Textura del endosperma del grano
La textura del endosperma es una de las características de calidad panadera más
importantes, ya que tiene un profundo efecto en la molienda, amasado y calidad de los
productos finales. En general las harinas provenientes de trigos duros son preferidas
para la panificación y las provenientes de trigos blandos, para la elaboración de galletas
y otros productos de repostería (LILLEMO y MORRIS, 2000).
En el contexto del grano de trigo la textura es normalmente definida como “resistencia
que opone el grano a ser fracturado entre los rodillos del molino”, “propiedades de
fractura y distribución de partículas después de la molienda” o “energía requerida para
reducir el endosperma a harina” (GIROUX y MORRIS, 1997).
Las diferencias en textura del endosperma, que existen entre las distintas variedades de
trigo, se explican por diferencias en la fuerza de adherencia entre la superficie de los
granos de almidón y la matriz de proteínas dentro de las células del endosperma
(LILLEMO y MORRIS, 2000).
2.2.1. Influencia en la calidad
La textura de grano influencia el procesamiento de los granos en el molino y la calidad
de panificación de la harina. Según PEÑA (2002), tanto el tiempo de molienda como la
energía consumida para obtener harina y la cantidad de almidón dañado, son mayores
durante la molienda de trigos con endosperma duro que en la de trigos con endosperma
blando.
La proporción de almidón dañado durante la molienda puede afectar, dependiendo del
tipo de pan y el proceso de panificación, la absorción de agua, las propiedades de
manejo y los requerimientos de fermentación de la masa, así como la expansión de la
masa durante el horneado, la suavidad y textura de la miga de pan, y el tiempo de
envejecimiento (perdida de suavidad) del mismo. Estos efectos se deben a que la
absorción de agua y la utilización de los componentes del almidón, amilosa y
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amilopectina, se incrementan considerablemente cuando el almidón es dañado durante la
molienda (PEÑA et al., 1998).
Según YUFENG y FLORES (2001), un exceso de almidón dañado produce masas flojas
debido a que, los gránulos dañados hinchados liberan el agua cuando el almidón que
contienen es digerido por las alfa-amilasas, dando a la masa una textura pegajosa y
migosa. Por el contrario, cuando el porcentaje de almidón dañado es muy bajo resulta un
pan de bajo volumen y textura pesada.
Una cantidad moderada de almidón dañado es deseable en harinas para panificación
(aproximadamente 8%). En contraste, en la elaboración de galletas son deseables harinas
que absorban agua lo menos posible para evitar una reducción en la capacidad de
expansión de la galleta durante el horneado (PEÑA, 2002).
Según HOSENEY (1991), durante el procesamiento de los granos en el molino, la
textura afecta el tiempo utilizado en el proceso de acondicionamiento de los granos
(adición de agua para ablandar el endospermo y poner correoso el salvado). De esta
forma, los trigos duros son acondicionados al 16% de humedad y los trigos blandos al
15%, por lo que los trigos duros requieren mayor tiempo.
2.2.2. Proteínas modeladoras de la textura: puroindolinas
Las primeras pistas acerca de la naturaleza molecular de la variación en textura la
aportaron GREENWELL y SCHOFIELD (1986) con el descubrimiento de una proteína
de 15 KDa denominada friabilina. Esta proteína básica se encuentra en abundancia en la
membrana de gránulos de almidón purificados a partir de trigos blandos y está presente
en cantidades mucho menores en los gránulos de almidón de trigos duros. Sin embargo,
GIROUX y MORRIS (1997), afirman que las diferencias en contenido de friabilina
entre trigos duros y blandos, se debe a un fenómeno de partición o afinidad que ocurre
durante el aislamiento del almidón y no a una diferencia directa en la expresión del gen
de la friabilina entre trigos duros y blandos.
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Más tarde, MORRIS et al. (1994) demostraron que la friabilina está compuesta por dos
polipéptidos considerados como isoformas, identificados por ODA y SCHOFIELD
(1997), como las puroindolinas a y b. Las isoformas puroindolina a y b, se caracterizan
por tener una masa molecular relativamente baja de 13 KDa. Presentan un 60 % de
homología a nivel de secuencia de aminoácidos y son únicas entre las proteínas de las
plantas por poseer un dominio rico en triptofano, de carácter hidrófobo y de alta afinidad
por lípidos (GIROUX y MORRIS, 1998).
Las puroindolinas a y b, presentan diferencias en su lugar de expresión, Pina se
encuentra en el endosperma almidonoso y Pinb, principalmente en la capa de aleurona;
siendo Pina, más abundante que Pinb dentro del grano (DUBREIL et al., 1998a). Los
polipéptidos Pina y Pinb maduros, están conformados por 120 y 119 residuos,
respectivamente (GAUTIER et al., 1994). También, se observan diferencias menores en
el dominio rico en triptofano de éstos polipéptidos, el cual está conformado por los
aminoácidos: Trp-Arg-Trp-Lys-Trp-Trp-Lys (Pina) y Trp-Pro-Thr-Trp-Trp-Lys (Pinb)
(DUBREIL et al.,1998a).
Aunque la estructura tridimensional de las puroindolinas no ha sido dilucidada,
modelamientos basados en homologías estructurales a otras lipid-binding-proteinsLBPs, indican que su estructura corresponde a una lámina  y dos  hélices unidas
(DUBREIL et al., 1997).
Las puroindolinas tienen relación funcional con el grupo de proteínas de unión de lípidos
(lipid-binding-proteins), por su propiedad de interactuar con lípidos y bicapas lipídicas
(DUBREIL et al., 1998b). Estas propiedades contribuyen a explicar su localización a
nivel de la membrana amiloplástica de los gránulos de almidón, en el endosperma del
grano.
El efecto de las puroindolinas sobre la textura del grano, se expresaría durante la
maduración del grano de trigo, etapa en que los gránulos de almidón se desarrollan
rodeándose por su membrana amiloplástica. Las puroindolinas formarían anclajes con
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ésta membrana, evitando su colapso, estabilizándola y provocando que los gránulos de
almidón estén débilmente unidos a la matriz de proteínas. A su vez, en trigos duros, los
cuales presentan menor cantidad de puroindolinas activas, habría una menor capacidad
para estabilizar la membrana causando un contacto más íntimo y fuerte entre los
gránulos de almidón y la matriz de proteínas (LILLEMO y MORRIS, 2000).
2.2.3. Regulación genética
La textura de grano esta fuertemente influenciada por factores genéticos y se ha
determinado que hasta un 80% de la variación en textura está gobernada por un solo
locus mayor, llamado HARDNESS (Ha) y localizado en la parte distal de brazo corto del
cromosoma 5D (GIROUX y MORRIS, 1998).
Estrechamente ligados al locus Ha, se encuentran los genes para puroindolina a (pina) y
puroindolina b (pinb). Sin embargo, no hay evidencia directa de que los genes pin sean
el producto del locus Ha (SOURDILLE et al., 1996). En trabajos previos realizados por
GIROUX y MORRIS (1998), se determinó que la distancia genética entre el gen pinb y
el locus Ha sería de aproximadamente 4,3 cM. Además, sus resultados sugirieron que el
locus Ha, estaría compuesto de los genes pina y pinb. Los productos de éstos genes
actuarían juntos, posiblemente como un heterodímero.
LILLEMO y MORRIS (2000) afirman que la textura es heredada como un carácter
genético simple, mientras que BETTGE et al. (1995) señalan que la textura es heredada
en forma aditiva en el endosperma. Esta forma de herencia es la más aceptada.
Según LILLEMO y RINGLUD (2002), al realizar un cruzamiento entre un progenitor de
grano duro y otro de grano blando, la progenie presentará tres categorías de textura: un
grupo de textura dura (similar a la del progenitor de grano duro), un grupo de textura
intermedia y un grupo de textura blanda (similar a la del progenitor de grano blando),
ver Figura 3.
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FIGURA 3. Distribución de índices de dureza de los progenitores Avle y Kal y de la
progenie obtenida a partir de la cruza Avle x Kal.
(σ) desviación estándar, (ID) índice de dureza medido a través de Perten Singel Kernel
Characterization System (SKCS 4100). (Avle) progenitor de grano duro portador de
pinb-D1c, (Kal) progenitor de grano blando.
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FUENTE: LILLEMO y RINGLUND (2002).
2.2.4.
Composición alélica del locus Ha y fenotipo de textura de
endosperma asociado
GIROUX y MORRIS (1997, 1998) propusieron las designaciones Pina-D1a y Pinb-D1a
para las secuencias génicas pina y pinb que posee la variedad Chinesse Spring. Las
cuales, están asociadas a endosperma de textura blanda con proteínas puroindolinas
funcionales y corresponden al tipo silvestre (Cuadro 2).
CUADRO 2.
Genotipos Pin presentes en germoplasma de trigo, alteraciones
moleculares que caracterizan a las diferentes combinaciones de alelos de genes pina y
pinb con su respectivo fenotipo de grano asociado.
FUENTE: Adaptado de LILLEMO (2001).
A partir de entonces se ha descrito la existencia de una serie alélica para cada gen,
originada por mutaciones en su secuencia aminoacídica, que en el caso de Pina está
compuesta por los alelos pina-D1a y pina-D1b. El número de alelos para el gen pinb es
mayor y consta de siete alelos denominados pinb-D1a, pinb-D1b, pinb-D1c, pinb-D1d,
20
pinb-D1e, pinb-D1f y pinb-D1g (Cuadro 2) (GIROUX y MORRIS, 1997; 1998;
LILLEMO y MORRIS, 2000; LILLEMO, 2001).
La mutación pina-D1b esta caracterizada por la ausencia del transcrito y de la proteína
Pina correspondiente, en el endosperma. El origen molecular de esta mutación es
desconocida. Se ha sugerido que la disminución en el contenido total de puroindolinas a
raíz de la presencia de este alelo; causaría un aumento en el grado de interacción entre
granos de almidón y matriz proteica, incrementando la dureza del grano (LILLEMO,
2001).
FIGURA 4. Mutaciones puntuales que afectan la secuencia del gen de puroindolina b en
el dominio rico en triptofano y secuencia aminoacídica de la proteína.
FUENTE: Adaptado de LILLEMO y MORRIS (2000).
La mutación pinb-D1b (glicina-46 a serina-46) corresponde a un cambio de base de
guanina a adenina, que produce la sustitución del aminoácido glicina por serina en la
posición 46 de la secuencia (Figura 4). La rigidez introducida por el residuo serina,
dentro del dominio rico en triptofano, alteraría la conformación de la hélice y perturbaría
las habilidades de enlace del dominio con los lípidos polares presentes, por lo que la
21
interacción gránulo de almidón/matriz proteica aumentaría, cambiando el fenotipo de
grano de blando a duro (GIROUX y MORRIS, 1998).
La mutación pinb-D1c (leucina-60 a prolina-60) corresponde a un cambio de timina a
citosina, que produce la sustitución del residuo leucina por prolina, en la posición 60
(Figura 4).
El residuo prolina introduce rigidez en la hélice del dominio rico en
triptofano, por lo que causaría el mismo efecto que en la mutación pinb-D1b (LILLEMO
y MORRIS, 2000).
La mutación pinb-D1d (triptofano-44 a arginina-44) corresponde a un cambio timina a
adenina, produciendo el cambio de triptofano a arginina en la posición 44 de la
secuencia aminoacídica, correspondiente al último residuo del dominio rico en triptofano
(Figura 4). En este caso, el residuo arginina introducido alteraría las habilidades de
enlace de la proteína debido a su carga positiva (LILLEMO y MORRIS, 2000).
2.3. Herramientas biotecnológicas generales utilizadas en el
estudio de la composición alélica del locus de la textura
A partir del año 1999, en INIA Carillanca se comenzó por detectar el alelo
condicionante de la textura dura del endospermo, pinb-D1b, vía PCR. Con este avance a
nivel molecular se posibilitó la selección anticipada de genotipos portadores del gen de
interés, aumentando la eficacia en la selección (JOBET et al., 2001). Paralelamente, en
el resto del mundo se había realizado la detección de otros alelos condicionantes de
textura dura del grano: alelo nulo pina-D1b, por medio de electroforesis de proteínas
(GIROUX y MORRIS, 1998), y alelos pinb-D1c y pinb-D1d a través de la técnica
Cleaved Amplified Polimorphic Sequence-CAPS (GALANDE et al., 2001).
2.3.1. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction-PCR) fue
desarrollada por Kari Mullis a mediados de la década de los 80, por la cual le fue
22
concedido el Premio Nobel de Química (MULLIS y FALOONA, 1987). El fuerte
impacto de la técnica se debe a su simplicidad, rapidez, versatilidad y sensibilidad
(FERREIRA y GRATTAPAGLIA, 1996).
La PCR consiste en la amplificación in vitro de una secuencia específica de bases de
ADN mediante ciclos térmicos secuenciales que permiten desnaturalizar
y
posteriormente sintetizar de nuevo ADN. La técnica se basa en el empleo de la enzima
ADN polimerasa termo-estable proveniente de las especies Thermus aquaticus, T. flavis
y T. termophilus. En la reacción se utilizan partidores, que corresponden a secuencias
sintetizadas artificialmente de 18 a 24 nucleotidos, y cuya función es proporcionar un
sitio de inicio de síntesis del ADN, al aparearse con su secuencia complementaria de
ADN templado (CAMPOS, 1995).
Un ciclo PCR consta de tres etapas: desnaturación del ADN templado, hibridación de los
partidores con secuencias complementarias y por último la síntesis de ADN. En la
Figura 5, se muestra esquemáticamente las distintas etapas de la PCR. En la primera
etapa la doble hebra del ADN templado es desnaturalizada a través de la elevación de la
temperatura entre 92º y 95º C.
En la segunda etapa la temperatura es reducida
rápidamente a valores entre 35º y 60º C, dependiendo del tamaño y secuencia del
partidor utilizado, permitiendo la hibridación de los partidores con las secuencias
complementarias en una hebra de ADN templado. En la última etapa la temperatura se
eleva a 72º C y la enzima ADN polimerasa sintetiza ADN a partir de cada extremo 3’ de
los partidores. Esta síntesis envuelve la adición de nucleótidos utilizando como molde
una hebra de ADN templado, de esta manera se crea una hebra nueva, en forma similar a
lo que ocurre durante la replicación in vivo del ADN.
El ciclo puede repetirse decenas de veces y debido a que las secuencias amplificadas
duplican su cantidad en cada ciclo; la amplificación sigue una progresión geométrica de
manera que, después de 20 ciclos las secuencias amplificadas superan más de un millón
de veces la cantidad inicial (FERREIRA y GRATTAPLAGIA, 1996). Dado el elevado
nivel de amplificación alcanzado durante una reacción PCR, ésta permite la detección de
23
secuencias específicas presentes en cantidades ínfimas de una muestra de ADN de un
organismo.
FIGURA 5. Esquema representando la reacción de la polimerasa en cadena-PCR.
FUENTE: Adaptado de FERREIRA y GRATTAPAGLIA (1996).
2.3.2. Cleaved Amplified Polymorphic Sequence - CAPS
La técnica consiste en digerir fragmentos de ADN específicos amplificados por medio
de la PCR, con diversas enzimas de restricción, hasta encontrar enzimas que produzcan
un polimorfismo (variabilidad) de restricción. Lo anterior permite revelar mutaciones de
punto que afectan la secuencia de restricción de la enzima utilizada (GARCIA-MAS et
al., 2000).
24
FIGURA 6. Esquema representativo de marcadores de ADN tipo CAPS.
FUENTE: GARCIA-MAS et al. (2000).
En la Figura 6, se muestra en el lado izquierdo bandas del mismo tamaño obtenidas por
PCR en los tres individuos: A, B y H, lo que impide la diferenciación entre ellos. En el
lado derecho se muestra el polimorfismo después de digerir, se observa un sitio de corte
para la muestra A, no así en la muestra B, y la muestra H presenta los dos alelos por
tratarse de un híbrido entre A y B.
2.3.3. Electroforesis
El término electroforesis fue acuñado por Michaelis en 1909, al descubrir que las
proteínas de una mezcla se podían separar según sus puntos isoeléctricos. El principio
de la técnica se basa en la migración de una partícula cargada, sobre un medio de soporte
mas o menos inerte, por efecto de la aplicación de un campo eléctrico (MANIATIS et
al., 1981). Los medios de soporte utilizados pueden ser papel, acetato de celulosa,
agarosa, almidón y poliacrilamida, siendo los dos últimos los más utilizados
(VAZQUEZ et al., 2000).
Los geles de agarosa se utilizan comúnmente para separar fragmentos de ADN y
determinar su peso molecular, en éste caso la electroforesis se realiza en forma
25
horizontal en un campo eléctrico de dirección y voltaje constante (MANIATIS et al.,
1981). Cuando el ADN es cargado en un gel de agarosa, es forzado a migrar a través de
los espacios de la red, desde el ánodo hacia el cátodo, debido a que los residuos de
fosfato le confieren una carga neta negativa. La velocidad de migración depende de: el
tamaño molecular y conformación del ADN, tamaño del poro (otorgado por el
porcentaje de agarosa utilizado), gradiente de voltaje y tampón electroforético
(JEYANSEELAN, 1987). La visualización de los fragmentos de ADN, se realiza por
medio de la tinción con bromuro de etidio y exposición a la luz ultravioleta (MANIATIS
et al., 1981).
La electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) se utiliza normalmente para la
secuenciación del ADN y análisis de proteínas, y se realiza de forma vertical. Los geles
se elaboran con acrilamida y biscrilamida, en presencia del agente catalizador de la
polimerización, persulfato de amonio, y de una amida, que actúa como promotor
(TEMED-tetra-metil-etilendiamina) (JEYANSEELAN, 1987).
En el sistema de electroforesis desnaturante de proteínas con sistema de buffer
discontinuo (SDS-PAGE) de LAEMMLI (1970), las proteínas son desnaturadas a 100ºC
en presencia de exceso de SDS y del agente reductor DTT. Bajo estas condiciones los
polipéptidos forman un complejo con el SDS, al que se enlazan en una proporción
aproximadamente constante de 1,4 g de SDS por g de polipéptido. Como consecuencia,
los complejos SDS-proteína adoptan una conformación extendida y una densidad de
carga negativa uniforme y la tasa de migración de los complejos en el sistema
electroforético dependerá sólo del tamaño de las moléculas, de la fuerza del campo
eléctrico, de la viscosidad y temperatura del medio empleado en su separación (QUIWEI
SHI y JACKOWSKI, 1998). Una vez realizada la electroforesis los geles pueden ser
teñidos con sales de plata o con azul de comassie, observándose un perfil de bandas
(MANIATIS et al., 1981).
26
Los geles de agarosa poseen un menor poder de resolución que los de poli-acrilamida,
sin embargo, poseen un mayor rango de separación. Fragmentos de ADN entre 200 pb y
50 Kb pueden ser separados sobre geles de agarosa (MANIATIS et al., 1981).
27
3. MATERIAL Y METODO
3.1. Material
El material vegetal y de laboratorio, utilizados durante la etapa experimental de este
trabajo de tesis, se detallan a continuación.
3.1.1. Material vegetal
Se utilizaron dos grupos de materiales de diverso origen, constituidos por 21 y 93
genotipos de Triticum aestivum L., respectivamente.
Las semillas de los genotipos del primer grupo (n=21) provenían de la cosecha de la
temporada 2000-2001, obtenida por el Programa Nacional de Trigos (PNT) en el Centro
Regional de Investigación (CRI) Carillanca, del Instituto de Investigaciones
Agropecuarias (INIA). La textura de estos genotipos, había sido caracterizada
fenotípicamente mediante el método del perlado (SCHÄEFER, 2002), en la temporada
1999-2000; siendo clasificados entonces como duros a semiduros (Cuadro 3). Estos
materiales fueron empleados en el estudio para investigar la presencia de variantes
alélicas de las proteínas Pin.
Los genotipos del segundo grupo (n=92) correspondieron a una colección de líneas
avanzadas de trigo (F6) bajo evaluación agronómica en la comuna de Traiguén,
Provincia de Malleco, IX Región, conducida por el PNT con sede en el CRI Carillanca.
En la temporada 2001, se cosechó una espiga por cada línea desde las parcelas de
ensayo, se trilló manualmente cada espiga y las semillas se envasaron en bolsas de
papel.
28
CUADRO 3. Germoplasma de trigo utilizado en la estandarización de técnicas para la
detección de alelos de puroindolinas, con sus respectivos índices de dureza perlado.
Nº
Germoplasma
Indice de dureza
Textura de grano
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
KONA (P)
TUKAN (P)
DALCAHUE (P)
CAR - 3911
F9 MEINEL 23
CAR - 3934
CAR - 3935
CAR - 3938
TEMU 1032 - 97
TEMU 1042 - 97
TEMU 1049 - 97
TEMU 1056 - 97
TEMU 1067- 97
TEMU 1092 - 97
BAROUDEUR
RIVAL (P)
AMAROK
ORATORIO
DOLOMIT (P)
GASPORAL
H9 - 6330
25,8
21,2
20,02
21,5
20,4
25,0
26,2
27,5
19,3
26,4
22,3
19,0
21,3
25,1
27,0
23,0
22,9
27,4
23,4
30,8
24,3
SD
D
D
D
D
SD
SD
SD
D
SD
D
D
D
SD
SD
D
D
SD
D
B
D
(D) Grano de textura dura, (SD) grano de textura semidura y (B) grano de textura
blanda. (P) progenitores del programa de mejoramiento de INIA-Carillanca.
FUENTE:
SCHAEFER (2002).
29
3.1.2. Material de laboratorio
Los equipos utilizados correspondieron a: refrigeradores de 4ºC, congeladores de -20°C
y –80°C; estufas de incubación; baño de agua termo-regulado; termociclador modelo
480 (Perkin Elmer); espectrofotómetro modelo 6105-UV (Jenway); transiluminador UV
modelo UV20 (Hoefer); cámara electroforética vertical modelo V16-2 (Gibco BRL);
cámara
electroforética
vertical
modelo
Miniprotean
II
(BIO-RAD);
cámara
electroforética horizontal modelo 96 (BIO-RAD); fuentes de poder modelo PowerPac
3000 y 300 (BIO-RAD); horno microondas (Samsung); microcentrífuga modelo 5415
(Eppendorf); vórtex modelo VX100 (Labnet); concentrador de ADN modelo Mini
(Heto); homogenizador modelo RM14; sistema de documentación Digital Science 1D
(Kodak); cámara de flujo laminar; campana de extracción; autoclave; estufas de secado;
destilador de agua; balanza de precisión y micropipetas (Gilson).
Los materiales desechables correspondieron a: tubos de 1.7, 0.5 y 0.2 ml (Eppendorf);
puntas para micropipetas (Axygen); papel aluminio; guantes; parafilm.
Además se
utilizaron otros materiales de uso general que correspondieron a pistones plásticos
autoclavables, recipientes de aislapol, gradillas, pinzas, espátulas, material de vidrio y
plástico en general.
Los reactivos utilizados en procedimientos de laboratorio como extracciones de ADN y
proteínas, electroforesis de ADN y proteínas, PCR, análisis de restricción y otros se
detallan en el Anexo 1.
3.2. Método
Los experimentos se realizaron en el Laboratorio de Genética y Biología Molecular de la
Unidad de Biotecnología de INIA Carillanca y se dividieron en seis etapas. Primero se
estandarizaron las técnicas específicas para la detección de mutaciones en puroindolinas,
sobre el grupo de genotipos candidatos (n=21) de grano de textura dura a semidura.
Luego, fueron secuenciados los genes de puroindolinas de los progenitores de Programa
de Mejoramiento de Trigos de INIA Carillanca. Posteriormente, en base a la secuencia
30
del gen pinb mutado determinada, se diseñó un sistema de partidores para la detección
de la mutación pinb-D1d por PCR. Las técnicas estandarizadas se emplearon en la
detección de mutaciones en puroindolinas en un jardín de líneas avanzadas de trigo
(n=92). Finalmente, a través de las mediciones de textura fenotípica del grano se
realizaron comparaciones entre datos genotípicos y fenotípicos.
3.2.1. Montaje y estandarización de técnicas para la identificación de
mutaciones en genes de puroindolinas
A continuación se detallan las metodologías específicas utilizadas para la detección de
las mutaciones pina-D1b, pinb-D1b, pinb-D1c y pinb-D1d.
3.2.1.1. Identificación de la mutación pina-D1b por análisis de proteínas
Las proteínas puroindolinas fueron extraídas a través del método descrito por GIROUX
y MORRIS (1998), con modificaciones. Aproximadamente 0,05 g de harina, obtenida a
partir de la molienda de 1-2 granos de cada genotipo, se dispersaron en 1,5 mL de
tampón TBS-T (10 mM Tris·HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 1% v/v Tritón X114) y la
mezcla se agitó durante 30 minutos a 4ºC. La suspensión fue centrifugada a 7000 r.p.m.
por 5 minutos, el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se incubó a 37ºC por 30
minutos. Luego, se centrifugó durante 5 minutos a 7.000 r.p.m., se recuperó la fase rica
en detergente y se adicionó 1 volumen de TBS 1%(v/v) TX-114 (200 μL). La mezcla se
mantuvo en agitación a 4ºC por 30 minutos y después de centrifugar a 7.000 r.p.m. por 5
minutos se eliminó la fase superior. La precipitación de proteínas se realizó agregando a
la fase inferior acetona al 80% v/v (800 μL), posteriormente se agitó las muestras en
vórtex por 2 minutos y se centrifugaron a 7000 r.p.m. por 30 minutos. Una vez lavados
los pellets con 1000 μL de acetona, fueron secados dejando los tubos boca abajo sobre
papel absorbente. Las proteínas fueron resuspendidas en 20 μL de TBS, para lo cual
fueron calentadas en baño maría a 65ºC por 30 minutos. Finalmente se adicionó 20 μL
de buffer de muestra (20% SDS; 34,8% glicerol; 0,02% azul de bromofenol; 0,08 M trisHCl pH8,0).
31
Las subunidades de proteínas, fueron separadas mediante electroforesis vertical en gel
de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE) de acuerdo a LAEMMLI (1970).
Se utilizó una cámara de electroforesis Mini Protean III (BioRad) con capacidad para
dos minigeles de 0.75 mm de espesor, 80 mm de ancho y 60 mm de alto. Utilizando
peinetas de diez dientes fue posible analizar hasta 18 muestras por corrida.
El gel concentrador contenía 5% de los monómeros (acrilamida y bisacrilamida,
C=2,6%); 0,125 M Tris·HCl pH 6,8 y 0,1% p/v SDS. La polimerización se inició con la
adición de 0,05% p/v persulfato de amonio y 0,1% v/v de TEMED. Para la elaboración
de los geles separadores, se probaron distintas concentraciones de monómeros, las que
fluctuaron desde 12% a 17,56% (C=2.6%).
Los geles contenían además 0,375 M
Tris·HCl pH 8,8; 0,1% SDS y la polimerización se inició por adición de 0,05%
persulfato de amonio y 0,06% v/v de TEMED.
Las electroforesis se corrieron a 25 mA por gel, empleando un buffer de corrida 1X (25
mM Tris HCl pH 8,3; 250 mM glicina y 0,1% p/v SDS), diluido a partir de un stock 5X.
Finalmente, las bandas de proteínas fueron teñidas utilizando el método de LAEMMLI
(1970), que consistió en agitar el gel durante 1 hora en la solución colorante (10% v/v
ácido acético glacial, 45% v/v metanol y 0,25% p/v azul de Coomasie R-250) y luego en
la solución decolorante (75% v/v metanol y 25% v/v ácido acético) hasta obtener una
reducción completa del fondo. Los geles desteñidos se almacenaron en glicerol al 10%
v/v y fueron fotografiados con sistema de documentación Kodak 1D.
3.2.1.2. Identificación de la mutación pina-D1b por PCR alelo-específica
El ADN utilizado en PCR fue extraído a partir de hojas jóvenes de trigo según el
procedimiento de DOYLE y DOYLE (1987), modificado por la inclusión de
polivinilpirrolidona en el buffer de extracción. El tejido se sumergió brevemente en
nitrógeno líquido y se redujo a polvo con la ayuda de un pistón plástico estéril accionado
por un motor de taladro. El polvo se dispersó en 500 μL de tampón de extracción (2%
CTAB; 0,4% v/v β-mercaptoetanol; 0,28% p/v NaHSO4 y 16 mM NaOH, 1%PVP)
32
precalentado a 65ºC, se adicionaron 50 μL de mezcla cloroformo: alcohol isoamílico
24:1 y se agitó la muestra 3 minutos en vórtex. Se incubó los tubos a 65ºC por 30
minutos en baño maría mezclando ocasionalmente.
Posteriormente, se agregó 1
volumen (500 μL) de cloroformo: alcohol isoamílico 24:1 y se mezcló durante 5 minutos
por inversión. Se centrifugó a 14.000 r.p.m. por 5 minutos, se recuperó la fase superior
(400 μL), la que fue transferida a un nuevo tubo. La precipitación de ADN se realizó
agregando 2,5 volúmenes (1000 μL) de etanol 96° y mezclando con suavidad hasta la
formación de pellet. Para recuperar el ADN, se centrífugo a 14.000 r.p.m por 5 minutos
y se eliminó el sobrenadante, para más tarde secar el pellet de ADN al vacío por 10
minutos. Finalmente, el ADN fue resuspendido toda la noche a 4ºC en 400 μL de TE
(10 mM Tris·HCl pH 8,0; 1 mM EDTA). Para verificar la calidad del ADN extraído, se
realizó una electroforesis en geles de agarosa al 1%. Posteriormente las concentraciones
de ADN fueron cuantificadas por espectrofotometría, considerando que una unidad de
absorbancia a 260 nm (1A 260) es igual a 50 ng ADN/μL. Las concentraciones fueron
estandarizadas a 50 ng ADN/μL a través de dilución.
Para la amplificación PCR del gen pina, se utilizaron los partidores reportados por
GAUTIER et al. (1994), cuyas secuencias nucleotídicas fueron:
Pina-L
(5’ATG AAG GCC CTC TTC CTC A3’)
Pina-R
(5’TCA CCA GTA ATA GCC AAT AGT G’3)
Para las reacciones, se utilizó una concentración de ADN de 100 ng, 3 mM MgCl2, 250
μM dNTP, 0,4 μM de cada partidor, 10% v/v glicerol y 0,125 U de Taq Polimerasa, para
un volumen final de 25 μL (GAUTIER et al., 1994). La PCR consistió en un tiempo
inicial de desnaturación de 4 minutos a 94°C, luego 35 ciclos con un tiempo de
desnaturación del ADN de 30 segundos a 94°C, una temperatura de apareamiento de
partidores de 60°C, un período de elongación de 1 minuto a 72°C y un período de
elongación final de 7 minutos (GAUTIER et al., 1994).
33
Posteriormente, los productos PCR fueron separados por medio de electroforesis en
geles de agarosa al 1% utilizando el método de MANIATIS et al. (1981). Se utilizó
TBE 0,5X (89 mM Tris·HCl pH 8,0; 2,5 mM EDTA; 89 mM ácido bórico) tanto para la
corrida electroforética como para la elaboración de los geles. Las preparaciones de
ADN y productos PCR fueron mezclados con buffer de carga (30% v/v glicerol;
0,0025% p/v azul de bromofenol en TE) en una concentración de 10% v/v, para ser
depositados en los pocillos de los geles. La electroforesis se realizó a 80 V en una
cámara horizontal hasta que el frente de migración estuvo a 1 cm del borde del gel. Se
utilizó como marcador de peso 1 Kb plus (Gibco). Luego de teñir el gel en una solución
de bromuro de etidio (0,5 μg/mL), las bandas de ADN fueron visualizadas en un
transiluminador de luz ultravioleta y finalmente fotografiadas con sistema de
documentación Kodak 1D.
EL tamaño de fragmento esperado fue de 450 pb
aproximadamente.
3.2.1.3. Identificación de la mutación pinb-D1b por PCR alelo-específica
El ADN utilizado correspondió al extraído según lo descrito en el punto 3.2.1.2. Para la
amplificación del alelo Pinb-D1b mediante PCR alelo-específico se utilizaron los
partidores reportados por GIROUX y MORRIS (1997), cuyas secuencias nucleotídicas
fueron:
HRD 1
5’ATG AAG ACC TTA TTC CTC CTA3’
HRD 2
5’CTC ATG CTC ACA GCC GCC3’
HRD 3. 5’CTC ATG CTC ACA GCC GCT3’
Las reacciones PCR se realizaron en un volumen final de 25 μL. La mezcla de reacción
contenía una concentración de 100 ng de ADN; 2 mM MgCl2; 20 μM dNTP (dATP,
dTTP, dCTP, dGTP); 0,2 μM de cada oligonucleótido partidor específico; 1% cresol
sacarosa; y 0,625 U de Taq Polimerasa por cada reacción (GAUTIER et al., 1994). Las
condiciones utilizadas en la PCR consistieron en una desnaturación inicial de 4 minutos
34
a 94°C, a continuación 35 ciclos que consideraron: una etapa de desnaturación a 94°C
por 30 segundos, hibridación a 60°C por 30 segundos y síntesis de ADN a 72°C por 45
segundos. Al término del último ciclo de amplificación se programó una etapa de
síntesis final por 7 minutos a 72°C (GAUTIER et al., 1994).
Los productos PCR fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%
de acuerdo a la metodología detallada en el punto 3.2.1.2 y fotografiados con sistema de
documentación Kodak 1D. El tamaño de fragmento esperado para ambas combinaciones
de partidores fue de 250 pb.
3.2.1.4. Identificación de la mutación pinb-D1c por CAPS
El ADN utilizado correspondió al extraído según lo descrito en el punto 3.2.1.2. Para la
identificación del alelo pinb-D1c, se realizó PCR del segmento genómico
correspondiente al gen pinb y su posterior digestión con la enzima PvuII. Para la
amplificación del gen pinb por PCR se utilizó los partidores reportados por GAUTIER et
al. (1994), cuya secuencia nucleotídica correspondió a:
Pinb-L
(5´ATG AAG ACC TTA TTC CTC CTA3’)
Pinb-R
(5´TCA CCA GTA ATA GCC ACT AGG GAA3’)
Para las reacciones PCR, se utilizó una concentración de ADN de 100 ng, 3 mM MgCl2,
250 μM dNTP, 0,4 μM de cada partidor, 10% v/v glicerol y 0,125 U de Taq Polimerasa,
para un volumen final de 25 μL (GAUTIER et al., 1994). La PCR consistió en un
tiempo inicial de desnaturación de 4 minutos a 94°C, luego 35 ciclos con un tiempo de
desnaturación del ADN de 30 segundos a 94°C, una temperatura de apareamiento de
60°C, un período de elongación de 1 minuto a 72°C y un período de elongación final de
7 minutos (GAUTIER et al., 1994).
Posteriormente, los productos PCR fueron
separados por medio de electroforesis en geles de agarosa al 1% de acuerdo a la
metodología descrita en el punto 3.2.1.2.
35
La restricción del fragmento pinb amplificado por PCR se realizó según el método de
LILLEMO y MORRIS (2000). Fueron digeridos 10 μL de producto PCR pinb a 37ºC,
con 2 unidades de la enzima PvuII, en un volumen final de 30 μL. La endonucleasa
PvuII proviene de la bacteria Proteus vulgaris y su sitio de corte corresponde a:
5´…(CAG*CTG…3´)
3´…(GTC*GAC...5´)
Se probaron tiempos de digestión de: 2; 2,5 y 3 horas. Hasta obtener una total digestión
del ADN. Los productos obtenidos de la digestión enzimática, fueron separados por
electroforesis en geles de agarosa al 1,5% según la metodología descrita en el punto
3.2.1.2.
El tamaño esperado del fragmento correspondiente al gen pinb fue de aproximadamente
448 pb y el de los fragmentos derivados del corte de la enzima de restricción fue de 264
y 184 pb.
3.2.1.5. Identificación de la mutación pinb-D1d por CAPS
Para la identificación del alelo pinb-D1d, el fragmento correspondiente al gen pinb fue
amplificado de acuerdo a lo descrito en el punto 3.2.1.2 y luego fue digerido a 37ºC por
16 horas con 2 unidades de las enzimas de restricción MnlI y StyI, en buffer G+
(LILLEMO y RINGLUND, 2002).
La enzima MnlI proviene de Moxarella nonliquefaciens y su sitio de corte corresponde
a:
5’...(CCTC (N)7 *...3’)
3’...(GGAG (N)6*…5’)
La enzima StyI, proviene de Escherichia coli RFL130 y su sitio de corte corresponde a:
36
5’...(C*CTTGG...3’)
3’...(GGAAC*C…5’)
Los productos originados a partir de la digestión enzimática fueron separados en geles
preparados en concentraciones de 10% bis-acrilamida; 0,05% persulfato de amonio y
0,05% TEMED. Se utilizó un stock de bis-acrilamida al 10%, en proporción 19:1
acrilamida: biasacrilamida en TBE 1X. Las muestras de ADN fueron mezcladas con
buffer de carga (30% v/v glicerol; 0,0025% p/v azul de bromofenol en TE) en
proporción 20% v/v. Se utilizó como buffer de corrida TBE 1X, la electroforesis fue
realizada a 40 V y fue detenida cuando el frente de migración estuvo a 2 cm del borde
del gel. Posteriormente, los geles fueron teñidos con bromuro de etidio (0,5 μg/mL),
visualizados en transiluminador UV y fotografiados con sistema de documentación
Kodak 1D (MANIATIS et al., 1981).
El alelo mutado pinb-D1d origina fragmentos de 115 pb, 84 pb, 66 pb, 48 pb, 29 pb, 28
pb, 25 pb, 22 pb, 20 pb, 5 pb, 5 pb y 3 pb. El alelo pinb-D1a origina fragmentos de 137
pb, 84 pb, 66 pb, 48 pb, 29 pb, 28 pb, 25 pb, 20 pb, 5 pb, 5 pb y 3 pb.
3.2.2. Secuenciación de genes de puroindolinas en progenitores del
Programa de Mejoramiento de Trigo de INIA-Carillanca
Los genes pina y pinb fueron amplificados por PCR utilizando la metodología descrita
en los puntos 3.2.1.2 y 3.2.1.4. El volumen final de la reacción fue de 100 μL y se
realizó una repetición por muestra para descartar variación en la secuencia obtenida
debido a errores de la enzima Taq Polimerasa.
Posteriormente, los productos PCR fueron purificados, para lo que se corrió un gel
preparativo de agarosa al 1%, cargando el volumen total de la reacción (90 μL), el gel
fue teñido por 15 minutos en bromuro de etidio (0,5 μg/mL) recién preparado y fue
visualizado en transiluminador con luz UV. Luego, se recortó la banda de pina y pinb
del gel preparativo de agarosa por medio de un bisturí estéril, con el objetivo de aislar la
37
banda y excluir ADN genómico, impurezas y ARN. La banda de agarosa extraída fue
molida por medio de una jeringa, se agregó ½ volumen de TE y ½ volumen de fenol
equilibrado en TE y se mezcló por 1 minuto. Luego de congelar en nitrógeno líquido
por 5 minutos, se dejó descongelar a temperatura ambiente y se centrifugó por 5 minutos
a 14.000 r.p.m., posteriormente se traspasó la fase acuosa a un nuevo tubo y se precipitó
el ADN con 2,5 volúmenes de etanol. Se centrifugó por 5 minutos a 14.000 r.p.m., se
lavó el pellet con etanol acetato de amonio y se secó por 5 minutos en secador mini de
ADN, finalmente el fragmento fue resuspendido en 25 μL de TE. El fragmento PCR
purificado, fue ligado al vector de clonación PGEM-T easy (Promega), para lo que se
utilizó una proporción molar fragmento: vector de 3:1. Para la ligación se mezcló en un
tubo: 0,5 μL de ligasa; 2,5 μL buffer 2x y agua destilada para un volumen final de
reacción de 5 μL. La ligación se mezcló suavemente y se dejó reposar toda la noche a
4°C.
Para la preparación de células competentes de Escherichia coli DH5α se utilizó el
protocolo basado en tratamiento de células con CaCl2 (COHEN et al., 1972). Todos los
pasos fueron realizados en ambiente estéril. Se inoculó una colonia de células de
Escherichia coli DH5α (Promega) en 3 mL de caldo LB y se dejó crecer a 37°C con
agitación toda la noche. Al día siguiente se inoculó 50 mL de medio LB fresco con 200
μL de precultivo y se continuó la incubación en las mismas condiciones, cuando se logró
una densidad óptica de 0,5 a 600 nm, se enfrió el medio de cultivo en hielo por 10
minutos.
Las células se cosecharon por centrifugación a 7.000 r.p.m. durante 10
minutos a 4°C. Se eliminó el sobrenadante.
El sedimento celular se resuspendió
suavemente en 2 a 5 ml de CaCl2 100 mM frío y estéril. Se agregó 50 ml de CaCl2, las
células se mantuvieron en hielo con la solución de calcio por 1 hora, y se cosecharon
nuevamente por centrifugación.
Se eliminó el sobrenadante, las células se
resuspendieron suavemente en 2 a 2,5 mL de CaCl2 100 mM estéril. Las células se
almacenaron 24 horas a 4°C.
Luego, se realizó la transformación de células de Escherichia coli DH5α competentes.
Se tomaron 5 μL de cada reacción de ligación preparada y se depositaron en tubos de 1,5
38
mL. Se agregó 100 μL de células Escherichia coli competentes, se pusieron en hielo por
30 minutos, luego por 1 minuto a 42°C y posteriormente 5 minutos en hielo. Luego se
agregó 1 mL de medio LB estéril y se mantuvo en agitación a 37°C por 1 hora. Se
sembró 100 μL de células en placas petri con agar LB suplementado con 60 μg/mL de
carbenicilina, 0,04% p/v IPTG y 0,02% p/v X-GAL. Se dejó crecer las colonias toda la
noche a 37°C.
Para verificar que las colonias eran transformantes, se realizó una PCR directa a partir de
ADN plasmidial crudo para detectar los genes pina o pinb. Se tomó una porción de
colonia y se centrifugó a 10.000 r.p.m. por 1 minuto. Se tomó 1 μL del sobrenadante y se
realizó la PCR para los genes pina o pinb, según lo descrito en los puntos 3.2.1.2 y
3.2.1.4, respectivamente. Los productos PCR fueron separados por medio de
electroforesis en geles de agarosa al 1% y visualizados por medio de luz UV.
Las minipreparaciones de DNA de Escherichia coli se realizaron de acuerdo a un
método modificado del protocolo estándar de lisis alcalina de BIRNBOIM y DOLY
(1979) para lo cual las colonias recombinantes fueron subcultivadas en tubos
conteniendo 3 mL de caldo LB suplementado con carbenicilina, luego de lo cual fueron
mantenidas en agitación a 37°C toda la noche. Al día siguiente se centrifugaron los
tubos de 1,5 mL con el cultivo respectivo a 10.000 r.p.m por 1 minuto. Se eliminó el
sobrenadante dejando secar los tubos boca abajo sobre papel absorbente. Los pellet
fueron resuspendidos en 100 μL de solución I (50 mM glucosa; 25 mM Tris HCl pH 8,0;
10 mM EDTA pH 8,0; estéril) y mantenidas por 15 minutos en hielo. A continuación, se
adicionó 200 μL de solución II (0,2 N NaOH; 1% SDS), mezclando por inversión, para
luego incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se agregó 150
μL de solución III (5 M acetato de potasio; 11,5% v/v ácido acético glacial) fría para ser
mantenidas por 30 minutos en hielo. La mezcla de lisis se centrifugó 5 minutos a 10000
r.p.m., el sobrenadante acuoso fue transferido a otro tubo, para ser tratado con 10 μL de
solución ARN-asa (10 mg/mL), durante 30 minutos a 37°C.
Posteriormente se
desnaturalizaron las proteínas con la adición de un volumen equivalente de la mezcla
fenol: cloroformo: alcohol isoamilico (25:24:1) saturado con tampón TE. Los tubos
39
fueron agitados con un vórtex y centrifugados a 10.000 r.p.m. por 5 minutos para separar
las fase orgánica y acuosa (inferior y superior, respectivamente).
Una vez fueron
separadas, se transfirió la fase acuosa a otro tubo y se mezcló con un volumen
equivalente de la mezcla cloroformo: alcohol isoamilico (24:1), se repitió el tratamiento
de agitación y centrifugación anterior. La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo y el
ADN se precipitó con la adición de 2,5 volúmenes de etanol absoluto. El tubo se dejó
reposar 30 minutos a –20°C y luego se centrifugó a 10000 r.p.m. durante 20 minutos.
Finalmente el ADN se lavó con etanol al 70%, fue secado al vacío y resuspendido en
100 μL de TE. Se verificó la calidad del ADN realizando electroforesis en geles de
agarosa al 1%. El ADN plasmidial fue posteriormente purificado utilizando el kit
Concert® (Rapid Plasmid DNA System).
El servicio de secuenciación de ADN fue contratado en la Universidad Católica de
Chile. Los plasmidios fueron secuenciados con el sistema BigDye® Terminator Cycle
Sequencing v.2.0 y se utilizaron los partidores universales M13 directo y reverso,
empleándose un equipo automático ABI PRISM 310. Finalmente, las secuencias fueron
comparadas con la secuencia publicada del gen pinb (accesión GenBank X69912) y
fueron analizadas en el laboratorio por medio del software BioEdit Sequence Alignment
Editor (HALL, 1999).
3.2.3. Diseño de sistema PCR para la detección de la mutación pinbD1d en base a la secuencia del gen pinb mutado obtenida
Las actividades realizadas para este fin, consistieron en: diseño de partidores y
optimización de condiciones de amplificación.
3.2.3.1. Diseño de partidores
Se utilizó el programa computacional Oligo 4.1 (RYCHLIK, 1989) y la secuencia
completa del gen pinb mutado obtenida a partir de la secuenciación (punto 3.2.5). Se
buscaron secuencias de 21 bases complementarias a la región de la mutación, en el sitio
40
de cambio de triptófano por arginina. Se diseñaron 2 partidores: uno directo (Pind-F) y
uno reverso (Pind-R), para ser utilizados en combinación con los partidores Pinb-L,
Pinb-R y HRD1, ya descritos y disponibles en el Laboratorio. Las combinaciones
utilizadas fueron: Pind-F/ Pinb-R; Pind-R/ Pinb-L y Pind-R/ HRD1. El proveedor de los
partidores diseñados fue BIOS-CHILE.
3.2.3.2. Optimización de condiciones PCR
La optimización de la amplificación, consistió en la variación de concentraciones de
partidores, cloruro de magnesio y dNTP, así como en la variación en la temperatura de
apareamiento de los partidores y el número de ciclos de la PCR.
Para la combinación de partidores Pind-F/Pinb-R y Pinb-L/Pind-R se mantuvieron
constantes las concentraciones: 50 ng de ADN; 3 mM MgCl2; buffer 1X, 10% glicerol;
0,125 U de Taq Polimerasa, para un volumen final de reacción de 25 μL. Se probaron
concentraciones de: 0,4 μM Pinb-L/0,4 μM Pind-R y 0,4 μM Pinb-L/0,2 μM Pind-R,
concentraciones de 10 μM, 20 μM, 100 μM y 200 μM de dNTP, y temperaturas de
apareamiento (Ta) de partidores de 55ºC, 60°C, 63°C, 66ºC, 70ºC, 72ºC.
Para la
combinación Pind-R/ HRD1 se utilizó las mismas condiciones del párrafo anterior pero
además las descritas en el punto 3.2.1.3, se probaron temperaturas de apareamiento de
partidores de 55ºC, 60°C, 63°C y 66°C, y se realizaron amplificaciones PCR de 32 y 35
ciclos.
3.2.4. Identificación de mutaciones en genes de puroindolinas en un
jardín de líneas avanzadas de trigo
Se analizó molecularmente 113 genotipos de trigo, para las variantes alélicas: pina-D1b,
pinb-D1b y pinb-D1c. Para la detección del alelo pina-D1b se utilizó la amplificación
PCR del fragmento correspondiente al gen pina (ver punto 3.2.1.2). El alelo pinb-D1b
fue detectado por medio de PCR alelo específico (ver punto 3.2.1.3). Finalmente, el
41
alelo pinb-D1c fue detectado a través de la digestión del fragmento amplificado por PCR
correspondiente al gen pinb, con la enzima PvuII (ver punto 3.2.1.4).
3.2.5. Caracterización fenotípica de la textura del grano de un jardín
de líneas avanzadas de trigo
Fueron triturados 15 g de granos por genotipo de trigo en un molino modelo SPM 500/
A (Seedburo). El producto de la molienda fue pasado a través de tamices de: 0,5 y 0,08
mm, luego fue almacenado en bolsas plásticas para su análisis en el mismo día.
Las mediciones de textura fueron realizadas colocando 10 g de muestra previamente
procesada, en la cubeta de medición de un equipo Inframatic 8600 (Perten). El equipo
había sido previamente calibrado para la medición de textura por personal de
laboratorio, utilizando un grupo de muestras con índices de dureza conocidos. Una vez
realizadas las lecturas el valor entregado correspondió directamente a los índices de
dureza, los cuales son inferiores a 25 en granos de textura dura, entre 25 y 29 en trigos
de textura intermedia y mayores a 30 en caso de granos de textura blanda.
3.2.6. Comparación de datos genotípicos y fenotípicos de textura de
grano
Se realizaron comparaciones entre datos de textura genotípicos, derivados del análisis
molecular de mutaciones, y fenotípicos, correspondientes a los índices de dureza
obtenidos.
Los datos de índices de dureza fueron agrupados en tres categorías: los mayores a 30
correspondieron a la categoría de textura blanda, los agrupados entre 25 y 29 a la de
textura intermedia y los menores a 25 a la de textura dura. Luego los datos fueron
separados por clases, las que correspondieron a rangos de índice de dureza de: 17,00 a
17,9; 18 a 18,9 hasta llegar a valores de 30.
42
Para la comparación de datos, se utilizaron gráficas de frecuencias que relacionaron el
número de genotipos por categoría de textura, tanto para el grupo de genotipos
portadores de mutaciones como para el de no portadores. Además, se comparó la
frecuencia de genotipos y su distribución de acuerdo a las clases de índice de dureza
definidas, para cada mutación. Finalmente se obtuvo los promedios de índice de dureza
por mutación.
43
4. PRESENTACION Y DISCUSION DE
RESULTADOS
4.1.
Montaje y estandarización de técnicas para la
identificación de mutaciones en genes de puroindolinas
Las técnicas para la detección de las mutaciones pina-D1b, pinb-D1c y pinb-D1d fueron
montadas y estandarizadas, lo que posibilitó la identificación de estas mutaciones dentro
del grupo de genotipos candidatos de grano duro a semiduro analizados.
Para la
detección del alelo pina-D1b, se optimizó un protocolo de extracción de proteínas a
partir de un solo grano de trigo además de las condiciones de separación de bandas
mediante eletroforesis. Adicionalmente se cuenta con un sistema PCR para el alelo que
previamente no había sido reportado en la literatura. Los alelos pinb-D1c y pinb-D1d
fueron identificados con las metodologías de CAPS, propuestas por la literatura, con
leves modificaciones. Los resultados de cada metodología se detallan a continuación.
4.1.1. Identificación de la mutación pina-D1b por análisis de proteínas
Debido a que el método de GIROUX y MORRIS (1998) fue diseñado para la
purificación de puroindolinas a escala preparativa, se adaptó y optimizó el método para
emplearlo en el estudio de líneas avanzadas, donde a menudo la cantidad de semillas
disponibles para análisis es limitado.
El proceso de optimización de extracción de puroindolinas, consistió en la reducción
sistemática de las cantidades finales de reactivos y material vegetal utilizado.
Inicialmente, los volúmenes fueron adaptados a tubos de centrifuga de 50 mL y se
utilizó una proporción de 1 g de harina por 30 mL de TBS 1% TX114 obteniéndose una
44
abundante precipitación de proteínas.
Finalmente, debido a la alta eficiencia de
extracción proteica, la proporción utilizada correspondió a 0,05 g de harina por 1,5 mL
de TBS 1% TX114. De esta forma, el método quedó estandarizado para ser realizado en
micro-tubos de 1,5 mL y sobre muestras de harina obtenidas a partir de un solo grano de
trigo. El proceso total de extracción no abarcó más de 4 horas.
Las proteínas solubles en el detergente TX-114 fueron separadas a través de
electroforesis en geles de poliacrilamida, observándose el perfil característico de esta
fracción proteica (Figura 8). Según DOULIEZ et al. (2000) el componente mayoritario
de estas proteínas son puroindolinas (bandas de 13 KDa), purotioninas y algunos
inhibidores de amilasa.
Las mejores condiciones de separación y visualización de bandas de proteína se lograron
utilizando geles a concentraciones de poliacrilamida superiores al 15%, las que son
mayores a lo descrito por GIROUX y MORRIS (1998). El óptimo correspondió a geles
elaborados al 17,56% de poliacrilamida y un entrecruzamiento de C=2,6%, lo que
permitió resolver la fracción correspondiente a las puroindolinas, en la zona de 13-15
Kda (Figura 7).
De acuerdo a LILLEMO (2001), la mutación pina-D1b produce una ausencia total de
puroindolina a en el grano de trigo. Por lo tanto, al analizar el perfil de bandas de
proteínas solubles en TX-114 en un gel de poliacrilamida, el alelo nulo pina-D1b se
evidencia por la ausencia de la banda de puroindolina a (Figura 8). En los resultados
experimentales se observó ausencia de la banda puroindolina a en 5 genotipos de los 21
analizados. Estos materiales correspondieron a: Dalcahue-INIA (3), Car-3911(4), Temu
1032-97(9), Temu 1056-97(12) y 1067-97(13), ver Figura 8.
FIGURA 7.
Optimización de porcentaje de poliacrilamida para la separación de
proteínas solubles en TX-114.
45
Izquierda: gel de poliacrilamida al 15%. Derecha: gel de poliacrilamida al 17,56%. (M)
marcador de peso molecular, (A) banda correspondiente a la sub-unidad de puroindolina
a, (B) banda correspondiente a la sub-unidad de puroindolina b.
FIGURA 8. Detección de la mutación pina-D1b por fraccionamiento de proteínas
solubles en TX-114, en gel de poliacrilamida al 17,56%, para 17 genotipos de grano
duro.
46
(M) marcador de peso, (A) banda correspondiente a la sub-unidad de puroindolina a, (B)
banda correspondiente a la sub-unidad de puroindolina b. (
→)
Indica el tipo de perfil
característico del alelo pina-D1b. (17) Cv. Chinese Spring con puroindolinas no
mutadas, (3) Dalcahue-INIA, (4) Car-3911, (9) Temu 1032-97, (12) Temu 1056-97 y
(13) 1067-97.
Con respecto a la banda de puroindolina b, esta fue observada en todos los genotipos
estudiados y parecería que el alelo nulo para puroindolina b no está presente en la
muestra de genotipos duros estudiados.
Según LILLEMO y MORRIS (2000), la
mayoría de las mutaciones presentes en el gen pinb sólo afectan la función de la
proteína, con excepción de los alelos pinb-D1e (Trp 39 a codón de término), pinb-D1f
(Trp 44 a codón de término) y pinb-D1g (Cys 56 a codón de término), que causarían una
nula producción de puroindolina b en el endosperma y fenotipo de grano duro.
4.1.2. Identificación de la mutación pina-D1b por PCR alelo-específica
Los resultados de la extracción de ADN realizada se muestran en la Figura 9A. El ADN
genómico corresponde a la banda ubicada sobre las 12.000 pb del marcador de peso, se
observó bajas proporciones de ARN y degradación de ADN. El rendimiento medio de
extracción fue de 43 μg de ADN, con valores mínimos y máximos de 31,2 y 56 μg,
respectivamente. Con el propósito de evitar variaciones en los resultados de las
amplificaciones a consecuencia de la variación en la concentración de ADN, las
muestras se diluyeron a 50 ng/μL en agua destilada estéril.
FIGURA 9. Perfil electroforético en gel de agarosa al 1% de ADN extraído a un grupo
de genotipos y productos PCR pina para repeticiones del cultivar de grano blando
Chinese Spring.
47
(M) 1 kb plus. (A) Extracciones de ADN de las muestras (1) cv. Chinese Spring (2) cv.
Tukan-INIA (3) cv. Kona-INIA (4) cv. Dolomit (5) cv. Rival. (B) PCR para gen pina, (-)
control negativo o no portador del alelo (+) control positivo o portador de alelo pinaD1b.
La reacción PCR para el gen pina bajo las condiciones propuestas por GAUTIER et al.
(1994) amplificó fragmentos del tamaño esperado de 450 pb, observándose una alta
intensidad de banda y ausencia de productos de amplificación inespecífica (Figura 9B).
La metodología fue probada sobre ADN proveniente de 20 plantas diferentes del cultivar
Chinese Spring, caracterizado por poseer grano de textura blanda y puroindolinas no
mutadas (NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION (NCBI),
2003). Se observó amplificación del fragmento en todas las muestras, de acuerdo con lo
esperado (Figura 9B).
Posteriormente se analizó el grupo de genotipos de grano duro a semiduro. Se observó
que aquellos genotipos clasificados previamente como portadores de la mutación pinaD1b mediante análisis de proteínas (gel PAGE-SDS, parte superior de la Figura 10), no
dieron el producto de amplificación esperado (gel de agarosa, parte inferior de la Figura
10).
Con el objeto de iniciar estudios de validación del método PCR como una alternativa a
la detección de la mutación pina-D1b mediante el análisis PAGE-SDS en el Programa
de Fitomejoramiento de Trigo, se evaluaron ambos métodos en una muestra de la
población doblehaploide derivada de la cruza Renan x Dalcahue-INIA. En estos
48
experimentos preliminares se demostró que la ausencia de la proteína Pina cosegrega
completamente con la ausencia del producto de amplificación del gen pina (resultados
no mostrados).
Este sistema de PCR para el gen pina, había sido publicado por GAUTIER et al. (1994),
con el objetivo de estudiar la secuencia del gen. Posteriormente, fue utilizado por
GAUTIER et al. (2000), para detectar la presencia del gen en ancestros diploides del
trigo (GAUTIER et al., 2000), pero no había sido reportado como un método de
identificación del alelo nulo pina-D1b.
La ausencia de amplificación del gen pina por PCR en genotipos portadores de la
mutación podría tener diversas causas, como: inserción de una secuencia de ADN tipo
tranposón dentro de la secuencia del gen pina, modificación de la secuencia de ADN
justo en la zona de unión de los partidores o simplemente que el gen haya sido
eliminado, tema que aún no ha sido dilucidado.
FIGURA 10. Detección del alelo nulo pina-D1b a través de SDS-PAGE y de PCR pina.
Superior: gel PAGE-SDS al 17,56% de puroindolinas de los genotipos 1 al 15, de
textura dura a semidura; Inferior: Gel de agarosa al 1% de productos del análisis PCR
del gen pina en los mismos genotipos mencionados. Los genotipos con asterisco son
49
portadores de la mutación pina-D1b. (M) marcador de peso, (A) banda correspondiente
a la sub-unidad de puroindolina a, (B) banda correspondiente a la sub-unidad de
puroindolina b. (
→) Perfil característico del alelo pina-D1b.
4.1.3. Identificación de la mutación pinb-D1b por PCR alelo-específica
Los resultados de la aplicación de la metodología, que había sido previamente
optimizada en INIA-Carillanca a partir de aquella propuesta por GAUTIER et al.
(1994), se muestran en la Figura 11. La mutación pinb-D1b se reconoció por la
amplificación de un fragmento de 250 con los partidores alelo-específicos HRD1 y
HRD3 y, complementariamente, por la ausencia de un producto de amplificación de 250
pb con los partidores HRD1 y HRD2 (Figura 11).
FIGURA 11. Perfil electroforetico en geles de agarosa al 1% de PCR alelo pinb-D1b
positivo y negativo para 17 genotipos estudiados.
Superior: producto PCR alelo específico pinb-D1b para los genotipos de textura dura a
semidura 1 al 17. Inferior: producto PCR para la secuencia complementaria a la
mutación pinb-D1b, en los mismo genotipos del panel superior. (M) 1 Kb Plus. (6) CAR
3935, genotipo portador del alelo pinb-D1b.
50
El alelo pinb-D1b fue detectado en la línea avanzada CAR 3935 y el análisis de los
genotipos candidatos con las dos combinaciones de partidores, permitió demostrar que
todos son homocigotos para ese carácter. Lo que se debe a que el material estudiado está
constituido en su totalidad por cultivares y líneas avanzadas de trigo F6, que ya han
alcanzado la homocigosis.
4.1.4. Identificación de la mutación pinb-D1c por CAPS
La amplificación PCR del fragmento correspondiente al gen pinb con la metodología de
GAUTIER et al. (1994), se observa en la parte superior de la Figura 12. Los productos
obtenidos fueron del orden de 450 pb de acuerdo con lo mencionado en la literatura. Las
bandas amplificadas, fueron de alta intensidad y estuvieron presentes en la totalidad de
las muestras analizadas. No se observó productos de amplificación inespecíficos.
En las condiciones descritas por LILLEMO y MORRIS (2000), la digestión del producto
PCR pinb (9 μl) con la endonucleasa PvuII fue parcial, originándose fragmentos de 448,
264 y 184 pb. Para lograr digestiones completas se disminuyó la cantidad de producto
PCR a 6 μl (manteniendo constantes el resto de los componentes y el volumen final de la
reacción) y se aumentó el tiempo de incubación con la enzima a 3 horas. De este modo,
la digestión generó sólo los fragmentos de 264 y 184 pb.
La mutación pinb-D1c modifica el sitio de corte de la endonucleasa PvuII, por lo que
ésta no es capaz de cortar el ADN. En las digestiones positivas para el alelo pinb-D1c,
en que se observó un fragmento sin digerir de 448 pb, se realizaron repeticiones,
obteniéndose el mismo resultado. En la Figura 12 parte inferior, se muestran el perfil
electroforético obtenido para el grupo de genotipos de grano duro a semiduro estudiados.
Las muestras (10) TEMU 1049-97 y (15) F9 Meinel 23, son portadoras del alelo pinbD1c de acuerdo al análisis.
FIGURA 12. Detección del alelo pinb-D1c a través de CAPS con la enzima PvuII.
51
Superior: productos de la amplificación del gen pinb en 15 genotipos de textura dura a
semidura. Inferior: digestión del producto pinb con la endonucleasa PvuII en los mismos
genotipos del panel superior. (M) marcador de peso, (
→) perfil típico del alelo pinb-
D1c, (10) TEMU 1049-97, (15) F9 Meinel 23.
4.1.5. Identificación de la mutación pinb-D1d por CAPS
La mutación pinb-D1d introduce un sitio de restricción adicional para la endonucleasa
MnlI en el gen pinb. LILLEMO y RINGLUND (2002) utilizaron con éxito esta enzima
para detectar el polimorfismo de restricción generado por la mutación. Sin embargo,
debido a que el patrón de restricción es complejo y los fragmentos de restricción
discriminantes son muy similares en tamaño, recurrieron al uso de una segunda
endonucleasa (StyI) para simplificar los patrones de digestión y elevar el poder
discriminatorio del método. De esta manera, en geles de poliacrilamida, los portadores
de la mutación se caracterizan por poseer un fragmento de 115 pb y los no portadores,
uno de 137 pb (Figura 13).
El método propuesto por LILLEMO y RINGLUND (2002), produjo la digestión de la
totalidad del ADN correspondiente al fragmento pinb. La diferencia en el perfil de
bandas entre el gen pinb no mutado de Chinese Spring y el mutado es bastante leve (22
52
pb) lo que complica la identificación del alelo (Figura 13). Por esta razón, se pensó en el
diseño de una técnica basada en PCR alelo-específica para su detección.
FIGURA 13. Detección del alelo pinb-D1b a través de CAPS con las enzimas MnlI y
StyI , electroforesis en gel de poli-acrilamida al 10%.
→) perfil característico del alelo pinb-D1d y (→) perfil del alelo no mutado.
(
(1 a 7)
Tukan-INIA portador del alelo pinb-D1d. (M) marcador de peso, (CS) cv Chinese
Spring.
La mutación pinb-D1d introduce un nuevo sitio de corte para la enzima MnlI, siendo
esta la enzima discriminadora. Mientras que la enzima StyI, se emplea con el fin de
simplificar el patrón de digestión, muy rico en fragmentos de tamaño pequeño y que
pueden confundir la lectura. La presencia de la mutación fue discriminada a través del
fragmento de mayor tamaño en el gel de poliacrilamida, los genotipos portadores
presentaron un fragmento de 115 pb y los no portadores de 137 pb (Figura 13).
4.1.6.
Comparación de métodos utilizados para la detección de
mutaciones en puroindolinas
Como se describió anteriormente, los métodos utilizados para la detección de
mutaciones en puroindolinas se basaron en análisis de proteínas, PCR alelo específico y
53
CAPS. Para cada sistema de detección existieron ventajas y desventajas, referidas a la
simplicidad tecnológica y a la pertinencia de utilización dependiendo del tipo de
germoplasma experimental a analizar.
Para el alelo pina-D1b una alternativa certera de identificación fue el análisis de
proteínas del grano. Sin embargo, esta técnica presenta mayores requerimientos de
tiempo y es más compleja al compararla con la PCR. El análisis de proteínas requiere la
elaboración de geles de poliacrilamida y el tiempo de extracción de proteínas,
electroforesis y tinción de bandas abarca mínimo 24 horas. Por el contrario, la técnica
de PCR es simple y permite la identificación de la mutación en máximo 10 horas.
Además, el ADN extraído puede ser utilizado en otras pruebas de PCR para calidad
panadera como la detección de otros alelos de puroindolina, traslocación trigo centeno y
alelo 5+10 de glutenina, entre otros. Sin embargo lo anterior, la PCR utilizada en éste
caso, tiene la desventaja de poseer una base genética dominante, lo que impide la
identificación de genotipos heterocigotos. Por otro lado, para la detección del alelo
pina-D1b, la presencia de la mutación se detecta por la ausencia de la banda. Esto podría
eventualmente ocasionar errores de identificación del alelo por inhibición de la PCR.
En el caso del alelo pinb-D1b, la técnica de PCR alelo específico utilizada, es
recomendable para el análisis de todo tipo de genotipos de trigo, ya que éste sistema
permite la identificación de los heterocigotos. La PCR realizada con los partidores
HRD1 y HRD2 está ligada al alelo no mutado pinb-D1a y con los partidores HRD1 Y
HRD3 al alelo mutado pinb-D1b.
La detección del alelo pinb-D1c a través de CAPS, fue certera y presentó la ventaja de
que el tiempo de digestión es relativamente reducido (3 horas). Además, el perfil de
digestión obtenido es de fácil análisis y es discernible en geles de agarosa. Por otro
lado, la codominancia de la técnica permite la detección de heterocigotos, siendo
recomendable tanto para el estudio de cultivares y de materiales segregantes.
Sin
embargo, el método presentó la desventaja de que ocasionalmente podrían existir errores
de identificación, ya que cuando se trata del alelo mutado la enzima no corta el ADN.
54
Según MANIATIS et al. (1981), las enzimas de restricción se pueden inhibir cuando el
ADN está contaminado con polisacáridos o cuando está en concentraciones elevadas.
El alelo pinb-D1d no fue detectado eficientemente con el método CAPS, ya que la
digestión enzimática requiere de 16 horas además del tiempo utilizado en la PCR y
electroforesis. Por otro lado, la complejidad del patrón de digestión hace que sólo sea
discernible en geles de poliacrilamida. Por estos motivos se diseñó un método PCR
alternativo, alelo específico, para la identificación del alelo.
4.2. Secuenciación de genes pin de progenitores del Programa
de Mejoramiento de Trigo de INIA-Carillanca
La secuenciación y el análisis de secuencias, realizados sobre los progenitores del
Programa de Mejoramiento de Trigo de INIA, permitió dar una base sólida para estudios
posteriores del locus Ha en las poblaciones segregantes de cada alelo estudiado. Los
progenitores secuenciados fueron Tukan-INIA, Rival, Dolomit, Kona-INIA y Chinese
Spring como control de secuencia no mutada.
Los resultados de la clonación de los genes pin hasta la purificación del ADN
plasmidial, el cual fue enviado posteriormente para secuenciación, se muestran en la
Figura 14. Los datos enviados desde la Universidad Católica de Chile, correspondieron
a duplicados de la secuencia de la hebra directa (5`...3`) del gen pinb de los cultivares:
Chinese Spring, Kona-INIA, Rival, Dolomit y Tukan-INIA. Además de los duplicados
de la hebra directa del gen pina de: Chinese Spring y Kona-INIA.
De acuerdo a la información de secuencias obtenida, Tukan-INIA y Rival, son
portadores de la mutación pinb-D1d, Dolomit es portador de la mutación pinb-D1c y
Kona-INIA no presentó mutaciones en los genes pin. En la Figura 15, se compara las
secuencias de aminoácidos obtenidas y deducidas de un par de clones por planta, donde
se puede apreciar la mutación característica TGG a AGG en el codón 44, que provoca la
55
sustitución de Triptofano 44 por Arginina, y la mutación CTG a CCG que produce un
cambio de leucina a prolina en la posición 60.
En la Figura 16, se presenta la secuencia nucleotídica completa del gen pinb mutado del
cultivar Tukan-INIA y del tipo silvestre depositado en GenBank, junto con su secuencia
de aminoácidos deducida. Dentro de la secuencia de 450 pb se muestra resaltado el sitio
de la mutación pinb-D1d.
FIGURA 14. Resultados del proceso de clonación de genes pin del cv. Kona-INIA en
bacterias Escherichia coli DH5 y purificación de ADN plasmidial para secuenciación.
(a) amplificación por PCR de los genes pina y pinb en duplicado; (b) purificación de
fragmentos correspondientes a genes pin desde gel de agarosa; (c) bacterias Escherichia
coli transformadas con el gen pina creciendo en medio LB suplementado con
carbenicilina, IPTG y X-Gal; (d) amplificación PCR de genes pin directamente sobre
→)
colonias; (e) ADN plasmidial, enviado para secuenciación; (
Colonia blanca
trasformada, (-) control negativo de transformación correspondiente a colonias azules,
(A) gen pina y (B) gen pinb.
56
FIGURA 15. Secuencia de aminoácidos deducida de la secuenciación de los genes pinb
de los progenitores del Programa de Mejoramiento de Trigo, mostrando la presencia de
la mutación pinb-D1c en el cv. Dolomit y pinb-D1d en los cvs. Tukan-INIA y Rival.
(R) mutación pinb-D1d y (P) mutación pinb-D1c.
FIGURA 16. Comparación entre la secuencia completa del gen pinb mutada del cv.
Tukan-INIA, obtenida a partir de la secuenciación de ADN y la del gen pinb tipo
silvestre depositada en GenBank (X69912).
57
Resaltado se muestra el cambio W (triptofano) 44→R (arginina) producido por la
mutación pinb-D1d.
58
Ya se mencionó que el cultivar Kona-INIA no presentó mutaciones en pina y pinb, sin
embargo en ensayos previos de clonación se obtuvo un clon secuenciado que presentaba
la mutación pinb-D1c. Por medio de análisis CAPS los resultados fueron negativos para
la mutación y dado el índice de dureza intermedio que presenta Kona-INIA, se pensó
que podría existir heterogeneidad dentro del cultivar. MORRIS et al. (2001), han
establecido la existencia de mezclas de componentes duro y blando en distintas
proporciones en cultivares de dureza intermedia, y que el componente duro es portador
de mutaciones en genes de puroindolinas. Para intentar dilucidar esta situación, durante
el desarrollo de esta tesis fue analizado un grupo de 20 plantas de Kona-INIA para los
alelos pina-D1b, Pinb-D1b y pinb-D1c para intentar detectar mezclas, sin embargo todas
las plantas fueron negativas.
Por lo tanto la dureza intermedia de Kona-INIA,
probablemente se podría explicar por otros factores modeladores de la textura como por
ejemplo el contenido de pentosanos en el grano (BETTGE y MORRIS, 2000).
4.3. Diseño de sistema PCR para la detección de la mutación
pinb-D1d en base a la secuencia del gen pinb mutado
A partir de la secuenciación de genes pin de los progenitores del programa de
Mejoramiento de Trigo de INIA, se encontró que los cultivares Rival y Tukan-INIA eran
portadores de la mutación pinb-D1d. Esto permitió que la estandarización de la técnica
CAPS para la identificación del alelo fuera realizada sobre estos genotipos.
Sin
embargo, la técnica presentó desventajas desde el punto de vista de la duración, costo y
simplicidad del análisis. En consecuencia, se diseñó partidores alelo-específicos para la
detección del alelo pinb-D1d, los resultados del diseño y optimización de partidores se
detallan a continuación.
4.3.1. Diseño de partidores
La estrategia para la detección del alelo pinb-D1d mediante PCR se basó en el empleo
de un partidor discriminador, cuya base 3’ terminal fuera complementaria a la mutación
59
puntual característica de este alelo, y un partidor genérico situado aproximadamente a
200-300 pares de bases upstream o downstream de la mutación (Figura 17).
FIGURA 17. Representación esquemática de las combinaciones de partidores utilizadas
para la detección del alelo pinb-D1d y sitio de unión de los partidores.
(■) Sitio de unión de los partidores diseñados por su extremo 3` justo en el punto de
cambio de timina a adenina en el codón 44 de la secuencia, (*) partidores diseñados en
éste trabajo.
Los partidores diseñados tuvieron una longitud de 21 nucleótidos y su secuencia
corresponde a:
Pind-R 5'...(ATG CTC ACA GCC GCC CTT CCT…3’)
Pind-F 5'...(TCA CCT GGC CCA CAA AAT GGA…3’)
Las temperaturas de fusión (Tm = melting temperature) calculadas según el porcentaje
de guanina citosina-%GC fueron: 61ºC para Pind-R y 52ºC para Pind-F. La relación
entre bases puricas: pirimidicas correspondió a 1: 2,5 para el partidor Pind-R y 1:1 para
Pind-F. Las secuencias de los partidores diseñados fueron alineadas con las de los
partidores genéricos a utilizar en combinación con ellos (Pinb-L, Pinb-R y HRD1) y
60
presentaron una baja interacción. De esta forma, se evita el apareamiento entre
partidores favoreciendo su unión con el ADN blanco.
Las secuencias nucleotídicas de los partidores, no fueron complementarias con
secuencias de genes contenidas en bases de datos de internet, lo que indica que el
sistema de partidores es específico para la secuencia del gen pinb en el ADN del trigo y
que no deberían amplificar en ADN de otras especies (NCBI, 2003).
4.3.2. Optimización de condiciones PCR
De las combinaciones de partidores probadas para la detección del alelo pinb-D1d (PindF/Pinb-R; Pind-R/Pinb-L y Pind-R/HRD1), la que entregó el mejor resultado fue PindR/HRD1. Para éste sistema de partidores se logró una completa discriminación entre los
controles positivos y negativos. En la Figura 18D, se observa que las primeras cuatro
muestras correspondientes a repeticiones de Rival y Tukan-INIA, portadores de la
mutación pinb-D1d, amplificaron bandas de alta intensidad mientras que los controles
negativos Chinese Spring y Kona-INIA no mostraron amplificación.
Las condiciones optimas de amplificación para los partidores Pind-R/HRD1 fueron
encontradas al bajar las concentraciones de dNTP a 20 mM y al subir la Ta a 63ºC.
Además se bajó el número de ciclos de amplificación de la PCR de 35 a 32, con lo que
se logró hacer invisible cierto grado de amplificación inespecífica que todavía ocurría
con las condiciones mencionadas. La PCR óptima consistió de una mezcla de reacción
conteniendo 2 mM MgCl2; 20 μM dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP); 0,2 μM de cada
oligonucleótido partidor específico; 1% cresól sacarosa; y 0,625 U de Taq polimerasa
por cada reacción, mientras que el programa térmico empleado consistió en 4 minutos a
94°C, 32 ciclos que consideraron: una etapa de desnaturación a 94°C por 30 segundos,
un apareamiento de partidores a 63°C por 30 segundos, una etapa de elongación a 72°C
por 45 segundos y una elongación final por 7 minutos a 72°C. El tamaño de los
fragmentos obtenidos fue de 250 pb.
61
Para el sistema de partidores Pind-F/Pinb-R no se logró optimizar las condiciones de
PCR y el mejor resultado obtenido con esta combinación se muestra en la Figura 19B.
Al utilizar 40 μM dNTP y Ta de 66ºC se observó un grado de discriminación levemente
mayor entre controles positivos y negativos, que al utilizar una Ta de 60ºC (Figura 19A).
Para intentar lograr una completa discriminación se subió la Ta de la PCR y además se
bajaron las concentraciones de dNTP, sin embargo las bandas amplificadas con 20 y 40
μM dNTP y una Ta de 66ºC fueron débiles (Figura 19C) y para 40 μM dNTP y Ta de
72ºC se inhibió la PCR (Figura 19D). Posteriormente, se probaron concentraciones de 1
y 1,5 mM de cloruro de magnesio para disminuir la inespecificidad, sin embargo se
obtubieron resultados similares.
La estrategia de bajar la concentración de dNTP en la PCR, se debió a que la bibliografía
señala que excesivas concentraciones de éstos pueden incrementar la tasa de error y
posiblemente inhibir a la enzima Taq polimerasa.
En cuanto a la temperatura de
apareamiento de los partidores a la hebra de ADN templado (Ta) durante la PCR, ésta
depende del %GC en la secuencia nucleotídica de los partidores. Mientras mayor es el
%GC mayor es la temperatura de fusión (Tm) de los partidores y mayor es la fuerza de
unión de éstos al ADN blanco. Por lo tanto, frente a una Ta baja durante la PCR,
partidores con una Tm alta tienen mayor posibilidad de aparearse al ADN templado y el
apareamiento parcial de los partidores es tolerado. Generalmente la diferencia de Tm
entre los partidores directo y reverso, no debe superar los 5ºC (COYNE et al., 1998).
FIGURA 18. Optimización del sistema de partidores pind-R/HRD1 diseñado para la
detección del alelo pinb-D1d por PCR.
62
(1-4) Controles positivos portadores de pinb-D1d correspondientes a repeticiones de
ADN de Tukan-INIA y de Rival, (5-8) controles negativos correspondientes a
repeticiones de Kona-INIA y Chinese Spring. (A) PCR conteniendo 40 μM dNTP y Ta
de 55ºC, (B) 40 μM dNTP y Ta de 60ºC (C) 20 m μM dNTP, Ta de 60ºC y 35 ciclos de
amplificación (D) 20 μM dNTP, Ta de 63ºC y 32 ciclos de amplificación.
FIGURA 19. Optimización del sistema de partidores Pind-F/Pinb-R diseñado para la
detección del alelo pinb-D1d.
63
(1-4) Controles positivos portadores de pinb-D1d correspondientes a repeticiones de
ADN de Tukan-INIA y de Rival, (5-8) controles negativos correspondientes a
repeticiones de Kona-INIA y Chinese Spring, (A) PCR conteniendo 40 μM dNTP y Ta
de 60ºC, (B) 40 μM dNTP y Ta de 66ºC (C) 20 μM dNTP y Ta de 66ºC, (D) 40 μM
dNTP y Ta de 72ºC.
De acuerdo a lo anterior, los mejores resultados obtenidos con el partidor Pind-R, se
deben a que su temperatura de fusión (Tm de 61°C) es cercana a la de los partidores
HRD1 ( Tm de 58°C) y pinb-L (Tm de 58°C). Por el contrario, el partidor pind-F al
poseer una Tm de 52°C (más de 5°C de diferencia con la de los otros partidores) produjo
amplificación inespecífica (Figura 18A y B) y al subir en consecuencia la Ta de la PCR,
no se observó amplificación (Figura 19C y D).
De los resultados experimentales obtenidos en el proceso de optimización, se desprende
que los factores que jugaron un rol esencial fueron la Ta de la PCR y las concentraciones
de dNTP. En cuanto a las concentraciones de partidores probadas se optó por utilizar la
más baja de 0,2 μM ya que permitió disminuir el gasto de ellos y los resultados fueron
similares, aunque con un leve aumento en la discriminación entre controles positivos y
negativos.
4.4. Identificación de mutaciones en genes de puroindolinas
en un jardín de líneas avanzadas de trigo
El análisis del total de germoplasma, a través de métodos moleculares, para los alelos
pina-D1b, pinb-D1b y pinb-D1c reveló que el 56% (61 de 113 genotipos) de éste
presentó las mutaciones en genes de puroindolinas estudiadas.
Al analizar las frecuencias para cada mutación, se observó una alta prevalencia de pinbD1b con un 40%, siguiedole en importancia los alelos pinb-D1c y pina-D1b, con un 8 y
7% respectivamente (Figura 20). Por otro lado, un 45% del germoplasma no presentó
64
las mutaciones en puroindolinas estudiadas.
Los resultados específicos para cada
genotipo se muestran en el Cuadro 5.
Del total de germoplasma analizado ningún genotipo fue portador de mutaciones en pina
y pinb simultaneamente, debido a que estos genes se encuentran ligados. En los estudios
realizados por LILLEMO y MORRIS (2000), no se observó recombinación entre los
tipos de mutaciones en pina y b.
FIGURA 20.
Porcentaje de individuos portadores de cada alelo de puroindolina
estudiado, con respecto al total de germoplasma en estudio.
4.4.1. Mutación pina-D1b
El estudio del total de germoplasma a través de PCR pina, detectó la presencia del alelo
nulo en 8 genotipos de los 113 analizados, lo que corresponde al 7%. De acuerdo al
origen geográfico, el alelo fue encontrado en el: 27,7% de los genotipos chilenos; 4,16%
de los franceses y 2,7% de los alemanes.
En el estudio realizado por LILLEMO y MORRIS (2000), se había reportado que el
alelo pina-D1b estaba presente en un alta frecuencia en materiales latino-americanos,
65
mejorados en el CIMMYT-México. Ellos encontraron que 12 de 16 trigos analizados
fueron portadores del alelo nulo.
Los genotipos portadores del alelo nulo pina-D1b corresponden a: Car-3911, DalcahueINIA, Temu 1032-97, Temu 1056-97, Temu 1067-97, 93283-166-98, 95L067 y x-5 v
113 Traiguen 2000 (Cuadro 5).
4.4.2. Mutación pinb-D1b
El alelo pinb-D1b estuvo presente en una alta proporción, de 113 genotipos analizados
44 presentaron la mutación glicina a serina en posición 46 (pinb-D1b) correspondiente al
40%. Por origen geográfico fue encontrada en el 27% de los genotipos chilenos, 37% de
los genotipos franceses y 44% de los genotipos alemanes.
La presencia del alelo pinb-D1b en materiales de todos los orígenes geográficos fue
reportada por LILLEMO y MORRIS (2000), sin embargo el alelo era particularmente
prevalente en genotipos del norte de Europa y América Latina. A partir del análisis de
238 genotipos, se detectó la presencia del alelo en la mitad del germoplasma duro. Por
otro lado, MORRIS et al. (2001), detectaron alelos de puroindolinas en variedades
antiguas de trigo de Norte América y encontraron que el 96% del germoplasma duro
presentaba la mutación pinb-D1b.
Los genotipos portadores del alelo pinb-D1b corresponden a: Car 3935, F9 Meinel 21,
F9 Meinel 97-6, F9 Meinel 97-21F9, Schach 97-98, F9 Schach 97-46, 93HO52-34-98,
93H066-43-98, 93H221-76-98, 93L046-26-98, 93L047-27-98, Dollinco, 93L250 57-98,
93L250-58-98, 93L255-99-98, 93283-175-98, 93345-177-98, 911343-19-98, 93363185-98, 95L067, x-3 v-73 Traiguen 2000, x-3 v-74 Traiguen 2000, x-4 v-77 Traiguen
2000, x-4 v-81 Traiguen 2000, x-4 v-82 Traiguen, x-4 v-83 Traiguen 2000, x-4 v-84
Traiguen 2000, x-4 v-86 Traiguen 2000, x-4 v-89 Traiguen 2000, x-4 v-92 Traiguen
2000, x-4 v-96 Traiguen 2000, x-4 v-97 Traiguen 2000, x-4 v-98 Traiguen 2000, x-5 v102 Traiguen 2000, x-5 v-103 Traiguen 2000, x-5 v-107 Traiguen 2000, x-5 v-108
66
Traiguen 2000, x-5 v-111 Traiguen 2000, x-5 v-112 Traiguen 2000, x-5 v-114 Traiguen
2000, x-5 v-116 Traiguen 2000 y x-5 v-118 Traiguen 2000 (Cuadro 5).
4.4.3. Mutación pinb-D1c
La mutación leucina a prolina en posición 60 (pinb-D1c) fue encontrada en 9 genotipos
de los 113 analizados, correspondiente a un 8%. Por origen geográfico presentaron el
alelo: el 5,55% de los genotipos chilenos; 4,16% de los genotipos franceses y 9,72% de
los genotipos alemanes. Dentro del germoplasma analizado la mutación pinb-D1c se
encontró en baja proporción, a pesar de que LILLEMO y MORRIS (2000) encontraron
una alta frecuencia de éste alelo en materiales de todo el mundo. Aporximadamente 89
de 295 genotipos de trigo analizados por ellos, fueron portadores de la mutación.
Los genotipos portadores del alelo pinb-D1c corresponden a: F9 Meinel 23, Temu 104997, 95L059, 95L067, x-3 v-71 Traiguen 2000, x-4 v-94 Traiguen 2000, x-4 v-99
Traiguen 2000, x-5 v-104 Traiguen 2000 (Cuadro 5).
4.4.4. Mutación pinb-D1d
De los 21 genotipos analizados, sólo 2 fueron portadores del alelo pinb-D1d: TukanINIA y Rival (Cuadro 4). Este resultado era esperable ya que MORRIS et al. (2001), al
analizar genotipos de todos los orígenes geográficos, encontraron que éste alelo rara vez
se encontraba presente.
La mutación triptofano a arginina en posición 44 (pinb-D1d) encontrada en Tukan-INIA
y Rival explicaría su dureza de grano, pero cabe recalcar que según LILLEMO y
MORRIS (2000), el cultivar Rival es portador del alelo pinb-D1b y no de Pinb-D1d, por
lo que debería analizarse la identidad del material.
67
4.5. Caracterización fenotípica de la textura del grano de un
jardín de líneas avanzadas de trigo
Las mediciones de textura, realizadas sobre un grupo de 73 genotipos de trigo,
entregaron valores de índices de dureza que oscilaron dentro del rango de 17,00 y 30,80,
con un promedio de 25,99. Se observó que el 83,56% (61 genotipos) perteneció a la
categoría de textura de grano dura; el 15,06% (11 genotipos) a la de textura semidura y
el 1,36% (1 genotipo) a la de textura blanda (Cuadro 4).
CUADRO 4. Frecuencias de genotipos obtenidas por categoría de textura de grano con
sus respectivos promedios de índice de dureza.
(ID) Indice de dureza.
Al analizar específicamente los índices de dureza obtenidos para cada genotipo, se
observó que los genotipos más duros fueron Tukan-INIA y Car 3935, con un valor de
17. Por otro lado el único genotipo que presentó textura de grano blanda fue Gasporal,
con un valor de índice de dureza de 30,8. El promedio de índice obtenido para la
categoría de textura dura fue de 21,3 y para la semidura 26,04 (Cuadro 5).
68
4.6.
Comparación de datos genotípicos y fenotípicos de
textura de grano
Las comparaciones entre datos genotípicos y fenotípicos de textura de grano realizadas,
permitieron concluir que el 94,5% (34 genotipos) del germoplasma mutado perteneció a
la categoría de textura dura y el 5,5% (2 genotipos) restante a la categoría de textura
semidura (Figura 21). Estos resultados concuerdan con los obtenidos por GIROUX Y
MORRIS (1998), ya que ellos demostraron que una mutación en cualquiera de los genes
pin, es suficiente para producir un genotipo y fenotipo de grano duro.
FIGURA 21. Gráfica de frecuencia de genotipos por categoría de textura de grano de
acuerdo a la presencia o ausencia de mutaciones en genes de puroindolinas.
Por otro lado, dentro de los genotipos no mutados o portadores de otras variantes alélicas
no detectadas en este trabajo, el 73% (27 genotipos) perteneció a la categoría de textura
dura, el 24% (9 genotipos) a la de textura semidura y el 3% (1 genotipo) a la de textura
blanda (Figura 21).
Estos resultados podrían explicarse por la presencia de otras
variantes alélicas en genes pin, por otros factores genéticos o por el contenido de
pentosanos en el grano.
69
En los resultados obtenidos por LILLEMO y MORRIS (2000), se observó que en la
mayoría de los genotipos de grano duro incluidos en su estudio, la textura dura podía ser
atribuida a alguna mutación en pina o pinb. Sin embargo, existirían otros factores
genéticos contribuyendo an la variación de la expresión fenotípica de ésta, ya que
encontraron genotipos con alelos suaves (pina-D1a y pinb-D1a) que poseían grano de
textura dura.
FIGURA 22. Gráfica de frecuencia de genotipos por mutación y su distribución de
acuerdo al índice de textura de grano que presentan.
(ID) índice de dureza.
70
En la Figura 22, se puede observar que la distribución de frecuencias de genotipos por
índice de dureza es dependiente del tipo de alelo encontrado. El alelo pina-D1b es el que
presenta el mayor desplazamiento hacia texturas de grano más duras, le siguen los alelos
pinb-D1b y pinb-D1c. Estos resultados concuerdan con lo planteado por GIROUX y
MORRIS (1998), según lo cual la variante alélica pina-D1b es la que estaría asociada a
texturas de grano más duras. Sin embargo, en éste caso el resultado es preliminar ya que
para las variantes alélicas pina-D1b y pinb-D1c se encontró un bajo número de
genotipos mutados, por lo que podría no ser representativo del alelo.
Los promedios de índice de dureza obtenidos para cada variante alélica, correspondieron
a: 20,22 para pina-D1b; 21,50 para pinb-D1b ; 21,85 para pinb-D1c y 22,95 para los
genotipos no portadores de los alelos estudiados. Los valores de ID oscilaron entre 23,2
y 17 para el alelo pina-D1b; 26,4 y 18 para el alelo pinb-D1b; 23,4 y 20,4 para el alelo
pinb-D1c; 23 y 21,2 para pinb-D1d; y finalmente 30,8 y 18,6 para los no portadores de
las mutaciones estudiadas (Cuadro 5). De acuerdo a lo anterior, la mayor variación en
textura la presentó el grupo no portador de las mutaciones y pinb-D1c fue el que
presentó una distribución más comprimida en torno al promedio.
Según LILLEMO y MORRIS (2000), la variación en la expresión fenotípica de la
textura, que se presenta dentro de los distintos grupos (no mutados y portadores de cada
alelo), se debe a factores ambientales y genéticos. Por otro lado, IGREJAS et al. (2001),
señalan que la expresión de los genes de puroindolinas es altamente heredable,
presentando un bajo efecto del medio ambiente. Desde el punto de vista del contenido
de puroindolinas mutadas o no mutadas, no existe una correlación significativa entre la
variación en la cantidad de éstas y la variación en textura, a pesar de que éstas son más
abundantes en los trigos suaves que en los duros. Por lo tanto, la variación se produciría
por la acción de otros loci menores (LILLEMO y RINGLUD, 2002).
CUADRO 5. Resultados de la identificación de mutaciones o alelos de puroindolinas y
de mediciones de textura de grano para el total de genotipos estudiados.
71
(-) valor no determinado. (ID) índice de dureza. (1) y (0) presencia y ausencia del alelo.
(Continúa)
CUADRO 5. Continuación
72
(-) valor no determinado. (ID) índice de dureza. (1) y (0) presencia y ausencia del
alelo.(Continúa)
Cuadro 5. Continuación
73
(-) valor no determinado. (ID) índice de dureza. (1) y (0) presencia y ausencia del alelo.
A partir de un análisis QTL, SOURDILLE et al. (1996), reportaron la existencia de
cuatro diferentes regiones con loci menores (2AL, 2DL, 5BL y 6DS) en la población
Synthetic x Opata, que explicarían un 4 a 6% de la variación en textura.
Dos
significantes loci menores (1A y 6D) en la población Courtot x Chinese Spring
explicarían un 3 y 5,5% (PERRETANT et al., 2000) y un significante locus menor
(3AS) explicaría un 8,4%, en la población NY18 x CC (CAMPBELL et al., 1999).
74
Otro factor que podría contribuir con la variación en textura es el contenido de
pentosanos, un grupo de carbohidratos (arabinoxylanos y arabinogalactanos).
Los
pentosanos se encuentran asociados a la membrana del amiloplasto y podrían servir para
modificar las fuerzas de adhesión entre la matriz de proteínas y los granos de almidón.
Por otro lado, se ha observado que en trigos duros usualmente hay mayores niveles de
pentosanos que en trigos blandos y que entre cultivares la dureza tiende a ser realzada
por el contenido total de pentosanos (HONG et al., 1989).
Al aislar la fracción de pentosanos en muestras de trigos blandos y duros, BETTGE y
MORRIS (2000), observaron que entre muestras de trigo blando los pentosanos
asociados a la membrana contribuyen con un 53 a 76% de la variación en textura de
grano. Por otro lado, entre genotipos de trigo duro se observó una débil relación.
75
5. CONCLUSIONES
Como resultado del desarrollo de esta tesis se logró adaptar, para el aprovechamiento del
Programa de Mejoramiento de Trigo de INIA, técnicas para la caracterización de los
alelos asociados a dureza de grano: pina-D1b, pinb-D1c y pinb-D1d. Además se cuenta
con un nuevo sistema PCR alelo-específico para la detección de pinb-D1d.
La técnica más adecuada para la detección de alelos de puroindolinas en líneas
avanzadas y cultivares de trigo, fue la amplificación por PCR alelo-específico. Sin
embargo, ocasionalmente ocurrieron errores de identificación por inhibición de la PCR.
Para el análisis de materiales segregantes sería indicado la detección por análisis de
proteínas y CAPS debido a que, a pesar de que los requerimientos de tiempo y recursos
económicos son mayores, permite el reconocimiento de heterocigotos.
Dentro del pool genético estudiado se encuentran presentes los alelos pina-D1a, pinaD1b, pinb-D1a, pinb-D1b, pinb-D1c y pinb-D1d.
El estudio del total de germoplasma, reveló que el 55% de éste presentó mutaciones en
genes de puroindolinas. La mutación pinb-D1b representó el 40%, los alelos pinb-D1c y
pina-D1b, el 8 y 7% respectivamente.
Los promedios de índice de dureza obtenidos por mutación, correspondieron a: 20,22
para pina-D1b; 21,50 para pinb-D1b; 21,85 para pinb-D1c, lo que permite concluir que
todos los genotipos portadores de mutaciones poseen textura de endosperma dura.
El promedio de índice de dureza obtenido para los genotipos no portadores de los alelos
estudiados correspondió a 22,95. Esto implica que en ellos podrían existir otros factores
condicionando la textura de grano dura, como otras mutaciones en genes de
puroindolinas, otros factores genéticos menores o el nivel de pentosanos contenidos en
el grano.
76
6. BIBLIOGRAFIA
ADSULE, R.N. y KADAM, S.S. 1986. Quality of wheat. In Salunkhe, D.K.; Kadam,
S.S. y Austin, A. Quality of wheat and wheat products. Metropolitan, India. pp 1-7.
ALLAN, R.E. 1980. Wheat. In Fehr, W.R y Hadley, H.H. (eds). Hybridization of
crops plants. American Society of Agronomy and Crop Science Society of America,
USA. pp 709-719.
ALLARD, R. 1967. Principios de la mejora genética en plantas. Omega, Barcelona.
485 p.
BETTGE, A.D. y MORRIS, C.F. 2000. Relationships among grain hardness, pentosan
fractions, and end-use quality of wheat. Cereal Chem. 77 (2) : 241-247.
BETTGE, A., MORRIS, C. y GREENBLATT, G. 1995. Assesing genotipic softness in
single wheat kernels using starch granule-associated frialbilin as a biochemical marker.
Euphytica. 86 : 65-72.
BIRNBOIM, H.C. y DOLY, J.
1979.
A rapid alkaline extraction procedure for
screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acid Research. 7 : 1513-1518.
CAMPBELL, K.G.; BERGMAN, C.J.; GUALBERTO, D.G.; ANDERSON, J.A.;
GIROUX, M.J.; HARELAND, G.; FULCHER, G.; SORRELS, M.E. y FINNEY, P.L.
1999: Quantitative trait loci associated with kernel traits in a soft x hard wheat cross.
Crop Sci. 39 : 1184-1195.
CAMPOS DE QUIROZ, H. 1995. Marcadores Moleculares: Conceptos. Agro Sur
(Chile). 23 (1) : 68-75.
CHILE, OFICINA DE ESTUDIOS PUBLICOS Y POLITICAS AGRARIAS (ODEPA).
2002. <http://www.odepa.cl/base-datos/estadisticas/> (20 dic. 2002)
COHEN, S.N.; CHANG, A.C. y HSU, L. 1972. Nonchromosomal antibiotic resistance
in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc. Natl.
Acad. Sci. 69 : 2110.
COYNE, V.E.; JAMES, M.D.; REID, S.J. y RYBICKI, E.P. 1998. Molecular Biology
Techniques Manual. 3a . ed.
77
<http://web.uct.ac.za/microbiology/pcr.htm> (20 may. 2003).
DOULIEZ, J.; MICHON, T.; ELMORJANI, K. y MARION, D. 2000. Structure,
biological and technological functions of lipid transfer proteins and indolines, the major
lipid binding proteins from cereal kernels. J. Cereal Sci. 32 : 1-20.
DOYLE, J. y DOYLE, J. 1987. Isolation of plants DNA from fresh tissue. Focus. 12 :
13-15.
DUBREIL, L.; MELIANDE, S.; CHIRON, H.; COMPOINT, J.; QUILLIEN, L.;
BRANLARD, G. y MARION, D. 1998a. Effect of puroindolines on the breadmaking
propierties of wheat flour. Cereal Chem. 75 (2) : 222-229.
DUBREIL, L.; GABORIT, T.; BOUCHET, B.; GALLANT, D.; BROEKAERT, W.;
QUILLIEN, L. y MARION, D.
1998b.
Spatial and temporal distribution of
puroindolines (puroindoline-a and puroindoline-b) and non specific lipid transfer protein
(ns-LTP1e1) of Triticum aestivum seeds. Relationships with their in vitro antifungal
properties. Plant Sci. 138 : 121-135.
DUBREIL, L.; COMPOINT, J. y MARION, D. 1997. Interaction of puroindolines with
wheat flour polar lipids determines their foaming properties. J. Agric. Food Chem. 45 :
108-116.
FAIGUEMBAUM, M. 1987. Producción de cultivos en Chile: cereales, leguminosas e
industriales. Torrelodones, Santiago, Chile. 332 p.
FELDMAN, M.
1976.
Taxonomic Classification and names of wild, Primitive,
cultivated, and modern cultivated wheats. In Simmonds, N.W. (ed). Evolution of Crop
Plants. Longman, London. pp 120-128.
FERREIRA, M. y GRATTAPAGLIA, D. 1996. Introducao ao uso de marcadores
moleculares em análise genetica. 2a ed. Embrapa, Brasilia D.F. 220 p.
GALANDE, A.A.; TIWARI, R.; AMMIRAJU, J.S.S.; SANTRA, D.K.; LAGU, M.D.;
RAO, V.S.; GUPTA, V.S.; MISRA, B.K.; NAGARAJAN, S. y RANJEKAR, P.K.
2001. Genetic analysis of kernel hardness in bread wheat using PCR-based markers.
Theor. Appl. Genet. 103 : 601-606.
78
GAUTIER, M.F.; COSSON, P.; GUIRAO, A.; ALARY, R. y JOUDRIER, F. 2000.
Puroindoline genes are highly conserved in diploid ancestor wheats and related species
but absent in tetraploid Triticum species. Plant Sci. 153: 81-91.
GAUTIER, M.; ALEMAN, M.; GUIRAO, A. y JOUDRIER, P.
1994.
Triticum
aestivum puroindolines, two basic cystine- rich seed proteins: cDNA sequence analysis
and developmental gene expression. Plant Mol. Biol. 25 : 43-57.
GARCIA-MAS, J. E.; GRAZIANO, M. J; ARANZANA, A; MONFORTE, M.;
OLIVER, J.; BALLESTER, M. A. y VIRUEL Y. P. 2000. Marcadores de ADN:
concepto, tipos, protocolos. In Nuez, F. y Carrillo, J.M. (eds).
Los Marcadores
Genéticos en la Mejora Vegetal. Editorial U.P.V, Valencia. pp 93-151.
GIROUX, M. y MORRIS, C.
1998.
Wheat grain hardness results from highly
conserved mutation in the friabilin components puroindoline a and b. Proc. Natl. Acad.
Sci. 95 : 6262-6266.
GIROUX, M. y MORRIS, C. 1997. A serine to glycine change in puroindoline b is
associated with wheat grain hardness and low levels of starch-surface friabilin. Theor.
Appl. Genet. 95 : 857-864 .
GONZALEZ, J. y VELASCO, R. 2001. Situación y competitividad del trigo. Tierra
Adentro. (Chile). 38 : 24-29.
GREENWELL, P. y SCHOFIELD, J.D. 1986. A starch granule protein associated with
endosperm softness in wheat. Cereal Chem. 63 : 379-380.
HANSON, H.; BORLAUG, N.E. y ANDERSON, R.G. 1985. Trigo en el tercer mundo.
Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo, México. 166 p.
HALL, T.A. 1999. BioEdit: a user-frienly biological sequence alignment editor and
analysis program for windows 95/98/NT. Nucl. Acids Symp. Ser. 41: 95-98.
HILL, A. 1965. Botánica Económica. Omega, Barcelona. 421 p.
HOSENEY, C. 1991. Principios de ciencia y tecnología de los cereales.
Acribia,
Zaragoza. 321 p.
HONG, B.H.; RUBENTHALER J.L. y ALLAN, R.E. 1989. Wheat pentosans, cultivar
variation and relationship to kernel hardness. Cereal Chem. 66 : 369-373.
79
HUANG, S.; SIRIKHACHORNKIT, A.; SU, X.; FARIS, J.; GILL, B.; HASELKORN,
R. y GORNICKI, P. 2002. Genes encoding plastid acetyl-CoA carboxylase and 3phosphoglycerate kinase of the Triticum/ Aegilops complex and the evolutionary history
of polyploid wheat. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (12) : 8133-8138.
IGREJAS, G.; GABORIT, T.; OURY, F.; CHIRON, H.; MARION, D. y BRANLARD,
G.
2001.
Genetic and enviromental effects on puroindolina-a and puroindoline-b
content and their relationship to technological properties in french bread wheats. Journal
of Cereal Sciense. 33 : 1-19.
JOBET, C.; ZUÑIGA, J.; CAMPOS, H.; RATHGEB, F.; SOTO, B.; ARCOS, A. y
MARIN, G.
2001.
Mejoramiento de trigo: selección molecular.
Tierra Adentro.
(Chile). 37 : 16-17.
JEYASEELAN, K.
1987.
Genes and proteins, a laboratory manual of selected
techniques in molecular biology. ICSU press, EEUU. 203 p.
KENT, N.L. 1987. Tecnología de los Cereales. Acribia, Zaragoza. 260 p.
LAEMMLI, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature. 227 : 680-685.
LELLEY, J. 1976. Wheat breeding, theory and practice. Publishing house of the
hungarian academy of Science. Akademiai Kiado, Budapest. 485 p.
LEONARD, W.H. y MARTIN, J.H. 1963. Cereal crops. Macmillan, London. 824 p.
LERSTEN, N.R. 1987. Morphology and Anatomy of the Wheat Plant. In Heyne, E.G.
(ed). Wheat and Wheat Improvement. American Society of Agronomy, Madison, WI. pp
33-75.
LILLEMO,
M.
2001.
Genetics
of
endosperm
hardness.
<http://arken.nlh.no/~ipfmol/genetics.html> (20 dic. 2001).
LILLEMO, M. y RINGLUND, K. 2002. Impact of puroindoline b alleles on the genetic
variation for hardness in soft x hard wheat crosses. Plant Breed. 121 : 210-217.
LILLEMO, M. y MORRIS, C.F. 2000. A leucine to proline mutation in puroindoline b
is frequently present in hard wheats from Northern Europe. Theor. Appl. Genet. 100 :
1100-1107.
80
MANIATIS, T.; SAMBROOK, J. y FRITSH, E. 1981. Molecular cloning, a laboratory
manual. 2a . ed. Cold Spring Harbor, Laboratory Press, New York. 1017 p.
MELLADO, M. 1998. Análisis del cultivo del trigo en Chile durante el siglo veinte.
Agricultura Técnica. (Chile). 58 : 230-240.
MORRIS, C.; LILLEMO, M.; SIMEONE, M.; GIROUX, J.; BABB, S. y KIDWELL, K.
2001.
Prevalence of puroindoline grain hardness genotypes among historically
significant North American spring and winter wheats. Crop Sci. 41 : 218-228.
MORRIS, C.F.; GREENBATT, G.A.; BETTGE, A.D. y MALKAWI, H.I.
1994.
Isolation and characterization of multiple forms of friabilin. J. Cereal Sci. 20 : 167-174.
MULLIS, K.B. y FALOONA, F. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a
polymerase catalyzed chain reaction. Methods. Enzymol. 155 : 335-350.
NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION (NCBI).
2003.
Triticum aestivum Pinb gene for puroindoline b. <http://www.ncbi.nlm.nih.gov> (20
may. 2003).
ODA, S. y SCHOFIELD, J.D. 1997. Characterisation of friabilin polypeptides. J Cereal
Sci. 26 : 29-36.
PEÑA, R.; ORTIZ-MONASTERIO, J. y SAYRE, K. 1998. Estrategias para mejorar (o
mantener), la calidad panadera en trigo de alto potencial de rendimiento. In KOOHLI,
M; MARTINO, M. (eds). “Explorando altos rendimiento de trigo”. La estanzuela,
Uruguay; CIMMYT-INIA. pp 287-304.
PEÑA, R.J. 2002. Influencia de la textura del endospermo y la composición de las
proteínas del gluten en la calidad panadera del trigo. Seminario: avances y perspectivas
en calidad industrial del trigo. Temuco, Chile, Oct. 9-30. Instituto de Investigaciones
Agropecuarias.
PERRETANT, M.; CADALEN, R.T.; CHARMET, G.; SOURDILLE, P.; NICOLAS,
P.; BOEUF, C.; TIXIER, M.H.; BRANLARD, G. y BERNARD, S.
2000.
QTL
analysis of bread-making quality in wheat using a doubled haploid population. Theor.
Appl. Genet. 100 : 1167-1175.
POEHLMAN, J. 1965. Mejoramiento genético de las cosechas. Ed. Limusa-Wiley.
S.A., Méjico. 453 p.
81
QINWEI SHI y JACKOWSKI, G.
1998.
One dimensional polyacrylamide gel
electroforesis. Gel electrophoresis of proteins: a practical approach. 3a . ed. In Hames,
B.D. Oxford university press, Oxford. pp 1-50.
RYCHLIK, W. 1989. OLIGO 4.1, Primer Analysis Software. National Bioscience,
USA.
SHÄEFER, D. 2002. Ajuste protocolar e identificación de proteínas de alto peso
molecular (gluteninas) y su relación con parámetros de calidad industrial en trigo de pan
(Triticum aestivum L.). Tesis Título Ingeniero Agrónomo. Temuco. Universidad de la
Frontera, Facultad de Ciencias Agrarias. 113 p.
SOURDILLE, P.; PERRETANT, M.R.; CHARMET, G.; LEROY, P.; GAUTIER, M.F.;
JOURDRIER, P.; NELSON, J.C.; SORRELLS, M.E. y BERNARD, M. 1996. Linkage
between RFLP markers and genes affecting kernel hardness in wheat. Theor. Appl.
Genet. 93 : 580-586.
VAZQUEZ, J.F.; SANCHEZ-YELAMO, M.D. y CARRILLO, J.M. 2000. Marcadores
genéticos y bioquímicos. In Nuez, F. y Carrillo, J.M. Los marcadores genéticos en la
mejora vegetal. pp 25-89.
YUFENG, M. y FLORES, R.A. 2001. Mechanical starch damage effects on wheat
flour tortilla texture. Cereal Chem. 78 (3) : 286-293.
ANEXOS
ANEXO 1. Reactivos utilizados en la metodología con sus
respectivas marcas.
82