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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS
EXTRACTOS ETANÓLICOS Y/O ACEITES ESENCIALES DE LAS
ESPECIES VEGETALES Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata FRENTE A
MICRORGANISMOS PATÓGENOS Y FITOPATÓGENOS
ANDREA JIMENA LIZCANO RAMÓN
JENNY LISSETH VERGARA GONZÁLEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá D.C., Colombia
Julio 18 de 2008
i
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS
EXTRACTOS ETANÓLICOS Y/O ACEITES ESENCIALES DE LAS
ESPECIES VEGETALES Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata FRENTE A
MICRORGANISMOS PATÓGENOS Y FITOPATÓGENOS
ANDREA JIMENA LIZCANO RAMÓN
JENNY LISSETH VERGARA GONZÁLEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá D.C.
Julio 18 de 2008
ii
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS
EXTRACTOS ETANÓLICOS Y/O ACEITES ESENCIALES DE LAS
ESPECIES VEGETALES Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata FRENTE A
MICRORGANISMOS PATÓGENOS Y FITOPATÓGENOS
ANDREA JIMENA LIZCANO RAMÓN
JENNY LISSETH VERGARA GONZÁLEZ
APROBADO
_____________________________
María Eugenia Torres
Microbióloga Industrial
Director
___________________________
Alberto Gómez Mejía
Doctoris Scientiae Juridicae
Codirector
______________________________
Prof. Miguel Pinzón
Asesor Estadístico
iii
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS
EXTRACTOS ETANÓLICOS Y/O ACEITES ESENCIALES DE LAS
ESPECIES VEGETALES Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata FRENTE A
MICRORGANISMOS PATÓGENOS Y FITOPATÓGENOS
ANDREA JIMENA LIZCANO RAMÓN
JENNY LISSETH VERGARA GONZÁLEZ
APROBADO
______________________________
________________________________
Ingrid Schuler. Phd
Decana Académica
Facultad de Ciencias
Janeth Arias Palacios M.Sc.
Directora de Carrera
Microbiología Industrial
iv
DEDICATORIA
Durante estos años ha habido momentos inolvidables, para alegrarse, para
entristecerse pero sobre todo para sentirse orgulloso de haber terminado un camino
bastante largo. Cuando ya estoy a unas pocas semanas de graduarme, es que me doy
cuenta de tantos momentos que tal vez, pasaron desapercibidos, y ahora llegan como
buenos recuerdos. Muchísima gente involucrada en estos años han hecho que este
tiempo no fuera una lucha sino más bien, como una aventura. A todos
ellos….Muchas Gracias.
Dedico esta página a mis padres: Eduardo y Elizabeth, mis hermanos: Eli, Caro y
Jorge, mi novio Héctor, a Dios, Ecopetrol y amigos, a los que me han enseñado que
tenemos algo muy importante para ofrecernos unos a otros y a todos aquellos que
han logrado pasar toda la clase de experiencias, mirando el miedo cara a cara, con
fuerza, valor y confianza, para con orgullo decir: “ He sobrevivido una vez más, y
estoy en capacidad de manejar lo que venga ”.
Jenny Lisseth Vergara González
Dedico este trabajo a todas las personas que me acompañaron en el transcurso de mi
vida, en especial, a mi papá, mí mamá, mis hermanas (Martha y Liliana), mi tía Libia
por apoyarme en los momentos en que mas los necesite, ayudarme y aconsejarme en
los momentos más duros. Aquellas personas que me soportaron durante estos años, a
quienes con regaños y un poco de afán por verme crecer como persona supieron
comprenderme y aquellos que tal vez no me vieron como la mejor pero siempre con
un pensamiento de que podría serlo.
A todos ellos Gracias.
Andrea Jimena Lizcano Ramón
v
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos al Jardín Botánico de Bogotá D.C José Celestino Mutis por facilitarnos
materiales y equipos para el desarrollo de este trabajo.
Al equipo de trabajo de las instalaciones de Subdirección Científica por su
colaboración, paciencia y dedicación para la culminación de nuestro trabajo de grado.
A la Microbióloga Industrial María Eugenia Torres por sus consejos y por compartir
desinteresadamente sus amplios conocimientos y experiencia.
A Freddy Alejandro Ramos por transmitirnos sus conocimientos y darnos seguridad
Al Dr. Alberto Gómez Mejía por su confianza y apoyo incondicional
A Héctor Lancheros por su contribución a la realización de este estudio aportándonos
su orientación estadística en la elaboración y discusión de nuestro trabajo de grado.
Al profesor Miguel Pinzón por su compromiso y conocimientos estadísticos
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
PDA (Agar papa dextrosa)
DCM (Diclorometano)
EX1 (Extracto etanólico hojas de Valeriana pilosa)
EX2 (Extracto etanólico hojas de Hesperomeles ferruginea)
EX3 (Extracto etanólico hojas de Myrcianthes rhopaloides)
EX4 (Extracto etanólico hojas de Passiflora manicata)
CDC (Centro para el Control y Prevención de Enfermedades)
FR1 (Fase acuosa de Extracto hojas Passiflora manicata)
FR2 (Fase diclorometano de Extracto hojas Passiflora manicata)
FR3 (Fase alcohol isoamílico de Extracto hojas Passiflora manicata)
AE1 (Aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides)
C+
(Control positivo)
C-
(Control Negativo)
Cm (Cloramfenicol)
gl
(Grados de libertad)
vii
TABLA DE CONTENIDO
Pág
1. INTRODUCCIÓN
2. MARCO TEÓRICO
2.1 GENERALIDADES METABOLITOS SECUNDARIOS
2.1.1 Antecedentes de los metabolitos secundarios de origen vegetal
2.1.2 Importancia de los metabolitos secundarios
2.1.3 Metabolito secundario
2.1.4 Metabolismo secundario
2.2 EXTRACTOS
2.2.1 Consistencia de los extractos
2.2.1.1 Extractos blandos
2.2.1.2 Extractos firmes o de consistencia pilular
2.2.1.3 Extractos secos
2.2.1.4 Extractos fluidos
2.2.2 Características de los extractos
2.2.3 Conservación de los extractos
2.3 METODOS
2.3.1 Métodos de extracción
2.4 MOLÉCULAS ACTIVAS EN EL ÁMBITO MEDICINAL E INDUSTRIAL
2.4.1 Los Alcoholes
2.4.2 Los Fenoles
2.4.3 Cumarinas
2.4.4 Alcaloides
2.4.5 Los Aldehídos
2.4.6 Los Terpenoides
2.4.7 Flavonas
2.4.8 Los Isoflavonoides
2.4.9 Los Alcaloides
viii
2.4.10 Quinonas
2.4.11 Tanoides o Taninos
2.4.12 Los aceites esenciales
2.4.13 Saponinas
2.4.14 Esteroides y Triterpenos
2.4.15 Cromenos y Benzofuranos
2.4.16 Sesquiterpenlactonas
2.5 ESPECIES VEGETALES
2.5.1 Valeriana pilosa
2.5.1.1 Características generales
2.5.1.1.1 Descripción
2.5.1.1.2 Distribución geográfica
2.5.1.1.3 Fitoquímica
2.5.1.1.4 Usos
2.5.2 Myrcianthes rhopaloides
2.5.2.1 Características generales de la especie
2.5.2.1.1 Descripción
2.5.2.1.2 Distribución Geográfica
2.5.2.1.3 Propagación tradicional:
2.5.2.1.4 Cosecha
2.5.2.1.5 Usos
2.5.2.1.6 Bromatología y Aporte Nutricional
2.5.2.1.7 Fitoquímica
2.5.3 Passiflora manicata
2.5.3.1 Características generales de las especies
2.5.3.1.1 Descripción
2.5.3.1.2 Distribución geográfica
2.5.3.1.3 Usos
2.5.4 Hesperomeles ferruginea
2.5.4.1 Características generales de las especies
ix
2.5.4.1.1 Descripción
2.5.4.1.2 Distribución geográfica
2.5.4.1.3 Usos
2.5.4.1.4 Fitogeografía y ecología
2.5.4.1.5 Fitoquímica
2.6 MICROORGANISMOS SELECCIONADOS
2.6.1 Hongo fitopatógeno
2.6.1.1 Alternaria sp.
2.6.2 Microorganismos patógenos
2.6.2.1 Candida albicans
2.6.2.2 Staphylococcus aureus
2.6.2.3 Escherichia coli
2.6.2.4 Bacillus subtillis
2.7 ANTIMICROBIANOS
2.7.1 CLORAMFENICOL
2.7.1.1 Origen
2.7.1.2 Mecanismos de acción del cloramfenicol
2.7.1.3 Mecanismos de resistencia bacteriana al cloramfenicol
2.7.1.4 Constitución química
2.7.1.5 Propiedades
2.7.2 GRISEOFULVINA
2.8 MÉTODOS DE EVALUACIÓN ANTIMICROBIANA
2.8.1 Método de difusión en gel
2.8.2 Método de dilución
2.8.3 Método de Bioautografia
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 Formulación del problema
3.2 Justificación de la Investigación
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
x
4.2 Objetivos Específicos
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 LOCALIZACIÒN
5.2 RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS
5.3 TRATAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL
5.4 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS
5.4.1 Extracto Etanólico
5.4.2 Aceite Esencial
5.5 MICROORGANISMOS
5.5.1 Cepas
5.5.2 Aislamiento de las cepas
5.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS
5.6.1 Prueba de susceptibilidad antimicrobiana
5.6.1.1 Técnica de difusión de disco en Agar
5.6.1.1.1 Bacterias
5.6.1.1.2 Levadura
5.6.1.1.2.1 Evaluación antifúngica
5.6.1.1.3 Hongo
5.6.2 Ensayo biodirijido
5.7 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
5.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7. CONCLUSIONES
8. RECOMENDACIONES
9. BIBLIOGRAFANEXOS
xi
ÍNDICE DE GRÁFICAS
Gráfica 1. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al
control positivo para S. aureus.
Gráfica 2. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al
control positivo para E. coli.
Gráfica 3. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al
control positivo para B. subtillis.
Gráfica 4. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al
control positivo para C. albicans.
Gráfica 5. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al
control positivo para Alternaria sp
Gráfica 6. Diámetro de halos de inhibición Vs. Microorganismos seleccionados para
las diferentes fases.
Gráfica 7. Halos de inhibición Vs. Fracciones para cada microorganismo
Gráfica 8. Halos de inhibición Vs Microorganismos seleccionados frente al aceite
esencial de M. rhopaloides
xii
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Valeriana pilosa
Figura 2. Myrcianthes rhopaloides
Figura 3. Passiflora manicata
Figura 4. Hesperomeles ferruginea
Figura 5. Características Macro y Microscópicas de Alternaria sp
Figura 6. Características Macro y Microscópicas de Candida albicans.
Figura 7. Características Macro y Microscópicas de Staphylococcus aureus
Figura 8. Características Macro y Microscópicas de Escherichia coli
Figura 9. Características Macro y Microscópicas de Bacillus subtillis
Figura 10. Rotavapor Heidolph LABOROTA 4000-EFFICIENT
Figura 11. Proceso para la obtención de extractos a partir del material vegetal
Figura 12. Montaje Hidrodestilación hojas de Myrcianthes rhopaloides
Figura 13. Fraccionamiento hojas de Passiflora manicata
Figura 14. Fase diclorometano (DCM) de extracto hojas Passiflora manicata
Figura 15. Fase Acuosa - Fase Alcohol Isoamílico de extracto hojas de Passiflora
manicata
Figura 16. Proceso para la obtención de fracciones a partir del material vegetal
Figura 17. Ensayos biológicos con extractos vegetales EX1 (Valeriana pilosa), EX2
(Hesperomeles ferruginea), EX3 (Myrcianthes rhopaloides), EX4 (Passiflora
manicata), C+ (Control positivo), C- (Control Negativo) frente a microorganismos
patógenos y fitopatógenos A. Escherichia coli, B. Candida albicans, C.
Staphylococcus aureus, D. Bacillus subtillis, E. Alternaria sp.
Figura 18. Ensayo biológico de las fracciones (FR1: Fase acuosa, FR2: Fase
Diclorometano, FR3: Alcohol isoamilico) del extracto de Passiflora manicata frente
a E. coli
Figura 19. Ensayo biológico del aceite esencial del extracto de M. rhopaloides frente
A. B. subtillis y B. C. albicans
xiii
INDICE TABLAS
Tabla 1. Análisis bromatológicos proximales para M. rhopaloides (contenido/100g
de pulpa)
Tabla 2. Peso en gramos del material vegetal a extraer.
Tabla 3. Especies, Parte a estudiar y Extractos a evaluar
Tabla 4. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para S. aureus.
Tabla 5. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para E. coli.
Tabla 6. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para B. subtillis.
Tabla 7. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para C.albicans.
Tabla 8. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rophaloides y Passiflora manicata para Alternaria sp..
Tabla 9. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores
Tabla 10. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos
seleccionados
Tabla 11. Prueba de comparación de medias de Tukey para extractos
Tabla 12. Análisis de varianza para S. aureus
Tabla 13. Prueba de comparación de medias de Tukey para S. aureus
Tabla 14. Análisis de varianza para E. coli
Tabla 15. Prueba de comparación de medias de Tukey para E. coli
xiv
Tabla 16. Análisis de varianza para B. subtillis
Tabla 17. Prueba de comparación de medias de Tukey para B. subtillis
Tabla 18. Análisis de varianza para Candida albicans.
Tabla 19. Prueba de comparación de medias de Tukey para Candida albicans
Tabla 20. Análisis de varianza para Alternaria sp.
Tabla 21. Prueba de comparación de medias de Tukey para Alternaria sp.
Tabla 22. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para E. coli.
Tabla 23. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para S. aureus.
Tabla 24. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para B. subtillis.
Tabla 25. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para Candida albicans.
Tabla 26. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar y de
fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para Alternaria sp.
Tabla 27. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores
Tabla 28. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos
seleccionados
Tabla 29. Prueba de comparación de medias de Tukey para fracciones.
Tabla 30. Análisis de varianza para S. aureus con las diferentes fracciones
Tabla 31. Prueba de comparación de medias de Tukey para S. aureus
Tabla 32. Análisis de varianza para E. coli
Tabla 33. Prueba de comparación de medias de Tukey para E. coli
Tabla 34. Análisis de varianza para B. subtillis
Tabla 35. Prueba de comparación de medias de Tukey para B. subtillis
Tabla 36. Análisis de varianza para Candida albicans.
Tabla 37. Prueba de comparación de medias de Tukey para Candida albicans
Tabla 38. Análisis de varianza para Alternaria sp.
Tabla 39. Prueba de comparación de medias de Tukey para Alternaria sp.
xv
Tabla 40. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite
esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para B. subtillis.
Tabla 41. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite
esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para S. aureus.
Tabla 42. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite
esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para E. coli.
Tabla 43. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite
esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para Alternaria sp.
Tabla 44. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite
esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para Candida albicans.
Tabla 45. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores
Tabla 46. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos
seleccionados con respecto al aceite esencial.
xvi
INDICE DE ANEXOS
ANEXO 1
PREPARACIÓN AGAR MUELLER HINTON
ANEXO 2
PREPARACIÓN AGAR CHROMOCULT
ANEXO 3
PREPARACIÓN AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)
ANEXO 4
PREPARACIÓN AGAR BAIRD PARKER
ANEXO 5
PREPARACIÓN DE AGAR BPLS (Verde brillante, Rojo de fenol,
Lactosa y Sacarosa)
xvii
RESUMEN
El presente trabajo se realizó en los laboratorios de las
instalaciones de la
Subdirección Científica del Jardín Botánico de Bogotá José Celestino Mutis, con el
fin de observar y determinar el efecto antimicrobiano de extractos etanólicos
vegetales
y aceite esencial obtenidos a partir de 4 especies Valeriana pilosa,
Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata priorizadas
dentro del proyecto de Uso Sostenible del Distrito Capital y la región frente a
microorganismos patógenos
Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus
aureus, Candida albicans y un hongo fitopatógeno Alternaria sp, cepas adquiridas de
la Pontificia Universidad Javeriana.
Para la obtención de los extractos etanólicos se utilizó el material vegetal seco
previamente triturado, el cual fue macerado en frio utilizando como solvente etanol
durante 48 horas, se realizó
reflujo con etanol-agua(9:1) para su posterior
concentración a presión reducida. Para obtener aceite esencial a partir de las hojas de
Myrcianthes rhopaloides se utilizó la técnica de hidrodestilación.
Luego de obtener los extractos a evaluar se midió la actividad antimicrobiana
utilizando la técnica de difusión de disco en agar de Kirby-Bauer, prueba que
permitió medir la suceptibilidad In Vitro de los microorganismos patógenos y
fitopatógenos seleccionados frente a sustancias de origen natural con potencial
antimicrobiano, utilizando 300 μg de
extracto obtenido por especie vegetal,
utilizando de igual manera como control positivo 10 μg de cloramfenicol y agua
estéril como control negativo.
Al analizar los resultados de los diferentes ensayos se observó que el extracto
etanólico de Passiflora manicata presentó mayor actividad antimicrobiana frente a E.
coli, Candida albicans y B. subtillis, razón por la cual se seleccionó para fraccionar el
extracto crudo utilizando como solventes diclorometano, agua y alcohol isoamílico,
xviii
demostrando que la fase acuosa fue la de mayor efecto inhibitorio frente a todos los
microorganismos evaluados. Los resultados obtenidos para el aceite esencial obtenido
con las hojas de Myrcianthes rhopaloides mostraron inhibición solo frente a Candida
albicans.
En este trabajo se concluyó que Passiflora manicata fue el extracto etanólico que
presentó mayor acción frente a todos los microorganismos, permitiendo realizar el
fraccionamiento con los diferentes solventes identificando a la fase acuosa como la
responsable del principio activo con potencial antimicrobiano; cabe anotar que para
dar continuidad a futuras investigaciones entorno a la potencialidad antimicrobiana de
la especies es necesario el aislamiento y la elucidación de la molécula capaz de
inhibir a los microorganismo seleccionados.
xix
ABSTRACT
The present work was performed in the Laboratories of the Scientific Subdirection of
Botanical Garden of Bogotá José Celestino Mutis, in order to observe and determine
the antimicrobial effect of ethanolic plant extracts and essential oil, obtained from 4
species Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rophaloides and
Passiflora manicata chosen for the Sostenible Use project of the Capital District and
the Region. These species were tested against the pathogen microorganisms
Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans and the
phythopathogen fungus Alternaria sp, which were acquired from the storage of the
Pontificia Universidad Javeriana.
For the obtainment of the ethanolic extracts we used dried plant material that was
previously crushed; this was cold macerated using ethanol as a solvent during 48
hours. We used reflux ethanol-water (9:1) in order to concentrate it in a reduced
pressure.
For the obtainment of the essential oil from the leaves of Myrcianthes rophaloides
we used the hydrodistillation technique.
After, we measured the antimicrobial activity using the difussion disc agar technique
of Kirby-Bauer. This technique allows us to measure the In vitro oversensitivity of
the pathogen and phytophatogen microorganisms, to the natural origin substances
which have antimicrobian potential. We took 300 μg of each extract, using 10 μg of
cloramfenicol as a postive control and water as a negative control.
As a result of the different tests, we observed that the ethanolic extract of Passiflora
manicata had a better antimicrobial activity against E.coli, Candida albicans and B.
subtillis. For this reason we chose the extract of Passiflora manicata and divided it
using dichloromethane, water and isoamilic alcohol as solvents. We found that the
xx
aqueous phase showed the highest antimicrobial effect against all the evaluated
microorganisms.
The results for the essential oil which was obtained from the leaves of Myrcianthes
rophaloides showed that Candida albicans was inhibited the most.
In this work we concluded that Passiflora manicata was the ethanolic extract that
showed the best results against all the microorganisms, permiting the division with
the different solvents. We identified that the aqueous phase was responsible for all of
the principle actions because there was the antimicrobial potential.
In order to continue fututre investigations about antimicrobial potential of plant
species it is necessary to find and isolate the specific molecule able to inhibit the
microorganism chosen.
xxi
1. INTRODUCCIÓN
Se puede afirmar que el uso de las plantas medicinales nació con el hombre. Desde
tiempos prehistóricos hasta comienzos del siglo XIX se utilizaron por ensayo error,
aquellos extractos que brindaban curar enfermedades. Esta práctica médica pasaba y
se perfeccionaba de generación en generación, por lo cual se denominó medicina
tradicional.
Hasta el siglo XVIII se conocieron las propiedades curativas de las plantas, su efecto
sobre el organismo y su modo de aplicación, desconociendo en muchas de los casos
la composición y caracterización de principios activos. Con el desarrollo de las
teorías de la evolución, herencia genética, el uso del microscopio y el nacimiento de
ciencias como la fitoquímica, fue posible el reconocimiento y el aislamiento de
principios activos de muchas especies vegetales. La gran mayoría de los principios
activos se han obtenido sintéticamente en laboratorios, para su posterior uso en la
preparación de medicamentos químicos. Con el paso de los años el consumo de
medicamentos sintéticos se incrementó, desplazando cada vez más el uso directo de
plantas medicinales alejándose así de la medicina tradicional.
Desde tiempos muy remotos las plantas han cumplido un papel importante en el área
terapéutica gracias a las múltiples propiedades que ellas poseen. Por esta razón en las
últimas décadas ha ido tomando cada día mayor importancia su estudio y el desarrollo
de técnicas analíticas que permitan la determinación e identificación de las sustancias
o principios activos contenidos en especies vegetales.
En la actualidad, el gran desafío para los países ricos en biodiversidad es poder
vincular y convertir el conocimiento proveniente de los recursos biológicos en
compuestos, procesos, métodos, herramientas o productos útiles, como parte del
aprovechamiento y la explotación sostenible de la diversidad biológica en beneficio
de la sociedad.
xxii
Colombia cuenta con un extenso banco de germoplasma, rico en moléculas activas de
gran interés para la industria farmacéutica y
dada la gran disminución de
disponibilidad, uso y aprovechamiento de especies vegetales que se encuentran en
ecosistemas de Distrito Capital y la región, para entidades como el Jardín Botánico
José Celestino Mutis (JBJCM) como centro de investigación y desarrolló científico
en cumplimiento de sus objetivos misionales, contribuye con la generación del
conocimiento en cuanto al uso y el aprovechamiento de especies vegetales
promisorias presentes en los ecosistemas del Distrito Capital y la región.
Con base en lo anterior en aras de buscar alternativas de aprovechamiento y conocer
la presencia de principios activos en especies como Valeriana pilosa, Hesperomeles
ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata,
priorizadas como
potenciales dentro del proyecto de “ Uso Sostenible de los recursos vegetales del
Distrito Capital y la regióni”, se planteó evaluar la actividad antimicrobiana de los
extractos etanólicos o aceites esenciales obtenidos a partir de las especies, frente a
microorganismos patógenos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus
aureus, Candida albicans y el hongo fitopatógeno Alternaria sp utilizando la técnica
de susceptibilidad microbiana., para determinar cual de los extractos presenta mayor
actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados.
xxiii
2. MARCO TEÓRICO
2.1 GENERALIDADES METABOLITOS SECUNDARIOS
2.1.1 Antecedentes de los metabolitos secundarios de origen vegetal
Aproximadamente hasta el año 1800, apenas se había progresado en el campo de la
Fitoquímicaii. Solo se conocían unas cuantas sustancias como el azúcar de caña,
almidón, alcanfor y ácido benzoico, debido a que su preparación era sumamente
sencilla. Mezclas complejas como grasas, aceites, esencias, breas y resinas, se habían
utilizado y elaborado, aunque prácticamente no se sabía nada acerca de su
composición. Los primeros investigadores en el campo de la Fitoquímica no llegaron
a apreciar la extrema complejidad de las materias con que realizaban sus
investigaciones y carecieron casi por completo de las técnicas necesarias para
conseguir un proceso auténtico. Se quemaron grandes cantidades de plantas para
obtener cenizas y esos primitivos investigadores se desanimaron al encontrar
diferencias mínimas entre las cenizas de una planta venenosa y otra inocua. La
expresión, la extracción acuosa y la evaporación se habían empleado tiempo atrás en
la obtención de azúcar a partir de la caña de azúcar. El farmacéutico francés Nicolás
Lémery (1645-1715) extendió el empleo de los procesos de extracción y utilizó el
alcohol como disolvente (Torres C, 2004).
Robert Boyle (1627-1691) abandonó la antigua teoría de Aristóteles de que la materia
está compuesta de cuatro elementos y aunque jamás llegó a aislar ningún alcaloide es
evidente que iba bien encaminado cuando trató el opio con carbonato potásico y
alcohol (Torres C, 2004).
En 1747 se aisló la sacarosa de muchas plantas, entre ellas de la remolacha, por el
farmacéutico alemán A.S. Marggraf (1707-1780). K. W. scheele (1742-1786), obtuvo
un gran éxito en el campo de la Fitoquímica, al aislar los ácidos cítrico, gálico,
málico, oxálico, tartárico y prúsicoiii (Torres C, 2004).
xxiv
En el siglo XIX, los progresos alcanzan mayor rapidez. En 1803 se aísla el primer
alcaloide, la narcotina, y le siguieron rápidamente muchos otros, como morfina,
estricnina, emetina. Entre 1813 y1823, Chevreul dilucidó la naturaleza química de las
grasas y los aceites fijos (Torres C, 2004).
Hasta mediados del siglo XX, el principal empeño, en cuanto a la química de los
productos naturales, siguió siendo el aislamiento y determinación de la estructura de
una amplia gama de compuestos. Resulta claro que se habían establecido los
principales tipos estructurales encontrados comúnmente en las plantas. A partir de
entonces, la atención de los químicos respecto a los productos naturales fue virando
hacia la disolución de las rutas biosintéticas halladas en la planta (Torres C, 2004).
2.1.2 Importancia de los metabolitos secundarios
A lo largo de la historia, los metabolitos secundarios de las plantas han sido utilizados
por la humanidad convirtiéndose en una fuente inagotable de compuestos químicos
y complejas sustancias activas, que desde hace muchos años han sido explotadas por
el hombre (Torres C, 2004).
Así mismo es importante destacar que a pesar de todos los esfuerzos de naciones,
instituciones gubernamentales y no gubernamentales e investigadores en aumentar el
nivel y el caudal de conocimientos adquiridos sobre las
trasformación secundaria (de frutos, flores,
metodologías de
semillas, hojas y tallos) y de la
identificación y caracterización de los metabolitos secundarios de especies vegetales
priorizadas, en la actualidad sólo unos pocos metabolitos se utilizan de forma
industrial, por lo que se ha creado la necesidad de generar opciones y alternativas de
producción enfocadas al
uso sostenible de todos aquellos recursos vegetales
disponible en el entorno trabajando activamente en la detección y caracterización de
sustancias producidas por diferentes especies promisorias
que pueden tener
aplicación en la industria (cosmética, farmacéutica, textilera y agroalimentaria)
(Torres C, 2004).
xxv
2.1.3 Metabolito secundario
Son todas aquellas moléculas activas generadas por diversas especies vegetales. Los
metabolitos son moléculas que no son necesarias para el crecimiento y la
reproducción de las plantas, pero cumplen con roles muy importantes en el reino
vegetal, pueden suponer una ventaja competitiva considerable (Torres C, 2004).
2.1.4 Metabolismo secundario
El metabolismo secundario compromete aquellos procesos químicos que son únicos
para una planta dada y no son universales. Dicho metabolismo es la química que
conduce a la formación de un producto natural. Algunas porciones de esta química
son comunes para un número de plantas diferentes o familias de plantas, pero
actualmente la química de los metabolitos secundarios es usualmente diferente de una
planta a otra, pues precursores químicos comunes pueden conducir a resultados
totalmente diferentes (Torres C, 2004).
2.2 EXTRACTOS VEGETALES
Los extractos vegetales se han definido como un concentrado obtenido por
tratamiento de productos vegetales con solventes apropiados, tales como agua, etanol
o éter, de elementos solubles, constituidos por una mezcla de principios activos y
sustancias inertes que se producen de la totalidad o de partes de una planta fresca o
seca (Ruiz & Susunaga, 2000).
2.2.1 Consistencia de los extractos
Alzate en 1990, descubrió la consistencia ideal que debían tener los extractos. De
acuerdo con este aspecto comúnmente los extractos se clasifican en cuatro grupos:
blandos, firmes, secos y fluidos (Barreto J, 1997).
xxvi
2.2.1.1 Extractos blandos
Tienen la consistencia de la miel espesa; algunas veces, debido a la absorción de la
humedad atmosférica, presentan una consistencia menos densa (Barreto J, 1997).
2.2.1.2 Extractos firmes o de consistencia pilular
Como su nombre lo indica deben tener una estrecha semejanza con la masa con la
cual se fabrican o manufacturan las píldoras; deben tener la característica especial de
no adherirse a los dedos (Barreto J, 1997).
2.2.1.3 Extractos secos
Anteriorrmente se les conocía con la denominación de “sales esenciales”. Son los
extractos en los cuales el disolvente ha sido casi completamente eliminado. Contiene
tan solo del 5 al 8% de agua. Se reducen fácilmente a polvo y facilitan su
manipulación y dosificación. La forma farmacéutica de extractos secos aparece en
varias farmacopeas (Belga, Norteamericana, noruega y mexicana), pero no indican un
método exacto para la preparación de este tipo de extractos. Golaz (1973) les dio el
nombre de extractos unitarios y los recomienda para la preparación de tinturas y
jarabe (Barreto J, 1997).
2.2.1.4 Extractos fluidos
Son preparados en una forma tal que el peso del extracto corresponde exactamente al
peso de la sustancia empleada como medicamento, desecada al aire y pulverizada
(Barreto J, 1997).
xxvii
2.2.2 Características de los extractos
Estudios realizados por Corpas y Barrero entre 1988 y 1991, permitieron fundamentar
las siguientes características específicas de los extractos:
a. Los extractos bien preparados son de color más o menos oscuros; cuando han
sido preparados al vacío, son ligeramente más claros.
b. Algunos son de color café amarillento, otros rojizos; los extractos
provenientes de hojas son verdosos debido a la clorofila.
c. Su aspecto debe ser liso, fino y homogéneo.
d. Su olor y sabor son propiedades características de la materia prima que les ha
dado su origen. Cuando son mal preparados, adquieren olor a caramelo o
confitura poco conocida.
e. La solubilidad de los extractos es variable y está en relación directa con el tipo
de preparación al cual fueron sometidos.
f. Los extractos acuosos son completamente solubles en agua y producen una
solución transparente, algunas veces ligeramente turbia, debido a que han sido
preparados con mucha anterioridad.
g. Los extractos alcohólicos son parcialmente solubles en agua y algunas veces
son totalmente insolubles, especialmente los extractos que han sido
preparados con alcohol fuerte tienen un excelente índice de disolución, en el
mismo título alcoholimétrico del alcohol con el cual han sido preparados.
h. Los extractos alcohólicos preparados con hojas, dan soluciones coloreadas de
verde, pues la eliminación de la clorofila no puede ser total. Cordell (1995)
propuso ensayos generales para someter a los extractos a pruebas específicas
xxviii
para observar su calidad
y composición final. Estos trabajos fueron
remontados por Corpas, quien propuso realizar ensayos de identidad a los
extractos obtenidos (Barreto J, 1997).
2.2.3 Conservación de los extractos
Labfarve (1995) determinó las alteraciones y los diferentes métodos de conservación
de los extractos. Los extractos son medicamentos en donde la alteración modifica y
varia notoriamente la naturaleza del producto. En principio, un extracto seco o de tipo
pilular se conserva mejor que un extracto acuoso. Esto no es totalmente exacto, pues
la naturaleza del producto interviene igualmente. Algunos extractos se descomponen
al aire, otros absorben humedad atmosférica. Algunos se recubren de hongos y
permiten el desarrollo de gérmenes bacterianos. Por otra parte, las alteraciones más
frecuentes consisten en modificaciones químicas no aparentes como sucede con los
extractos de flores verdes que por la oxidación de la clorofila pierden su color. Los
extractos a base de alcaloides, bajan de título, según lo demuestran las
investigaciones de Fricotel y Métin (1970). Esta disminución del título alcalóidico, es
especialmente sensible a los extractos blandos y de aspecto pilular y bastante menos
notorio en los extractos secos (Barreto J, 1997).
Según Corpas y Barriga (1993), la conservación de los extractos es indispensable y
deben cumplir las siguientes condiciones:
a. Se deben conservar protegiéndolos de la luz.
b. Los envases deben estar bien tapados.
c. Se deben conservar en un medio ambiente seco (Barreto J, 1997).
Desde luego, son numerosos los métodos que se han indicado para la conservación de
los extractos. Para mayor comodidad ellos se pueden clasificar, en dos categorías
(Barreto J, 1997).
xxix
En el primer grupo tenemos aquellos a los cuales no se les ha adicionado ninguna
materia extraña. Al segundo grupo, por el contrario, pertenecen aquellos extractos
que han sido objeto de la adición de productos extraños, de naturaleza físico-química
definida (Barreto J, 1997).
2.3 METODOS DE EXTRACCIÓN
Deben obedecer a la información de la naturaleza química de las sustancias, presentes
en la planta y al propósito de la investigación. En el caso de búsqueda de sustancias
para la comprobación de actividad biológica, la extracción del material vegetal debe
hacerse en agua o con solución disotónica (0.9 % NaCl). Frecuentemente se usa la
extracción con solventes orgánicos de bajo punto de ebullición (alcohol, acetato de
etilo) y de baja reactividad. Algunas veces es conveniente desengrasar el material
vegetal con éter de petróleo (extracto etéreo) o hexano. El alcohol es generalmente
mas eficaz para recuperar la mayoría de los metabolitos secundarios. Los extractos
son evaporados bajo presión reducida o liofilizados, en el caso de extracción con agua
(Arévalo A, 1996).
Los métodos de extracción se basan en las diferentes solubilidades de los diversos
compuestos encontrados en el material vegetal, así , para sustancias de baja polaridad
( lípidos) se utilizan como solventes el éter de petróleo y cloroformo; para sustancias
de mediana y alta polaridad el acetato de etilo, el etanol y la acetona . Las
extracciones pueden hacerse por “extracción continua en soxhlet”, en la cual el
material seco se sitúa en una cámara central y el solvente se hace evaporar en
caliente, en un recipiente inferior, el vapor del solvente asciende al condensador y
gotea sobre el material vegetal. Por “reflujo”, el material vegetal y el solvente se
colocan en un balón el cual tiene acoplado un refrigerante, se calienta, el solvente
evaporado se condensa y vuelve a mezclarse con el material vegetal. Y por
“maceración en frío “, el material se mezcla con el solvente triturado continuamente
en frío (Arévalo A, 1996).
xxx
2.4 MOLÉCULAS ACTIVAS EN EL ÁMBITO MEDICINAL E INDUSTRIAL
No todos los componentes químicos elaborados por la planta, poseen igual interés
para la Fitoquímica. Los denominados principios activos son frecuentemente
alcaloides o heterósidos; ambos merecen por ello especial atención. Otros grupos,
como los glúcidos, grasas y proteínas, tienen importancia dietética y muchos, como
los almidones y las gomas, se emplean en técnica farmacéutica, aunque carecen de
señalada acción farmacológica. Otras sustancias como el oxalato cálcico, sílice,
lignina y materiales colorantes, pueden ser materias primas coadyuvantes en
diferentes procesos en la industria (Torres C, 2004).
2.4.1 Los Alcoholes: Los alcoholes libres no están generalmente presentes más que
en forma de trazas en las plantas vivas. Son esterificados y combinados bajo la forma
de heterósidos. Se encuentran sobre todo en los aceites esenciales. El olor de ciertos
alcoholes les da gran aplicación en la perfumería o como aromatizante (Carey, 2003).
Los alcoholes alifáticos son tensoactivos e hipotensores1. Todos los alcoholes son
tóxicos en grado diverso. Los alcoholes de las plantas umbelíferas, tienen una
toxicidad muy elevada (Carey, 2003).
2.4.2 Los Fenoles: Entre los fenoles encontrados en estado libre, se encuentran
constituyentes importantes de las esencias como el timol, el carbacrol (esencias de
tomillo), el eugenol y el chavicol. Muchos de los fenoles están en estado de éter
oxidado en las esencias, entre ellos citaremos el estragol, la miristicina, el apiol y el
atenol (Carey, 2003).
Los fenoles tienen una actividad fisiológica marcada porque poseen propiedades
antisépticas. Hidroquinol, timol (este último también antihelmíntico), eugenol
(igualmente anestésico local), el apiol es emenagogo, el anetol es carminativo2 y
1
2
Fitoterapia que actúa a nivel de los vasos sanguíneos.
Dícese de los agentes que previenen la formación de gases en el tubo digestivo o provocan la
expulsión de los mismos
xxxi
antidiarreico
a
pequeñas
dosis
y
veneno
del
SNC
a
altas
dosis.
El
3
tetrahidrocannabinol es alucinógeno. Los polifenoles del helecho son antihelmínticos
(Carey, 2003).
Son los compuestos más simples y consisten en un anillo fenólico sustituido. Algunos
ejemplos los constituyen el catecol, el pirogalol y los ácidos cinámicos y cafeico.
Plantas productoras de compuestos de estas características son el tomillo, la
manzanilla y la gayuba, cuyo principio activo, la arbutina, ha sido utilizado a lo largo
de los años en el tratamiento de la infección urinaria (Domingo D., 2003).
El mecanismo parece estar relacionado con la inhibición enzimática por los
compuestos oxidados, posiblemente mediante reacciones de grupos sulfihidrilo o por
interacciones no específicas con proteínas (Domingo D., 2003).
2.4.3 Cumarinas: Son compuestos derivados de la benzo-α-pirona, como la
cumarina, la esculetina, la umbeliferona y la escopoletina. Están presentes en las
margaritas y tienen propiedades antiinflamatorias, antitrombóticas y vasodilatadoras.
Parece que su mecanismo de acción antimicrobiano es mediante interacción con el
ADN eucariota, lo que explica también su actividad antiviral (Domingo D., 2003).
2.4.4 Alcaloides: Reciben esta denominación los compuestos nitrogenados
heterocíclicos. Pertenecen a este grupo, entre otros, sustancias como la morfina, la
heroína y la cocaína. El mecanismo de acción de los alcaloides parece ser mediante
intercalación entre la pared celular y el DNA del microorganismo (Domingo D.,
2003).
2.4.5 Los Aldehídos: Son derivados de los alcoholes primarios por deshidrogenación.
Muchos aldehídos son aromatizantes como la vainilla y el citral. Así mismo este
3
El tetrahidrocannabinol (THC) es uno de los compuestos activos de la marihuana que está siendo
objeto de un gran número de estudios debido a las propiedades beneficiosas que puede ejercer sobre
algunas patologías.
xxxii
grupo fitoquímico tienen propiedades antisépticas. La vainilla por ejemplo tienen
efectos coleréticos (Carey, 2003).
2.4.6 Los Terpenoides: Son compuestos a menudo no saturados formados por
carbono, hidrógeno y oxígeno de estructura no aromática y que se encuentran sobre
todo en los aceites esenciales y en las resinas (Carey, 2003).
Muchas de las plantas, deben a sus compuestos terpénicos de las esencias, sus
propiedades aromáticas. Pero estas sustancias, poseen también propiedades
farmacodinámicas muy variadas en relación con las diferentes funciones ligadas a su
esqueleto terpénico. Algunas, son irritantes de la piel y de las mucosas, utilizándose
como rubefacientes4 (pineno en la esencia de trementina). Los azulenos tienen
propiedades antinflamatorias. El geraniol, cineol y linalol
tienen propiedades
antisépticas. El ascaridol, tiene propiedades vermífugas. La tuyona tiene propiedades
abortivas y estupefacientes. Las cucurbitáceas, poseen propiedades tóxicas y
necrosantes. El ácido glicirricético tiene propiedades antinflamatorias (Torres C,
2004).
2.4.7 Flavonas: Las flavonas son estructuras fenólicas que contienen un grupo
carbonilo. Constituyen la familia más amplia de fenoles naturales. Su actividad frente
a los microorganismos probablemente se debe a que forman complejos con las
proteínas solubles y extracelulares y con las células de la pared bacteriana, de forma
similar a las quinonas. Mención especial merecen las catequinas, presentes en el té
verde, las cuales ejercen actividad frente a Vibrio cholerae O1, Streptococcus mutans,
Shigella y otros microorganismos. Otros flavonoides tienen en general actividad
antiviral.
2.4.8 Los Isoflavonoides: Actúan como efectivas fitoalexinas, las cuales pueden ser
definidas como compuestos antimicrobianos de pequeño peso molecular o
4
Rubefaciente se refiere a la sustancia que produce un enrojecimiento en la piel debido al flujo de la
sangre de los vasos capilares.
xxxiii
metabolitos de estrés biológico. Ellos pueden ser constitutivos o también ser
inducidos por ataque biológico o heridas. Los constituyentes varían entre especies, y
también varían dependiendo la edad y el ambiente en el que se encuentra la planta.
Estos flavonoides inhiben la germinación de esporas de hongos y causan daño a los
sistemas de membrana. El recubrimiento de algunas semillas y algunas resinas de
árboles son particularmente ricas en flavonoides antimicrobianos. Esta cita e
información se debe incluir.
2.4.9 Los Alcaloides: Estos compuestos constituyen
con los heterósidos y los
antibióticos la mayor parte de los principios activos de las plantas medicinales. Son
sustancias de origen biológico y sobre todo de origen vegetal, ya que en el reino
animal se encuentran raramente representadas. Los alcaloides contienen siempre
carbono, hidrógeno,
nitrógeno y oxígeno. Excepcionalmente algunos alcaloides
contienen azufre (Torres C, 2004).
2.4.10 Quinonas: Las quinonas son anillos aromáticos con dos funciones ceto. Son
ubicuas en la naturaleza y causantes del color marrón que se produce en las frutas
cuando son dañadas. Poseen una alta reactividad, formando complejos con los
aminoácidos hidrofílicos de las proteínas, la mayoría de las veces inactivando la
proteína y anulando su función. Debido a esto, el potencial antimicrobiano de este
grupo es amplio (Domingo D., 2003).
2.4.11 Tanoides o Taninos: Son sustancias de origen vegetal, no nitrogenadas de
estructura polifenólica, solubles en agua, alcohol y acetona. Estas sustancias son de
sabor astringente y tienen la propiedad común de curtir la piel, haciéndola
imputrescible e impermeable al fijarse sobre sus proteínas (Domingo D., 2003).
El término tanino se empleó para denominar ciertas sustancias presentes en extractos
vegetales capaces de combinarse con proteínas de la piel animal, evitando su
putrefacción y convirtiéndola en cuero. Constituyen un grupo de sustancias fenólicas
xxxiv
poliméricas y se pueden dividir en hidrolizables y condensados, en función de que
puedan o no ser hidrolizados. Se han descrito más de 30 taninos que pueden inhibir
hongos y bacterias (Domingo D., 2003).
2.4.12 Los aceites esenciales: Estos productos llamados comúnmente esencias son
sustancias olorosas volátiles contenidas en los vegetales. Su volatilidad les diferencia
de los aceites fijos que producen de los lípidos. Son particularmente abundantes en
las Coníferas, Rutáceas, Umbelíferas, Mirtáceas y Labiadas (Torres C, 2004).
Son compuestos causantes del agradable olor de determinadas plantas y algunos con
poder antimicrobiano, como el mentol obtenido de la menta (Menta piperita) y la
capsaicina de la planta conocida como el pimiento rojo o chile (Capsicumm annum).
(Domingo D., 2003).
2.4.13 Saponinas: son los compenentes principales de varios extractos de plantas,
tienen actividad antiprotozoaria. Las saponinas se unen al colesterol y otros esteroles
de la membrana celular de los protozoos causando su inestabilidad, lisis y muerte
celular (Calsamiglia S, 2005).
2.4.14 Esteroides y Triterpenos: Los compuestos esteroidales pueden interferir
determinados procesos de síntesis vitales en la célula bacteriana y los triterpenos, por
su parte, pueden actuar siguiendo diversos mecanismos en dependencia de su
naturaleza química: los de naturaleza hidrocarbúrica, por ejemplo, tienen
generalmente acción depresora sobre la tensión superficial lo cual, cuando tiene lugar
en el entorno de la célula bacteriana, altera la selectividad de la membrana
citoplasmática para el intercambio de sustancias. Los triterpenos de naturaleza
alcohólica pueden alterar la naturaleza coloidal del protoplasma de la célula
provocando su muerte (Pelczar M., 1992).
xxxv
2.4.15 Cromenos y Benzofuranos: Los cromenos y benzofuranos son productos
naturales que se han encontrado en algunas especies de Rutaceae, Liliaceae,
ciperaceae y principalmente en ciertas tribus de las Asteraceae, entre las cuales parece
ser exclusivos de las Asterreae, Eupatorieae, Heliantheae, Inulaeae y Senecioneae
(Scherriber, K., 1963).
Estos compuestos se encuentran presentes generalmente en hojas y tallos, y menos
comúnmente en raíces habiéndose encontrado en los primeros hasta un 5% sobre el
peso seco (Scherriber, K., 1963).
Muchos cromenos y benzofuranos han mostrado ser biológicamente activos como el
toxol y la dehidrotrementona que son bacteriostáticos; la tremetona, la
dehidrotremetona y la hidroxitremetona son tóxicos a los peces; el toxol y el angelato
de toxilo exhiben una debil actividad antitumor contra la leucemia linfocitica P-388;
el encecalin, el 7-hidroxiencalin y la 6- metaoxieuparina son fototóxicos a varios
hongos y bacterías; el encecalin también ha mostrado acción insecticida; así mismo
los precocenos I y II actuan como hormonas antijuveniles en los insectos (Scherriber,
K., 1963).
2.4.16 Sesquiterpenlactonas: derivadas biogenéticamente de los sesquiterpenos, son
una clase de productos naturales distribuidos menos ampliamente que estos últimos y
de ocurrencia predominante en la familia Asteraceae (notablemente en géneros
Artemisia y ambrosia), de allí que su distribución permite ser aplicada a problemas
taxonómicos especialmente en los géneros nombrados y en otras taxas (Scherriber,
K., 1963).
Son sustancias amargas que se encuentran en todas las partes de las plantas, en
concentraciones que varían entre 0,01 y 8% del peso seco, siendo las concentraciones
mayores generalmente en las hojas; son bastantes solubles en cloroformo y en eter
etílico. Presentan gran importancia por la variada acción biológica que han
xxxvi
demostrado: acción citotóxica, antitumoral, analgésica, inhibidoras del crecimiento de
bacterias, entre otras (Scherriber, K., 1963).
Estos compuestos lactónicos son primariamente clasificados en base a su esqueleto
carbocíclico como germacranólidos, guaianólidos, eudesmanólidos y pseudoguaianólidos, entre otros (el sufijo olido se refiere a la función lactona) (Scherriber,
K., 1963).
2.5 ESPECIES VEGETALES
2.5.1 Valeriana pilosa
Figura 1. Valeriana pilosa Fuente: Autores
Orden: DIPSACALES
Especie: Valeriana pilosa Ruiz & Pavón
Familia: VALERIANACEAE
xxxvii
Sinónimos: Valeriana longifolia H.B.K., Valeriana longifolia var. pilosa
(Ruiz & Pav.) Wedd.
Nombre Común: valeriana, Mata de gato
2.5.1.1 Características generales
2.5.1.1.1 Descripción: Hierba perenne con las hojas en una roseta basal, 10-75 cm de
alto, ramificada desde la base. Raíz central obcónica. Hojas simples, pecioladas;
lámina de la hoja lanceolada, 5-35 x 0.5-2.5 cm, subcoriácea, en la parte superior
glabra a pilosa, en la parte inferior glabra o pilosa, ocasionalmente con el nervio
medio piloso, aguda en el ápice, los márgenes enteros con pequeñas berrugas en la
parte superior que dan la impresión de dientes; peciolos dilatados y generalmente
ciliados en la base. Inflorescencia paniculoide, 2-41 x 1-8 cm, el eje piloso; eje
principal de la inflorescencia con 1-3 pares de hojas sésiles, lanceoladas a linear
lanceoladas, generalmente con el margen verrugoso, con o sin inflorescencias
parciales en sus axilas, brácteas y bracteolas superiores espatuladas, 2-10 x 1-4 mm,
glabras o pilosas en la base. Flores ginodioicas, corola infundibuliforme, la de flores
perfectas de 2-3 mm de longitud, la de flores pistiladas de 1-2.5 mm de longitud,
blanca, a menudo teñida de púrpura, glabra, 5-lobada; estambres o estilo exsertos.
Aquenios de 1.5-2 mm de longitud, de forma creciente en corte transversal, el vilano
de 3-5 mm de longitud, usualmente con 6 radios (Guzmán, 2005)
2.5.1.1.2 Distribución geográfica: El género Valeriana tiene 150 especies
distribuidas por todo el mundo, la mayoría en Sudamérica, especialmente en la
Cordillera de los Andes. Esta especie se distribuye en Ecuador, Perú y Colombia
entre los 2700 a 4250m. En Colombia se encuentra en los departamentos de
Antioquía, Caldas, Santander, Boyacá y Cundinamarca entre los 2700 a 3800m. En
Cundinamarca se halla en los páramos de Cruz verde, Sumapáz, El Tablazo,
Chingaza, San Cayetano, Chipaque, Chisacá. Esta especie crece en bosques alto
andino y páramo (Torres, 2007).
xxxviii
2.5.1.1.3 Fitoquímica: Los análisis fitoquímicos preeliminares uno realizado en las
hojas y otro en los rizomas de V. pilosa mostraron la presencia de alcaloides,
esteroides y/o triterpenoides, flavonoides y taninos. Las pruebas realizadas para
cumarinas y lactonas terpénicas, glicósidos cardiotónicos y saponinas dieron
resultados negativos. La presencia de alcaloides puede estar relacionada con
alcaloides iridoidales similares a los aislados de las raíces de V. officinalis (Guzmán,
2005).
Los iridoides son la familia de compuestos monoterpenicos mas comunes en el
genero Valeriana y en la familia Valerianaceae. Aunque en un principio se creía que
estos compuestos eran los responsables de la actividad sedante de la valeriana,
algunos autores consideran que los ácidos valerénicos y otros sesquiterpenos
estructuralmente similares, que se encuentran en el aceite esencial de las raíces de V.
officinalis son los responsables de esta actividad y no los valeropotriatos
(epoxiridoides encontrados en la Valeriana). Estos resultados sugieren la necesidad de
caracterizar química y farmacológicamente la especie V. pilosa, con el fin de evaluar
su aprovechamiento como una novedosa fuente de extractos sedativos (Guzmán,
2005).
2.5.1.1.4 Usos: En general, las especies pertenecientes al género Valeriana, son
usadas con fines medicinales. En Bogotá y alrededores se encuentra muy difundido el
uso de los tallos y hojas de estas plantas, como tranquilizante, para la conciliación del
sueño y otras afecciones del sistema nervioso. Sin embargo, la mayoría de las
personas adquieren los fragmentos de estas plantas en la sección de plantas
medicinales de las plazas de mercado y en centros naturistas, muchas veces sin tener
certeza sobre la identidad de la especie a la cual corresponde dicho fragmento, ya que
son pocas las personas que reconocen esta planta en su ambiente natural (Guzmán,
2005).
xxxix
En Perú, se reporta además el uso de las hojas y tallos de la Valeriana pilosa para
curar las irritaciones, como desinfectante y para combatir la fiebre interna. Las raíces
de esta especie se hierven por pocos minutos y el té es utilizado como un sedante y
para disminuir el stress (Gúzman, 2005).
2.5.2 Myrcianthes rhopaloides
Figura 2. Myrcianthes rhopaloides.
Fuente : Autores
Orden: MYRTALES
Familia: MYRTACEAE
Especie: Myrcianthes rhopaloides (H.B.K.) McVaugh
xl
Nombres comunes: Hueso,
Guayabo, Almanegra, Arrayán, Arrayán guayabón,
Guayabón, Arrayán negro, Arrayán de los Andes.
Sinónimos: Eugenia porphyroclada O. Berg, Eugenia rhopaloides (Kunth) DC.,
Myrtus rhopaloides Kunth
2.5.2.1 Características generales de la especie
2.5.2.1.1 Descripción: Árbol de hasta 15 m de altura, tronco cilíndrico, copa regular.
Corteza color rojizo, escamosa, resinosa y desprendible. Hojas simples, opuestas, de
limbo ovalado, consistencia coriácea; con el borde entero, a veces involuto; con ápice
marginado y base redondeada; haz glabro y lustroso, de color verde oscuro, envés
verde amarillento con la nervadura central prominente. Pecíolo corto lignificado.
Flores hermafroditas, completas y estaminoideas; cáliz dialisépalo, color verde;
corola con pétalos libres, color blanco; estambres muy numerosos, de 9-10 mm de
largo; ovario ínfero, estilo largo y estigma capitado. Fruto en drupa, carnoso, de
forma orbiculada, color rojo oscuro cuando maduro, con una sola semilla. Los frutos
pesan 2.88 g promedio; las semillas miden aproximadamente 0.82 cm de largo y 0.61
de ancho y 100 semillas pesan 0.172 g en promedio (Pico, 2004).
2.5.2.1.2 Distribución Geográfica: Se encuentra distribuida en Costa Rica,
Colombia, Ecuador, Panamá, Perú, y Venezuela desde los 2300 a 2800 m. En
Colombia se le encuentra en la cordillera Central y Oriental en el departamento de
Cundinamarca, en el altiplano Cundiboyacense y sus alrededores y en el Tolima. En
Cundinamarca en los municipios de la Calera (Santa Isabel), Facatativa. En Bogotá
D.C se encuentra en las zonas rurales de Usme (Pasquilla) y Sumapaz (Capitolio)
dentro de un rango altitudinal de 2500 a 3200m (Guzmán, 2005).
Crece en laderas bajas y pies de ladera, suelos pesados con drenaje lento, no
anegados. Frecuentemente se halla aislada en potreros junto con otros elementos
relictuales de los bosques de susca y de tíbar, como elemento silvopastoril tradicional
xli
(potrero arbolado de arrayanes, común en toda la región andina con otros géneros y
especies de la misma familia). Es inductor preclimácico de la sere de laderas bajas,
vinculado a la mesosere del bosque de susca (Ocotea heterophylla) y la del tibaral
(bosque de Escallonia paniculata) (DAMA, 2000).
2.5.2.1.3 Propagación tradicional: Las semillas se extraen de los frutos con bisturí,
con presión de pinzas con punta delgada o bien de manera manual al presionar el
fruto carnoso, se lavan 2 a 3 veces con agua durante 2 minutos máximo cada vez. No
se realiza aplicación de jabones ni detergentes, dado el carácter fotosintético del
embrión y los cotiledones, desde el momento de maduración de los frutos. Deben
mantenerse en humedad superior al 60% desde la extracción del fruto y el lavado. No
requiere etapa de secado, posterior al lavado, por el contrario, debe mantenerse la
humedad. En medio estéril utilizando cajas de petri con papel absorbente, luz solar
parcial y temperatura ambiente en condiciones de laboratorio (17°C promedio), se
registra germinación desde el tercer día después de la hidratación hasta el séptimo
día, siendo la germinación del 100% para el día 7 (Pico, 2004).
La germinación es tipo hipogea, puesto que los cotiledones verdes permanecen en el
sustrato, en el lugar de siembra y emerge la radícula y posteriormente la plúmula
entre los cotiledones. Se deben sembrar 2 semillas por alvéolo, con una profundidad
de 1 cm, el riego debe ser cada 2 días y de manera suave (Pico, 2004).
2.5.2.1.4 Cosecha: La colecta se realiza de manera manual, halando de la parte
apical, para propagación se pueden colectar frutos con pocos días de caída en el
suelo.
El ciclo reproductivo de esta especie es poco constante y depende del tipo de suelo
pues plantas de una misma región inician fases reproductivas a diferentes épocas. En
el mes de abril en Pasquilla y Guachetá se han encontrado plantas de esta especie en
floración, plantas con frutos se encuentran en los meses de febrero en Duitama, abril
xlii
en Sumapaz, junio en el Verjón alto localidad de Chapinero y julio en la Calera. En el
JBJCM la floración generalmente inicia a principios de año en los meses de febrero a
abril y los frutos maduros son colectados cinco meses después (Pico, 2004).
2.5.2.1.5 Usos: Los frutos de ésta especie son comestibles y por su agradable sabor se
consumen directamente, en jugos con leche y dulces. La planta al igual que
Myrcianthes leucoxyla, es maderable y es empleada con fines medicinales. El uso
medicinal más frecuente en las áreas rurales de Bogotá es para combatir la diabetes,
utilizando diferentes partes de la planta. También se usa como tranquilizante
preparando las hojas en infusión y como antidiarreico, cocinando las hojas en agua
junto con el laurel (Laurus nobilis) (Molina, 2004).
Esta planta también es usada en la inducción de matorrales de Miconia spp., en la
formación de corredores y estribones ornitócoros, como barrera antiganado, cercas
vivas, ornamental y en la fabricación de postes y cabos de herramienta (DAMA,
2000).
2.5.2.1.6 Bromatología y Aporte Nutricional: Los resultados del análisis
bromatológico proximal expresados en base húmeda para M. rhopaloides son
presentados en la tabla 1, los cuales al ser comparados con los mismos obtenidos para
M. leucoxyla, evidencian que un menor aporte nutricional. Sin embargo, esta especie
representa un potencial de aprovechamiento muy interesante desde el punto de vista
de alimentos (Molina, 2004).
xliii
Nutriente
Contenido
Proteína (g)
2.9
Grasa (g)
0.3
Fibra (g)
2.4
Cenizas(g)
1.4
Calcio (mg)
100mg
Fósforo (mg)
38
Hierro ppm
28
Tabla 1. Análisis bromatológicos proximales para M. rhopaloides (contenido/100g
de pulpa)
2.5.2.1.7 Fitoquímica: El aceite esencial obtenido por hidrodestilación de hojas M.
rhopaloides recolectadas en Ecuador fue caracterizado por CGAR y CGAR-EM,
identificando 40 compuestos de los cuales la mayoría corresponden a alcoholes y
aldehídos monoterpenicos como geranial (34%), neral (25%), α-pineno (7%), βpineno (9%) y algunos sesquiterpenos (1.5%). Al comparar estos resultados con lo
reportado por Guzmán et al. 2005 para M. leucoxyla, se encuentra que los aceites
tienen en común el alto contenido de monoterpenos tales como el α-pineno y βpineno, aunque detectados en concentraciones mayores para el aceite esencial de M.
rhopaloides, además de 1,8-cineol, mirceno, linalol, terpinen-4-ol, y nerolidiol
(Guzmán, 2005).
xliv
2.5.3 Passiflora manicata
Figura 3. Passiflora manicata
Fuente: Autores
Familia: PASSIFLORACEAE
Especie: Passiflora manicata (Juss.) Pers.
Sinónimos: Passiflora meridensis H. Karst., Passiflora rhodantha Harms, Tacsonia
manicata Juss.
Nombre Común: Flor de la pasión, Tacso (Nariño), Curubo de Monte (Quindío),
Diablito (Ecuador)
xlv
2.5.3.1 Características generales de las especies
2.5.3.1.1 Descripción: Plantas pubescentes o glabras en las superficies adaxiales de
las láminas foliares, flores y frutos. Tallos angulares, esencialmente glabros o
pubescentes. Hojas ovadas, trilobuladas, de 4.2 a 10.0 cm de largo y 5.0 a 12.0 cm de
ancho, con ángulos de aproximadamente 45º entre lóbulos medios y laterales, con
lóbulos oblongos u ovados, agudos o acuminados en el ápice, redondeadas o
ligeramente acorazonadas en la base, glandular-aserradas en las márgenes,
densamente pubescentes en la superficie abaxial, con tricomas ondulados,
transparentes, blancuzcos, de aproximadamente 0.3 mm de largo, glabras en la
superficie adaxial, con tricomas escasos repartidos sobre las venas foliares; pecíolos
de 1.4 a 4.1 cm de largo, con 4 a 9 nectarios generalmente estipitados, de 1 a 2 mm de
largo repartidos sobre la superficie adaxial; estípulas generalmente suborbiculares, de
1.5 a 2.0 cm de largo y 0.5-1.0 cm de ancho, con dentaciones gruesas en el margen.
Pedúnculo grueso, de 4.6 a 7.5 cm de largo; brácteas ovadas, libres hasta la base o
unidas cerca de la base, de 2.0 a 4.0 cm de largo y 1.0 a 2.0 cm de ancho, acuminadas
o agudas en el ápice, cuneadas o redondeadas en la base. Flores erectas de 5.0 a 5.6
cm de largo; hipantios cilíndricos, de aproximadamente 2 cm de largo; sépalos
oblongos o lanceolados de 3.0 a 3.6 cm de largo, de aproximadamente 6 mm de
ancho, verdosos abaxialmente, rojos adaxialmente; pétalos sub-iguales a los sépalos,
rojos; corona en 3 o 4 series, con filamentos de hasta 4 mm de largo, con series más
exteriores color morado, con la serie interior de color blanco; opérculo localizado
aproximadamente a 1 cm de la base del hipantio, de aproximadamente 1 cm de largo,
doblado, membranáceo, blanco. Frutos obovados u oblongos, de 3.5 a 5.5 cm de largo
y 2.0 a 3.7 cm de ancho, con pericarpio coriáceo, verde al madurar; semillas
obovadas a acorazonadas, de 3.5 a 5.1 mm de largo y 2.0 a 3.0 mm de ancho, con
testa reticulada, color café oscuro; arilo anaranjado poco suculento (Escobar, 1988).
Esta especie presenta características intermedias entre los subgéneros Tacsonia y
Passiflora. La flor es erecta, presenta una corola color rojo intenso, con un hipantio
xlvi
más corto que en el subgénero Tacsonia, pero más largo que en subgénero Passiflora;
es autógama y altamente polimórfica (Escobar, 1988).
2.5.3.1.2 Distribución geográfica: Es nativa de Venezuela, Colombia, Ecuador y
Perú. Posiblemente es originaria de los Andes de Perú y Chile, entre 1400m -2800 m
de altitud. Crece de forma silvestre como una enredadera (Torres, 2007).
2.5.3.1.3 Usos: El fruto no es considerado como comestible porque no se puede
diferenciar claramente el estado maduro del estado inmaduro, durante el cual los
frutos pueden tener efectos tóxicos y sicótropos (de ahí su nombre de “diablito” en el
Ecuador). El interés de esta especie proviene de su potencial para el mejoramiento
genético de las curubas, por su cercanía con ellas y su rusticidad. Es resistente a los
nemátodos y a las enfermedades fúngicas (antracnosis, oidio y Alternaria sp) (Torres,
2007)
xlvii
2.5.4 Hesperomeles ferruginea
Figura 4. Hesperomeles ferruginea.
Fuente: Autores
Orden: ROSALES
Familia: ROSACEAE
Especie: Hesperomeles ferruginea (Pers.) Benth.
Nombres Comunes: Mortiño (Cordillera Central, Cundinamarca), noro (Cordillera
central, Valle del Cauca), cerote (Cauca, Huila), guayabo de páramo (Cauca, Valle),
manzano (Cauca, Santander). Huagra manzana, jalo, pujín, quique (Ecuador).
xlviii
Sinónimos: Crataegus ferruginea Pers., Eriobotrya cordata Lindl., Hesperomeles
lanuginosa Ruiz & Pav. ex Hook., Hesperomeles oblonga Lindl., Mespilus ferruginea
(Pers.) Poir., Osteomeles ferruginea (Pers.) Kunth.
2.5.4.1.1 Descripción: Arbustos hasta 5 m de altura, ramas pubescentes o glabras
hacia las puntas. Estipulas, 2 a 6 mm de largo y 0.5 a 1 mm de ancho, pubescentes a
glabras, usualmente persistentes; pecíolos 0.5 a 2 cm de longitud, pubescentes. Hojas
más o menos oblongas, elípticas u ovadas, 3 a 10 cm de largo y 1.5 a 8 cm de ancho,
coriaceas o subcoriaceas, ápice redondeado, base redondeada, obtusa o subcordada,
margen serrado o biserrado, superficie adaxial frecuentemente puberula a glabra,
reticuladas o suavemente abullada, con venas inmersas, superfice abaxial pubescente
con venas prominentes. Inflorescencia en forma de cima con 10 a 100 flores,
densamente pubescentes; pedúnculo de 5 a 40 mm. Brácteas florales, 5 a 10 mm de
largo y 1 a 1.5 mm de ancho; pedícelo de 2 a 5 mm de longitud. Flores 5 a 9 mm de
largo; hipantio urceolado a crateriforme; sépalos 1.5 a 3 mm de largo, ápice agudo;
pétalos ampliamente elípticos u obovados, 2.5 a 5 mm de largo, glabros, pubérulos o
ciliados, blancos o cremas comúnmente teñidos de rosa o rojo. Fruto de 5 a 8 mm de
largo y 6 a 8 mm de ancho, rojo. Semillas de 2.5 a 3 mm de largo y 1 a 1.5 mm de
ancho (Guzmán, 2005).
2.5.4.1.2 Distribución geográfica: Se encuentra distribuida a lo largo de Suramerica,
en Colombia, Ecuador, Perú y Venezuela. Se encuentra entre los 2800 y 3900 m. En
Cundinamarca se localiza en los municipios de Cogua, La Aguadita, San Miguel y
Represa del Neusa. En Bogotá D.C. en las Localidades de Ciudad Bolívar, Sumapaz,
Usme y en los Cerros Orientales. También se encuentra en los departamentos del
Boyacá, Cauca, Cesar, Magdalena, Norte de Santander y Risaralda. Esta especie se
encuentra en relictos de bosque andino, asociada a matorrales densos en cañadas y
ocasionalmente en linderos de predios en forma aislada, es una especie persistente en
zonas de disturbio antrópico (Rangel, 2000).
xlix
Se desarrolla en suelos ácidos orgánicos y algo arcillosos, se han encontrado
asociaciones micorríticas de tipo vesículo arbuscular, en cuanto a aspectos climáticos
no soporta heladas prolongadas y se producen defoliaciones frecuentes. Esta planta
esta más adaptada a paramos húmedos que H. goudotiana (Rangel, 2000).
2.5.4.1.3 Usos: En las áreas rurales del sur de Bogotá D. C. esta especie al igual que
H. goudotiana es bastante conocida y utilizada. El fruto maduro se consume
directamente, o se usa para preparar mermeladas, dulces y yogurt. En el departamento
de Boyacá los frutos de mortiño se tuestan con azúcar o panela, y se prepara “masato”
para las fiestas de San Pedro a finales de Junio (Cardozo, 2005).
Por otra parte, a partir de esta planta se obtiene la madera para fabricar cabos de
azadón y cercas vivas (Molina, 2004), lo que esta ocasionando una gran disminución
en las poblaciones de esta especie, hecho que también se evidencia en países como
Ecuador, donde H. ferruginea se encuentra amenazada por la fragmentación de
hábitat y por la tala a la que es sometida por la calidad de su madera; además la
regeneración natural no es eficiente y los pocos árboles que alcanzan a rebrotar en las
áreas intervenidas son muy susceptibles a enfermedades (Ordóñez, 2006).
2.5.4.1.4 Fitogeografía y ecología: Posición sucesional: inductores preclimácicos
priserales. Aparece como subordinada en las priseres del encenillal, denotando las
facies de suelos húmedos. Es un importante elemento protector de los bordes
relictuales, por sus espinas. Su papel como subdominante del clímax de subpáramo
húmedo, indica también su función mediadora del ascenso del límite superior del
bosque y la regeneración del encenillal sobre subpáramos húmedos y potreros por
encima de los 3200 msnm. Es uno de los precursores leñosos más frecuentes en los
pastizales altos de Holcus lanatus en el subpáramo degradado (Torres, 2007).
2.5.4.1.5 Fitoquímica: Aún no se han publicado estudios acerca de la composición
química de los frutos, hojas y otras partes de H. ferruginea, sin embargo cabe esperar
l
que no difiera de la composición de otras especies de su mismo género, como la
observada en H. goudotiana donde se encuentran esteroides, triterpenoides,
flavonoides y taninos. Además por la coloración de sus frutos es muy probable que
contenga compuestos polifenólicos tipo antocianinas que pueden ser utilizadas como
colorantes en la industria de alimentos y posiblemente como antioxidantes (Garzón,
2006).
No se han publicado estudios sobre la actividad biológica que pueda tener H.
ferruginea, sin embargo en otras especies como H. cuneata Lindl., H. obtusiofolia
(Pers.) Lindl. H. heterophylla Hook., se ha encontrado que los frutos y las hojas
tienen actividad antiinflamatoria sobre los riñones y el hígado (Garzón, 2006).
2.6 MICROORGANISMOS SELECCIONADOS
2.6.1 Hongo fitopatógeno
La mayoría de los hongos fitopatógenos forman hifas, es decir, talos tubulares, que se
extienden mediante crecimiento apical y un sistema organizado de ramificación. La
red de hifas que resultan de dicho crecimiento se conoce como micelio y el micelio
interconectado producto de un propágulo o de la fusión de hifas de dos o más
propágalos se denomina colonia (Ayala S, 1998).
li
2.6.1.1 Alternaria sp.
Figura 5. Características Macro y Microscópicas de Alternaria sp.
Forma parte de los llamados hongos imperfectos. Produce manchas en hojas, frutos y
tallos, además de necrosis foliar (Arévalo A, 1996). Algunas de la enfermedades más
comunes causadas por Alternaria spp, incluye el tizón temprano de la papa, el tomate
y el brócoli; mancha de la hoja del tabaco, del geranio, hule, gladiola y kenaf; tizón
de la zanahoria, macha circular en la remolacha, mancha concéntrica del cártamo,
pudrición negra del fruto en el chile. Causa manchas y tizón en la cebolla, manchas
en frutas como la manzana, el limón y la naranja. Estas manchas son generalmente
café oscuras o negras, frecuentemente numerosas y dispuestas en anillos concéntricos
que le dan la apariencia de tablero de tiro (Ayala S, 1998).
Sobre las ramas y tallos de plantas tales como el tomate, aparecen varias manchas
obscuras, profundas y con frecuencia en forma de blanco. A veces las lesiones del
tallo en las plántulas forman cánceres que pueden extenderse, cubrir el tallo y matar a
la planta, o si se forman cerca de la superficie del suelo pueden desarrollarse y
originar una pudrición del cuello. (Forero N, 1997)
Características macroscópicas: Colonias vellosas, de superficie rugosa y borde
regular, de color gris intenso en el anverso y negro en el reverso (Ayala S, 1998).
Características microscópicas: Conidios grandes y pequeños entre lazados (Ayala S,
1998).
lii
2.6.2 Microorganismos patógenos
2.6.2.1 Candida albicans
Figura 6. Características Macro y Microscópicas de Candida albicans.
La especie patógena más frecuente en el hombre es la Candida albicans. Estos
hongos viven como saprofitos sobre la piel y las mucosas del tracto respiratorio,
digestivo y genital femenino, de preferencia en pacientes diabéticos y durante el
embarazo (Roncancio B, 2001). Es una levadura, redonda u ovoide con 3 mcm de
diámetro, con o sin gemación. Forma parte de la flora normal de la boca, tubo
digestivo y vagina. Y esta considerada como la más patógena de este género (Arévalo
A, 1995). Es frecuente ver las invasiones superficiales (piel y mucosas) producidas
por este hongo (Roncancio B, 2001). La forma generalizada se produce por vía
hemática y se manifiesta por lesiones o abscesos en casi todos los órganos y tejidos.
Microscópicamente se puede observar que en el tejido se forma un micelio con hifas
delgadas y seudohifas, además de células micéticas levaduriformes pequeñas. Estas
células pueden mostrar gemación. Las hifas y seudohifas penetran en el tejido como
lo hacen las raíces de una planta (Roncancio B, 2001).
Se relaciona con los alimentos ya que es una levadura presente en la fermentación de
éstos, atacando alimentos ricos en grasa, a pesar de ello otras especies de Candida sp
liii
tienen importancia industrial produciendo ácidos orgánicos, etanol a partir de
nutrientes especiales, enzimas como la lipasa utilizada en la producción de jabón,
lípidos en sustratos ricos en glucosa y vitaminas como la riboflavina, entre otras
(Roncancio B, 2001).
Presenta rasgos clínicos como dolor de esófago y dificultad para comer, infección del
torrente sanguíneo y enfermedad diseminada normalmente con fiebre, raramente:
pulmonía, osteomelitis y artritis.
Según el CDC y la división de enfermedades bacterianas y micóticas posee una
incidencia de 8 casos/100000 en la población general, en los pacientes VIH positivos
se presenta como una infección oportunista (Roncancio B, 2001).
2.6.2.2 Staphylococcus aureus
Figura 7. Caracterísiticas Macro y Microscópicas de Staphylococcus aureus.
Son cocos Gram positivos de 0,5 - 1 mcm de diámetro, inmóviles, aerobios o
anaerobios facultativos, caracterizados por su agrupación en forma de racimo. Crecen
a una temperatura óptima de 37 °C y se desarrollan mejor en un pH ligeramente
alcalino de 7.6 la adición de glucosa favorece el crecimiento (Peñaranda, 2003).
Forma parte de la flora normal de mucosas y piel e intervienen en procesos
patológicos diversos como infecciones supurativas e intoxicaciones alimenticias
(Arévalo A, 1996). Más del 95% de los Staphylococcus aureus producen proteína A,
liv
la cual puede estar asociada a la célula o al medio extracelular, con una importante
afinidad por la fracción Fc de la Ig G. La presencia de proteína A o coagulasa es de
gran utilidad clínica para diferenciar Staphylococcus aureus de otras especies de
Estafilococos (Uribe C, 2003). Staphylococcus aureus es una bacteria que puede
causar infección en todos los grupos de edad tanto en forma esporádica como
epidémica y se ha identificado como una de las principales causas de infección de
heridas quirúrgicas. Su principal forma de transmisión es por contacto (Uribe C,
2003).
La capacidad de S. aureus para fermentar los azúcares como maltosa, manitol,
trehalosa es positiva. La producción de una nucleasa termoestable es un buen
indicador de la presencia S. aureus, al igual que la conversión de nitratos a nitritos
(Peñaranda O, 2003).
Elaboran diversas enzimas: proteasas, lipasas, fosfatasas, gelatinasas, catalasas y
coagulasas (Peñaranda O, 2003).
En cultivo puro resisten una concentración de fenol al 1% durante 15 minutos, pero
solo los mata una concentración al 2%. Soportan el calor húmedo a 60 °C durante 30
minutos. Muchas cepas de S. aureus toleran concentraciones altas de cloruro de sodio
(7,5 a 10%), y son fácilmente inhibidos por colorantes como el violeta de genciana
(Peñaranda O, 2003).
lv
2.6.2.3 Escherichia coli
Figura 8. Características Macro y Microscópicas de Escherichia coli.
Es un bacilo de 1 – 3 µm por 0.5 µm, que se presenta sólo, en pares, en cortas
cadenas o formando grupos. En general es móvil (por flagelos perítricos), aunque
existen variantes inmóviles no flageladas. No forma esporas y por lo general es no
cápsulado y Gram negativo. En cultivos jóvenes la forma cocobacilar es bastante
frecuente; en los viejos se presentan formas de una dimensión mayor (Peñaranda O,
2003).
En agar forma colonias circulares de 3 a 5 mm convexas, de borde continuo o un
tanto ondulado, brillantes y de coloración blanca un poco amarillenta. Con
producción de ácido y gas, fermenta la lactosa y un gran número de carbohidratos;
algunas cepas son lactosa negativas. Es indol positiva, rojo de metilo positiva, Voges
Proskauer (VP) negativa y no utiliza el citrato. Produce H2S en determinados medios.
Acidifica y coagula la leche. Pueden necesitarse pruebas adicionales en casos de E.
coli aislada de colitis hemorrágicas, las cuales son típicamente negativas a sorbitol.
Este bacilo es aerobio y anaerobio facultativo. Su temperatura óptima de crecimiento
es de 37 °C, pero posee propiedades de desarrollo en una gama bastante amplia de
temperaturas; el pH favorable es de 7 alguna cepas producen hemolisina (Peñaranda
O, 2003).
Se ha considerado inicialmente sólo como un habitante del intestino, desde hace cerca
lvi
de tres décadas se empezó a estudiar su poder enteropatógeno. Se ha visto que las
cepas toxigénicas de E. coli pueden producir una enterotoxina termolábil (TL),una
termoestable (TS) o ambas. La TL es una proteína de alto peso molecular, que
bioquímicamente es muy similar a la toxina de Vibrio cholerae, activando la
adenilciclasa. Es inactivada a 60 ºC. La TS es una pequeña molécula relativamente
estable al ser hervida (Rodríguez V, 1995).
2.6.2.4 Bacillus subtillis
Figura 9. Características Macro y Microscópicas de Bacillus subtillis.
Son bacilos Gram positivos de tamaño 1 por 8 mcm, inmóviles, aerobios o anaerobios
facultativos, formadores de endosporas. Habitan en el suelo, agua, aire y son
contaminantes del ambiente de laboratorio. Este microorganismo es obligado en esta
clase de bioensayos por su gran sensibilidad. (Arévalo A. 1996)
Se encuentra con frecuencia en tierra y en vegetales, también se encuentra en diversos
productos alimenticios, produciendo infecciones aéreas o por contacto, se considera
un microorganismo perjudicial pero no peligroso en carne en la cual ataca las
proteínas. Este bacilo hidroliza el almidón y reduce los nitratos, no produce indol a
veces forma una escasa cantidad de ácido sulfúrico, sus esporas son menos
termorresistentes que las de los géneros térmofilos. (López L., 2001)
Esta bacteria no se desarrolla en la leche cruda porque mediante la acidificación
lvii
continuada producida por los streptococcus lácticos, se entorpece su crecimiento; a
pesar de esto a una temperatura alta adecuada, este bacilo muchas veces puede
coagular la leche pasteurizada por medio de los fermentos de laboratorio sin previa
acidificación y tras reposar un largo período puede sobrevenir la peptonización.
Esta bacteria también es importante porque produce subtilicina, una bacteriocina que
inhibe o mata especies estrechamente relacionadas o incluso a cepas diferentes de la
misma especie. (López L., 2001)
Algunas enfermedades causadas por este son:
-
Mancha blanca del trigo
-
Daños en cultivo de tejidos de la palma datilera
-
Daños en óvulos y semillas de papa (López L., 2001)
2.7 ANTIMICROBIANOS
Desde el siglo XVIII se han empleado sustancias químicas para el tratamiento de las
emnfermedades infecciosas. Paul Ehrlich, quien formulo los principios de toxicidad
selectiva, reconoció las reacciones químicas específicas entre microorganismos y
medicamento, la aparición de la resistencia a estos y el papel de la terapéutica
combinada para combatirlos. Posteriormente se descubrieron las sulfonamidas y se
acrecentó el interés en sustancias antibacterianas de origen microbiano, llamadas
antibióticos, de ahí surgió la penicilina, estreptomicina, tetraciclina, cloramfenicol,
etc. Las cuales también han sido obtenidas sintéticamente, a través de modificación
química, total o parcial, de las moléculas por biosíntesis (Manrique E, 1997).
El ataque a los microorganismos, por parte de los antimicrobianos, se pueden dar de
diferentes maneras: por inhibición de la síntesis de la pared celular, de las funciones
de la membrana celular, de la traducción de material genético y de la síntesis de
ácidos nucleicos (Manrique E, 1997).
El término antibiótico, se refiere a un producto metabólico de un organismo que es
lviii
perjudicial o inhibitorio para otros microorganismos en muy pequeñas cantidades,
estas sustancias pueden actuar de dos maneras:
a. Como microbiocidas, es decir, que matan las formas vegetativas de los
gérmenes, específicamente se denominan bactericidas, refiriéndose a bacterias
y fungicidas refiriéndose a hongos.
b. Como microbiostatico, es decir que inhibe el crecimiento de microorganismos
y se denominará, bacteriostático o fungistático, según se refiera a bacterias o a
hongos, respectivamente (Barreto J, 1997)
2.7.1 CLORAMFENICOL
2.7.1.1 Origen
El Cloramfenicol (Cm) es un antibiótico clásico de amplio espectro que es producido
por diversas especies del género bacteriano Streptomyces. Este agente antimicrobiano
es único entre los compuestos naturales ya que contiene un grupo nitrobenceno
conectado a un grupo propanol, así como un grupo amino conectado a un derivado
del ácido dicloroacético. El Cm es una de las moléculas más simples, razón por la que
fue el primer antibiótico cuya síntesis química fue desarrollada para la producción
comercial a gran escala y que ha sido modificado en múltiples para la obtención de
moléculas análogas con mejor actividad antimicrobiana. A pesar de la toxicidad del
Cm, algunas veces éste se usa como antibiótico sistémico debido a su efectividad
contra infecciones causadas por Samonella typhi y se recomienda en pacientes con
meningitis de tipo bacteriana causada por Enterococcus faecium, Haemofilus
influenzae, Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae, especialmente en
aquellos que son alérgicos a los β – lactámicos. Además, debido a que la molécula de
Cm es pequeña y con características poco polares, este antibiótico es capaz de
difundir a través de células eucarióticas y paredes de células procarióticas. De hecho,
la solubilidad lipídica de este antibiótico es la que permite que el Cm penetre bien
lix
dentro del cerebro, razón por las que sus potencialidades se aumentan para tratar
infecciones en estos sitios donde otros antibióticos no podrían llegar a producir los
efectos deseados. Además el Cm sigue siendo un antibiótico de elección para el
tratamiento tópico de una amplia variedad de infecciones bacterianas incluyendo las
causadas por anaerobios (Morales Y, 2007).
2.7.1.2 Mecanismos de acción del cloramfenicol
El mecanismo de acción principal del Cm sobre diversas bacterias, involucra la
inhibición de la síntesis de proteínas en las cepas sensibles. El ácido ribonucleico
mensajero (ARNm), derivado del proceso de transcripción es usado como molde por
el complejo ribosomal donde la información es convertida a proteínas (traducción).
Los ribosomas son la unidad funcional de la traducción y actúan como un catalizador.
El Cloramfenicol se une a la subunidad 50S bloqueando las funciones principales de
los ribosomas como la reacción de la PTasa, la terminación de la traducción y
causando un proceso de traducción impreciso. La inhibición de la síntesis de las
proteínas causada por el Cm en la mayoría de los microorganismos susceptibles
produce un efecto bacteriostático (Morales Y, 2007).
Los ribosomas eucarióticos son más largos, complejos y difieren significativamente
de los procariotas, razón por la cual los agentes antimicrobianos como el
Cloramfenicol no interfieren considerablemente con ribosomas eucarióticos y poseen
más especificidad sobre los ribosomas de las células procariotas (Morales Y, 2007).
2.7.1.3 Mecanismos de resistencia bacteriana al cloramfenicol
Los microorganismos han desarrollado distintas estrategias para competir por los
nutrientes en su hábitat, algunos han mejorado sus sistemas de quimiotaxis y otros
han elaborado compuestos antimicrobianos para inhibir a otros miembros del
ambiente. Diversas son las sustancias antagónicas que los microorganismos producen
para dominar su hábitat, por ejemplo los antibióticos de amplio espectro, los
lx
productos del metabolismo como ácidos orgánicos, las moléculas quelantes de hierro
(sideróforos) y las bacteriocinas (Morales Y, 2007).
2.7.1.4 Constitución química
Fórmula global C11H12Cl2N2O5
Peso molecular: 323.13
Estructura química
2.7.1.5 Propiedades
Es un polvo blanco o blanco amarillento, inodoro, intensamente amargo; es poco
soluble en agua, muy soluble en alcohol, propilenglicol, acetona y acetato de etilo. Es
prácticamente estable en soluciones neutras o ligeramente ácidas, pero se destruye
rápidamente en solución alcalina (Morales Y, 2007).
lxi
2.7.2 GRISEOFULVINA
Obtenida de especies de Penicillium. Utilizada en infecciones micóticas. Es un
análogo de las purinas y así conlleva a un error de la secuencia de los aminoácidos
para la lectura del RNAm, inhibiendo así, la mitosis fúngica. La resistencia está dada
por cambios en la permeabilidad de la membrana celular. Tiene acción fungistática,
bloquea la reproducción del hongo, inhibiendo la mitosis fúngica. (Manrique E,
1997).
2.8 MÉTODOS DE EVALUACIÓN ANTIMICROBIANA
Estas técnicas fueron desarrolladas al observar que los microorganismos eran capaces
de inducir resistencia al antimicrobiano que se ha utilizado contra él durante un
período largo de tiempo, esta resistencia puede deberse a diversos mecanismos como:
a. Producción de una sustancia que destruye el antibiótico.
b. Adaptación del metabolismo bacteriano para inhibir el antibiótico.
c. La pared celular del microorganismo se vuelve impermeable al antibiótico.
d. Un fago comunica la resistencia por transducción
e. Desaparición de cepas sensibles y supervivencia de cepas resistentes por un
fenómeno de selección natural.
f. Producción de cepas mutantes (Arévalo A, 1996).
Existen varias técnicas para evaluar los antimicrobianos: métodos de dilución,
método de difusión en gel y método de bioautografía (Arévalo A, 1996).
2.8.1 Método de difusión en gel
Se basa fundamentalmente en incorporar al medio de cultivo el antibiótico o el
microorganismo en concentración conocida para que luego de solidificado el medio
se adicione la contraparte y observar inhibición de crecimiento o halos de inhibición
según la técnica utilizada. Esta técnica también abarca la llamada de discos de papel,
lxii
en la cual el antibiótico a ensayar viene incorporado a discos de papel absorbente en
concentración conocida, los cuales se colocan sobre la superficie de una caja de agar
sembrado masivamente con el microorganismo en estudio, luego de incubar a la
temperatura y tiempo adecuados se observan halos de inhibición de crecimiento
(Arévalo A, 1996).
Las ventajas de los métodos de difusión son que utilizan una pequeña cantidad de la
muestra evaluar y ofrecen la posibilidad de ensayar varias sustancias contra un
mismo microorganismo (Arévalo A, 1996).
Con éstas técnicas y realizando diluciones de los diferentes antimicrobianos a probar
se puede la concentración Mínima Inhibitoria (MIC), que se define como la menor
concentración de antibiótico en µg/mL capaz de inhibir el desarrollo in vitro del
microorganismo en estudio y la concentración Mínima Bactericida (MBC),
considerándose como la menor concentración del antibiótico en µg/mL que mata los
microorganismos in vitro (Arévalo A, 1996).
2.8.2 Método de dilución
También llamado turbidimétrico, consiste en hacer diluciones seriadas del antibiótico
en µg/ml en caldo de cultivo y un tubo como control de crecimiento de
microorganismo, los tubos se inoculan con una suspensión calibrada del
microorganismo y se incuban a temperatura y tiempo determinados, finalizado el
período de incubación, los tubos se examinan visualmente para comprobar la
existencia o no de turbidez. (Manrique E, 1997)
2.8.3 Método de Bioautografia
Este método consiste en incluir los cromatogramas obtenidos por cromatografía en
capa fina en un medio de cultivo. Para ello se utilizan placas cromatográficas de sílica
gel 60f 254 de MERCK o de celulosa las cuales se colocan en las cajas petri
lxiii
correspondientes. Previamente se procede a eliminar el disolvente para evitar falsas
bandas de inhibición. (Manrique E, 1997)
La bioautografía ha sido considerada como el ensayo más eficiente para la detección
de componentes antimicrobiales, porque esta permite la localización de la actividad
en un complejo matriz y por lo tanto permite un directo aislamiento de los
constituyentes activos. El ensayo de bioautografia puede dividirse en tres grupos:
a. bioautografía directa: Donde los microorganismos crecen directamente sobre
la capa fina cromatográfica.
b. bioautografia de contacto: Donde los componentes antimicrobiales son
transferidos de la fina capa cromatográfica y son inoculados en una caja de
agar a través de contacto directo.
c. bioautografia cubierta de agar o inmersión de bioautografia: Es donde el
medio de agar sembrado es aplicado encima de la fina capa cromatografica.
(Manrique E, 1997)
lxiv
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1 Formulación del problema
¿Tendrán actividad antimicrobiana los extractos etanólicos o aceites esenciales
obtenidos a partir de las
ferruginea,
Myrcianthes
especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles
rhopaloides
y
Passiflora
manicata
contra
los
microorganismos patógenos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus
aureus, Candida albicans y el hongo fitopatógeno Alternaria sp ?
3.2 Justificación de la Investigación
En la actualidad, el gran desafío para los países ricos en biodiversidad es poder
vincular y convertir el conocimiento proveniente de los recursos biológicos en
compuestos, procesos, métodos, herramientas o productos útiles, como parte del
aprovechamiento y la explotación sostenible de la diversidad biológica en beneficio
de la sociedad. El Distrito Capital posee especies cuyas propiedades medicinales no
han sido estudiadas por completo, y con el fin de de generar conocimiento en cuanto
a las posibles propiedades farmacológicas
se han seleccionado las especies
Myrcianthes rhopaloides, Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea y Valeriana
pilosa que posiblemente pueden tener propiedades antimicrobianas, ya que especies
de su misma familia y género han sido estudiadas preliminarmente por tener
principios activos bactericidas y fungicidas.
Este trabajo de grado se basa en evaluar la actividad antimicrobiana de extractos
etanólicos de las especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para demostrar la capacidad
inhibitoria que ejercen éstas sustancias obtenidas de estas plantas contra los
microorganismos patógenos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus
lxv
aureus, Candida albicans y el hongo fitopatógeno Alternaria sp para formar parte
del desarrollo científico de la sociedad, estudiar microbiológicamente las propiedades
terapéuticas de plantas colombianas ya que resulta imprescindible descubrir nuevas
sustancias con actividad antibiótica frente a microorganismos resistentes y con alta
capacidad infectiva, aumentando la calidad de vida del hombre.
lxvi
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Evaluar la actividad antimicrobiana de extractos etanólicos y aceites esenciales de las
especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes
rhopaloides y Passiflora manicata frente a los microorganismos patógenos
Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans y el
hongo fitopatógeno Alternaria sp.
mediante la Prueba de Sensibilidad
Antimicrobiana.
4.2 Objetivos Específicos
- Realizar la prueba de sensibilidad antimicrobiana a cada uno de los extractos
vegetales utilizando los microorganismos seleccionados.
- Determinar cual de los extractos obtenidos presenta mayor acción contra los
microorganismos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus,
Candida albicans y Alternaria sp.
lxvii
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 LOCALIZACIÒN
El presente trabajo se llevó a cabo en las instalaciones de los laboratorios de la
Subdirección Científica del Jardín Botánico José Celestino Mutis de la ciudad de
Bogotá D.C (JBJCMB).
5.2 RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS
Se recolectó el material vegetal para cada especie vegetal de la siguiente forma:
Myrcianthes rhopaloides
Passiflora manicata
Jardín Botánico Bogotá José Celestino Mutis
Ubate – 2800 mt
Hesperomeles ferruginea
Valeriana pilosa
Guacheta - 2400 mt
Páramo Cruz Verde (Choachí, Cundinamarca)
Tabla 2. Peso en gramos del material vegetal a extraer.
Peso (g) de
extracto total
Hojas
Peso (g) de
material
vegetal
220
0.348
Peso (g)
extracto
utilizado
0.03
Hojas
200
0.253
0.03
Hojas
200
0.222
0.03
Hojas
250
0.436
0.03
Especie
vegetal
Parte de la
planta
Myrcianthes
rhopaloides
Passiflora
manicata
Hesperomeles
ferruginea
Valeriana
pilosa
5.3 TRATAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL
lxviii
Las plantas de las diferentes especies se separaron por partes, se lavaron con agua,
para luego secarlas a temperatura ambiente; una vez secas se cortaron
independientemente con el fin de obtener partículas uniformes, lo cual facilito el
proceso de extracción, y se peso el material vegetal para conocer la cantidad exacta a
extraer, ver Tabla 2.
5.4 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS
Tabla 3. Especies, Parte a estudiar y Extractos a evaluar
ESPECIES
PARTE A
EXTRACTOS A
ESTUDIAR
EVALUAR
Hojas
Extracto Etanólico y
Myrcianthes
aceite esencial
rhopaloides
Passiflora manicata
Hojas
Extractó Etanólico
Hesperomeles
Hojas
Extracto Etanólico
Hojas
Extracto Etanólico
ferruginea
Valeriana pilosa
5.4.1 Extracto Etanólico
Se recolectó el material vegetal descrito en la Tabla 2, posteriormente se puso a secar
a temperatura ambiente y cuando se secó se disminuyó el tamaño de partícula de
forma manual. Para obtener el extracto se adicionó el solvente (etanol 90%) y se dejó
en maceración fría durante 48 horas. Posteriormente se puso en reflujo a 60ºC en
baño termostatado tres veces durante 4 horas, se concentró el extracto utilizando el
rotavapor y se dejó secando el mismo a temperatura ambiente. Los extractos
obtenidos se almacenaron hasta el momento de utilizarlos a 4ºC. (Torres, 2004)
lxix
Figura 10. Rotavapor Heidolph LABOROTA 4000-EFFICIENT
De estos extractos se sacaron alícuotas para hallar la concentración en peso de cada
extracto y su equivalencia en gramos (g), con ellos se evaluó la actividad
antimicrobiana contra bacterias, hongo y levadura, a una concentración específica
para cada caso. (Arévalo A, 1996)
lxx
RECOLECCIÓN DE LA PLANTA
SEPARACIÓN DE LAS PARTES DE LA PLANTA
OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ETANÓLICO
FLÓCULO
FILTRADO
CONCENTRAR EXTRACTO
REFRIGERAR 4ºC
Figura 11. Proceso para la obtención de extractos a partir del material vegetal
5.4.2 Aceite Esencial: Con el material vegetal semi–seco se realizó una
Hidrodestilación con arrastre a vapor durante 4 horas utilizando un destilador de
aceites esenciales con capacidad 3 litros (Torres, 2007).
lxxi
Figura 12. Montaje hidrodestilación hojas de Myrcianthes rhopaloides.
5.5 MICROORGANISMOS
5.5.1 Cepas: Se utilizaron los siguientes microorganismos Escherichia coli, Bacillus
subtillis y Sthaphylococcus aureus., los cuales fueron seleccionados bajo los
siguientes criterios.
•
representan diferentes grupos
•
Son agentes patógenos para humanos, por su relación con los diferentes
cuadros clínicos que causan
•
Crean resistencia con mucha facilidad
lxxii
En el caso del hongo fitopatógeno, (Alternaria sp) se seleccionó bajo el criterio:
•
Es un microorganismo que ataca con mucha frecuencia algunas de las
especies vegetales presentes en el arbolado urbano.
5.5.2 Aislamiento de las cepas
Patógenas: Se realizó la siembra de los microorganismos en Agar Mueller Hinton,
las cuales se incubaron a 35 ºC durante 24 horas, posterior a esta incubación se
sembró cada microorganismo en medio selectivo para cada uno. Para E. coli
Chromocult (Colonias azul/violeta oscuro), para S. aureus Baird Parker (colonias
negras, lustrosas, convexas, 1–5 mm de diámetro, rodeado de un halo claro de 2-5
mm de anchura. Dentro del halo claro presencia de anillos opacos no visibles antes de
las 48h de incubación) y BPLS (colonias naranja) para B. subtillis. Se realizó la
determinación de las características macroscópicas y microscópicas para cada
microorganismo realizando Coloración de Gram (Torres, 2007).
Fitopatógeno: Se realizó la siembra en medio PDA y se incubo a 27º C, durante 3- 5
Días. Posteriormente se determinaron las características macro y microscópicas
realizando Coloración con azul de lactofenol (Torres, 2007).
5.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS
5.6.1 Prueba de susceptibilidad antimicrobiana: Se utilizó la técnica de difusión de
disco en Agar de Kirby-Bauer, prueba que permite medir la susceptibilidad in Vitro
de microorganismos patógenos y fitopatógenos frente a una sustancia o a la mezcla
de varias sustancias desconocidas de origen vegetal con potencial antimicrobiano
(Torres, 2007).
lxxiii
5.6.1.1 Técnica de difusión de disco en Agar
5.6.1.1.1 Bacterias
Luego de tener las cepas totalmente aisladas en sus respectivos medios se tomó por
cada microorganismo de 4 a 5 colonias y se colocó en 5 mL de solución salina al
0.85%, se ajustó las concentraciones con el Tubo No. 0.5 Mc Farland (1.5 x 106
UFC/mL). Luego la suspensión ajustada se sembró masivamente con escobillón
estéril en el Agar Mueller Hinton para cada microorganismo. Posteriormente se
tomaron los discos de papel estériles a los cuales se les adicionó 10 µl de extracto con
una concentración de 30 mg/mL de acetona, se dejaron secar en una caja de petri
cerrada luego se distribuyeron en cada una de las cajas que contenían Agar Mueller
Hinton. El control positivo fue un disco con cloramfenicol (10mg/mL) y el control
negativo fue agua estéril.
Para hallar las concentraciones de los extractos se tomaron 0.03g y se adicionaron en
1mL de acetona, para la concentración del control positivo se tomaron 0.01g y se
adicionaron en 1 mL de acetona.
Se dejó incubando a 37ºC durante 24 horas, luego del periodo de incubación se
realizó la lectura de los halos de inhibición (mm). Todos los ensayos de actividad
antimicrobiana se realizaron cinco (5) veces.
5.6.1.1.2 Hongo
5.6.1.1.2.1 Evaluación antifúngica
Comprende la realización de los ensayos biológicos para determinar la actividad
antifúngica. Existen varios métodos para la evaluación de la actividad antifúngica de
productos vegetales, los cuales se pueden agrupar en los tres siguientes:
-
Método de crecimiento radial sobre un medio de Agar en caja de petri.
lxxiv
-
Método de crecimiento en cultivo líquido (el cual puede ser medido como un
aumento en el peso seco o como un aumento en la turbidez).
-
El método conocido como bioautografía (el cual utiliza una suspensión de
esporas fúngicas, mientras que el extraído a analizar se separa previamente
por cromatografía en capa delgada (CCD).
Se prefirió en este caso el método de crecimiento radial puesto que es el bioensayo
más adecuado para hongos de rápido crecimiento. Se utilizó Agar PDA, este se
incubó a 27 ºC de 5 a 10 días. Después de la incubación se añadió 10 mL de agua
destilada para remover las estructuras del hongo, de allí se tomaron 0,1 mL para
realizar siembra masiva con escobillón estéril. Se tomaron los discos de papel
estériles a los cuales se les adicionó 10 µl de extracto con una concentración de 30
mg/mL de acetona. Se utilizó Griseofulvina como control positivo y como control
negativo agua estéril.
Se dejaron incubando a 27 ºC de 3 – 5 días, luego del tiempo de incubación se realizó
la lectura de los halos de inhibición (mm). Todos los ensayos de actividad
antimicrobiana se realizaron cinco (5) veces.
5.6.1.1.3 Levadura
Teniendo la cepa totalmente aislada de Candida albicans, se tomaron de 4 a 5
colonias y se colocaron en un tubo que contenía 5 mL de solución salina al 0,85%, se
ajustó la concentración con el tubo Nº 0.5 Mc Farland (1.5 x 106 UFC/mL), luego la
suspensión ajustada se sembró masivamente con escobillón estéril en Agar PDA.
Posteriormente se tomaron discos de papel estériles a los cuales se les adicionó 10 µl
de extracto con una concentración de 30 mg/mL de acetona. El control positivo fue
un disco de papel con Griseofulvina (10mg/mL) y el control negativo fue agua estéril.
lxxv
En todos los ensayos la lectura de los halos de inhibición (mm) de la actividad
antimicrobiana se determinó de la siguiente manera:
C = A - B
C = Tamaño del halo de inhibición ( mm)
A = Tamaño del halo + disco de papel filtro
B = Tamaño del disco de papel filtro(6 mm)
5.6.2 Ensayo biodirigido: Se realizó un estudio bioguiado al extracto que presentó
mayor actividad antimicrobiana, realizando una serie de fraccionamientos utilizando
diferentes solventes (diclorometano, alcohol isoamílico y agua) para determinar cual
fracción es la responsable de la actividad antimicrobiana. Se tomó aproximadamente
de 0.2 a 0.4 g de extracto vegetal y se disolvió en agua, se mezcló y se adicionó
diclorometano (DCM), esto se agitó en un embudo de decantación y se le sacó el gas
abriendo la llave, este proceso se realizó 3 veces. Se mantuvo sobre un soporte
metálico dejando que se separaran las fases (acuosa – DCM) luego se sacó la fase
acuosa en un vaso de precipitado y aparte la fase de diclorometano.
lxxvi
Figura 13. Fraccionamiento hojas de Passiflora manicata.
Figura 14. Fase diclorometano (DCM) de extracto hojas Passiflora manicata.
lxxvii
La fase acuosa se volvió adicionar al embudo de decantación y se agrego alcohol
isoamílico, se agitó y se dejo escapar el gas abriendo la llave, este proceso se realizó
3 veces. Se dejo sobre el soporte esperando que se separaran las fases (acuosa –
alcohol isoamílico), posteriormente se obtuvo la fase acuosa y la fase de alcohol
isoamílico por separado.
Figura 15. Fase Acuosa - Fase Alcohol Isoamílico de extracto hojas de Passiflora
manicata.
Al final del procedimiento cada fase fue secada en el rotavapor para conocer el peso
(g) extracto de la fracción obtenida.
lxxviii
Figura 16. Proceso para la obtención de fracciones a partir del material vegetal
5.7 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
La presente investigación estuvo basada en un estudio experimental cuantitativo que
buscaba encontrar la mayor actividad antimicrobiana representada en halos de
inhibición que tuvieran los extractos obtenidos de las especies Myrcianthes
rhopaloides, Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea y Valeriana pilosa y
determinar cual de ellos era el mejor frente a microorganismos patógenos y
fitopatógenos. En la experimentación se determinaron cinco (5) tratamientos
diferentes, cada uno contó con cinco (5) repeticiones.
lxxix
5.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
La presente investigación estuvo basada en un estudio experimental cuantitativo, el
análisis estadístico se determinó por medio de la prueba ANOVA (Análisis de
varianza) y la comparación de medias de Tukey.
Cada ensayo se realizó cinco (5) veces.
Hipótesis nula: Ninguno de los extractos obtenidos de las especies Myrcianthes
rhopaloides, Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea y Valeriana pilosa
presentan actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados de
referencia (Patógenos y fitopatógenos).
Hipótesis alterna: Todos los extractos obtenidos de las especies Myrcianthes
rhopaloides, Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea y Valeriana pilosa
presentan actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados de
referencia (Patógenos y fitopatógenos).
Variables: Las variables planteadas en el presente trabajo contribuirán a la
determinación de aquellas especies que tienen propiedades antimicrobianas.
•
Dependiente: Tamaño de Halo de inhibición medido en mm.
•
Independiente: Tipo de microorganismo y tipo de extracto
lxxx
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Es común el empleo popular de partes vegetales con la finalidad de obtener diversos
efectos terapéuticos. Varios estudios han validado científicamente la eficacia de
numerosos usos de la medicina tradicional utilizada por la gente. Entre las variadas
aplicaciones terapéuticas de los vegetales, se incluyen aquellas con finalidad
antimicrobiana (Garzón, 2006).
Con el objetivo de evaluar la actividad antimicrobiana de extractos etanólicos y
aceites esenciales de las especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles
ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata frente a los
microorganismos patógenos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus
aureus, Candida albicans y Alternaria sp, se diseñó un experimento en el que se
compara la capacidad de los extractos vegetales de inhibir el crecimiento de los
microorganismos a través de la Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana, usando el
Cloramfenicol (Cm) y la griseofulvina como control positivo, teniendo en cuenta que
es un antibiótico de amplio espectro activo en técnicas in vitro contra un gran
número de bacterias, ya que previene la formación de enlaces peptídicos y la síntesis
proteica en gran variedad de organismos Gram negativos y Gram positivos.
La inhibición de la síntesis de proteínas causada por el Cm en la mayoría de los
microorganismos susceptibles produce un efecto bacteriostático (Morales Y., 2007).
En el presente trabajo se utilizó una dosis de Cm (10 mg/mL), que al compararla con
la dosis de los extractos etanólicos de las plantas (30 mg/mL), determinó que la
concentración del extracto es tres (3) veces mayor que la del antibiótico, lo cual
mostró efectividad presentando una no correlación con la dosis empleada para el
antibiótico sintético, lo que nos permitió inferir que la concentración del extracto
debe ser más elevada, por ser una mezcla compleja de sustancias, mientras que el Cm
lxxxi
es una molécula sintética, la cual contiene sus parámetros ya estandarizados (Torres,
2007).
En este experimento, la capacidad antimicrobiana es medida a través del diámetro del
halo de inhibición, el cual es afectado por dos factores: El microorganismo y el
extracto vegetal, en donde la actividad antimicrobiana de varios extractos vegetales es
evaluada sobre los diferentes microorganismos seleccionados. A continuación se
presentan cinco gráficas (gráfica 1 - 5) que describen los resultados del experimento
conducido. En todos los casos, los puntos representan los diámetros de los halos de
inhibición que se obtuvieron en el experimento para cada extracto vegetal
considerado. En todos los ensayos se tomó como patrón de referencia el control
positivo para determinar cual era el que tenía mayor actividad antimicrobiana.
Tabla 4. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para S. aureus.
Extractos
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
X
σ
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
EX1
4
6
5
4
4
4.6
0.894
EX2
5
4
4
3
4
4.0
0.707
EX3
9
9
6
6
7
7.4
1.516
EX4
1
0
1
2
2
1.2
0.836
Control
24
24
19
19
26
22.4
3.209
Positivo
lxxxii
Gráfica 1. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al
control positivo para S. aureus.
Se observa claramente que el diámetro de los halos de inhibición del extracto vegetal
Passiflora manicata fue menor al de los demás extractos en presencia del
microorganismo Staphylococcus aureus, es decir, que el poder inhibidor de este
extracto vegetal es mínimo. Se observa también que frente a este microorganismo el
extracto que presentó mejor actividad fue el de Myrcianthes rhopaloides, el cual
estuvo más cercano al valor obtenido para el control positivo (Gráfica 1).
Las posibles razones para que el crecimiento del microorganismo se viera poco
afectado es la existencia de mecanismos de resistencia por parte de S. aureus, la cual
esta relacionada con la activación de una síntesis de la pared celular, con
hiperproducción de proteínas ligadoras de penicilinas, engrosamiento de la pared y el
encarcelamiento de fármacos por hiperproducción de los componentes de pared
(Tavares, 2000).
Otros mecanismos que posee la bacteria son la producción de la enzima coagulasa
que hace que se deposite el material de fibrina sobre los cocos protegiéndoles del
ataque por las células del hospedador, producción de proteasas, nucleasas y lipasas
lxxxiii
que sirven para despolimerizar las proteínas del hospedador, los ácidos nucleicos y
las grasas, el desarrollo de una vía bioquímica resistente la cual puede tener lugar por
intercambio genético bloqueando el agente antimicrobiano y por eflujo donde el
microorganismo es capaz de bombear hacia afuera el antimicrobiano que va entrando
en la célula. Estudios previos han demostrado que S. aureus posee genes que le
permiten generar resistencia contra biocidas (Agentes químicos y antibióticos)
(Tavares, 2000).
Tabla 5. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para E. coli.
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
Extractos
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
X
Σ
EX1
6
6
6
9
9
7.2
1.643
EX2
4
7
6
4
6
5.4
1.341
EX3
9
10
12
9
10
10
1.224
EX4
24
19
24
14
12
18.6
5.549
Control
24
24
24
19
19
22
2.738
Positivo
lxxxiv
Gráfica 2. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al
control positivo para E. coli.
En el caso de Escherichia coli se evidencia que el poder inhibidor del extracto vegetal
Passiflora manicata es muy similar al del Control Positivo (C+), representando una
buena actividad antimicrobiana para este. Sin embargo los demás extractos
presentaron actividad aunque mucho menor en comparación con el control positivo y
con el extracto de Passiflora manicata (Gráfica 2).
E. coli hace parte de las bacterias Gram negativas, además del peptidoglicano, poseen
una capa adicional en su pared que esta compuesta de lipopolisacáridos. Esta capa
representa una segunda bicapa lipídica, que no consta solamente de fosfolípidos como
la membrana plasmática, sino que contiene polisacáridos y proteínas. Los lípidos y
polisacáridos están estrechamente unidos en la capa externa formando estructuras
lipopolisacáridas específicas. La presencia del lipopolisacárido justifica que la
membrana externa se denomine generalmente capa de lipopolisacárido o simplemente
LPS. Los mecanismos de resistencia de estas bacterias pueden presentarse como
alteración del sitio blanco o diana de antimicrobianos, disminución de la
permeabilidad de la pared por poseer una pequeña capa de peptidoglicano, la cual es
más sensible, adquisición de mecanismo de eflujo y cambio de vía metabólica
lxxxv
externa, lo anterior podría sugerir que el extracto etanólico de Passiflora manicata
puede poseer sustancias capaces de contrarrestar los mecanismos de resistencia del
microorganismo, como por ejemplo las saponinas las cuales actúan sobre los lípidos
de la membrana ocasionando alteraciones y provocando muerte celular; así como lo
indica la Tabla Nº 5 presentando solo una diferencia de 2 unidades frente al control
positivo.
Tabla 6. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para B. subtillis.
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
Extractos
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
X
σ
EX1
7
5
6
9
9
7.2
1.789
EX2
5
7
6
4
4
5.2
1.303
EX3
14
14
19
24
22
18.6
4.560
EX4
34
36
39
34
36
35.8
2.049
Control
34
39
39
34
39
37
2.738
Positivo
lxxxvi
Gráfica 3. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al
control positivo para B. subtillis.
Se observa para Bacillus subtillis que el efecto inhibidor de los extractos es mayor al
compararlos frente a los demás microorganismos evaluados, en este caso para
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata, siendo este último el más cercano al
control positivo, definiendo que el extracto tiene el mejor poder inhibidor, lo cual se
traduce en que dicha especie puede ser una fuente natural de antimicrobianos
cumpliendo un papel importante en el área terapéutica capaz de inhibir un bacilo
Gram positivo esporulado, de tomar una molécula de DNA y transformarla, siendo
este un elemento natural que el microorganismo posee como factor de competencia y
resistencia regulada, existiendo
proteínas especiales que juegan un papel en el
transporte y procesamiento del DNA. Estas proteínas específicas de competencia
incluyen una proteína de unión del DNA que esta asociada a la membrana, una
autolisina de la pared celular y varias nucleasas (Gutowski-Eckel, 1994) (Gráfica 3).
de nutrientes esenciales como el nitrógeno y el carbono, proceso que solo dura 8
horas.
Este microorganismo fue el más sensible en todos los ensayos biológicos
posiblemente puede deberse a la estructura de su pared celular ya que como es un
microorganismo Gram positivo es menos compleja pues esta compuesta por una
lxxxvii
membrana citoplasmática y una capa gruesa de peptidoglicano en comparación con
los microorganismos Gram negativos que tienen una pared más compleja ya que
posee una membrana citoplasmática, un delgada capa de peptidoglicano,
lipopolisacáridos y proteínas.
Tabla 7. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para C.albicans.
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
Extractos
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
X
σ
EX1
0
4
4
0
0
1.6
2.190
EX2
2
3
0
5
6
3.2
2.387
EX3
1
4
9
4
5
4.6
2.880
EX4
3
4
5
9
6
5.4
2.302
Control
8
8
9
9
8
8.4
0.547
Positivo
Tabla 8. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,
Myrcianthes rophaloides y Passiflora manicata para Alternaria sp..
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
Extractos
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
X
σ
EX1
1
4
4
2
1
2.4
1.516
EX2
2
3
4
2
2
2.6
0.894
EX3
2
8
2
5
6
4.6
2.607
EX4
3
4
6
4
4
4.2
1.095
Control
5
8
8
5
6
6.4
1.516
Positivo
lxxxviii
Gráfica 4. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al
control positivo para C.albicans.
Gráfica 5. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al
control positivo para Alternaria sp
En las gráficas 4 y 5 se puede apreciar que para la levadura y el hongo fitopatógeno
ninguno de los extractos vegetales, incluido el Control Positivo (C+), logró generar
halos con diámetro superior a 10 mm. Lo que indica que los extractos vegetales no
presentaron una eficiente actividad antimicrobiana frente a este tipo de
lxxxix
microorganismos, por ser complejos y adicionalmente poseer diversos mecanismos
de resistencia entre las que encontramos la pared celular compuesta de polisacáridos,
proteínas, lípidos, iones inorgánicos y mananos. Los polisacáridos (Quitina) y
glucanos no celulósicos. Los resultados anteriormente expuestos sugieren que los
extractos evaluados son más eficientes con bacterias debido a que sus estructuras y
metabolismo celular es mucho menos complejo que el de los hongos (Tavares, 2000).
Para el análisis de los datos se planteó el siguiente modelo:
yij = µ + αi +βi+ (αβ)ij +Ԫij
Donde yij es el valor del halo de inhibición en cada observación, µ es la media
general, αi es el efecto del factor A (microorganismo), βj es el efecto del factor B
(extracto utilizado), (αβ)ij es el efecto de la interacción de los dos factores €ij es el
efecto de error aleatorio. ij = 5
Se plantean hipótesis para probar los efectos de cada factor y de la interacción de
estos. Para los efectos del factor A (microorganismo) se plantea:
H0: α1 = α2 = α3 = α4 = α5 = 0
Hi: al menos un αi ≠ 0
Para probar los efectos del factor B (extracto) se plantea:
H0: β1 = β2 = β3 = β4 = β5 = 0
Hi: al menos un βi ≠ 0
Para probar el efecto de la interacción de los factores A y B se plantea:
xc
H0: (αβ)ij = 0 para toda i, j
Hi: al menos una (αβ)ij ≠ 0
En todas las tablas están sombreados de rojo los microorganismos que presentaron
mayor resistencia y los extractos que tuvieron mayor actividad antimicrobiana; de
azul están sombreados los microorganismos más sensibles y los extractos con menor
actividad antimicrobiana.
Tabla 9. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores
Fuente de
variación
MICR
EXTRAC
MICR *
EXTRAC
Error
Total
Suma de
cuadrados
4783,12
3993,68
3260,8
gl
4
4
16
536,4
12574
100
124
Cuadrados
medios
1195,78
998,42
203,8
F
222,93
186,13
37,99
Sig.
0,000
0,000
0,000
5,36
R Squared = ,957 (Adjusted R Squared = ,947)
La tabla 11 muestra que el nivel de significación para los efectos de los dos factores
(Microorganismo – Extracto) y de la interacción es menor a 0.05, por lo tanto se
rechazan las hipótesis nulas, es decir, existen diferencias significativas de los halos de
inhibición entre los microorganismos analizados y se presenta un efecto significativo
del extracto utilizado sobre el tamaño de los halos de inhibición; también se presenta
un efecto significativo de la interacción microorganismo*extracto.
xci
Tabla 10. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos
seleccionados
N
SUBSET
Alternaria sp.
25
4.04
C. Albicans
25
4.64
S. aureus
25
E. coli
25
B. subtillis
25
MICR
Sig.
7.92
12.64
20.76
0.89
1
1
1
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que Alternaria sp. y C.
albicans son los microorganismos que presentaron menores halos de inhibición, los
otros microorganismos presentaron halos de inhibición significativamente superiores,
en orden de menor a mayor inhibición están: S. aureus, E. coli y B. subtillis.
Tabla 11. Prueba de comparación de medias de Tukey para extractos.
N
SUBSET
Hesperomeles ferruginea
25
4.08
Valeriana pilosa
25
4.6
Myrcianthes rhopaloides
25
Passiflora manicata
25
Control positivo
25
EXT.
Sig.
9.04
13.04
19.24
0.93
1
1
1
La prueba de comparación de medias de Tukey entre extractos muestra que los
extractos 2 y 1 presentaron menor efecto inhibidos, pues presentan los menores
xcii
promedios de tamaño de halo; los extractos 3, 4 y 5 (control positivo) presentan
tamaños de halo progresivamente superiores, con diferencias significativas entre sí.
Como se presentó efecto significativo de la interacción entre los factores extracto y
microorganismo, se evaluaron las diferencias por cada microorganismo, utilizando el
siguiente modelo:
yijk= µ + αi + ℇijk
Donde yijk es el valor del halo de inhibición en cada observación, µ es la media
general, αi es el efecto del extracto utilizado y ℇijkes el efecto de error aleatorio.
Tabla 12. Análisis de varianza para S. aureus
Fuente de
variación
EXTRAC
Error
Total
Suma de
cuadrados
1407.44
58.4
1465.84
gl
Cuadrados
medios
351.86
2.92
4
20
24
F
120.5
Sig.
0,000
R Squared = ,960 (Adjusted R Squared = ,952)
La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el
halo de inhibición en S. aureus.
xciii
Tabla 13. Prueba de comparación de medias de Tukey para S. aureus
N
SUBSET
Passiflora manicata
5
1.2
Hesperomeles ferruginea
5
4
Valeriana pilosa
5
Myrcianthes rhopaloides
5
Control positivo
5
EXT.
4
4.6
4.6
7.4
22.4
Sig.
0.11
0.98
0.11
1
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta
un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con los
extractos; el extracto 3 presenta un efecto significativamente superior al del extracto
2.
Tabla 14. Análisis de varianza para E. coli
Fuente de
variación
EXTRAC
Error
Total
Suma de
cuadrados
1060.56
177.2
1237.76
gl
Cuadrados
medios
265.14
8.86
4
20
24
F
29.92551
Sig.
0,000
R Squared = ,857 (Adjusted R Squared = ,828)
La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el
halo de inhibición en E. coli.
xciv
Tabla 15. Prueba de comparación de medias de Tukey para E. coli
N
SUBSET
Hesperomeles ferruginea
5
5.4
Valeriana pilosa
5
7.2
Myrcianthes rhopaloides
5
10
Passiflora manicata
5
18.6
Control positivo
5
22
EXT.
Sig.
0.144481
0.397581
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta
un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con los
extractos 1,2 y 3. El extracto 4 presenta un efecto significativamente al del extracto 2.
Tabla 16. Análisis de varianza para B. subtillis
Fuente de
variación
EXTRAC
Error
Total
Suma de
cuadrados
4602.96
149.6
4752.56
gl
Cuadrados
medios
1150.74
7.48
4
20
24
F
153.8422
Sig.
0,000
R Squared = ,969 (Adjusted R Squared = ,962)
La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el
halo de inhibición en B. subtillis.
xcv
Tabla 17. Prueba de comparación de medias de Tukey para B. subtillis
N
SUBSET
Hesperomeles ferruginea
5
5.2
Valeriana pilosa
5
7.2
Myrcianthes rhopaloides
5
Passiflora manicata
5
35.8
Control positivo
5
37
EXT.
18.6
Sig.
0.775186
1
0.955519
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta
un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con los
extractos 1,2 y 3. El extracto 4 presenta un efecto significativamente al del extracto 2.
Los extracto 4 y 5 no presentan diferencia significativa entre ellos.
Tabla 18. Análisis de varianza para Candida albicans.
Fuente de
variación
EXTRAC
Error
Total
Suma de
cuadrados
130.16
97.6
227.76
gl
Cuadrados
Medios
32.54
4.88
4
20
24
F
6.668033
Sig.
0,001
R Squared = ,571 (Adjusted R Squared = ,486)
La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el
halo de inhibición en Candida albicans.
xcvi
Tabla 19. Prueba de comparación de medias de Tukey para Candida albicans
N
SUBSET
Valeriana pilosa
5
1.6
Hesperomeles ferruginea
5
3.2
Myrcianthes rhopaloides
5
4.6
4.6
Passiflora manicata
5
5.4
5.4
Control positivo
5
EXT.
8.4
Sig.
0.086117
0.086117
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta
un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con los
extractos 1, 2. Los extractos 3 y 4 no presentan diferencias significativas entre ellos.
Tabla 20. Análisis de varianza para Alternaria sp.
Fuente de
variación
EXTRAC
Error
Total
Suma de
cuadrados
53.36
53.6
106.96
gl
Cuadrados
Medios
13.34
2.68
4
20
24
F
4.977612
Sig.
0,006
R Squared = ,499 (Adjusted R Squared = ,399)
La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el
halo de inhibición en Alternaria sp.
xcvii
Tabla 21. Prueba de comparación de medias de Tukey para Alternaria sp.
N
SUBSET
Valeriana pilosa
5
2.4
Hesperomeles ferruginea
5
2.6
Passiflora manicata
5
4.2
4.2
Myrcianthes rhopaloides
5
4.6
4.6
Control positivo
5
EXT.
6.4
Sig.
0.248543
0.248543
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta
un promedio de halo de inhibición estadísticamente no significativo entre todos los
extractos. Los extractos 1 y 2 no presentan diferencias significativas entre ellos, al
igual que los extractos 3 y 4.
Tabla 22. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para E. coli.
Extracto
Passiflora
Replica 1
manicata
(mm)
FR1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
X
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
10
8
8
9
8
8.6
0.894
FR2
0
0
0
0
0
0
0
FR3
0
1
0
2
0
0.6
0.894
Control
21
22
18
19
21
20.2
1.643
positivo
xcviii
Σ
Tabla 23. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para S. aureus.
Extracto
Passiflora
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
X
σ
manicata
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
FR1
5
4
3
3
5
4
1
FR2
0
0
0
0
0
0
0
FR3
0
0
0
0
0
0
0
Control
18
19
18
20
20
19
1
positivo
Tabla 24. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para B. subtillis.
Extracto
Passiflora
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
X
manicata
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
FR1
6
5
6
4
5
5.2
0.836
FR2
0
0
0
0
0
0
0
FR3
1
1
0
2
1
1
0.707
Control
30
32
34
32
34
32.4
1.673
positivo
xcix
Σ
Tabla 25. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para Candida albicans.
Extracto
Passiflora
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
manicata
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
FR1
3
5
4
4
FR2
0
1
0
FR3
0
0
Control
12
11
Replica 5
X
Σ
3
3.8
0.836
1
0
0.4
0.547
0
0
0
0
0
13
11
13
12
1
(mm)
positivo
Tabla 26. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar y de
fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para Alternaria sp.
Extracto
Passiflora
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
X
manicata
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
FR1
4
5
0
0
5
4.7
0.577
FR2
0
0
0
0
0
0
0
FR3
0
0
0
0
0
0
0
Control
22
23
22
20
20
21.4
1.342
positivo
c
σ
Gráfica 6. Diámetro de halos de inhibición Vs. Microorganismos seleccionados para
las diferentes fases.
Con base en el análisis de los resultados estadísticos se determinó que el extracto más
eficiente frente a todos los microorganismos evaluados fue el de la especie Passiflora
manicata, siendo este extracto el candidato para realizar el fraccionamiento para
determinar cual fración era la responsable de la actividad antimicrobiana. En la
Gráfica 6 se aprecian las diferencias entre el diámetro promedio del halo de
inhibición del extracto vegetal Passiflora manicata en presencia de los
microorganismos seleccionados para cada una de las fases (FR1, FR2, FR3). Se
observa que el comportamiento del halo de inhibición en FR2 y FR3 del extracto
vegetal es muy similar, adicionalmente que el diámetro del halo de inhibición en FR1
es más parecido al halo del Control Positivo (C+) en comparación a las otras dos
fases.
ci
Gráfica 7. Halos de inhibición Vs. Fracciones para cada microorganismo
En la Gráfica 7 se aprecian las diferencias entre el diámetro promedio del halo de
inhibición del extracto vegetal Passiflora manicata en sus tres fases para todos los
microorganismos seleccionados. Se observa que el comportamiento de Bacillus
subtillis es mayor para FR1 en comparación con las siguientes fases (FR2 y FR3).
También se muestra que el microorganismo con menos actividad antimicrobiana fue
C. albicans ya que el promedio de halos de inhibición fue tan solo 3.8 mm para FR1
en comparación con el mejor de B. subtillis que fue de 5.2 mm, en este caso el
Control positivo (C+) fue de 12 mm.
Por otra parte las tres fases evaluadas (FR1, FR2, FR3) estuvieron definidas de
acuerdo a la polaridad de cada solvente, es decir, de mayor a menor polaridad. Donde
FR1 es una mezcla de compuestos de alta polaridad en los cuales posiblemente se
pueden encontrar taninos, proteínas hidrosolubles y azúcares responsables de la
actividad antimicrobiana evaluada, tal como lo sugiere Domingo & Lopez Brea
(2003) 1 al definir que los extractos vegetales poseen una gran cantidad de
compuestos químicos con carácter antimicrobiano, algunos de los cuales muestran
una actividad in Vitro comparable a los de los microbianos sintéticos utilizados en la
cii
clínica, lo que podemos comparar con el extracto etanólico de Passiflora manicata al
observar los resultados obtenidos en el tamaño de halos de inhibición del extracto
Vs. control positivo.
De esta manera en la fase FR1 se observó halos de inhibición superiores a los de las
demás fases indicando que en ella se encuentra la molécula responsable del principio
activo con marcada actividad antimicrobiana. La fracción FR2 fue la que obtuvo el
menor rendimiento en la evaluación antimicrobiana para el extracto vegetal de
Passiflora manicata.
Tabla 27. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores
Fuente de
variación
MICR
FRAC
MICR *
FRAC
Error
Total
Suma de
cuadrados
347.76
7306.59
836.96
gl
4
3
12
83.2
8574.51
80
99
Cuadrados
medios
86.94
2435.53
69.74667
F
83.59615
2341.856
67.0641
Sig.
0,000
0,000
0,000
1.04
R Squared = ,990 (Adjusted R Squared = ,988)
La tabla 29 muestra que el nivel de significación para los efectos de los dos factores
(Microorganismo – Extracto) y de la interacción es menor a 0.05. Existen diferencias
significativas de los halos de inhibición entre los microorganismos analizados y se
presenta un efecto significativo de la fracción utilizada sobre el tamaño de los halos
de inhibición; también se presenta un efecto significativo de la interacción
microorganismo*fracción.
ciii
Tabla 28. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos
seleccionados
.
N
SUBSET
C. albicans
20
4.05
S. aureus
20
5.75
Alternaria sp.
20
6.05
E. coli
20
B. subtillis
20
MICR
7.35
9.65
Sig.
1
0.884324
1
1
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que Candida albicans y S.
aureus son los microorganismos que presentaron menores halos de inhibición, los
otros microorganismos presentaron halos de inhibición significativamente superiores,
en orden de menor a mayor inhibición están: Alternaria sp., E. coli y B. subtillis.
Tabla 29. Prueba de comparación de medias de Tukey para fracciones.
N
SUBSET
FR2
25
0.08
FR3
25
0.32
FR1
25
C+
25
EXT.
Sig.
4.88
21
0.83908
civ
1
1
La prueba de comparación de medias de Tukey entre fracciones muestra que las
fracciones 2 y 3 presentaron menor efecto inhibidor, pues presentan los menores
promedios de tamaño de halo; las fracciones 1 y 4 (control positivo) presentan
tamaños de halo progresivamente superiores, con grandes diferencias significativas
entre sí.
Tabla 31. Análisis de varianza para S. aureus con las diferentes fracciones
Fuente de
variación
FRAC
Error
Total
Suma de
cuadrados
1223.75
8
1231.75
gl
Cuadrados
medios
407.9167
0.5
3
16
19
F
815.8333
Sig.
0,000
R Squared = ,994 (Adjusted R Squared = ,992)
La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el
halo de inhibición en S. aureus.
Tabla 30. Prueba de comparación de medias de Tukey para S. aureus
N
SUBSET
FR2
5
0
FR3
5
0
FR1
5
C+
5
FRAC.
4
19
1
Sig.
cv
1
1
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta
un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con las
fracciones; la fracción 1 presenta un efecto significativamente al de las demás
fracciones.
Tabla 32. Análisis de varianza para E. coli con las diferentes fracciones
Fuente de
variación
FRAC
Error
Total
Suma de
cuadrados
1331.35
17.2
1348.55
gl
Cuadrados
Medios
443.7833
1.075
3
16
19
F
412.8217
Sig.
0,000
R Squared = ,987 (Adjusted R Squared = ,985)
La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo de las fracciones sobre
el halo de inhibición en E. coli.
Tabla 33. Prueba de comparación de medias de Tukey para E. coli
N
SUBSET
FR2
5
0
FR3
5
0.6
FR1
5
C+
5
FRAC.
Sig.
8.6
20.2
0.797264
1
1
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta
un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con todas
cvi
las fracciones. La fracción 1 presenta un efecto significativamente superior a las
fracciones 2 y 3.
Tabla 34. Análisis de varianza para B. subtillis con las diferentes fracciones
Fuente de
variación
FRAC.
Error
Total
Suma de
cuadrados
3526.55
16
3542.55
gl
Cuadrados
medios
1175.517
1
3
16
19
F
1175.517
Sig.
0,000
R Squared = ,995 (Adjusted R Squared = ,995)
La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo de la fracción sobre el
halo de inhibición en B. subtillis.
Tabla 35. Prueba de comparación de medias de Tukey para B. subtillis
N
SUBSET
FR2
5
0
FR3
5
1
FR1
5
C+
5
FRAC.
Sig.
5.2
32.4
0.416163
1
1
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta
un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con las
fracciones 1,2 y 3. La fracción 1 presenta un efecto significativamente superior al de
las otras.
cvii
Tabla 36. Análisis de varianza para Candida albicans.
Fuente de
variación
FRAC.
Error
Total
Suma de
cuadrados
464.95
8
472.95
gl
Cuadrados
Medios
154.9833
0.5
3
16
19
F
309.9667
Sig.
0,000
R Squared = ,983 (Adjusted R Squared = ,980)
La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo de la fracción sobre el
halo de inhibición en Candida albicans.
Tabla 37. Prueba de comparación de medias de Tukey para Candida albicans
N
SUBSET
FR3
5
0
FR2
5
0.4
FR1
5
C+
5
FRAC.
Sig.
3.8
12
0.807829
1
1
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta
un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con las
fracciones. La fracción 1 presentan diferencias significativas con respecto a las
fracciones 2 y 3.
cviii
Tabla 38. Análisis de varianza para Alternaria sp.
Fuente de
variación
FRAC
Error
Total
Suma de
cuadrados
1596.95
34
1630.95
gl
Cuadrados
Medios
532.3167
2.125
3
16
19
F
250.502
Sig.
0,000
R Squared = ,979 (Adjusted R Squared = ,975)
La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo de la fracción sobre el
halo de inhibición en Alternaria sp.
Tabla 39. Prueba de comparación de medias de Tukey para Alternaria sp.
N
SUBSET
FR2
5
0
FR3
5
0
FR1
5
C+
5
FRAC.
Sig.
2.8
21.4
1
1
1
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta
un promedio de halo de inhibición estadísticamente significativo para todas las
fracciones. La fracción 1 presenta diferencias significativas entre ellas.
cix
Tabla 40. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite
esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para B. subtillis.
Aceite
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
Esencial
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
X
σ
AE 1
9
1
2
9
9
6
4.123
Control
34
37
34
39
34
35.6
2.302
positivo
Tabla 41. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite
esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para S. aureus.
Aceite
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
Esencial
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
X
σ
AE 1
24
19
19
14
19
19
3.535
Control
27
27
30
29
29
28.4
1.341
positivo
Tabla 42. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para E. coli.
Aceite
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
Esencial
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
X
σ
AE 1
6
4
7
4
3
4.8
1.643
Control
16
15
15
17
15
15.6
0.894
positivo
cx
Tabla 43. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite
esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para Alternaria sp.
Aceite
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
Esencial
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
X
Σ
AE 1
19
14
19
17
19
17.6
2.191
Control
28
27
27
29
29
28
1
positivo
Tabla 44. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de
aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para Candida albicans.
Aceite
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Replica 4
Replica 5
Esencial
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
AE 1
24
22
20
24
22
22.4
1.673
Control
26
24
29
27
24
26
2.121
X
Σ
positivo
Gráfica 8. Halos de inhibición Vs Microorganismos seleccionados frente al aceite
esencial de M. rhopaloides
La Gráfica 8 muestra que el microorganismo que mejor se comporto frente al aceite
cxi
esencial fue Candida albicans. En general las bacterias Gram positivas (Bacillus
subtillis, S. aureus) fueron mas sensibles que la bacteria Gram negativa (E. coli) la
cual fue más resistente frente a este, pudiendo tener su causa en la diferencia que
presentan estas bacterias en cuanto a su pared celular, lo cual determinará la
penetración o no del terpenoide a la célula bacteriana para que produzca su acción
bacterioestatica ( Maguna, 2006).
Según Maguna (2006) uno de los principales mecanismos de acción propuestos para
los terpenoides consiste en la disrupción de la membrana celular bacteriana mediante
tres (3)
posibles vías: aumentando la permeabilidad de la membrana a iones
pequeños, afectando la estabilidad estructural de la membrana y desestabilizando el
empaquetamiento de la bicapa lipídica, cualquiera de estos tres efectos produce la
muerte en la célula bacteriana
Entonces podríamos considerar que el hecho de que las bacterias Gram negativas
presenten mayor sensibilidad, entre otras cosas, puede deberse a su pared celular
menos compleja dado que tiene una capa simple (red de mureína delgada), mientras
que en las Gram positivas es una estructura de multicapa (red de mureína muy
desarrollada y llega a tener hasta 40 capas) (Maguna, 2006).
Con base en lo anterior y de acuerdo con lo reportado por iii Hernández & Rodríguez
(2001), se confirma con los resultados obtenidos para el aceite esencial evaluado de
las hojas de Myrchianthes rhopaloides encontrando que también posee actividad
antibacteriana y antifúngica como otras especies vegetales de familia de Myrtaceae.
Finalmente se puede establecer que los extractos etanólicos de las especies vegetales
evaluados poseen de leve a moderada actividad antimicrobiana frente a los
microorganismos seleccionados, encontrando que el que posee mas potencial
bacteriostático y fungistático es el extracto obtenido a partir de las hojas de Passiflora
manicata, el cual teniendo un amplio espectro de inhibición puede ser capaz de
cxii
inhibir tanto micoorganismos Gram positivos, Gram negativos y hongos siendo mas
efectivos frente al primer grupo mencionado, adicionalmente la fracción del extracto
crudo identificada con potencial antimicrobiano fue la fase en donde pueden
encontrarse compuestos de alta polaridad como taninos y proteínas entre otros
reportados por diversos autores como responsables de dicha actividad (Ver figura 18,
19 y 20 )
En cuanto Myrcinathes rhopaloides se confirma que al aceite esencial obtenido a
partir de las hojas posee actividad antibacterina como lo han reportado para especies
de la familia de las Mirtaceas.
Tabla 45. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores
Fuente de
variación
MICR
ACEITE
MICR *
ACEITE
Error
Total
Suma de
cuadrados
1352.72
2035.22
970.48
gl
212.8
4571.22
40
49
4
1
4
Cuadrados
medios
338.18
2035.22
242.62
F
63.56767
382.5602
45.60526
Sig.
0,000
0,000
0,000
5.32
R Squared = ,953 (Adjusted R Squared = ,943)
La Tabla 47 muestra que el nivel de significación para los efectos de los dos factores
(Microorganismo – Aceite) y de la interacción es menor a 0.05. Existen diferencias
significativas de los halos de inhibición entre los microorganismos analizados y se
presenta un efecto significativo del aceite utilizado sobre el tamaño de los halos de
inhibición; también se presenta un efecto significativo de la interacción
microorganismo*aceite.
cxiii
Tabla 46. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos
seleccionados con respecto al aceite esencial.
N
SUBSET
E. coli
10
10.2
B. subtillis
10
20.8
Alternaria sp.
10
22.8
22.8
S. aureus
10
23.7
23.7
C. albicans
10
MICR
Sig.
24.2
1
0.055535
0.657771
La prueba de comparación de medias de Tukey indica que E. coli y S. aureus son los
microorganismos que presentaron menores halos de inhibición, en general no hay
diferencias significativas entre el valor promedio de los halos de inhibición y los
microorganismos seleccionados.
cxiv
A
B
D
C
E
Figura 17. Ensayos biológicos con extractos vegetales EX1 (Valeriana pilosa), EX2
(Hesperomeles ferruginea), EX3 (Myrcianthes rhopaloides), EX4(Passiflora
manicata) , C+ (Control positivo), C- (Control Negativo) frente a microorganismos
patógenos y fitopatógenos A. Escherichia coli, B. Candida albicans, C.
Staphylococcus aureus, D. Bacillus subtillis, E. Alternaria sp.
Figura 18. Ensayo biológico de las fracciones (FR1: Fase acuosa, FR2: Fase Diclorometano,
FR3: Alcohol isoamilico) del extracto de Passiflora manicata frente a E. coli
cxv
A
B
Figura 19. Ensayo biológico del aceite esencial del extracto de M. rhopaloides frente A. B.
subtillis y B. C. albicans
cxvi
7. CONCLUSIONES
• El extracto etanólico de hojas de Passiflora manicata reveló la mayor
actividad antimicrobiana contra los microorganismos seleccionados, siendo
Bacillus subtillis el microorganismo con los valores más altos de inhibición.
• Los microrganismos Gram positivos evaluados fueron más sensibles al poder
inhibidor de los extractos etanólicos, siendo los hongos los que mostraron
más resistencia.
• La fase acuosa del extracto etanólico crudo
manicata
mostró
mayor
actividad
de las
antimicrobiana
hojas de Passiflora
con
todos
los
microorganismo seleccionados en comparación con la fase de diclorometano y
la fase de alcohol isoamílico evaluada.
• El aceite esencial obtenido de las hojas de Myrchiantes rhopaloides presentó
mayor actividad antimicrobiana obtenida frente a los microorganismos
evaluados.
• El extracto etanólico obtenido de Passiflora manicata puede constituirse en
una fuente de principios activos que contribuyan al descubrimiento de
antimicrobianos de origen natural los cuales pueden ser utilizados como linea
base para la sintesis de moléculas útiles a nível farmacéutico.
• El estudio realizado permitió conocer algunas de las potencialidades de uso de
las especies Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes
rhopaloides y Valeriana pilosa
presentes en los ecositemas del Distrito
Capital y la región contribuyendo al aumento del conocimiento de las mismas.
cxvii
8.RECOMENDACIONES
•
Se recomienda identificar, separar y elucidar la molécula presente en la fase
acuosa del extracto crudo de Passiflora manicata responsable de la actividad
antimicrobiana reportada en el presente trabajo, con el fin de generar
alternativas para la obtención de nuevos antimicrobianos de amplio espectro a
partir de una fuente de origen natural .
•
Se recomienda realizar estudios in vivo con el fin de determinar la
concentración inhibitoria mínima de la fase acuosa con el objetivo de utilizar
el extracto obtenido en la formulación de nuevos productos con potencial
biocida.
•
Se recomienda realizar estudios in vivo con el fin de determinar la estabilidad
del extracto obtenido frente a agentes físicos y químicos que puedan interferir
en la actividad antimicrobiana descrita en el presente trabajo.
cxviii
9.BIBLIOGRAFIA
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Chromatographie
von
Solanm
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cxxiii
Seroidalkaloiden
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cxxiv
ANEXO 1
PREPARACIÓN AGAR MUELLER HINTON
Composición
g/L
Infusión de carne
2
Hidrolizado de caseína
17.5
Almidón
Agar – Agar
1.5
13
Preparación
Disolver 34 g/L, esterilizar con cuidado en autoclave (10 min a 115ºC). Enfriar
eventualmente a 45 – 50 ºC para incorporar del 5 al 10% de sangre desfibrinada.
Verter placas. pH: 7.4 ± 0.2. Las placas con medio de cultivo sin la sangre son claras
y de color parduzco opalecescent.
cxxv
ANEXO 2
PREPARACIÓN AGAR CHROMOCULT
Composición
g/L
Peptona
3
Cloruro sódico
5
Dihidrógenofosfato potásico
1.7
Hidrógenofosfato dipotásico
3
Piruvato sódico
1
Triptófano
1
Lauril sulfato sódico
0.1
Mezcla de cromógenos
0.2
Agar – Agar
12
Preparación
Disolver 27 g/L en agua desmineralizada por calentamiento en el baño de agua
hirviendo o en vapor fluente, enfriar a 45 – 50 ºC y verter en placas. pH 6.8 ± 0.1 a
25 ºC.
El empleo se rige según los correspondientes métodos de investigación para agua y
alimentos. Incubación: 24 horas, eventualmente hasta 48 horas a 35 – 37 ºC.
cxxvi
ANEXO 3
PREPARACIÓN AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)
Composición
g/L
Infusión de patata (preparada a partir de 200 g de patata)
4
Glucosa
20
Agar – Agar
15
Preparación
Disolver 39 g/L y esterilizar en autoclave (15 min, a 121ºC). pH: 5,6 ± 0,1.
Para ajustar el pH a aprox. 3,5, incorporar al medio de cultivo, a 45 – 50ºC, una
solución estéril de ácido tartárico al 10%, a razón de 14 mL/L.
Las placas con medio de cultivo son claras e incoloras.
Este medio de cultivo se siembra, por estría, en superficie, o mediante el
procedimiento de incorporación. Incubación: hasta 5 días a temperatura ambiente.
Levar a cabo la investigación de acuerdo con los correspondientes fines de empleo.
ANEXO 4
cxxvii
PREPARACIÓN AGAR BAIRD PARKER
Composición
g/L
Peptona de caseína
10
Extracto de carne
5
Extracto de levadura
1
Piruvato sódico
10
Glicina
12
Cloruro de Litio
5
Agar – Agar
15
Preparación
Disolver 58 g en 0.95 L, esterilizar en autoclave (15 min, a 121ºC), enfriar a 45 – 50
ºC, añadir mezclando 50 mL de emulsión de yema de huevo telurito y,
eventualmente, 50 mg/L de Sulfametacina. Verter en placas. pH: 6,8 ± 0,2.
En tanto que el medio de cultivo basal puede guardarse de 1 a 2 meses a 4ºC, el
medio de cultivo completo, vertido en placas, ha de ser utilizado dentro de las 24
horas siguientes a su preparación.
Diluir convenientemente el material a investigar y extenderlo finamente sobre la
superficie del medio de cultivo. Incubación: desde 24 hasta 48 horas a 37ºC.
ANEXO 5
cxxviii
PREPARACIÓN DE AGAR BPLS (Verde brillante, Rojo de fenol, Lactosa y
Sacarosa)
Composición
g/L
Peptona de
5
Peptona de caseína
5
Extracto de carne
5
Cloruro sódico
3
Hidrogenofosfato disódico
2
Lactosa
10
Sacarosa
10
Rojo de Fenol
0,08
Verde Brillante
0,0125
Agar – Agar
12
Preparación
Disolver 52 g/L, esterilizar en autoclave (15 min, a 37ºC) y verter en placas. Ph: 6,9 ±
0,1.
Las placas con medio de cultivo son claras con un color ligeramente rojizo.
Sembrar directamente con el material objeto de investigación, o a partir de un cultivo
de enriquecimiento. Deben utilizarse en paralelo medios de cultivo menos
inhibidores. Incubación: 18 a 24 horas a 37ºC.
cxxix
cxxx
cxxxi