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Transcript

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA Y CONTROL DE MEDICAMENTOS
“EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA DE LOS EXTRACTOS
HIDROALCOHÓLICOS OBTENIDOS A PARTIR DE LA HOJA, TALLO Y RAÍZ DE
PETIVERIA ALLIACEA L. SOBRE STAPHYLOCOCCUS AUREUS, STAPHYLOCOCCUS
EPIDERMIDIS, PSEUDOMONAS AERUGINOSA Y CANDIDA ALBICANS”
Tesis de Investigación Científica para optar por el título de Magíster en Tecnología y Control de
Medicamentos.
Autor:
Paulo César Tello Navarrete
Email:
[email protected]
Tutor:
BQF. Dayana Paulina Borja Espín M. Sc.
Quito, Junio de 2015
Tello Navarrete, Paulo César (2015). Evaluación de la
Concentración
Mínima
Inhibitoria
de
los
extractos
hidroalcohólicos obtenidos a partir de la hoja, tallo y raíz de
Petiveria alliacea L. sobre Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans .Trabajo
de investigación para optar por el grado de Magister en Tecnología y
Control de Medicamentos. Instituto de Investigación y Posgrado.
Facultad de Ciencias Químicas. Quito: UCE. 118 p.
ii
DEDICATORIA
A mi madre Martha Cecilia Navarrete Olmos y mi abuelita Ángela Olmos por su apoyo constante y
desinteresado, ejemplo a seguir para el resto de mi vida.
A mi Tía Alba Navarrete Olmos, mi padre y hermanos.
A todas las personas quienes con su colaboración me apoyaron a culminar esta investigación.
iii
AGRADECIMIENTO
A todos quienes contribuyeron a la elaboración de esta investigación:
A la BQF. Dayana Paulina Borja Espín M. Sc. por su guía en su calidad de tutora.
A los egresados de la Facultad de Ciencias Químicas por su participación en algunas de las fases
experimentales.
A la Universidad Central del Ecuador, a la Facultad de Ciencias Químicas y al Instituto de
Investigación y Posgrado, por la organización, apoyo y seguimiento de la Maestría.
iv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
INSTITUTO DE INVESTIGACION Y POSGRADO
MAESTRIA EN TECNOLOGIA Y CONTROL DE MEDICAMENTOS
AUTORIZACIÓN DEL AUTOR
Yo, Paulo César Tello Navarrete, en calidad de autor del trabajo de investigación realizada sobre
“Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de los extractos hidroalcohólicos obtenidos a
partir de la hoja, tallo y raíz de Petiveria alliacea L. sobre Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans” por la presente autorizo a la
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o
de parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán
vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes
de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
En la ciudad de Quito a los, 22 días del mes de Junio de 2015
C.C. 1713702403
v
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
INSTITUTO DE INVESTIGACION Y POSGRADO
MAESTRIA EN TECNOLOGIA Y CONTROL DE MEDICAMENTOS
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Por la presente, dejo constancia que he leído el trabajo de Tesis de Investigación Científica de Maestría
presentado por el señor Paulo César Tello Navarrete para optar por el título de Máster en Tecnología y
Control de Medicamentos cuyo título es “Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de
los extractos hidroalcohólicos obtenidos a partir de la hoja, tallo y raíz de Petiveria alliacea L.
sobre Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomona aeruginosa y Candida
albicans”, el mismo que reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a evaluación por
el Tribunal Examinador.
En la ciudad de Quito a los, 22 días del mes de Junio de 2015
----------------------------------------------BQF. Dayana Paulina Borja Espín M. Sc.
C.C 1710993849
vi
CONTENIDO
DEDICATORIA ........................................................................................................................ iii
CONTENIDO ........................................................................................................................... vii
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. xiv
LISTADE TABLAS .............................................................................................................. xviii
RESUMEN .............................................................................................................................. xix
SUMMARY ............................................................................................................................. xx
CAPITULO I .............................................................................................................................. 1
1.1.
DESCRIPCIÓN DEL TEMA DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA ......................... 1
1.1.1.
1.2.
INTRODUCCION ........................................................................................................... 1
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA.......................................................................... 3
1.2.1.
CONTEXTUALIZACIÓN. .............................................................................................. 3
1.2.2.
ANÁLISIS CRÍTICO ....................................................................................................... 3
1.2.3.
PROGNOSIS .................................................................................................................... 4
1.2.4.
FORMULACIÓN............................................................................................................. 4
1.2.5.
DELIMITACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN. ............................................................... 5
1.2.6.
DELIMITACIÓN DE CONTENIDO .............................................................................. 5
1.2.6.1.
Delimitación Espacial .................................................................................... 5
1.2.6.2.
Delimitación Temporal .................................................................................. 5
1.3.
HIPÓTESIS .................................................................................................................. 5
1.4.
OBJETIVOS ................................................................................................................. 6
1.4.1.
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................... 6
1.4.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 6
CAPITULO II ............................................................................................................................. 7
MARCO TEORICO ................................................................................................................... 7
2.1.
ANTECEDENTES ....................................................................................................... 7
2.2.
FUNDAMENTACIÓN LEGAL................................................................................... 8
2.3.
CARACTERÍZACIÓN BOTÁNICA DE “Petiveria alliacea L.” .............................. 9
2.3.1
DESCRIPCIÓN .............................................................................................................. 10
2.3.2
DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA ................................................................................. 11
2.3.3
PARTE UTILIZADA ..................................................................................................... 11
2.3.4
COMPONENTES QUÍMICOS AISLADOS ................................................................. 11
vii
2.3.5
2.4.
USOS Y PROPIEDADES .............................................................................................. 12
MARCHA FITOQUÍMICA, PERFIL CROMATOGRÁFICO .................................. 12
2.4.1.
MARCHA FITOQUÍMICA ........................................................................................... 12
2.4.1.1
Triterpenos y esteroides ............................................................................... 12
2.4.1.2
Flavonoides y antocianidinas ....................................................................... 13
2.4.1.3
Lactonas y cumarinas ................................................................................... 14
2.4.1.4
Saponinas ..................................................................................................... 14
2.4.1.5
Taninos ......................................................................................................... 14
2.4.1.6
Aminoácidos................................................................................................. 15
2.4.1.6.1. Efectos de los aminoácidos en las plantas ........................................................... 16
2.4.1.6.2. Aminoácidos Azufrados ...................................................................................... 16
2.4.1.6.2.1. Cisteína ......................................................................................................... 16
2.4.1.6.2.2. Metionina ..................................................................................................... 16
2.4.2.
PERFIL CROMATOGRÁFICO .................................................................................... 17
2.4.2.1
Fundamento de la cromatografía de capa fina ............................................. 17
2.4.2.2
Adsorbente ................................................................................................... 17
2.4.2.2.1. Sílica .................................................................................................................... 17
2.4.2.3
Identificación por cromatografía en capa fina.............................................. 17
2.5. ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA:
CONCENTRACIÓN
MÍNIMA
INHIBITORIA. ..................................................................................................................... 18
2.6.
MICROORGANISMOS UTILIZADOS .................................................................... 19
2.6.1.
BACTERIAS .................................................................................................................. 19
2.6.1.1.
Staphylococcus aureus: ............................................................................... 19
2.6.1.2.
Staphylococcus epidermidis ......................................................................... 20
2.6.1.3.
Pseudomonas aeruginosa o Pseudomonas pyocyanea ................................. 20
2.6.2.
LEVADURA: ................................................................................................................. 22
2.6.2.1.
2.7.
Candida albicans .......................................................................................... 22
ESTADISTICA NO PARAMETRICA ...................................................................... 22
2.7.1.
Prueba de Kruskal-Wallis............................................................................................... 23
2.7.2.
Prueba de rangos con signos de Wilcoxon ..................................................................... 23
2.7.3.
Prueba de U Mann-Whitney ........................................................................................... 23
2.7.4.
Pruebas de normalidad ................................................................................................... 24
2.7.4.1.
Prueba de contraste de Kolmogorov-Smirnov ............................................. 24
2.7.4.2.
Prueba de contraste de Shapiro y Wilk ........................................................ 24
viii
CAPÍTULO III ......................................................................................................................... 25
METODOLOGÍA..................................................................................................................... 25
3.1.
ENFOQUE DE LA INVESTIGACIÓN ..................................................................... 25
3.2.
MODALIDAD DE LA INVESTIGACIÓN ............................................................... 25
3.3.
NIVELES DE INVESTIGACIÓN ............................................................................. 25
3.4.
IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES ...................................................................... 25
3.5.
DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ......................................................................... 26
3.5.1.
Caracterización botánica de la especie en estudio .......................................................... 26
3.5.2.
Obtención de extractos hidroalcohólicos hojas, tallo y raíz ........................................... 26
3.5.3.
Análisis Fitoquímico de los extractos ............................................................................ 26
3.5.4.
Concentración mínima inhibitoria por el método de Difusión en agar (Adaptación
método del método Kirby-Bauer)................................................................................................... 27
3.6.
POBLACIÓN Y MUESTRA...................................................................................... 27
3.6.1.
Población ........................................................................................................................ 27
3.6.2.
Muestra ........................................................................................................................... 28
3.7.
OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES DE LA HIPÓTESIS. ............... 28
3.8.
MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 28
3.8.1.
Recolección .................................................................................................................... 28
3.8.2.
Caracterización botánica de la especie. .......................................................................... 29
3.8.3.
Obtención de extractos hidroalcohólicos ....................................................................... 29
3.8.4.
Medición de las características físicas de los extractos .................................................. 30
3.8.4.1.
Determinación del pH .................................................................................. 30
3.8.4.2.
Determinación del peso específico. .............................................................. 31
3.8.4.3.
Determinación del índice de refracción ....................................................... 31
3.8.5.
Tamizaje fitoquímico ..................................................................................................... 32
3.8.5.1.
Extracto Etéreo ............................................................................................. 33
3.8.5.1.1. Ensayo de Dragendorff........................................................................................ 34
3.8.5.1.2. Ensayo de Mayer ................................................................................................. 34
3.8.5.1.3. Ensayo de Wagner ............................................................................................... 34
3.8.5.1.4. Ensayo de Baljet .................................................................................................. 35
3.8.5.1.5. Ensayo de Liebermann-Burchard ........................................................................ 35
3.8.5.2.
Extracto Etanólico ........................................................................................ 35
3.8.5.2.1. Ensayo de Dragendorff........................................................................................ 35
3.8.5.2.2. Ensayo de Mayer ................................................................................................. 36
ix
3.8.5.2.3. Ensayo de Wagner ............................................................................................... 36
3.8.5.2.4. Ensayo de Catequinas.......................................................................................... 36
3.8.5.2.5. Ensayo de resinas ................................................................................................ 36
3.8.5.2.6. Ensayo de Fehling ............................................................................................... 36
3.8.5.2.7. Ensayo de Baljet .................................................................................................. 37
3.8.5.2.8. Ensayo de Liebermann-Burchard ........................................................................ 37
3.8.5.2.9. Ensayo de la espuma ........................................................................................... 37
3.8.5.2.10. Ensayo del cloruro férrico ................................................................................. 37
3.8.5.2.11. Ensayo de la ninhidrina ..................................................................................... 37
3.8.5.2.12. Ensayo de Borntrager ........................................................................................ 37
3.8.5.2.13. Ensayo de Shinoda ............................................................................................ 38
3.8.5.2.14. Ensayo de Kedde ............................................................................................... 38
3.8.5.2.15. Ensayo de antocianidinas .................................................................................. 38
3.8.5.3.
Extracto Acuoso ........................................................................................... 38
3.8.5.3.1. Ensayo de Dragendorff........................................................................................ 39
3.8.5.3.2. Ensayo de Mayer ................................................................................................. 39
3.8.5.3.3. Ensayo de Wagner ............................................................................................... 39
3.8.5.3.4. Ensayo de Shinoda .............................................................................................. 39
3.8.5.3.5. Ensayo del cloruro férrico ................................................................................... 39
3.8.5.3.6. Ensayo de la espuma ........................................................................................... 39
3.8.5.3.7. Ensayo de Fehling ............................................................................................... 40
3.8.5.3.8. Ensayo de mucílagos ........................................................................................... 40
3.8.6.
Ensayos Complementarios ............................................................................................. 40
3.8.6.1.
Glicósidos cianogenéticos ............................................................................ 40
3.8.6.2.
Aceites, hidrocarburos y carotenos .............................................................. 40
3.8.6.3.
Ensayo de aceite fijo, secante o esencial ...................................................... 40
3.8.6.4.
Ensayo de hidrocarburos .............................................................................. 40
3.8.7.
Perfil cromatográfico...................................................................................................... 41
3.8.7.1.
Alcaloides ..................................................................................................... 42
3.8.7.2.
Aminoácidos................................................................................................. 42
3.8.7.3.
Esteroles ....................................................................................................... 43
3.8.7.4.
Flavonoides .................................................................................................. 43
3.8.7.5.
Naftoquinonas .............................................................................................. 44
x
3.8.7.6.
Antraquinonas .............................................................................................. 44
3.8.7.7.
Saponinas ..................................................................................................... 45
3.8.7.8.
Cardiotónicos ............................................................................................... 45
3.8.8.
Concentración mínima inhibitoria .................................................................................. 45
3.8.8.1.
Preparación de medios de cultivo................................................................. 47
3.8.8.2.
Prueba de determinación de actividad antimicrobiana en extractos fluidos 47
3.8.8.3.
Preparación del inóculo ................................................................................ 48
3.8.8.4. Procedimiento de identificación de la actividad antimicrobiana de los
extractos fluidos............................................................................................................. 48
3.9.
3.8.8.5.
Procedimiento para la preparación del antimicrobiano fluconazol .............. 48
3.8.8.6.
Procedimiento de CMI por Difusión en Agar .............................................. 48
DISEÑO EXPERIMENTAL ...................................................................................... 49
3.9.1.
Comparación de extractos (70:30) ................................................................................. 49
3.9.1.1.
3.9.2.
Comparación de extractos (50:50) ................................................................................. 49
3.9.2.1.
3.9.3.
Pruebas no paramétricas: Prueba de Kruskal-Wallis (70:30)....................... 49
Pruebas no paramétricas: Prueba de Kruskal-Wallis 50:50 ......................... 49
Comparación de órganos vegetativos (70:30) y (50:50) ................................................ 50
3.9.3.1.
Pruebas no paramétricas: Prueba de Prueba de Mann-Whitney: Raíz ......... 50
3.9.3.2.
Pruebas no paramétricas: Prueba de Prueba de Mann-Whitney: Tallo ........ 50
3.9.3.3.
Pruebas no paramétricas: Prueba de Prueba de Mann-Whitney: Hojas ....... 50
3.9.4.
Evaluación de CMI en extractos (70:30) para raíz, hojay tallo ...................................... 50
3.9.4.1.
3.9.5.
Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................... 50
Evaluación de CMI en extractos (50:50) para raíz, hoja y tallo .................................... 50
3.9.5.1.
Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................... 50
CAPITULO IV ......................................................................................................................... 52
RESULTADOS ........................................................................................................................ 52
4.1.
RESULTADOS TAMIZAJE FITOQUÍMICO DE Petiveria alliacea L. ................. 52
4.1.1.
Hojas .............................................................................................................................. 52
4.1.1.1.
Extracto etéreo de hojas ............................................................................... 52
4.1.1.2.
Extracto alcohólico de hojas ........................................................................ 52
4.1.1.3.
Extracto acuoso de hojas. ............................................................................. 55
4.1.1.4.
Ensayos complementarios de hojas. ............................................................. 56
4.1.2.
Tallo ............................................................................................................................... 57
4.1.2.1.
Extracto alcohólico de tallo .......................................................................... 57
xi
4.1.2.2.
Extracto acuoso de tallo. .............................................................................. 59
4.1.2.3.
Ensayos complementarios de tallo. .............................................................. 60
4.1.3.
Raíz ................................................................................................................................ 60
4.1.3.1.
Extracto alcohólico de raíz. .......................................................................... 60
4.1.3.2.
Extracto acuoso de raíz. ............................................................................... 62
4.1.3.3.
Ensayos complementarios de raíz. ............................................................... 63
4.2.
PRUEBAS FÍSICAS................................................................................................... 64
4.3.
PERFIL CROMATOGRÁFICO ................................................................................. 64
4.3.1.
Ensayos para alcaloides .................................................................................................. 65
4.3.2.
Ensayo para aminoácidos ............................................................................................... 68
4.3.3.
Ensayo para esteroles. .................................................................................................... 71
4.3.4.
Ensayos para Flavonoides. ............................................................................................. 73
4.3.5.
Ensayos para Naftoquinonas .......................................................................................... 77
4.3.6.
Ensayo para Antraquinonas. ........................................................................................... 80
4.3.7.
Ensayo para Cardiotónicos ............................................................................................. 81
4.4.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA .......................................................................... 84
4.5.
CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA ........................................................ 88
4.5.1.
Resultados de evaluación estadística de CMI. ............................................................... 94
4.5.1.1.
Verificación de la Normalidad de los datos ................................................. 94
4.5.1.2.
Análisis de Normalidad ................................................................................ 94
4.5.1.3.
Evaluación de Concentración mínima inhibitoria en Extractos (70:30). ..... 95
4.5.1.3.1. Raíz...................................................................................................................... 95
4.5.1.3.1.1. Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................... 96
4.5.1.3.2. Hojas.................................................................................................................... 97
4.5.1.3.2.1. Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................... 97
4.5.1.3.3. Tallos ................................................................................................................... 98
4.5.1.3.3.1. Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................... 98
4.5.1.4.
Evaluación de CMI en extractos (50:50)...................................................... 99
4.5.1.4.1. Raíz.................................................................................................................... 100
4.5.1.4.1.1. Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................. 100
4.5.1.4.2. Hojas.................................................................................................................. 101
4.5.1.4.2.1. Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................. 101
4.5.1.4.3. Tallo .................................................................................................................. 102
4.5.1.4.3.1. Prueba de Wilcoxon con cambios de signos. ............................................. 103
xii
4.5.1.5.
Comparación de Extractos (70:30) ............................................................. 104
4.5.1.5.1. Prueba de Kruskal-Wallis (70:30). .................................................................... 104
4.5.1.6.
Comparación de Extractos (50:50) ............................................................. 105
4.5.1.6.1. Prueba de Kruskal-Wallis 50:50........................................................................ 105
4.5.1.7.
Comparación de órganos vegetativos (70:30) y (50:50). ........................... 105
4.5.1.7.1. Prueba de Mann-Whitney: Raíz ........................................................................ 105
4.5.1.7.2. Prueba de Mann-Whitney: Tallo ....................................................................... 106
4.5.1.7.3. Prueba de Mann-Whitney: Hojas ...................................................................... 107
CAPITULO V ........................................................................................................................ 109
CONCLUSIONES Y DISCUSIONES ................................................................................... 109
CAPITULO VI ....................................................................................................................... 114
RECOMENDACIONES ........................................................................................................ 114
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 115
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Planta Petiveria alliacea L. ...................................................................................... 10
Figura2: Hojas de Petiveria alliacea L. .................................................................................. 10
Figura 3: Raíz de Petiveria alliacea L. ................................................................................... 10
Figura 4:S. aureus, micrografía electrónica de barrido, color artificial. .................................. 19
Figura 5: Imagen de escaneado electrónico de S. epidermidis. ................................................ 20
Figura 6: P. aeruginosa en XLD agar ...................................................................................... 21
Figura 7: Candida albicans ...................................................................................................... 22
Figura 8: Ensayo Liebermann- Burchard positivo para Triterpenos-Esteroides en extracto
etéreo de hojas. .......................................................................................................................... 52
Figura 9: Ensayo de catequinas positivo hojas extracto alcohólico. ........................................ 53
Figura 10: Ensayo de Baljet positivo para Lactonas en extracto alcohólico de hojas ............. 53
Figura 11: Ensayo de Liebermann- Burchard positivo para Triterpenos-Esteroides en extracto
alcohólico de hojas. ................................................................................................................... 53
Figura 12: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto alcohólico de hojas. ........ 54
Figura 13: Ensayo de cloruro férrico positivo para Fenoles y Taninos en extracto alcohólico
de hojas. ..................................................................................................................................... 54
Figura 14: Ensayo de ninhidrina positivo para Aminoacidos en extracto alcohólico de hojas.
................................................................................................................................................... 54
Figura 15: Ensayo de shinoda positivo para Flavonoides en extracto alcohólico de hojas. .... 54
Figura 16: Ensayo de antocianidina positivo en extracto alcohólico de hojas. ........................ 54
Figura 17: Ensayo de Dragendorff positivo para Alcaloides en extracto alcohólico de hojas. 55
Figura 18: Ensayo de Wagner positivo para Alcaloides en extracto alcohólico de hojas. ....... 55
Figura 19: Ensayo de Fehling positivo para Azucares Reductores en extracto acuoso hojas. 56
Figura 20: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto acuoso hojas. ................. 56
Figura 21: Ensayo de Mayer positivo para Alcaloides en extracto acuoso hojas. ................... 56
Figura 22: Ensayo de Wagner positivo para Alcaloides en extracto acuoso hojas. ................. 56
Figura 23: Ensayo de Resinas positivo en extracto alcohólico de tallo. ................................. 57
Figura 24: Ensayo de Baljet positivo para Lactonas en extracto alcohólico de tallo. ............. 58
Figura 25: Ensayo de Liebermann- Burchard positivo para Triterpenos y Esteroides en
extracto alcohólico de tallo. ....................................................................................................... 58
Figura 26: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto alcohólico de tallo. ......... 58
Figura 27: Ensayo de cloruro férrico positivo para Fenoles y Taninos en extracto alcohólico
de tallo. ...................................................................................................................................... 58
Figura 28: Ensayo de ninhidrina positivo para Aminoácidos en extracto alcohólico de tallo.
................................................................................................................................................... 58
Figura 29: Ensayo de antocianidina positivo en extracto alcohólico de tallo. ......................... 59
Figura 30: Ensayo de Dragendorff positivo para Alcaloides en extracto alcohólico de tallo. 59
Figura 31: Ensayo de Fehling positivo para Azucares Reductores en extracto acuoso de tallo.
................................................................................................................................................... 60
Figura 32: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto acuoso de tallo. ............... 60
Figura 33: Ensayo de resinas positivo en extracto alcohólico de raíz...................................... 61
Figura 34: Ensayo de Liebermann- Burchard positivo para Triterpenos y Esteroides en
extracto alcohólico de raíz. ........................................................................................................ 61
Figura 35: Ensayo de cloruro férrico positivo para Fenoles y Taninos en extracto alcohólico
de raíz. ....................................................................................................................................... 61
xiv
Figura 36: Ensayo de ninhidrina positivo para Aminoácidos en extracto alcohólico de raíz. 62
Figura 37: Ensayo de antocianidina positivo en extracto alcohólico de raíz. .......................... 62
Figura 38: Ensayo de Dragendorff positivo para Alcaloides en extracto alcohólico de raíz. .. 62
Figura 39: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto acuoso de raíz. ................ 63
Figura 40: Ensayo de Dragendorff positivo para Alcaloides en extracto acuoso de raíz. ...... 63
Figura 41: Ensayo de Wagner positivo para Alcaloides en extracto acuoso de raíz. .............. 63
Figura 42:Extractos secos: Orden de siembra .......................................................................... 64
Figura 43: Extractos frescos: Orden de siembra ...................................................................... 65
Figura 44: Ensayo de alcaloides fase móvil 1, placas cromatográficas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 66
Figura 45: Ensayo de alcaloides fase móvil 1, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca ....................................... 66
Figura 46: Ensayo de alcaloides fase móvil 2, placas cromatográficas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 67
Figura 47: Ensayo de alcaloides fase móvil 2, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 67
Figura 48: Ensayo de alcaloides fase móvil 3, placas cromatográficas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 67
Figura 49: Ensayo de alcaloides fase móvil 3, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 68
Figura 50: Ensayo de aminoácidos fase móvil 1, placas cromatográfícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 69
Figura 51: Ensayo de aminoácidos fase móvil1, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 69
Figura 52: Ensayo de aminoácidos fase móvil 2, placas cromatografícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 70
Figura 53: Ensayo de aminoácidos fase móvil2, placas cromatografícas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 71
Figura 54: Ensayo de esteroles con una sola fase móvil, placas cromatografías sin revelador
para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. .............................. 72
Figura 55: Ensayo de esteroles con una sola fase móvil, placas cromatografícas con revelador
a longitud de onda 365 nm para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de
planta seca.................................................................................................................................. 72
Figura 56: Ensayo de flavonoides con fase móvil 1, placas cromatografícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 73
Figura 57: Ensayo de flavonoides con fase móvil 1, placas cromatografícas con revelador a
longitud de onda de 365 nm para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de
planta seca.................................................................................................................................. 74
Figura 58: Ensayo de flavonoides con fase móvil 2, placas cromatografícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 75
Figura 59: Ensayo de flavonoides con fase móvil 2, placas cromatografícas con revelador a
longitud de onda de 365 nm para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de
planta seca.................................................................................................................................. 75
Figura 60: Ensayo de flavonoides con fase móvil 3, placas cromatografícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 76
xv
Figura 61: Ensayo de flavonoides con fase móvil 3, placas cromatografícas con revelador a
longitud de onda de 365 nm para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de
planta seca.................................................................................................................................. 77
Figura 62: Ensayo de naftoquinonas con fase móvil 1, placas cromatografías sin revelador
para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca ............................... 78
Figura 63: Ensayo de naftoquinonas fase móvil1, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 78
Figura 64: Ensayo de naftoquinonas con fase móvil 2, placas cromatografías sin revelador
para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. .............................. 79
Figura 65: Ensayo de naftoquinonas fase móvil 2, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ...................................... 79
Figura 66: Ensayo de antraquinonas, placas cromatográficas sin revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ..................................................... 80
Figura 67: Ensayo de antraquinonas, placas cromatográficas con revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ..................................................... 81
Figura 68: Ensayo para cardiotónicos, placas cromatográficas sin revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ..................................................... 82
Figura 69: Ensayo para cardiotónicos, placas cromatográficas con revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. ..................................................... 82
Figura 70: Ensayo para cardiotónicos con fase móvil 2, placas cromatográficas sin revelador
para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. .............................. 83
Figura 71: Ensayo para cardiotónicos con fase móvil 2, placas cromatográficas con revelador
para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca. .............................. 83
Figura 72: Ensayo de actividad antibacteriana para Pseudomonas aeruginosa en los seis
extractos fluidos......................................................................................................................... 84
Figura 73: Ensayo de actividad antibacteriana para
Staphylococcus aureus en los seis
extractos fluidos......................................................................................................................... 85
Figura 74: Ensayo de actividad antibacteriana para Staphylococcus epidermidis en los seis
extractos fluidos......................................................................................................................... 85
Figura 75: Ensayo de actividad antimicótica para Candida albicans en hojas para extractos
fluidos obtenidos a partir de etanol: agua (70:30) y etanol: agua (50:50). ................................ 86
Figura 76: Ensayo de actividad antimicótica para Candida albicans en tallos para extractos
fluidos obtenidos a partir de etanol: agua (70:30) y etanol: agua (50:50). ................................ 87
Figura 77: Ensayo de actividad antimicótica para Candida albicans en raíz para extractos
fluidos obtenidos a partir de etanol: agua (70:30) y etanol: agua (50:50). ................................ 87
Figura 78: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de raíz obtenido a
partir de etanol: agua (70:30) para las concentraciones uno, dos y tres. ................................... 88
Figura 79: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de tallos obtenido a
partir de etanol: agua (70:30) para la concentración uno. ......................................................... 89
Figura 80: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de hojas obtenido a
partir de etanol: agua (70:30) para las concentraciones uno, dos, tres y cuatro. ....................... 90
Figura 81: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de raíz obtenido a
partir de etanol: agua (50:50) para las concentraciones uno, dos. ............................................. 91
Figura 82: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de tallos obtenido a
partir de etanol: agua (50:50) para las concentraciones uno, dos. ............................................. 92
Figura 83: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de hojas obtenido a
partir de etanol: agua (50:50) para las concentraciones tres y cuatro. ....................................... 93
xvi
Figura 84: Halos de inhibición para Candida albicans
con fluconazol para las
concentraciones uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis y siete. ........................................................ 94
Figura85: Prueba de Wilcoxon para raíz (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows. ............. 96
Figura 86: Concentración versus diámetro para raíz (70:30) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................... 96
Figura 87: Prueba de Wilcoxon para hojas (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows. ......... 97
Figura88: Concentración versus diámetro para hojas (70:30) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................... 98
Figura 89: Prueba de Wilcoxon para tallos (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows. ......... 98
Figura 90: Concentración versus diámetro para tallos (70:30) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................... 99
Figura 91: Prueba de Wilcoxon para raíz (50:50) sistema SPSS 19.0 para Windows. .......... 100
Figura 92: Concentración versus diámetro para raíz (50:50) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................. 101
Figura 93: Prueba de Wilcoxon para hojas (50:50) sistemaSPSS 19.0 para Windows. ........ 101
Figura 94: Concentración versus diámetro para raíz (50:50) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................. 102
Figura 95: Prueba de Wilcoxon para tallos (50:50) sistema SPSS 19.0 para Windows. ....... 103
Figura 96: Concentración versus diámetro para tallos (50:50) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................. 103
Figura 97: Prueba de Kruskal-Wallis para extractos (70:30) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................. 104
Figura 98: Prueba de Kruskal-Wallis para extractos (50:50) sistema SPSS 19.0 para
Windows. ................................................................................................................................. 105
Figura 99: Prueba de Mann-Whitney para extractos de raíz (50:50) y (70:30) sistema SPSS
19.0 para Windows. ................................................................................................................. 106
Figura 100: Prueba de Mann-Whitney para extractos de tallo (50:50) y (70:30) sistema SPSS
19.0 para Windows. ................................................................................................................. 107
Figura 101: Prueba de Mann-Whitney para extractos de hojas (50:50) y (70:30) sistema
SPSS 19.0 para Windows. ....................................................................................................... 108
xvii
LISTA DE TABLAS
Tabla 1: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto etéreo de hojas ..................................... 52
Tabla 2: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto alcohólico de hojas. ............................. 52
Tabla 3: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto acuoso de hojas. .................................. 55
Tabla 4: Resultados de tamizaje fitoquímico ensayos complementarios en hojas. .................. 56
Tabla 5: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto alcohólico de tallo. .............................. 57
Tabla 6: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto acuoso de tallo. .................................... 59
Tabla 7: Resultados de tamizaje fitoquímico ensayos complementarios de tallo. ................... 60
Tabla 8: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto alcohólico de raíz. ............................... 60
Tabla 9: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto acuoso de raíz. ..................................... 62
Tabla 10: Resultados de tamizaje fitoquímico ensayos complementarios de raíz.................... 63
Tabla 11: Resultados de pruebas físicas de extractos fluidos. .................................................. 64
Tabla 12: Resultados de ensayos para aminoácidos con fase móvil 1. .................................... 68
Tabla 13: Resultados de ensayos para aminoácidos con fase móvil 2. .................................... 70
Tabla 14: Resultados de ensayos para esteroles. ...................................................................... 71
Tabla 15: Resultados de ensayos para flavonoides fase móvil 1. ............................................. 73
Tabla 16: Resultados de ensayos para flavonoides fase móvil 2. ............................................. 74
Tabla 17: Resultados de ensayos para flavonoides fase móvil 3. ............................................. 76
Tabla 18: Resultados de ensayos para naftoquinonas fase móvil 1. ......................................... 77
Tabla 19: Resultados de ensayos para naftoquinonas fase móvil 2. ......................................... 79
Tabla 20: Resultados de ensayos para antraquinonas. .............................................................. 80
Tabla 21: Resultados de ensayos para cardiotónicos fase móvil 1. .......................................... 81
Tabla 22: Resultados de ensayos para cardiotónicos fase móvil 2. .......................................... 83
Tabla 23: Codificación de bacterias. ........................................................................................ 84
Tabla 24: Resultados de ensayo de actividad antibacteriana en función de la presencia de halo
de inhibición en extractos fluidos. ............................................................................................. 84
Tabla 25: Codificación levadura. .............................................................................................. 86
Tabla 26: Resultados de ensayo de actividad antimicótica para Candida albicans en función
de la presencia de halo de inhibición. ........................................................................................ 86
Tabla 27: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto
fluido de raíces obtenido a partir de etanol: agua (70:30). ........................................................ 88
Tabla 28: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto
fluido de tallos obtenido a partir de etanol: agua (70:30). ......................................................... 89
Tabla 29: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto
fluido de hojas obtenido a partir de etanol: agua (70:30). ......................................................... 89
Tabla 30: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto
fluido de raíces obtenido a partir de etanol: agua (50:50). ........................................................ 90
Tabla 31: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto
fluido de tallos obtenido a partir de etanol: agua (50:50). ......................................................... 91
Tabla 32: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto
fluido de hojas obtenido a partir de etanol: agua (50:50). ......................................................... 92
Tabla 33: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans con
fluconazol. ................................................................................................................................. 93
Tabla 34: Pruebas de normalidad ............................................................................................. 94
Tabla 35: Resultados del extracto (70:30) ................................................................................ 95
Tabla 36: Resultados del extracto (50:50) ................................................................................ 99
xviii
“Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de los extractos hidroalcohólicos obtenidos
a partir de la hoja, tallo y raíz de Petiveria alliacea L. sobre Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans”
Autor: Paulo César Tello Navarrete
Tutor: Dayana Paulina Borja Espín
RESUMEN
El presente estudio comprende la evaluación de la concentración mínima inhibitoria de los extractos
hidroalcoholicos etanol: agua (50:50) y (70:30) de las hojas, raíz y tallo de Petiveria alliacea L., se
procedió a la obtención de los mismos por el método de maceración y concentración en rotavapor.
A los extractos obtenidos se realizó un tamizaje fitoquímico para determinar en forma cualitativa los
principales metabolitos secundarios presentes en cada uno de ellos.
Mediante el perfil cromatográfico se determinó la presencia de aminoácidos en hojas, raíz y tallo
presentando manchas para todos los extractos utilizando la fase móvil Butanol: Ácido acético: Agua
(4:1:1). Las manchas que presentan mayor intensidad corresponden a los extractos de raíces frescas
etanol: agua (50:50) y raíces frescas etanol: agua (70:30).
Para la evaluación de la actividad antimicrobiana se utilizó una adaptación del método Kirby-Bauer,
los seis extractos preparados presentaron actividad antimicótica frente a Candida albicans y carecen de
actividad antibacteriana.
Los valores de concentración mínima inhibitoria encontrados son para: extracto de raíz (70:30):10,50
mg/200uL, extracto de hoja (70:30):5.25 mg/200uL, extracto de tallo (70:30): 42.0 mg/200uL,
extracto de raíz (50:50):21.0 mg/200uL, extracto de hoja (50:50):5.25 mg/200uL, extracto de tallo
(50:50):21.0 mg/200uL.
PALABRAS CLAVE: PETIVERIA ALLIACEA L, CANDIDA ALBICANS, CONCENTRACIÓN
MÍNIMA INHIBITORIA, AMINOÁCIDOS, TAMIZAJE FITOQUÍMICO.
xix
SUMMARY
The present study contains the evaluation of the minimum inhibitory concentration of the aqueousalcoholic extracts ethanol: water (50:50) and (70:30) from the leaves, roots and stems of Petiveria
alliacea L, its obtainment was performed by the method of maceration and concentration in a
rotavapor.
To the obtained extracts, a phytochemical screening was conducted in order to determine qualitatively
the main secondary metabolites present in each one of them.
By the chromatographic fingerprint it was determined the presence of amino acids in the leaves, roots
and stems, presenting spots for all the extracts, using the mobile phase Butanol: Acetic Acid: Water
(4:1:1). The spots which present higher intensity correspond to the extract of fresh roots Ethanol:
Water (50:50) and fresh roots Ethanol: Water (70:30).
For the assessment of the antimicrobial activity, an adaptation of the Kirby-Bauer method was applied,
the six extracts presented antifungal activity in comparison with Candida albicans, and they lack of
antibacterial activity.
The discovered values of minimum inhibitory concentration are for: root extract (70:30):10,50
mg/200uL, leaf extract (70:30):5.25 mg/200uL, seem extract (70:30): 42.0 mg/200uL, root extract
(50:50):21.0 mg/200uL, leaf extract (50:50):5.25 mg/200uL, seem extract (50:50):21.0 mg/200uL.
KEYWORDS: PETIVERIA ALLIACEA L, CANDIDA ALBICANS, MINIMUM INHIBITORY
CONCENTRATION, AMINO ACIDS, PHYTOCHEMICAL SCREENING.
xx
CAPITULO I
1.1.
DESCRIPCIÓN DEL TEMA DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA
1.1.1.
INTRODUCCIÓN
La resistencia a los antimicrobianos es la resistencia de un microorganismo a un medicamento
antimicrobiano al que originalmente era vulnerable. Los organismos resistentes (bacterias, hongos,
virus y algunos parásitos) pueden resistir ataques de medicamentos antimicrobianos tales como
antibióticos, fungicidas, antivirales y antipalúdicos, de tal forma que los tratamientos
convencionales se vuelven ineficaces y las infecciones persisten, lo que incrementa el riesgo de
propagación. La evolución de las cepas resistentes es un fenómeno natural que ocurre cuando los
microorganismos se ven expuestos a fármacos antimicrobianos, y es posible un intercambio de
características de resistencia entre ciertos tipos de bacterias. El uso inapropiado de medicamentos
antimicrobianos acelera ese fenómeno natural. Las prácticas inapropiadas para el control de las
infecciones propician la propagación de la resistencia a los antimicrobianos (World Health
Organization. OMS, 2013).
Los conocimientos y las tecnologías disponibles hoy para descubrir y desarrollar nuevos fármacos
son muy superiores a los que tenían los científicos hace no muchos años. Sin embargo, los
investigadores y los fabricantes de productos farmacéuticos han recortado significativamente los
fondos para la investigación y la realización de estudios clínicos sobre nuevos antimicrobianos. En
consecuencia, el número de nuevos antimicrobianos en fase de desarrollo ha disminuido
notablemente en el último decenio, poniendo en cuestión la disponibilidad de opciones terapéuticas
eficaces en el futuro (Organización Mundial de la Salud, NE)
En este sentido, la Organización Mundial de la Salud (OMS), constantemente incentiva a la
comunidad científica para que continúe la búsqueda de nuevas estrategias, ya sea de origen sintético
o natural, que permitan ampliar el arsenal farmacológico disponible.
Numerosas investigaciones realizadas en distintas regiones del planeta, demuestran que las plantas
medicinales constituyen un importante punto de partida en el descubrimiento de nuevos fármacos,
tanto así, que aproximadamente el 25% de los medicamentos prescritos mundialmente son de origen
vegetal, y de los restantes, un significativo número son obtenidos por síntesis a partir de precursores
naturales (Gurib-Fakim, 2006, Feb)
En años recientes, ha ido creciendo el interés en terapias alternativas y en la terapéutica con
productos naturales, especialmente aquellos derivados de plantas. Este interés en drogas de origen
vegetal es debido a varias razones, entre ellas la medicina convencional puede ser ineficiente (por
ejemplo: efectos adversos o terapia no efectiva), el abuso y/o incorrecto uso de drogas sintéticas
1
resulta en efectos secundarios y otros problemas, un amplio porcentaje de la población mundial no
tiene acceso a un tratamiento farmacológico convencional y la medicina tradicional y la conciencia
ecológica sugieren que los productos naturales son inocuos. Sin embargo, el uso de estas sustancias
no es siempre autorizado por las autoridades regulatorias en relación con procedimientos seguros y
eficaces, muchas publicaciones apuntan a la falta de calidad en la producción, mercado y
prescripción de productos fitomedicinales(Rates, 2001)
La búsqueda de nuevas moléculas, hoy en día, ha tomado una ruta ligeramente diferente, donde la
ciencia de la etnobotánica y etnofarmacognosia están siendo utilizados como guía para dirigir al
químico hacia diferentes fuentes y clases de compuestos. Es en este contexto que la flora del
trópico, en virtud de su diversidad tiene un papel importante que desempeñar al ser capaz de
proporcionar nuevas pistas. No obstante, la cuestión de la soberanía y los derechos de propiedad
también debe abordarse en consonancia con la Convención de la Diversidad Biológica
(CDB)(Gurib-Fakim A. , February 2006)
La selección de especies vegetales para la investigación puede ser realizada al azar, utilizando
criterios quimiotaxonómicos o criterios etnofarmacológicos. Es así como la industria farmacéutica
ha desarrollado líneas de investigación en el campo de la etnofarmacología, de cara a la utilización
de sustancias de uso tradicional, donde las perspectivas de obtención de nuevos productos activos
naturales encuentren nuevos horizontes de futuro. El establecimiento de nuevas técnicas para
determinar metabolitos secundarios de forma precisa y cuantificar los mismos, permiten tener una
idea más clara del tipo de actividad que estos extractos podrían tener. Sin embargo estas técnicas no
están disponibles para todos los extractos de plantas, considerando que pueden tener una muy
variada composición y que es difícil establecer el marcador específico para un determinado
extracto.
En virtud de esto se han adaptado algunas técnicas que pueden funcionar como control de calidad
(perfil cromatográfico y análisis capilar) de extractos y permiten además establecer la presencia de
grupos de metabolitos secundarios y primarios que se menciona debe tener una determinada
especie.
El descubrimiento de nuevas sustancias bioactivas a partir de estudios etnofarmacológicos
(screening dirigido) supone un planteamiento que proporciona grandes éxitos a las compañías
farmacéuticas. Este enfoque implica un programa de recolección de plantas medicinales con
especial énfasis en aquellas especies utilizadas por la población indígena en zonas tropicales del
mundo, lo que supone una vía rápida en el largo y costoso proceso de screening casual, utilizado
por la industria convencional. Lógicamente la selección de las plantas a estudiar está dirigida hacia
la utilización etnomédica con un objetivo claro, la curación o mejora de una determinada
enfermedad. El hecho de que las plantas seleccionadas con este fin hayan sido utilizadas por el
hombre, aumenta la probabilidad de que las sustancias obtenidas sean eficaces en modelos de
experimentación animal, que reproduzcan la patología humana para cual fue seleccionada la planta.
En definitiva, la idea de establecer un proceso rápido y eficaz para el descubrimiento de nuevas
2
sustancias biológicamente activas, pasa por la integración de la etnobotánica, la medicina moderna,
y la química de productos naturales. (Durango, 2009)
En principio cabría suponer que el campo de la investigación de productos naturales debía de estar
agotado a estas alturas, pero nada más lejos de la realidad. Algunos autores afirman que solo se ha
estudiado, desde el punto de vista fitoquímico, algo más del 10% de la flora terrestre y lo realizado
con la flora marítima es, lógicamente, bastante menor, por lo que podríamos decir con relación al
futuro de las plantas medicinales, el 90% restante queda presto al descubrimiento y a la
investigación fitoquímica. Ahora bien, esto con relación alos análisis químicos, pero que hay con
respecto a los análisis de actividad biológica?.Son relativamente pocas hasta el momento las
especies tropicales que han sido estudiadas desde el punto de vista de su potencial de acción
farmacológica, se estima que menos del 1%.(Durango, 2009)
1.2.
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
1.2.1.
CONTEXTUALIZACIÓN.
¿Es posible determinar la concentración mínima inhibitoria en los distintos órganos vegetativos de
Petiveria alliacea L?
¿Tiene el solvente utilizado incidencia en la extracción de activos que indiquen una mejor
concentración mínima inhibitoria de los distintos órganos vegetativos de Petiveria alliacea L?
Las investigaciones previas realizadas sobre Petiveria alliacea L. y que se toman como punto de
partida para la presente investigación mencionan el hecho de que la raíz contiene una concentración
muy alta de activos en relación a hojas y tallos, sin embargo no se ha investigado su acción, debido
especialmente a la premisa de que en plantas nativas se debe preservar la especie, evitando la
recolección de la planta completa (evitar las raíces).
1.2.2.
ANÁLISIS CRÍTICO
De los resultados obtenidos en investigaciones previas es posible apreciar que las hojas son el
órgano vegetativo de la planta más empleado en la elaboración de los extractos, independientemente
de que los escasos estudios realizados con tallos y raíces evidencian resultados más alentadores.
Kubec y Musah (2001) aislaron dos diasteroisómeros del sulfóxido de S-bencil-cisteína (petiverina
A y petiverina B) y plantearon que el contenido total de petiverinas en las hojas, tallos y raíces de
esta planta es muy variable, siendo de 0,07; 0,29 y 2,97 mg/g de peso fresco, respectivamente. En
2002 continuaron con los estudios de Petiveria alliacea L .aislando otros 3 derivados de (R)-S-(2hydroxyethyl) cysteine. El elevado contenido de petiverinas en las raíces (42 veces superior que el
reportado en las hojas y 10 veces superior al reportado en los tallos) de esta especie, sugiere la
utilización de las mismas como el principal órgano de elección durante la elaboración de los
extractos.(Roman Kubec, 2001)
3
Kim et al. (2006) plantearon que las discrepancias y la ausencia de actividad antimicrobiana de esta
planta en los estudios precedentes podían ser el resultado de diferentes procedimientos empleados
durante la preparación de las muestras. Concluyeron además, que la inactivación de enzimas por el
secado del material vegetal y/o la aplicación de calor durante la preparación de los extractos podría
interferir en la formación efectiva del sulfino, los tiosulfinatos, y por consiguiente de otros
compuestos activos antimicrobianos como los trisulfuros.
El índice de polaridad de los solventes es un factor importante a tener en cuenta durante la
elaboración de los extractos. De manera general, los extractos elaborados con etanol al 70 y al 80%
han logrado una elevada efectividad frente a las especies de bacterias y de hongos evaluadas en
estudios de actividad antimicrobiana de esta planta, lo que sugiere que con la utilización de este
solvente a estas concentraciones se incrementa su poder difusivo en las células facilitándose una
mayor extracción de metabolitos bioactivos.
De lo anterior se desprenden las siguientes interrogantes.
¿El órgano vegetativo a utilizar tiene influencia sobre la Concentración mínima inhibitoria?
¿La utilización de diferentes mezclas hidroalcoholicas tiene influencia sobre la Concentración
mínima inhibitoria?
1.2.3.
PROGNOSIS
Si no se toman las respectivas consideraciones relacionadas al proceso de selección del órgano
vegetativo a utilizar, temperatura de secado, temperatura de concentración de extractos, utilización
de mezclas hidroalcoholicas adecuadas, se van a seguir presentando discrepancias en los resultados
publicados entre autores sobre la actividad antimicrobiana de Petiveria aliácea L.
Las plantas medicinales constituyen un importante punto de partida en el descubrimiento de nuevos
fármacos, por lo que si no se determinan las condiciones necesarias para que se demuestre las
propiedades antimicrobianas de Petiveria aliácea L. se desperdiciaría este recurso natural lo cual a
futuro no permitiría ampliar el arsenal farmacológico disponible en función de la resistencia a
antimicrobianos existente.
1.2.4.
FORMULACIÓN
Del análisis anterior se desprende la pregunta fundamental a ser respondida en el presente trabajo:
¿Cuál es el órgano vegetativo de Petiveria aliácea L. al utilizar material fresco y mezclas
hidroalcohólicas apropiadas (etanol-agua 70:30) o (etanol-agua 50:50), que permitirá obtener
extractos con la mejor CMI sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans?
4
Se establecen como variables, las siguientes:


Antecedente: Órgano vegetativo.
Consecuente: CMI sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
¿El órgano vegetativo a utilizar tiene influencia sobre la CMI?
¿La utilización de diferentes mezclas hidroalcoholicas tiene influencia sobre la CMI?
1.2.5.
DELIMITACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN.
Esta investigación se limita al:
Campo: Industria Farmacéutica
Área: Farmacognosia
Aspecto: Productos Naturales
1.2.6.
DELIMITACIÓN DE CONTENIDO
1.2.6.1.
Delimitación Espacial
El presente trabajo se realizara en la Universidad Central del Ecuador, Facultad de Ciencias
Químicas.
1.2.6.2.
Delimitación Temporal
Los antecedentes y estudios previos para la investigación del presente problema se ubican entre los
años 1972 y 2013.
1.3.
HIPÓTESIS
El órgano vegetativo empleado, utilizando material fresco, mezclas hidroalcoholicas (etanol-agua
70:30) y (etanol-agua 50:50) permite obtener extractos con Concentración Mínima Inhibitoria
(CMI) sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas
aeruginosa y Candida albicans.
Variable Independiente (VI):
 Órgano vegetativo utilizando material fresco,
 Mezclas hidroalcoholicas(etanol-agua 70:30) y (etanol-agua 50:50)
Variable Dependiente (VD): CMI sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
5
1.4.
OBJETIVOS
1.4.1.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar los órganos vegetativos (hojas, raíz y tallo) de Petiveria alliacea L. para determinar la
Concentración Mínima Inhibitoria que actúa sobre cepas de
Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans a partir de extractos
obtenidos de dos diferentes mezclas hidroalcohólicas, y de esta manera presentar otra posible
alternativa para combatir dichos microorganismos.
1.4.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.4.2.1. Determinar la presencia de metabolitos específicos en Petiveria alliacea L.
mediante la realización del tamizaje fitoquímico de los extractos de raíz, hojas y
tallo.
1.4.2.2. Determinar el perfil cromatográfico del extracto total de hojas, raíz y tallo de
Petiveria alliacea L. en función a sus constituyentes principales (CCF)
1.4.2.3. Determinar la influencia del órgano vegetativo (hojas, raíz y tallo) en los resultados
de CMI sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
1.4.2.4. Determinar la influencia de las mezclas hidroalcoholicas (etanol-agua 70:30) y
(etanol-agua 50:50) en los resultados de CMI sobre cepas de Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
1.4.2.5. Establecer la combinación de órgano vegetativo y mezclas hidroalcoholicas que
permita determinar la CMI sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
6
CAPITULO II
MARCO TEÓRICO
2.1.
ANTECEDENTES
Las enfermedades infecciosas constituyen una de las principales causas de morbilidad y mortalidad
a nivel mundial. El uso indiscriminado de antibióticos sintéticos y comerciales ha empeorado el
panorama, pues muchos de los microorganismos causantes de enfermedades comunes, que podían
ser tratados fácilmente, han adquirido gran resistencia. Cuantiosas son las investigaciones enfocadas
en la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos a partir de fuentes naturales, dentro de estas, un
gran número han sido dirigidas hacia la evaluación de actividades antimicrobianas en extractos y
aceites esenciales de plantas medicinales y aromáticas. Las plantas ofrecen grandes posibilidades en
el descubrimiento de nuevos fármacos, ya que de ellas se han aislado alrededor de 12 000
metabolitos secundarios, de los cuales un por ciento significativo presentan actividad
antimicrobiana. Petiveria alliacea L., es una planta perenne de la familia Phytolaccaceae,
usualmente conocida como anamú en los países de habla hispana y originaria del sur de Estados
Unidos, de Norteamérica y México. Esta especie tiene una distribución geográfica muy amplia,
desde la Florida, en toda América Central, desde Colombia hasta la Argentina y en África.
(Sariego; Marin; Ochoa; Viera, 2013).
La actividad antimicrobiana de esta especie es una de las propiedades etnobotánicas más difundidas
por países y regiones, razón por la cual ha sido utilizada con fines medicinales y ha sido cultivada
como “planta de la suerte” a la cual se le atribuyen propiedades mágicas en la preservación de la
salud humana, alejando los males y las hechicerías. De manera general, en algunos países entre los
que se encuentran Argentina, Cuba, Brasil, Guatemala, Haití, México, Puerto Rico y Venezuela se
le atribuyen a esta planta propiedades etnobotánicas para el tratamiento de infecciones cutáneas,
urinarias, venéreas y del tracto respiratorio. Se le han otorgado además, propiedades depurativas,
antifúngicas y antisépticas. Lo anterior, ha sugerido la realización de estudios in vitro por
investigadores de estos países para comprobar científicamente su posible efecto antimicrobiano. No
obstante, las investigaciones desarrolladas han evidenciado discrepancias en los resultados
publicados entre autores. Podría pensarse en la alternativa de reevaluar la actividad antimicrobiana
de esta planta frente a los microorganismos seleccionados en estudios anteriores, modificando las
condiciones experimentales durante la preparación de los extractos. (Sariego; Marin; Ochoa;
Viera, 2013).
Los autores mencionados evaluaron un total de 18 artículos en los cuales se publican resultados
obtenidos acerca de la evaluación de la actividad antimicrobiana de Petiveria alliacea L.
provenientes de 6 países distintos y en los cuales se menciona diversas formas de preparación de los
extractos, diferentes órganos vegetativos utilizados, diversas concentraciones evaluadas, así como
varios microorganismos utilizados para la investigación, de este artículo se deduce que varios
7
fueron los factores que pudieron influenciar en los resultados diversos en cuanto a la actividad
antimicrobiana de Petiveria alliacea L.
El principal objetivo de esta investigación es establecer si dos diferentes extractos de tres órganos
vegetativos de la planta (hojas, raíz o tallo) presentan diferente actividad sobre microorganismos
específicos que suelen actuar en infecciones de tipo dermatológico. Los artículos publicados indican
que las concentraciones de los extractos empleadas en estos estudios han sido muy variables. En
este sentido, es válido aclarar que en la actualidad no existe una organización o institución que
legisle o estandarice las concentraciones de extractos vegetales a emplear, por tanto, la selección de
las concentraciones a evaluar es arbitraria aunque deben tenerse en cuenta los niveles de toxicidad
de los extractos frente a los modelos biológicos a los que esté dirigida su aplicación. Bajo esta
premisa es factible hacer una relación entre el antibiótico de elección sobre las bacterias utilizadas y
la concentración de extracto.
Para la evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria se considera la concentración de extracto
crudo (extracto total) puesto que la acción de los fitofármacos suele considerarse con todos sus
constituyentes, el aislamiento de los componentes tiene más bien fines investigativos para verificar
un marcador, pues es muy posible que la acción atribuida tradicionalmente se deba al sinergismo de
todos los constituyentes presente en el extracto.
2.2.
FUNDAMENTACIÓN LEGAL
En base al registro oficial Nº 308 vigente desde el 11 de agosto del 2014 indica:
Que; la Ley Ibídem en el artículo 164, dispone que los productos naturales procesados de uso
medicinal, se producirán, almacenarán, comercializarán e importarán siempre que cuenten con
registro sanitario nacional, de conformidad con la ley y el reglamento correspondiente y bajo las
normas de calidad emitidas por la Autoridad Sanitaria Nacional (Órgano del Gobierno del
Ecuador, 2014)
Que; con Acuerdo Ministerial No. 244 publicado en el Registro Oficial No. 385 de 26 de octubre de
2006, se expidió el “Reglamento para el Registro y Control de Productos Naturales de Uso
Medicinal y de Establecimientos en donde se Fabrican, Almacenan y Comercializan”(Órgano del
Gobierno del Ecuador, 2014)
CAPITULO I: Objetivo y ámbito de aplicación
Art. 2.- Ámbito.- Las disposiciones de este Reglamento se aplicarán a todos los productos naturales
procesados de uso medicinal, que se importan, fabrican, envasan o empacan, transportan,
almacenan, distribuyen y comercializan, en todo el territorio nacional y a los establecimientos que
se dedican a dichas actividades.(Órgano del Gobierno del Ecuador, 2014)
8
Factores ontogenésicos: La época en que se recolecta cada droga tiene generalmente, considerable
importancia, puesto que la cantidad y a veces, la naturaleza de los principios activos, no son
constantes a la largo del año. Ahora bien, la edad de la planta, tiene así mismo, una importancia
considerable e influye no solo en la cantidad total de principios activos producidos, sino también en
las proporciones relativas de los componentes de la mezcla activa, estas variaciones pueden existir
en cualquier planta. Igualmente existe evidencia que la composición de un número de metabolitos
secundarios varia apreciablemente a través del día y la noche.(Osorio E. J., 2014)
Otro de los aspectos que se consideran desde el punto de vista ontogenésico es que los principios
activos se localizan preferentemente en determinadas partes u órganos del vegetal, en lugar de
distribuirse uniformemente por la planta.(Sharapin, MATERIA PRIMAS PARA LA INDUSTRIA
DE PRODUCTOS FITOFARMACÉUTICOS, 2000).
2.3.
CARACTERÍZACIÓN BOTÁNICA DE “Petiveria alliacea L.”
Familia: Fitolacáceas.
Nombre científico: Petiveria alliacea L. syn: P. alliacea B grandiflora (L.) Moq. = P.
paraguayensis Parodi = P. hexandria Sesse et Moq. (herbotecnia, 2004)
Origen del nombre científico: Petiveria por estar dedicado al farmacéutico y botánico inglés,
James Petiver (1665-1718) y, alliacea, por el aroma aliáceo; a ajo, (Alliumsativus L.) de la planta.
(herbotecnia, 2004)
Otros nombres populares: Pipí, calauchín, mikura (aymará y quechua), sunikila (quechua) en
Argentina; guiñé, erva pipí, raíz de guiñé, guiñé, sacha ajo en Brasil; chanvico en Perú; mapurite en
Venezuela; ajillo y zorrillo en Costa Rica; ipasina en Honduras y Nicaragua; apacín en Guatemala;
hierba de las gallinitas y zorrillo en México; epasina, hierva de toro en El Salvador; have en Haití;
ananuí en Puerto Rico; koujuorouk en República Dominicana; anamú en Panamá y el Caribe; namú
en Cuba; guinea henweed en Jamaica. Francés: verveinepuante; inglés: Garlicsentedpetiveria;
zorrilla en Ecuador.(herbotecnia, 2004)
9
Figura 1: Planta Petiveria alliacea L.
Figura2: Hojas de Petiveria alliacea L.
Figura 3: Raíz de Petiveria alliacea L.
2.3.1
DESCRIPCIÓN
Subfrútice erecto de 0,40 a 0,70 m. de altura, con olor a ajo. Raíz profunda, fusiforme, leñosa, de
hasta 2,5 cm de diámetro, irregularmente ramificada, cubierta por una corteza amarillenta, lisa,
carnosa, de aroma aliáceao, fuerte, desagradable y sabor un amargo, un tanto acre. Tallos
10
ramificados, con las ramas viejas rollizas, leñosas, angulosas y los nuevos herbáceos, angulosos, a
veces estriados longitudinalmente. Hojas alternas, pecioladas, elíptico lanceoladas, subglabras,
acuminadas en el ápice. Flores, dispuestas en espigas axilares o terminales de 15-40 cm de largo,
gráciles, pequeñas, hermafroditas, pétalos 4 a veces de color blanco, blanco-verdoso o rosado claro.
Fruto alargado, conservando el perianto en la base. (herbotecnia, 2004)
2.3.2
DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA
Originaria del sur de Estados Unidos de Norteamérica y México; crece, desde la Florida, en toda
América Central y desde Colombia hasta la Argentina. Crece generalmente en lugares húmedos,
algo sombríos y zonas ribereñas. (herbotecnia, 2004)
2.3.3
PARTE UTILIZADA
Principalmente la raíz y, también las hojas frescas. (herbotecnia, 2004)
2.3.4
COMPONENTES QUÍMICOS AISLADOS
Domínguez en Materia Médica Argentina, 1928, menciona que toda la planta contiene un aceite
esencial amarillento de olor fuerte, desagradable, constituido en gran proporción por sulfuro de alilo
(Peckolt, in Apoth. Zeit., 1895, 842; Historia das Plantas Medicinais e Uteis do Brazil, fasc. VII, p.
1133), y petiverina (Matta, Flora Médica brasiliense, Manaos, 1913, 186), cuerpo amorfo
pulverulento, inodoro, de sabor amargo y picante, soluble en éter y alcohol y en soluciones ácidas y
poco soluble en agua a 100° C, y cuyas soluciones precipitan por la solución de tanino y los
cloruros de oro y platino. Menciona además que en los tallos foliáceos-floríferos encontraron
además saponinas y una oxidasa (Invest. Fito-Quím. - Trabajo del Inst. Bot. Farmacol. 1919, N° 40,
16:17.) (herbotecnia, 2004)
Ragonese y Milano en Vegetales y substancias tóxicas de la flora argentina, 1984, citando a
Mendiondo, Rondina y Coussio, 1973, mencionan que contiene alcaloides en la raíz y además, un
aceite esencial de olor nauseabundo, aliáceo y persistente (Domínguez, 1903). (herbotecnia, 2004)
Soraru y Bandoni en "Plantas de la Medicina Popular Argentina", citando a Peckolt, T. y G.
Peckolt (Historia das Plantas Medicinais e Uteis do Brazil, vol 7, p. 1132, 1899) mencionan que la
planta contiene sulfuro de alilo; citando a Matta, F. (Flora Médica brasiliense, p. 186, 1913)
mencionan que contiene petiverina y a Adesogan, E. K. (Chem. Comm., 1974) que
contiene trithiolaniacina, aunque estos dos últimos no indican en que parte de la planta las hallaron;
citando a Sczepanski, V, Ch. P. Zgorzelak y G.A. Hoyer (Arzneim. Forsch, 22:1975) mencionan
que de tallo y raíz aislaron trisulfuro de 2-hidroxietilbencilo.
Diversos autores citan que de la raíz se han aislado esteroides, triterpenoides, saponosidos,
polifenoles, taninos, acetato de isoarbinol, cinamato de isoarbinol, cumarinas; de las raíces y tallos,
11
compuestos de azufre como tritiolaniazina y trisulforo de 2-hidroxietilbencilo, además sulfuro de
alilo, benzaldehído, ácido benzoico y petiverina. (herbotecnia, 2004)
2.3.5
USOS Y PROPIEDADES
Dominguez, J. A.: (1928:89-224 y 338) Cita en p. 89, a P. alliacea L. n.v.: pipí, calauchín, en
Tucumán, Salta, Jujuy, Chaco, Misiones, etc. y a P. alliacea var tetranda (Gómez) Hauman en
Misiones, Corrientes.
Se cita "pipí" (Petiveria sp.) entre las plantas con virtudes curativas o preservativas del "daño" o
gualicho y de las artes de la hechicería, compartiendo el título de payé (talismán) junto con otras
especies, capaz al que lo lleva consigo, no solamente de preservarlo del daño y aún curarlo, sino
más aún, el de conferirle el poder de dominar voluntades, por lo que en las tierras cálidas
Misioneras se dice que "la mujer que sahuma su habitación con contrayerba, pipí y cipó
milhombres, no esperará en vano al que desea". Menciona además que las hojas y sobre todo las
raíces tienen propiedades antiespasmódicas, diaforéticas, diuréticas y emenagogas. Que la raíz,
administrada en dosis elevadas y continuas, puede ocasionar accidentes peligrosos y aun la muerte
en lapsos de tiempo más o menos largos. (herbotecnia, 2004)
Martínez Crovetto, R.: (1981:45) escribe que en el Noroeste de la provincia de Corrientes, la
decocción es utilizada en baños en casos de "pasmos de vientre" y lavajes para "curar granos".
Agrega que su decocción se usa también en mezclas con hojas de naranjo agrio (Citrus aurantium)
en baños y fricciones.
Cita que la hierba es cultivada en las casas por las propiedades mágicas que la gente le atribuye de
preservar a la gente de la casa contra hechicerías o "payé". (herbotecnia, 2004).
2.4.
MARCHA FITOQUÍMICA, PERFIL CROMATOGRÁFICO
2.4.1.
MARCHA FITOQUÍMICA
La marcha Fitoquímica o tamizaje fitoquímico es un proceso en el cual se aplica técnicas de
extracción sobre el material vegetal seco o fresco para separar los posibles constituyentes de la
planta en función a la polaridad del solvente utilizado y la afinidad de los metabolitos presentes con
el solvente aplicado. En cada uno de las fracciones aisladas se aplican reacciones de coloración y/o
precipitación que permiten verificar o desechar la presencia de determinados metabolitos. (Miranda,
2000)
2.4.1.1
Triterpenos y esteroides
La reacción de identificación para estos metabolitos secundarios se realiza mediante el ensayo de
Liebermann-Buchard ya que se fundamenta en el reconocimiento del núcleo androstano,
generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6.
12
Los triterpenos están formados por seis moléculas de isopreno.
Los limonoides también son triterpenos, las sustancias amargas de los cítricos que actúan como
antiherbívoros. Un limonoide de los más poderosos repelentes de insectos es la azadiractina que se
usa en la industria alimentaria y en agronomía para el control de plagas. Entre los triterpenos se
encuentran también algunos esteroides en forma de glicósidos. Estos glicósidos esteroideos, con
importantes funciones en medicina y en la industria (cardenolípidos y saponinas), se consideran más
adelante en el apartado de glicósidos. (Ávalos García, Pérez, & Carril, 2009)
Es de destacar que los compuestos químicos pertenecientes a la familia de los triterpenos o
esteroles, y alcaloides, son los más abundantes en los extractos de la planta estudiada (ederla
adorata L.), por lo que es posible que estas familias de compuestos químicos sean las principales
responsables de la actividad antiestafilocócica. (Cabrera, Torres, Saavedra, Torres, Tamayo, &
García, 2013)
2.4.1.2
Flavonoides y antocianidinas
La reacción de identificación para estos metabolitos secundarios se realiza mediante el ensayo de
shinoda y el ensayo de catequinas ya que se fundamenta en el reconocimiento de los anillos de la
molécula y la generación de un color fluorescente, respectivamente.
La reacción de identificación para estos metabolitos secundarios (taninos) se realiza mediante el
ensayo de antocianidinas ya que se fundamenta en el reconocimiento la presencia de estructuras de
secuencia C6:C3:C6 de los anillos de la molécula y su conjugación.
Se han identificado más de 5.000 flavonoides, entre los que se pueden destacar:
1. Citroflavonoides: quercitina, hesperidina, rutina, naranjina y limoneno. La quercitina es un
flavonoide amarillo-verdoso presente en cebollas, manzanas, brócoles, cerezas, uvas o repollo rojo.
La hesperidina se encuentra en los hollejos de las naranjas y limones. La naranjina da el sabor
amargo a frutas como la naranja, limón y toronja, y el limoneno se ha aislado del limón y la lima.
2. Flavonoides de la soja o isoflavonoides: están presentes en los alimentos con soja tales como
porotos, tofu, tempeh, leche, proteína vegetal texturizada, harina, miso. Los dos más conocidos son
la genisteína y la daidzeina.
3. Proantocianidinas se localizan en las semillas de uva, vino tinto y extracto de corteza del pino
marino.
4. Antocianidinas: son pigmentos vegetales responsables de los colores rojo y rojo-azulado de las
cerezas.
5. Ácido elágico: es un flavonoide que se encuentra en frutas como la uva y en verduras.
6. Catequina: el té verde y negro son buenas fuentes.
7. Kaemferol: aparece en puerros, brócoles, rábano, endibias y remolacha roja.
13
Acción antioxidante de los flavonoides La capacidad de los polifenoles vegetales para actuar como
antioxidantes en los sistemas biológicos fue ya reconocida en los años treinta; sin embargo, el
mecanismo antioxidante fue ignorado en gran medida hasta hace poco tiempo. El creciente interés
en los flavonoides se debe a la apreciación de su amplia actividad farmacológica. Pueden unirse a
los polímeros biológicos, tales como enzimas, transportadores de hormonas, y ADN; quelar iones
metálicos transitorios, tales como Fe2+, Cu2+, Zn2+, catalizar el transporte de electrones, y depurar
radicales libres. Debido a este hecho se han descrito efectos protectores en patologías tales como
diabetes mellitus, cáncer, cardiopatías, infecciones víricas, úlcera estomacal y duodenal, e
inflamaciones. Otras actividades que merecen ser destacadas sus acciones antivirales y
antialérgicas, así como sus propiedades antitrombóticas y antiinflamatorias. (Martínez-Flórez,
González-Gallego, Culebras, & Tuñón, 2002)
2.4.1.3
Lactonas y cumarinas
La reacción de identificación para estos metabolitos secundarios se realiza mediante el ensayo de
Baljet se fundamenta en el reconocimiento de los compuestos con agrupamiento lactónico, en
particular Cumarinas.
Debido a la gran variedad estructural de estas moléculas son muchas las propiedades
farmacológicas asociadas a dicho anillo, entre otras: antimicrobianas, antiinflamatorias,
antiespasmódicas, antivirales, antihelmínticas, antioxidantes o inhibidoras enzimáticas. Existen
además derivados tricíclicos o tetracíclicos de cumarinas que se comportan como intercalantes del
ADN y, por tanto, tienen interés como antitumorales o bien como agentes fotoquimioterápicos en el
tratamiento de la psoriasis (8-MOP) 18,19 (Serra, 2009)
2.4.1.4
Saponinas
La reacción de identificación para estos metabolitos secundarios se realiza mediante el ensayo de la
espuma se fundamenta en el reconocimiento de las saponinas tanto del tipo esteroidal como
triterpénicas.
Saponinas o Saponósidos, del latín sapo = jabón, son sustancias que tienen poder espumante en
soluciones acuosas, y son tensoactivos naturales. Muchas poseen propiedades hemolíticas
(desintegración de los eritrocitos), resultando muy tóxicas inyectadas en sangre. La toxicidad se
reduce administrándolas vía oral. Son tóxicas para los animales de sangre fría. (López Serrano,
2012)
Las saponinas esteroides son glicósidos esteroides con un núcleo espirostano que tienen la
propiedad de hemolizar los glóbulos rojos y forman espuma abundante y estable al agitar sus
soluciones acuosas. (Martínez Martínez, 2001)
2.4.1.5
Taninos
La reacción de identificación para estos metabolitos secundarios (taninos) se realiza mediante el
ensayo de cloruro férrico ya que se fundamenta en el reconocimiento de los anillos de la molécula y
su conjugación.
14
Las acciones farmacológicas de los taninos están relacionadas con sus propiedades. Sus principales
acciones y usos son:
Antídotos en intoxicación por metales pesados y alcaloides: debido a su capacidad para formar
estructuras complejas con estas sustancias.
Astringentes: debido a su capacidad para precipitar proteínas de la piel, proteínas salivares, etc. Por
sus propiedades astringentes se usan por vía externa como cicatrizantes y por vía interna como
antidiarreicos. El efecto antidiarreico lo ejercen en el intestino, y para evitar los ardores del
estómago que producirían, se administran combinándolos con albúmina o gelatina. De esta forma el
tanino no se libera hasta llegar al intestino, donde hay medio básico.
Antisépticos: tienen una acción bactericida y bacteriostática. También ejercen un efecto antifúngico.
Protectores: los taninos aplicados en pomada de uso externo impermeabilizan la piel y la protegen
de los agentes externos. Si hay una cicatriz favorecen la regeneración y tienen poder analgésico.
Aplicados sobre heridas sangrantes pueden tener una acción antihemorrágica. Los taninos
condensados son protectores de la pared venosa y hemostáticos y se utilizan en supositorios
antihemorroidales.
Antioxidantes: son capaces de captar radicales libres e inhibir la peroxidación lipídica. Inhiben la
autooxidación del ácido ascórbico (vitamina C).
Efecto hipocolesterolémico: disminuyen los niveles de colesterol en sangre y aumentan su
metabolismo.
Son factores antinutrientes: ciertos taninos disminuyen la eficacia de los alimentos porque inhiben
las enzimas endógenas o porque se absorben y ejercen un efecto sistémico de precipitación de las
proteínas de la dieta. (Osorio E. , 2014)
2.4.1.6
Aminoácidos
Son las unidades básicas que forman las proteínas. Su denominación responde a la composición
química general que presentan, en la que un grupo amino (-NH2) y otro carboxilo o ácido (-COOH)
se unen a un carbono α (-C-). Las otras dos valencias de ese carbono quedan saturadas con un
átomo de hidrógeno (-H) y con un grupo químico variable al que se denomina radical (-R).
Los aminoácidos son compuestos sólidos; incoloros; cristalizables; de elevado punto de fusión
(habitualmente por encima de los 200 ºC); solubles en agua; con actividad óptica y con un
comportamiento anfótero.
Debido a su comportamiento anfótero, la solubilidad de los aminoácidos en solución acuosa varía
ya que son capaces de ionizarse, dependiendo del pH, como un ácido (cuando el pH es básico),
como una base (cuando el pH es ácido) o como un ácido y una base a la vez (cuando el pH es
neutro). En este último caso adoptan un estado dipolar iónico conocido como zwitterión.
El pH en el cual un aminoácido tiende a adoptar una forma dipolar neutra (igual número de cargas
positivas que negativas) se denomina Punto Isoeléctrico. La solubilidad en agua de un aminoácido
es mínima en su punto isoeléctrico. (Licata M. , 2013)
Los aminoácidos son de una vital importancia en el metabolismo de los seres vivos, desde su
condición de ser las unidades estructurales de las proteínas. Intervienen en la regulación endógena
del crecimiento y desarrollo vegetal.
15
Los aminoácidos son sintetizados por las plantas a partir del nitrógeno absorbido en forma de
nitrato o en forma de amonio del suelo (las leguminosas además utilizan el nitrógeno atmosférico
como fuente en la síntesis aminoácidos) dicho proceso supone un gasto energético por parte de la
planta, para evitar este gasto se procura una adición directa de aminoácidos.
Los aminoácidos llamados también bioactivadores pueden ser de tres tipos:
 Aminoácido de síntesis.
 Aminoácidos de fermentación enzimática (heparina).
 Aminoácidos de hidrólisis.
Todos estos productos se caracterizan por ser capaces de permitir el torrente circulatorio de la
planta evitando gasto energético y formando parte de los componentes de las plantas. (Suarez,
2008)
2.4.1.6.1. Efectos de los aminoácidos en las plantas
Por medio de los aminoácidos se realiza la síntesis de proteínas, uniéndose los L- aminoácidos.
Proveen resistencia al estrés, las altas temperaturas, enfermedades, heladas, etc.
Tienen efecto directo sobre la fotosíntesis. Ya que la Glicina y el ácido L-Glutámico incrementan la
concentración de clorofila en consecuencia aumenta la fotosíntesis.
Efecto quelante: Algunos aminoácidos como la Glicina y los ácidos L-Glutánico y L-Aspártico
tienen carga negativa por lo tanto son capaces de retener cationes formando quelatos. El resto de
aminoácidos son de carga positiva y neutra, con lo cual no son capaces de quelar.
Efecto sobre la polinización y cuajado de frutos, se ha demostrado que aminoácidos como la
Prolina, Glutámico y la Glicina, aumentan la germinación del grano de polen alargando el tubo
polínico. (Licata N. , 2008)
2.4.1.6.2.
2.4.1.6.2.1.


Aminoácidos Azufrados
Cisteína
Es abundante en defensinas y tioninas, que tienen potente acción antifúngica. Ya que las
defensinas tienen la capacidad de inhibir efectivamente el crecimiento de un amplio rango
de microorganismos fitopatógenos.
Generan resistencia a condiciones abióticas de estrés en plantas. (Noa, 2014)
2.4.1.6.2.2.
Metionina
16



2.4.2.
Precursor del etileno, incrementa calidad y producción del cultivo.
Aplicando al suelo favorece al crecimiento radical
Favorece la asimilación de nitratos. (Noa, 2014)
PERFIL CROMATOGRÁFICO
El perfil cromatográfico permite identificar grupos funcionales que pueden estar presentes en una
muestra de extracto de planta, una vez separada la fracción de interés de la planta en investigación
se procede a correr la muestra en una placa de cromatografía de sílica gel con un eluyente adecuado
para el componente que se necesita investigar, estos componentes pueden tener coloración y se
observarán directamente. Para el caso de componentes no coloreados, es posible la utilización de
reveladores, luz ultravioleta o la combinación de ambas para determinar la presencia de los
metabolitos primarios o secundarios.
2.4.2.1
Fundamento de la cromatografía de capa fina
La cromatografía de capa fina consiste en la separación de dos componentes de una mezcla a través
de migración diferencial sobre una capa delgada de adsorbente colocada sobre una superficie plana.
El proceso de separación está fundamentado principalmente en el fenómeno de adsorción. Sin
embargo, utilizando fases estacionarias tratadas puede ocurrir también por partición o intercambio
iónico, permitiendo su uso tanto en la separación de substancias hidrofóbicas como hidrofílicas.
(Collins, Braga, & Bonato, 2007)
2.4.2.2
Adsorbente
2.4.2.2.1.
Sílica
Ácido silicio amorfo altamente poroso. Presenta carácter débilmente ácido, que puede ser
aumentado por la presencia de impurezas ácidas pudiendo ocurrir como consecuencia fenómenos de
quimiosorción de bases o reacciones ácidas catalizadas por las muestras.
En general, la sílica es utilizada en la separación de compuestos lipofílicos como aldehídos, cetonas,
fenoles, ácidos grasos, aminoácidos, alcaloides, terpenoides y esteroides usando el mecanismo de
adsorción. (Collins, Braga, & Bonato, 2007)
2.4.2.3
Identificación por cromatografía en capa fina.
La cromatografía de capa fina sirve para identificar drogas vegetales, sus extractos y tinturas e
igualmente para que una formulación farmacéutica sea posible identificar la presencia de una droga
o sus extractos. Cuando los principios activos de una droga no son conocidos, la identificación de la
droga puede ser realizada a través de la determinación de sustancias características de las planta en
cuestión, aunque no tengan actividad farmacológica.
17
Estas sustancias denominadas marcadores son seleccionadas entre los compuestos característicos de
la planta. El uso de ellas debe limitarse solamente a la identificación del material vegetal, de los
extractos y de las tinturas. Los marcadores pueden servir, igualmente, para identificar la presencia
de la droga en una formulación farmacéutica. La presencia de manchas o bandas coloreadas con el
mismo Rf de las sustancias de referencia en el cromatograma de la muestra, no es suficiente para
identificar la droga.
La existencia de otras manchas o bandas coloreadas debe ser anotada, así como su posición en
relación a la posición de las sustancias de referencia utilizadas. El uso de sustancias de referencia
que no son constituyentes de la planta es de utilidad para determinar la ocurrencia de
falsificaciones. Estas sustancias reciben la denominación de marcadores negativos. (Sharapin,
Fundamentos de tecnología de Productos Fitoterapéuticos, 2000)
2.5.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA: CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA.
La Actividad antimicrobiana se evalúa generalmente a través del método conocido como
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) el mismo que en Microbiología se define como
la concentración más
baja
de
un antimicrobiano que
inhibe
el crecimiento de
un microorganismo después de su incubación. La concentración mínima inhibitoria es importante
en diagnósticos de laboratorio para confirmar la resistencia de microorganismos a un agente
antimicrobiano y además para monitorizar la actividad de los nuevos agentes antimicrobianos.
Las concentraciones mínimas inhibitorias pueden ser determinadas mediante métodos de
microdilución en caldo, normalmente siguiendo las directrices de centros de referencia tales como
el CLSI (Clinical Laboratory Institute Standards), BSAC (British Society for Antimicrobial
Chemotherapy) o EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing).
(Andrews, 2001).
El método de difusión en agar, está apoyado por datos clínicos y de laboratorios; y presenta la
ventaja que sus resultados son altamente reproducibles.
El fundamento de esta determinación es establecer, en forma cuantitativa, el efecto de un conjunto
de sustancias, ensayadas individualmente, sobre las cepas bacterianas que se aíslan de procesos
infecciosos. (Stella Ramirez & Marin Castaño, 2009)
El método se basa en la relación entre la concentración de la sustancia necesaria para inhibir una
cepa bacteriana y el halo de inhibición de crecimiento en la superficie de una placa de agar con un
medio de cultivo adecuado y sembrado homogéneamente con la bacteria a ensayar y sobre la cual se
ha sembrado en pozo impregnado con una cantidad conocida de la sustancia. (Stella Ramirez &
Marin Castaño, 2009)
18
La metodología de este método basado en la difusión en agar contiene un reservorio del extracto de
planta en el cual este está en contacto directo con el medio inoculado, y después de su incubación se
mide el diámetro de la zona inhibida alrededor del reservorio (diámetro de inhibición). El límite de
detección mínimo aumenta con el diámetro de inhibición cuando la difusión se mantiene a bajas
temperaturas durante horas antes de la incubación, para permitir la predifusión de los extractos
antes de la incubación. La lectura de los resultados representa la actividad In vitro de la sustancia.
(Dey & Harborne, 1991)
Los reservorios se deben realizar una vez que estén esterilizadas las placas, ya que si se los realiza
antes de este procedimiento es posible que afecte a la difusión del extracto en el medio. (Dey &
Harborne, 1991)
2.6.
MICROORGANISMOS UTILIZADOS
2.6.1.
BACTERIAS
2.6.1.1.
Staphylococcus aureus
Conocido como estafilococo áureo, o comúnmente estafilococo dorado, es una bacteria anaerobia
facultativa, gran positiva, productora de coagulasa, catalasa, inmóvil y no esporulada que se
encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo, estimándose que una de cada tres personas se
hallan colonizadas, aunque no infectadas, por ella. Puede producir una amplia gama de
enfermedades, que van desde infecciones cutáneas y de las mucosas relativamente benignas, tales
como foliculitis, forunculosis o conjuntivitis, hasta enfermedades de riesgo vital, como celulitis,
abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía.
Figura 4:S. aureus, micrografía electrónica de barrido, color artificial.
Además, también puede afectar al aparato gastrointestinal, ya sea por presencia física de
Staphylococcus aureus o por la ingesta de la enterotoxina estafilocócica secretada por la bacteria.
En la actualidad, este microorganismo se encuentra como el principal causante de las infecciones
nosocomiales. Esta situación se ve favorecida por el hecho de que esta especie habita tanto en las
mucosas como en la piel de los seres humanos, lo que permite que a través de las heridas
quirúrgicas pueda penetrar en el torrente sanguíneo del paciente por medio del contacto directo o
indirecto con el personal sanitario, con un objeto contaminado o incluso con otro paciente. Las
cepas habituales de Staphylococcus aureus son resistentes a la penicilina, dejando como los
antibióticos más eficaces para combatirlos a los aminoglucósidos y las cefalosporinas. Además de la
19
administración del tratamiento antimicrobiano correspondiente, puede ser conveniente, en función
del caso, la eliminación de puertas de entradas como catéteres venosos permanentes o drenajes
quirúrgicos. (Cervantes-García, García-González, & Salazar-Schettino, 214)
2.6.1.2.
Staphylococcus epidermidis
Es una especie bacteriana del género Staphylococcus, consistente en cocos gram-positivos
arreglados en grupos. Es coagulasa-negativa, no fermenta manitol, termo nucleasa-negativo aunque
a veces varia, se observa como colonias pequeñas en agar digerido, mucho menor que coliformes
fecales y se presenta frecuentemente en la piel de humanos y de animales y en membranas mucosas.
Figura 5: Imagen de escaneado electrónico de S. epidermidis.
Es sensible al antibiótico novobiocina; un concepto que lo distingue de otros organismos comunes
de coagulasa negativa como S. saprophyticus. Debido a contaminación, S. epidermidis es
probablemente la más común especie hallada en análisis de laboratorio. Es la causa menos común
en infecciones oportunistas. Es un mediador de infecciones nosocomiales. Su crecimiento no
produce hemolisis. Tiene una alta tasa de resistencia a múltiples antibióticos. Es resistente a la
meticilina y se ha demostrado que tiene sensibilidad a la vancomicina antibiótico con el cual los
pacientes evolucionan favorablemente. (Jabbar Resheg AL-Sa'ady, shaker, & Salam, 2014)
2.6.1.3.
Pseudomonas aeruginosa o Pseudomonas pyocyanea
Es una bacteria gram negativa, aeróbica, con motilidad unipolar. Es un patógeno oportunista en
humanos y también en plantas.Como otras Pseudomonas, P. aeruginosa secreta una variedad de
pigmentos como piocianina (azul verdoso), fluoresceína (amarillo verdoso fluorescente) y
piorrubina (rojo pardo). King, Ward, &Raney desarrollaron "Pseudomonas Agar P" (también
conocido como "medio King A") para mejorar la producción de piocianina y piorrubina; y
"Pseudomonas Agar F" (también conocido como "medio King B") para la fluoresceína. (Paho,
2009)
20
Figura 6: P. aeruginosa en XLD agar
P. aeruginosa es a menudo identificada, de modo preliminar, por su apariencia perlada y olor a uvas
in vitro. La identificación clínica definitiva de P. aeruginosa frecuentemente incluye, tanto
identificar la producción de piocianina y fluoresceína como determinar su habilidad de crecer a
42 °C. P. aeruginosa es capaz de crecer en combustibles como queroseno o gasóleo, ya que es un
microorganismo capaz de nutrirse a partir de hidrocarburos, causando estragos de corrosión
microbiana, y creando una gelatina oscura que a veces se identifica inadecuadamente con un alga.
Este patógeno oportunista de individuos immuno comprometidos, infecta los pulmones y las vías
respiratorias, las vías urinarias, los tejidos, (heridas), y también causa otras sepsis (infecciones
generalizadas en el organismo). Pseudomonas puede causar neumonías a grupos, lo que en
ocasiones precisa ayuda mecánica para superar dichas neumonías, siendo uno de los
microorganismos más frecuentes aislados en muchos estudios. La piocianina es un factor de
virulencia de la bacteria y se ha conocido que puede hasta causar muerte en Caenorhabditis
elegans por estrés oxidativo. (Callicó, y otros, 2004)
P. aeruginosa es naturalmente resistente a una gran cantidad de diferentes familias de antibióticos.
Es indispensable usarlos con una guía de tratamiento acorde con los resultados de antibiogramas
(sensibilidad de la especie de P. aeruginosa a diferentes potentes antibióticos), más que a elegir
determinado antibiótico empíricamente. (Lister, Wolter, & . Hanson, 2013)
Los antibióticos que han mostrado actividad contra P. aeruginosa incluyen:
 Aminoglicosidos (gentamicina, amikacina, tobramicina).
 Quinolonas (ciprofloxacino, levofloxacino pero no moxifloxacino).
 Cefalosporinas (ceftazidima, cefepima, cefpiroma, pero no cefuroxima, ceftriaxona,
cefotaxima).
 Ureidopenicilinas (piperacilina, ticarcilina, carbenicilina: P. aeruginosa es
intrínsecamente resistente a todas las otras penicilinas).
 Carbapenem (meropenem, imipenem, yno ertapenema).
 Polimixinas (polimixina B, colistina)
 Monobactamos (aztreonam) (Lister, Wolter, & . Hanson, 2013)
21
2.6.2.
LEVADURA:
2.6.2.1.
Candida albicans
Candida albicans es un hongo diploide asexual (forma de levadura) saprófito de la familia de los
Sacaromicetos. Normalmente se encuentra en la cavidad oral, en el tracto gastrointestinal y en la
vagina. Está envuelta en un rol relevante en la digestión de los azúcares mediante un proceso de
fermentación. (Muggiano, Quaranta, & Previat, 2014)
Figura 7: Candida albicans
Candida albicans puede asumir patogenicidad provocando la candidiasis; en ese caso se presenta
como una afección vaginal (vaginitis), de la cavidad oral (muguet), del intestino o de la piel. En un
físico debilitado, inmunodeprimido o convaleciente de un larga cura antibiótica, la Candida se
multiplica en modo anómalo y, atraviesa el intestino, para entrar al torrente sanguíneo, donde libera
sus propias toxinas provocando la candidemia. Este fenómeno da lugar a algunos síntomas
abdominales: mala digestión, gases e hichazón, molestias intestinales (estreñimiento o diarrea),
intolerancia alimentaria, irritabilidad, insomnio, pérdida de la memoria, dolores de cabeza y
depresión. (Muggiano, Quaranta, & Previat, 2014)
La candidiasis induce también una disminución de la absorción de las sustancias nutritivas por lo
que se podría producir un estado de malnutrición, según la extensión de la infección y el estado
general del paciente se deciden un tratamiento tópico o sistémico. Así tópicamente se puede
emplear cotrimazol al 1 por ciento, miconazol, ketoconazol, sertoconazol, terbinafina o naftilina.
Los tratamientos sistémicos más frecuentemente empleados son itraconazol o fluconazol. El
pronóstico es bueno siendo curativos tanto los tratamientos tópicos como sistémicos. Pero si los
factores predisponentes de estas micosis no se corrigen es posible otra nueva infección. (Biasoli,
2013)
2.7.
ESTADISTICA NO PARAMETRICA
Es la estadística que se utiliza cuando en un gran número de casos no se puede determinar la
distribución original ni la distribución de los estadísticos por lo que en realidad no se tiene
parámetros a estimar. Y solamente se tiene distribuciones que comparar. (Acuña E. , 2006)
22
2.7.1.
Prueba de Kruskal-Wallis
Sirve para comparar más de dos grupos. La prueba de Kruskal-Wallis, es una alternativa a la prueba
F del análisis de varianza para diseños de clasificación simple. En este caso se comparan varios
grupos pero usando la mediana de cada uno de ellos, en lugar de las medias. (Acuña E. , 2007)
Debe cumplir las siguientes características: que sea libre de curva, no necesite una distribución
específica y de nivel ordinal de la variable dependiente.
2.7.2.
Prueba de rangos con signos de Wilcoxon
Es usada para hacer pruebas de hipótesis acerca de la mediana, el cual se calcula de la siguiente
manera:
Se resta de cada dato el valor de la mediana que se considera en la hipótesis nula. Se calcula los
rangos de las diferencias sin tomar en cuenta el signo de las mismas (o sea en valor absoluto). En el
caso de haber empate se asigna un rango promedio a todas las diferencias empatadas es decir; se les
asigna el rango:
(
)
El estadístico W de Wilcoxon será la suma de los rangos correspondientes a las diferencias
positivas.
Cuando la hipótesis alterna es "mayor que" y la suma de los rangos correspondientes a las
diferencias positivas es mayor que el de las diferencias negativas, entonces el “p-value” se calcula
por P1=P (W≥ Wc), donde Wc es el valor calculado de la prueba de Wilcoxon. Cuando la suma de
los rangos correspondientes a las diferencias positivas es menor que el de las diferencias negativas,
entonces el “p-value” se calcula por P2 =P (W≤ Wc)
Si la hipótesis alterna es "menor que", y la suma de los rangos correspondientes a las diferencias
positivas es mayor que el de las diferencias negativas, entonces “p-value”=P 2. En caso contrario
“p-value”=P1. Cuando la hipótesis alterna es de dos lados y la suma de los rangos correspondientes
a las diferencias positivas es mayor que el de las diferencias negativas, entonces el “p-value”=2 P 2,
si la suma de los rangos correspondientes a las diferencias positivas es la menor entonces “pvalue”=2 P1 y si las sumas de los rangos correspondientes a las diferencias positivas y negativas
son iguales entonces “p-value”=1.0. (Acuña E. , 2006)
2.7.3.
Prueba de U Mann-Whitney
Esta prueba se emplea en combinación con el diseño de grupos independientes, con datos que tienen
por lo menos una escala ordinal Esta prueba puede sustituir a la prueba t student cuando ésta no
23
cumple con la suposición de normalidad de su población. La hipótesis nula y alternativa se enuncia
sin mencionar los parámetros de la población.
Ya que se requiere ordenar los datos por rangos para calcular U esta prueba requiere que los datos
estén por lo menos en una escala ordinal. También puede emplearse en lugar de la prueba t cuando
los datos no se encuentran en una escala de razón o intervalo. Básicamente compara la diferencia
entre las medianas de dos grupos. (Hernández, 2007)
La hipótesis nula es que la mediana de las dos poblaciones son iguales y la hipótesis alterna puede
ser que la mediana de la población 1 sea mayor (menor o distinta) de la mediana de la población 2.
Cuando tanto n1 como n2 sean mayores que 10, se puede demostrar que si no hay empates no hay
empates, entonces W se distribuye aproximadamente como una normal. (de la Torre & Acuña,
2007)
2.7.4.
Pruebas de normalidad
2.7.4.1.
Prueba de contraste de Kolmogorov-Smirnov
Compara las funciones de distribución empírica de la muestra y la que se desea contrastar. Es
aplicable a distribuciones continuas y para distribuciones discretas, los valores críticos no están
tabulados. Para distribuciones continuas, los valores críticos están tabulados para: distribuciones
con parámetros especificados, algunas distribuciones con parámetros no especificados (normal,
Weibull, gamma, exponencial). (Kisbye, 2010)
2.7.4.2.
Prueba de contraste de Shapiro y Wilk
Cuando la muestra es como máximo de tamaño 50 se puede contrastar la normalidad con la prueba
de Shapiro-Wilk. Para efectuarla se calcula la media y la varianza muestral, S2, y se ordenan las
observaciones de menor a mayor. A continuación se calculan las diferencias entre: el primero y el
último; el segundo y el penúltimo; el tercero y el antepenúltimo, etc. y se corrigen con unos
coeficientes tabulados por Shapiro y Wilk. El estadístico de prueba es:
Donde D es la suma de las diferencias corregidas.
Se rechazará la hipótesis nula de normalidad si el estadístico W es menor que el valor crítico
proporcionado por la tabla elaborada por los autores para el tamaño muestral y el nivel de
significación dado. (Kisbye, 2010).
24
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
3.1.
ENFOQUE DE LA INVESTIGACIÓN
Paradigma Cuantitativo: Porque busca las relaciones causales entre fenómenos, interpretación de
mediciones y está orientado a la comprobación de inferencias replicables.
3.2.
MODALIDAD DE LA INVESTIGACIÓN
Investigación Bibliográfica y Experimental


Bibliográfica
Porque se utilizó diferentes fuentes de información como: libros, artículos, publicaciones
con el fin de ampliar, comparar resultados y criterios de diversos autores de temas
relacionados a la investigación.
Experimental
Porque se evaluó diferentes fenómenos que se producen al introducir elementos que
modifican las variables en estudio las cuales fueron identificadas y medidas en momentos
establecidos.
3.3.
NIVELES DE INVESTIGACIÓN
Descriptivo: Porque clasificó, describió e interpretó los comportamientos y hechos generados en la
investigación.
Prospectivo: Porque la investigación se llevó a cabo a través del tiempo.
Longitudinal: Porque permite realizar una recolección sistemática de los datos relacionados a las
variables involucradas en el estudio en función del tiempo planificado.
De asociación de variables, porque determina la relación entre variables, a fin de evaluar su
correlación así como determinar modelos de comportamiento.
3.4.
IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES
Para llevar a cabo la investigación, se seleccionó la variable independiente del estudio, en base a
investigación bibliográfica.
 Independiente:

 Órgano vegetativo (Hojas, tallo y raíz)
 Solvente utilizado etanol:agua (70:30) y etanol:agua (50:50)
Dependiente: CMI sobre cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
25
3.5.
DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
3.5.1.
Caracterización botánica de la especie en estudio
Para asegurar que el espécimen recolectado se corresponde con la especie que menciona la
referencia bibliográfica investigada se envió una muestra vegetal (vaucher) a identificación en una
entidad reconocida para esta actividad.
3.5.2.
Obtención de extractos hidroalcohólicos hojas, tallo y raíz
La obtención de extractos se realizó cuidando ciertos factores ambientales durante el proceso
(temperatura y exposición a la luz), se escogió dos concentraciones de solución hidroalcohólica
etanol:agua (70:30) y etanol:agua (50:50), estos dos solventes se aplicaron sobre hojas, tallo y raíz.
El proceso de maceración que se utilizo es el de maceración dinámica (agitación diaria por tres días)
con cambio de solvente diario para maximizar la extracción de los constituyentes, evitando la
saturación del solvente.
Los extractos obtenidos que son un total de seis se concentran en rotavapor para extraer la mayor
cantidad del solvente hasta obtener un extracto fluido que permita la utilización del mismo en la
evaluación de la concentración mínima inhibitoria sobre los microorganismos arriba mencionados.
Los extractos no se llevaron a sequedad, para evitar su posible degradación debido a la acción
térmica
3.5.3.
Análisis Fitoquímico de los extractos
El análisis fitoquímico de los extractos preparados se llevó a cabo mediante la marcha fitoquímica
detallada en el libro de Farmacognosia y Productos naturales de Miranda, la secuencia de
extracciones parte de un extracto en éter etílico y el uso subsiguiente de solventes de diferente
polaridad que permitirán obtener fracciones constituidas por los distintos metabolitos presentes en
la plantas.
En cada una de estas fracciones se realizó reacciones de coloración y/o precipitación que permiten
confirmar la presencia de los metabolitos específicos, adicionalmente se llevó a cabo
cromatografías en placa de silica gel con los solventes específicos para los metabolitos a investigar
en cada fracción obtenida.
Este tamizaje fitoquímico permite también establecer mediante un perfil cromatográfico de la
fracción en la cual se encuentran los metabolitos de importancia (aminoácidos) y de los extractos
totales que también son sometidos a cromatografía en capa fina con la fase móvil más apropiada
para estos compuestos.
26
En la placa cromatográfica se verificó los Rf (medida de la elución de componentes) de todas las
manchas obtenidas visiblemente y se reveló la placa para confirmar o descartar la presencia de un
tipo específico de metabolito.
3.5.4.
Concentración mínima inhibitoria por el método de Difusión en agar (Adaptación
método del método Kirby-Bauer).
El ensayo in vitro se realizó en condiciones fisicoquímicas y ambientales controladas .Se utilizó la
Adaptación método del método Kirby-Bauer que es impartido y ejecutado en el laboratorio de
Microbiología Farmacéutica, así como en el Laboratorio de Productos Naturales II, como una
alternativa para evaluar la actividad antimicrobiana, los cambios aplicados incluyen el uso de
Tripticasa Soya Agar (TSA) y Sabouraud, utilizando gentamicina añadida para evitar el desarrollo
de otros microorganismos, con lo cual el medio es apropiado para esta prueba de CMI .
Se realizó por triplicado la determinación de actividad antimicrobiana en los seis extractos fluidos
obtenidos con la finalidad de identificar la presencia o ausencia de halos de inhibición al añadir el
extracto sin ningún tipo de dilución en los pozos que se realizaron en las cajas de agar solidificadas
con el sacabocados en las que previamente se hisoparon con suspensión microbiana los siguientes
microorganismos: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y
Candida albicans.
Este ensayo nos permitió identificar que extracto presenta actividad antimicrobiana en función de
estos resultados obtenidos se realizó el ensayo de concentración mínima inhibitoria.
Para los extractos que presentaron actividad antimicrobiana se realizó la preparación de siete
concentraciones a partir de la concentración inicial de cada extracto como se detalla a
continuación:C1 : 42.00 , C2 : 21.00 , C3 : 10.50 , C4 :5.25, C5: 2.62 , C6: 1.31 ,C7 :0.65
mg/200uL, se colocó por triplicado en las cajas de agar.
Se preparó siete concentraciones de antimicrobiano según el caso C1 : 42.00 , C2 : 21.00 , C3 :
10.50 , C4 :5.25, C5: 2.62 , C6: 1.31 ,C7 :0.65 mg/200uL las cuales se colocó por triplicado en las
cajas de agar .
Tan pronto el extracto se pone en contacto con la superficie del agar, este difunde, formándose un
gradiente de concentración. Transcurrido el tiempo de 24 a 48 horas de incubación para bacterias y
de 3 a 5 días para hongos, los pozos pueden o no aparecer rodeados por una zona de inhibición de
crecimiento bacteriano y se procede a medir el halo de inhibición.
Control positivo: Cajas con antimicrobiano en medio de cultivo
Control negativo: Una caja que solo contiene medio de cultivo.
3.6.
POBLACIÓN Y MUESTRA
3.6.1.
Población
En la presente investigación, se consideró como población a la especie Petiveria alliacea L. de la
familia Phytolaccaceae R. Br, proveniente de la provincia de Manabí, cantón El Carmen en la cual
se realizó el tamizaje fitoquímico y perfil cromatográfico y se determinó la actividad antimicrobiana
27
sobre Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida
albicans.
3.6.2.
Muestra
La muestra está conformada:
 Por los extractos etéreos, alcohólicos y acuosos de hoja, raíz y tallo obtenidos de Petiveria
alliacea L para el tamizaje fitoquímico.
 Por los extractos etéreos, alcohólicos, hidroalcohólicos y acuosos de hoja, raíz y tallo
obtenidos de Petiveria alliacea L para el perfil cromatográfico y pruebas físicas
 Por las 7 concentraciones obtenidas a partir de soluciones hidroalcohólicas etanol:agua
(70:30) y etanol:agua (50:50) de hoja, raíz y tallo obtenidos de Petiveria alliacea L con tres
repeticiones por cada concentración .
3.7.
OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES DE LA HIPÓTESIS.
Variable
Independiente
Dependiente
3.8.
Extracto
hidroalcohólico
de raíces, hojas
y tallos de
Petiveria
alliacea L.
Actividad
antimicrobiana
Definición
conceptual
Producto que se
obtendrá
mediante el
método de
extracción por
maceración con
etanol/agua
(70:30 y 50:50:)
Constituida por
el cambio en la
pared y
membrana
celular de los
microorganism
os produciendo
una inhibición
en el
crecimiento del
mismo.
Definición
operacional
Indicador
Escala de
medición
Tipo de
variable
El solvente en
contacto con la
especie vegetal
arrastra los
metabolitos
secundarios solubles
en él.
Concentración
del extracto
hidroalcohólico
de raíces, hojas
y tallos de
Petiveria
alliacea L.
Nominal
Cuantitativa
El método se basa en
la relación entre la
concentración de la
sustancia necesaria
para
inhibir
un
microorganismo y el
halo de inhibición de
crecimiento en la
superficie de una
placa de agar con un
medio de cultivo
adecuado
y
sembrado
homogéneamente.
Diámetro de
halo de
inhibición de
crecimiento a
una
concentración
de extracto
determinada
Nominal
Cuantitativa
MATERIALES Y MÉTODOS
3.8.1. Recolección
La Planta Petiveria alliacea L se recolectó en la provincia de Manabí, cantón El Carmen de
Ecuador en Enero del 2015.
28
3.8.2.
Caracterización botánica de la especie.
Se preparó una muestra adecuadamente procesada para la elaboración del vaucher, esta se envió a
identificación con un profesional botánico acreditado para este fin en el Herbario QCA de la
Pontificia Universidad Católica del Ecuador en la ciudad de Quito.
3.8.3.
Obtención de extractos hidroalcohólicos
Materiales










Planta
Cortador
Recipientes Plásticos
Frascos Transparentes
Frascos Ámbar
Fundas de Papel
Probeta
Matraz Kitasato
Embudo Buchner
Núcleos de ebullición
Reactivos



Hipoclorito de Sodio al 0.1 %
Agua
Etanol 96%
Equipos



Balanza
Bomba de vacío
Rotavapor
Procedimiento
Las muestras de planta se almacenaron en el laboratorio de productos naturales de la Universidad
Central del Ecuador, a temperatura ambiente y no se secaron para su extracción, y se someterá al
siguiente proceso:



Se separó las diferentes partes de la planta: hojas, tallos y raíces de Petiveria alliacea L.
Se desinfectó cada una de las partes separadas.
Se disminuyó el tamaño de partícula del material fresco previo al proceso de extracción.
29












3.8.4.
3.8.4.1.
Se pesó por separado 150 g de tallo y hoja, 200g de raíz disminuido el tamaño de partícula
previo al proceso de extracción.
Se preparó los solventes etanol:agua en diferentes proporciones 50:50 y 70:30 para cada
una de los órganos vegetativos previamente pesados.
Se rotuló los extractos como H1 para el extracto de Hojas en etanol:agua 50:50, y como H2
para el extracto de Hojas etanol:agua 70:30.
Se realizó la misma etiqueta para los extractos de los otros órganos vegetales en las mismas
proporciones y bajo los mismos parámetros.
Se dejó en maceración por 48 horas en frascos ámbar.
Se filtró en embudo Buchner y colocó nuevo solvente.
Se dejó en maceración durante 72 horas.
Se filtró en embudo Buchner y almacenó en frascos color ámbar.
Se concentró del volumen resultante del proceso de maceración en Rotavapor a 25 rpm y
temperatura de 27°C.
Se obtuvo el extracto fluido de cada parte de planta.
Se midió el volumen del extracto fluido
Se calculó las concentraciones de cada extracto.
Medición de las características físicas de los extractos
Determinación del pH
Materiales
 Vasos de precipitación 100mL
 Papel absorbente
Reactivos
 Extractos hidroalcohólicos
 Agua destilada
Equipos
 pHmetro
Procedimiento
 Se homogenizó los extractos hidroalcohólicos.
 Se tomó una alícuota en el vaso de precipitación de 100ml
 Se midió el pH.
 Se registró los datos.
30
3.8.4.2.
Determinación del peso específico.
Materiales
 Vasos de precipitación 100mL
 Papel absorbente
 Picnómetro de 10mL
Reactivos
 Extractos hidroalcohólicos
 Agua destilada
Equipos
 Balanza analítica
Procedimiento
 Se pesó el picnómetro vacío
 Se pesó el picnómetro con agua destilada, exento de burbujas de aire.
 Se homogenizó los extractos hidroalcohólicos.
 Se tomó una alícuota en el vaso de precipitación de 100ml
 Se pesó el picnómetro con el extracto hidroalcohólico, exento de burbujas de aire.
 Se registró los diferentes pesos.
 Se calculó el peso específico
3.8.4.3.
Determinación del índice de refracción
Materiales
 Vasos de precipitación 100mL
 Papel absorbente
Reactivos
 Extractos hidroalcohólicos
 Agua destilada
Equipos
 Refractómetro
Procedimiento
 Se calibró el refractómetro con agua destilada.
 Se homogenizó los extractos hidroalcohólicos.
 Se tomó una alícuota en el vaso de precipitación de 100ml
 Se colocó 1 o 2 gotas en el refractómetro.
 Se midió el índice de refracción.
 Se registró el índice de refracción.
31
3.8.5.
Tamizaje fitoquímico
Materiales
 Gradillas
 Tubos de ensayo
 Matraces
 Pipetas de diferente volumen, 1ml, 5ml, 10ml
 Vasos de precipitación
 Vidrios de reloj
 Embudos de separación
 Material vegetal seco
Reactivos
 Éter etílico
 Etanol
 Cloroformo
 Diclorometano
 Acetona
 Hidróxido de potasio 5%
 Anhídrido acético
 Ácido sulfúrico concentrado
 Carbonato de sodio
 Cloruro férrico
 Acetato de sodio
 Solución acuosa de Ninhidrina 2%
 Ácido clorhídrico
 Magnesio metálico
 Alcohol amílico
 Agua destilada
 Reactivo de Dragendorff
 Reactivo de Mayer
 Reactivo de Wagner
 Reactivo de Baljet
 Reactivo de Felling
 Reactivo de kedde
 Papel de picrato de sodio
PROCEDIMIENTO:
La planta fresca, seca o el residuo de una extracción; es sometida a tres reacciones sucesivas según
el siguiente esquema:
32
30-50 g MATERIAL VEGETAL
EXTRAER CON 90-150ml DE ÉTER ETÍLICO POR MACERACION
DURANTE 48 HORAS A TEMPERATURA AMBIENTE
FILTRAR
EXTRACTO ETÉREO
Medir volumen y calcular concentración
RESIDUO SÓLIDO
Secar y pesar
EXTRAER CON 3 VECES EL PESO DEL
RESIDUO EN VOLUMEN CON ETANOL POR
MACERACIÓN DURANTE 48 HORAS
FILTRAR
EXTRACTO AHCOHÓLICO
Medir volumen y calcular concentración
RESIDUO SÓLIDO
Secar y pesar
EXTRAER CON 3 VECES EL PESO DEL
RESIDUO EN VOLUMEN CON AGUA
DESTILADA POR MACERACIÓN DURANTE 48
HORAS
FILTRAR
EXTRACTO ACUOSO
Medir volumen y calcular concentración
RESIDUO SÓLIDO
Secar, pesar y desechar
Posteriormente en cada extracto por separado se procede de acuerdo a los esquemas siguientes:
3.8.5.1.


Extracto Etéreo
Se extrajo con 120ml de éter etílico por maceración durante 48 horas a temperatura
ambiente.
A continuación se filtró.
33
EXTRACTO ETÉREO
DIVIDIR EN FRACCIONES
5ml ENSAYO DE SUDÁN
(Aceites y grasas)
5ml ENSAYO DE BALJET
(Lactonas y Coumarinas)
15ml (dividir en 3 pociones)
ENSAYOS DE DRAGENDORFF,
MAYER Y WAGNER
(Alcaloides)

5 ml ENSAYO DE
LIEBERMANN-BUCHARD
(Triterpenos-Esteroides)
Se procedió en el extracto etéreo de acuerdo al esquema anterior, a realizar los ensayos de
la siguiente forma:
3.8.5.1.1. Ensayo de Dragendorff
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se evaporó en baño de agua y el residuo se re disolvió en 1 ml de HCl al 1%
en agua.
 A la solución acuosa ácida se le añadió 3 gotas del Reactivo de Dragendorff.
 Se observó si hay algún cambio
3.8.5.1.2. Ensayo de Mayer
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se evaporó en baño de agua y el residuo se re disolvió en 1 ml de HCl al 1%
en agua.
 A la solución acuosa ácida se le añadió una pizca de NaCl en polvo, se agitó y filtró.
 Después se añadió 3 gotas del Reactivo de Meyer
 Se observó si hay algún cambio
3.8.5.1.3. Ensayo de Wagner
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se evaporó en baño de agua y el residuo se re disolvió en 1 ml de HCl al 1%
en agua.
 A la solución acuosa ácida se le añadió 3 gotas del Reactivo de Wagner.
 Se observó si hay algún cambio
34
3.8.5.1.4. Ensayo de Baljet
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se evaporó en baño de agua y el residuo se re disolvió en 1 ml de etanol. En
estas condiciones se adicionó 1ml de reactivo de Baljet.
 Se observó si hay algún cambio
3.8.5.1.5. Ensayo de Liebermann-Burchard
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se evaporó en baño de agua y el residuo se re disolvió en 1 ml de
cloroformo.
 A la solución obtenida se le adicionó 1ml de anhídrido acético y se mezcló bien.
 Por la pared del tubo de ensayo se dejó resbalar 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin
agitar.
 Se observó si hay algún cambio.
3.8.5.2.


Extracto Etanólico
Se extrajo con 150ml de etanol por maceración durante 48 horas a temperatura ambiente.
A continuación se filtró.
EXTRACTO ALCOHÓLICO
DIVIDIR EN FRACCIONES
1ml ENSAYO DE
CATEQUINAS
2ml ENSAYO DE
FEHLING
(Azucares
Reductores)
2ml ENSAYO DE
RESINAS

2ml ENSAYO DE
LIEBERMANNBUCHARD
(Triterpenos-Esteroides)
2ml ENSAYO DE
BALJET
(Lactonas)
2ml ENSAYO DE
FeCl3
(Fenoles y Taninos)
2ml ENSAYO DE
ESPUMA
(Saponinas)
2ml ENSAYO DE
BORNTRAGER
(Quinonas)
2ml ENSAYO DE
NINHIDRINA
(Aminoácidos)
2ml ENSAYO DE
KEDDE
(Crdenolidos)
2ml ENSAYO DE
SHINODA
(Flavonoides)
6ml en 3 pociones
ENSAYO DE DRAGENDORFF,
MAYER Y WAGNER
(Alcaloides)
2ml ENSAYO DE
ANTOCIANIDINAS
Se procedió en el extracto etanólico de acuerdo al esquema anterior, a realizar los ensayos
de la siguiente forma:
3.8.5.2.1. Ensayo de Dragendorff
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
35



A continuación se evaporó en baño de agua y el residuo se re disolvió en 1 ml de HCl al 1%
en agua.
A la solución acuosa ácida se le añadió 3 gotas del Reactivo de Dragendorff.
Se observó si hay algún cambio
3.8.5.2.2. Ensayo de Mayer
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se evaporó en baño de agua y el residuo se re disolvió en 1 ml de HCl al 1%
en agua.
 A la solución acuosa ácida se le añadió una pizca de NaCl en polvo, se agitó y filtró.
 Después se añadió 3 gotas del Reactivo de Meyer
 Se observó si hay algún cambio
3.8.5.2.3. Ensayo de Wagner
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se evaporó en baño de agua y el residuo se re disolvió en 1 ml de HCl al 1%
en agua.
 A la solución acuosa ácida se le añadió 3 gotas del Reactivo de Wagner.
 Se observó si hay algún cambio
3.8.5.2.4. Ensayo de Catequinas
 Se colocó una alícuota del extracto, con ayuda de un capilar y se aplicó la solución sobre
papel filtro.
 Sobre la mancha hecha, se aplicó la solución de carbonato de sodio.
 Se observó si existe coloración en la luz UV.
3.8.5.2.5. Ensayo de resinas
 Se colocó 2ml del extracto en un tubo de ensayo.
 Después se adicionó 10ml de agua destilada
 Se observó si hay la aparición de un precipitado.
3.8.5.2.6. Ensayo de Fehling
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se evaporó en baño de agua y el residuo se re disolvió en 1 ml de agua.
 A la solución obtenida se le adicionó 2ml de Reactivo de Fehling y se calentó en baño de
agua por 10 minutos.
 Se observó si hay un cambio.
36
3.8.5.2.7. Ensayo de Baljet
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se adicionó 1ml de reactivo de Baljet.
 Se observó si hay un cambio.
3.8.5.2.8. Ensayo de Liebermann-Burchard
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se evaporó en baño de agua y el residuo se re disolvió en 1 ml de
cloroformo.
 A la solución obtenida se le adicionó 1ml de anhídrido acético y se mezcló bien.
 Por la pared del tubo de ensayo se dejó resbalar 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin
agitar.
 Se observó si hay algún cambio
3.8.5.2.9. Ensayo de la espuma
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 Se diluyó con 5 veces su volumen en agua y se agitó la mezcla fuertemente durante 5
minutos.
 Se observó si hay aparición de espuma.
3.8.5.2.10. Ensayo del cloruro férrico
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 Se le adiciono 3 gotas de una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina
fisiológica.
 Se observó si hay un cambio.
3.8.5.2.11. Ensayo de la ninhidrina
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se mezcló con 2ml de solución al 2% de ninhidrina en agua.
 La mezcla se calentó 10 minutos en baño de agua.
 Se observó si hay algún cambio.
3.8.5.2.12. Ensayo de Borntrager
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se evaporó en baño de agua y el residuo se re disolvió en 1 ml de
cloroformo.
 A la solución obtenida se le añadió 1ml de KOH al 5% en agua.
 Se agitó mezclando las fases y se dejó en reposo hasta su ulterior separación.
37

Se observó si hay cambio de coloración
3.8.5.2.13. Ensayo de Shinoda
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se diluyó con 1ml de HCl© y se colocó un pedacito de cinta de magnesio
metálico.
 Después de la reacción se esperó 5 minutos, se añadió 1ml de alcohol amílico, se mezclaron
las fases y se dejó reposar hasta que se separen.
 Se observó si hay algún cambio.
3.8.5.2.14. Ensayo de Kedde
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 Se mezcló con 1ml del Reactivo de Kedde y se dejó reposar durante 10 minutos.
 Se observó si hay algún cambio.
3.8.5.2.15. Ensayo de antocianidinas
 Se colocó 2ml de extracto en un tubo de ensayo.
 Se calentó durante 10 minutos en baño de agua con 1ml de HCl ©
 Se dejó enfriar.
 Después se adicionó 1ml de agua y 2ml de alcohol amílico.
 Se agitó y se deja separar las dos fases.
 Se observó si hay cambio de color en la fase amílica
3.8.5.3.
Extracto Acuoso
 Se extrajo con 100ml de agua destilada por maceración durante 48 horas a temperatura
ambiente.
 A continuación se filtró.
EXTRACTO ACUOSO
DIVIDIR EN FRACCIONES
10ml ENSAYO DE
MUCÍLAGOS
2ml ENSAYO DE
FEHLING
(Azucares
Reductores)
1o 2 gotas ENSAYO DE
PRINCIPIOS AMARGOS
2ml ENSAYO DE
FeCl3
(Taninos)
2ml ENSAYO DE
ESPUMA
(Saponinas)
38
6ml en 3 pociones
ENSAYO DE DRAGENDORFF,
MAYER Y WAGNER
(Alcaloides)
2ml ENSAYO DE
SHINODA
(Flavonoides)

Se procedió en el extracto acuoso de acuerdo al esquema anterior, a realizar los ensayos de
la siguiente forma:
3.8.5.3.1. Ensayo de Dragendorff
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A la alícuota se le añadió 1 gota de HCl©
 A la solución acuosa ácida se le añadió 3 gotas del Reactivo de Dragendorff.
 Se observó si hay algún cambio.
3.8.5.3.2. Ensayo de Mayer
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A la alícuota se le añadió 1 gota de HCl©.
 A la solución acuosa ácida se le añadió una pizca de NaCl en polvo, se agitó y filtró.
 A la solución filtrada se le añadió 3 gotas del Reactivo de Mayer.
 Se observó si hay algún cambio.
3.8.5.3.3. Ensayo de Wagner
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A la alícuota se le añadió 1 gota de HCl©.
 A la solución acuosa ácida se le añadió 3 gotas del Reactivo de Wagner.
 Se observó si hay algún cambio.
3.8.5.3.4. Ensayo de Shinoda
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A continuación se diluyó con 1ml de HCl© y se colocó un pedacito de cinta de magnesio
metálico.
 Después de la reacción se esperó 5 minutos, se añadió 1ml de alcohol amílico, se mezclaron
las fases y se dejó reposar hasta que se separen.
 Se observó si hay algún cambio.
3.8.5.3.5. Ensayo del cloruro férrico
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 Se le adicionó acetato de sodio para neutralizar y 3 gotas de una solución de tricloruro
férrico al 5% en solución salina fisiológica.
 Se observó si hay un cambio.
3.8.5.3.6. Ensayo de la espuma
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 Se diluyó con 5 veces su volumen en agua y se agitó la mezcla fuertemente durante 5
minutos.
 Se observó si hay aparición de espuma.
39
3.8.5.3.7. Ensayo de Fehling
 Se colocó una alícuota del extracto en un tubo de ensayo.
 A la alícuota se le adicionó 2ml del Reactivo de Fehling y se calentó en baño de agua por
10 minutos.
 Se observó si hay un cambio.
3.8.5.3.8. Ensayo de mucílagos
 Se colocó una alícuota del extracto, en un tubo de ensayo.
 Se enfrió de 0-5°C
 Se observó si cambia su consistencia.
3.8.6.
3.8.6.1.





Ensayos Complementarios
Glicósidos cianogenéticos
Se colocó 5g de material vegetal en un erlenmeyer de 125ml y se adicionó suficiente agua
para humedecer la muestra.
Se preparó un papel de picrato de sodio, sumergiendo una tira de papel filtro en una
solución recién preparada de picrato de sodio.
Se adicionó 1ml de cloroformo a la muestra humedecida.
Se insertó el papel de picrato de sodio en el recipiente con la muestra, colocándolo de tal
forma que no toque las paredes del mismo.
Se observó si hay cambios de coloración en el papel.
3.8.6.2.
Aceites, hidrocarburos y carotenos
 En un embudo de separación al cual se le colocó un pedacito de algodón en el orificio
interior, se adicionó 5g de droga en polvo y 15 ml de solvente de baja polaridad
(Diclorometano).
 Se tapó el embudo para evitar la evaporación del disolvente y se dejó en reposo 10 horas.
 Se abrió la llave del embudo y se obtuvo de esta forma el extracto.
3.8.6.3.
Ensayo de aceite fijo, secante o esencial
 Se tomó 5 ml del extracto y se dejó evaporar sobre un vidrio de reloj a temperatura
ambiente
 Se observó la consistencia del residuo
3.8.6.4.
Ensayo de hidrocarburos
 Se tomó 10ml del extracto y se colocó en un vidrio de reloj.
 A continuación se dejó evaporar a temperatura ambiente.
 Se disolvió el residuo obtenido en acetona calentando suavemente sobre baño de agua.
 Se dejó algunas horas en el refrigerador.
 Se observó si hay algún cambio
40
3.8.7.
Perfil cromatográfico
Materiales
 Vasos de precipitación 100mL.
 Placas cromatográficas.
 Capilares.
 Cámaras cromatográficas.
Reactivos
 Acetato de etilo.
 Metanol.
 Agua destilada.
 N-butanol.
 Ácido acético.
 Cloroformo.
 Éter de petróleo.
 Acetona.
 Ácido clorhídrico.
 Benceno.
 Hexano.
 Cloruro de metileno.
 Reactivo de Dragedorff acético.
 Anhídrido acético.
 Ácido sulfúrico concentrado.
 Acetato de plomo básico.
 Hidróxido de potasio 10% en metanol.
 Formaldehído.
 Ácido fosfórico 85%.
 Reactivo de kedde.
 Solución acuosa de Ninhidrina 2%.
Equipos
 Lámpara de UV.
 Estufa.
Procedimiento
Se realizó perfiles cromatográficos de extractos de planta seca y extractos de planta fresca
sembrados en el siguiente orden:
Extractos de planta seca: Orden de siembra
1. Etéreo de las hojas secas.
41
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Hidroalcohólico de hojas secas.
Hidroalcohólico de raíces secas.
Hidroalcohólico de tallos secos.
Acuoso de hojas secas.
Acuoso de raíces secas.
Acuoso de tallos secos.
Extractos de planta fresca: Orden de siembra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Raíces frescas Etanol: Agua (50:50).
Raíces frescas Etanol: Agua (70:30).
Tallos frescos Etanol: Agua (50:50).
Tallos frescos Etanol: Agua (70:30).
Hojas frescas Etanol: Agua (50:50).
Hojas frescas Etanol: Agua (70:30).
3.8.7.1.
Alcaloides
 Se sembró con la ayuda de un capilar en la placa cromatográfica los extractos en el orden
anteriormente indicado utilizando como fase estacionaria silica gel y como fase móvil las
siguientes:
 Se preparó la fase móvil Acetato de etilo: Metanol: Agua en proporciones 100:13,5:10
respectivamente.
 Se preparó la fase móvil Butanol: Ácido acético: Agua en proporciones 10:1:3
respectivamente.
 Se preparó la fase móvil Cloroformo: Metanol en proporciones 19:1 respectivamente.
 Se colocó cada fase móvil en cada cámara cromatográfica y se dejó saturar durante 15
minutos.
 Se colocó la placa cromatográfica lo más perpendicularmente posible a la base de la cámara
cromatográfica.
 Se eluyó la placa cromatográfica en cada una de las fases móviles hasta 1cm antes del final.
 Se retiró de la cámara cromatográfica, y se dejó evaporar el exceso de eluyente a
temperatura ambiente.
 Se reveló la placa cromatográfica con el reactivo Dragendorff acético.
 Se observó y se midió la distancia recorrida de las manchas reveladas.
3.8.7.2.
Aminoácidos
 Se sembró con la ayuda de un capilar en la placa cromatográfica los extractos en el orden
anteriormente indicado utilizando como fase estacionaria silica gel y como fase móvil las
siguientes:
 Se preparó la fase móvil Butanol: Ácido acético: Agua en proporciones 10:1:3
respectivamente
 Se preparó la fase móvil Butanol: Ácido acético: Agua en proporciones 4:1:1
respectivamente.
42







Se colocó cada fase móvil en cada cámara cromatográfica y se dejó saturar durante 15
minutos.
Se colocó la placa cromatográfica lo más perpendicularmente posible a la base de la cámara
cromatográfica.
Se eluyó la placa cromatográfica en cada una de las fases móviles hasta 1cm antes del final.
Se retiró de la cámara cromatográfica, y se dejó evaporar el exceso de eluyente a
temperatura ambiente.
Se reveló la placa cromatográfica con solución acuosa de Ninhidrina al 2%.
Se dejó en una estufa durante 5 min a 110ºC.
Se observó y se midió la distancia recorrida de las manchas reveladas.
3.8.7.3.
Esteroles
 Se sembró con la ayuda de un capilar en la placa cromatográfica los extractos en el orden
anteriormente indicado utilizando como fase estacionaria silica gel y como fase móvil la
siguiente:
 Se preparó la fase móvil Éter de petróleo: Acetona en proporciones 80:20 respectivamente.
 Se colocó la fase móvil en una cámara cromatográfica y se dejó saturar durante 15 minutos.
 Se colocó la placa cromatográfica lo más perpendicularmente posible a la base de la cámara
cromatográfica.
 Se eluyó la placa cromatográfica en cada una de las fases móviles hasta 1cm antes del final.
 Se retiró de la cámara cromatográfica, y se dejó evaporar el exceso de eluyente a
temperatura ambiente.
 Se reveló la placa cromatográfica con el reactivo de Liebermann-Buchard.
 Se dejó en una estufa durante 10 min a 110ºC.
 Se colocó bajo luz UV a 365nm.
 Se observó y se midió la distancia recorrida de las manchas reveladas.
3.8.7.4.
Flavonoides
 Se sembró con la ayuda de un capilar en la placa cromatográfica los extractos en el orden
anteriormente indicado utilizando como fase estacionaria silica gel y como fase móvil la
siguiente:
 Se preparó la fase móvil Forestal que contiene Ácido acético©: Ácido clorhídrico: Agua en
proporciones 10:3:30 respectivamente
 Se preparó la fase móvil Butanol: Ácido acético: Agua en proporciones 4:1:5
respectivamente.
 Se preparó la fase móvil Ácido acético 50% en agua
 Se colocó la fase móvil en una cámara cromatográfica y se dejó saturar durante 15 minutos.
 Se colocó la placa cromatográfica lo más perpendicularmente posible a la base de la cámara
cromatográfica.
 Se eluyó la placa cromatográfica en cada una de las fases móviles hasta 1cm antes del final.
 Se retiró de la cámara cromatográfica, y se dejó evaporar el exceso de eluyente a
temperatura ambiente.
43




3.8.7.5.










Se reveló la placa cromatográfica con acetato de plomo al 25% básico.
Se dejó evaporar el exceso de reactivo.
Se colocó bajo luz UV a 365nm.
Se observó y se midió la distancia recorrida de las manchas reveladas.
Naftoquinonas
Se sembró con la ayuda de un capilar en la placa cromatográfica los extractos en el orden
anteriormente indicado utilizando como fase estacionaria silica gel y como fase móvil la
siguiente:
Se preparó la fase móvil Forestal que contiene Ácido acético©: Ácido clorhídrico: Agua en
proporciones 10:3:30 respectivamente.
Se preparó la fase móvil Benceno: Éter de petróleo en proporciones 2:1 respectivamente.
Se colocó la fase móvil en una cámara cromatográfica y se dejó saturar durante 15 minutos.
Se colocó la placa cromatográfica lo más perpendicularmente posible a la base de la cámara
cromatográfica.
Se eluyó la placa cromatográfica en cada una de las fases móviles hasta 1cm antes del final.
Se retiró de la cámara cromatográfica, y se dejó evaporar el exceso de eluyente a
temperatura ambiente.
Se reveló la placa cromatográfica con hidróxido de potasio al 10% en metanol.
Se dejó evaporar el exceso de reactivo.
Se observó y se midió la distancia recorrida de las manchas reveladas.
3.8.7.6.
Antraquinonas
 Se sembró con la ayuda de un capilar en la placa cromatográfica los extractos en el orden
anteriormente indicado utilizando como fase estacionaria silica gel y como fase móvil la
siguiente:
 Se preparó la fase móvil Benceno: Acetato de etilo: Ácido acético en proporciones 75:24:1
respectivamente.
 Se colocó la fase móvil en una cámara cromatográfica y se dejó saturar durante 15 minutos.
 Se colocó la placa cromatográfica lo más perpendicularmente posible a la base de la cámara
cromatográfica.
 Se eluyó la placa cromatográfica en cada una de las fases móviles hasta 1cm antes del final.
 Se retiró de la cámara cromatográfica, y se dejó evaporar el exceso de eluyente a
temperatura ambiente.
 Se reveló la placa cromatográfica con hidróxido de potasio al 10% en metanol.
 Se dejó evaporar el exceso de reactivo.
 Se observó y se midió la distancia recorrida de las manchas reveladas.
44
3.8.7.7.
Saponinas
 Se sembró con la ayuda de un capilar en la placa cromatográfica los extractos en el orden
anteriormente indicado utilizando como fase estacionaria silica gel y como fase móvil la
siguiente:
 Se preparó la fase móvil Acetona: Hexanoen proporciones 4:1 respectivamente.
 Se colocó la fase móvil en una cámara cromatográfica y se dejó saturar durante 15 minutos.
 Se colocó la placa cromatográfica lo más perpendicularmente posible a la base de la cámara
cromatográfica.
 Se eluyó la placa cromatográfica en cada una de las fases móviles hasta 1cm antes del final.
 Se retiró de la cámara cromatográfica, y se dejó evaporar el exceso de eluyente a
temperatura ambiente.
 Se reveló la placa cromatográfica con formaldehido en ácido fosfórico al 85%.
 Se dejó evaporar el exceso de reactivo.
 Se observó y se midió la distancia recorrida de las manchas reveladas.
3.8.7.8.
Cardiotónicos
 Se sembró con la ayuda de un capilar en la placa cromatográfica los extractos en el orden
anteriormente indicado utilizando como fase estacionaria silica gel y como fase móvil la
siguiente:
 Se preparó la fase móvil Cloroformo: Acetona en proporciones 90:10 respectivamente.
 Se preparó la fase móvil Cloruro de metileno: Metanol: Agua en proporciones 87:12:1
respectivamente
 Se colocó la fase móvil en una cámara cromatográfica y se dejó saturar durante 15 minutos.
 Se colocó la placa cromatográfica lo más perpendicularmente posible a la base de la cámara
cromatográfica.
 Se eluyó la placa cromatográfica en cada una de las fases móviles hasta 1cm antes del final.
 Se retiró de la cámara cromatográfica, y se dejó evaporar el exceso de eluyente a
temperatura ambiente.
 Se reveló la placa cromatográfica con el reactivo de kedde.
 Se dejó evaporar el exceso de reactivo.
 Se observó y se midió la distancia recorrida de las manchas reveladas.
3.8.8.
Concentración mínima inhibitoria
Se realizó mediante el método de difusión en agar en pozo.
Materiales:




Cocineta.
Pipetas 10 ml, 1 ml.
Micropipetas (rango 20 ul a 200 ul) (rango 250 ul a 1000 ul).
Puntas estériles.
45









Balones aforados 10 y 25 ml.
Matraces 250 ml.
Cajas Petri.
Tubos de ensayo.
Sacabocados.
Hisopos.
Asas de inoculación.
Autoclave.
Incubadora.
Material biológico
Cepas de microorganismos ATCC


Bacterias:
o Pseudomonas aeruginosa. ATCC9027
o Staphylococcus aureus. ATCC25923
o Staphylococcus epidermidis. ATCC14990
Levadura
o Candida albicans ATCC10231
Reactivos






Agua destilada
Agua estéril
Solución buffer de fosfato de potasio pH 7.2
Medios de cultivo
o Agar Sabouraud (SAB)
o Agar Tripticasa Soya (TSA)
o Caldo Tripticasa Soya (TSB)
Estándar de Fluconazol pureza 99,24%
Extractos fluidos de planta fresca
Equipos




Balanza
Incubadora
Autoclave
Plancha de calentamiento
Procedimiento
46
3.8.8.1.
Preparación de medios de cultivo
TSB





Se pesó 30 g de del medio de cultivo.
Se dispersó en 1 litro de agua destilada.
Se calentó en una plancha de calentamiento hasta su total disolución.
Se distribuyó en tubos estériles.
Se esterilizó en autoclave.
TSA





Se pesó 40 g de del medio de cultivo.
Se dispersó en 1 litro de agua destilada.
Se calentó en una plancha de calentamiento hasta su total disolución.
Se esterilizó en autoclave.
Se distribuyó en cajas Petri en temperatura superior a 45ºC.
SAB





3.8.8.2.
Se pesó 65 g de del medio de cultivo.
Se dispersó en 1 litro de agua destilada.
Se calentó en una plancha de calentamiento hasta su total disolución.
Se esterilizó en autoclave.
Se distribuyó en cajas Petri en temperatura superior a 45ºC.
Prueba de determinación de actividad antimicrobiana en extractos fluidos
Codificación
Bacterias
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Levadura
Etanol Agua
70:30
B1
B2
B3
Candida albicans
L1
Parte planta
Tallos
47
Concentración
g/ml
0.75
50:50
3.8.8.3.



3.8.8.4.






3.8.8.5.
Raíz
Hojas
Tallos
Raíz
Hojas
0.625
0.2857
0.5357
0.666
0.0857
Preparación del inóculo
Se preparó tubos de ensayo con 10ml de solución buffer de fosfatos pH 7.2
Se tomó de una a dos colonias del microorganismo previamente aislado.
Se preparó la suspensión microbiana a una concentración de 0.5 McFarland.
Procedimiento de identificación de la actividad antimicrobiana de los extractos
fluidos.
En las cajas Petri que contenían los medios de cultivo preparados y distribuidos
anteriormente, se inoculó las respectivas bacterias y levaduras utilizadas en el ensayo.
Se extrajo el agar correspondiente a la formación de cada pozo.
Se añadió el extracto en cada pozo previamente codificado.
Las cajas Petri se llevó a incubación durante 24 horas para las bacterias y 3-5 días para
la levadura.
Se observó en que extractos existió la formación de halos de inhibición.
Por consiguiente se determinó la CMI de los extractos con dichos halos de inhibición
que demuestran la actividad antimicrobiana.
Procedimiento para la preparación del antimicrobiano fluconazol

3.8.8.6.







Se preparó siete concentraciones de fluconazol según el caso C1 : 42.00 , C2 : 21.00 ,
C3 : 10.50 , C4 :5.25, C5: 2.62 , C6: 1.31 ,C7 :0.65 mg/200uL las cuales se colocó por
triplicado en las cajas de agar .
Procedimiento de CMI por Difusión en Agar
Se prepararon 7 concentraciones de extracto: C1 : 42.00 , C2 : 21.00 , C3 : 10.50 , C4
:5.25, C5: 2.62 , C6: 1.31 ,C7 :0.65 mg/200uL
Se colocó por triplicado el extracto y la solución del antimicrobiano en las cajas Petri
previamente inoculadas con las bacterias y levadura.
Se extrajo el agar correspondiente a la formación de cada pozo
Se añadió el extracto y antimicrobiano, respectivamente, en cada pozo previamente
codificado.
Las cajas Petri se llevó a incubación durante 24 horas para las bacterias y 3-5 días para
la levadura.
Se observó y midió los halos de inhibición formados.
Se calculó la CMI para cada extracto.
48
3.9.
DISEÑO EXPERIMENTAL
Para evaluar los datos obtenidos en la investigación con respecto a las variables del estudio se
utilizó el software estadístico SPSS 19.0 para Windows y Excel.
Debido al tipo de ensayo en él se espera una respuesta de organismos biológicos, es importante
determinar si los resultados cumple o no con una distribución normal, para lo cual se utilizó las
pruebas de Kolmogorov - Smirnov o la prueba de Shapiro - Wilk (menor a 20 datos).
Pruebas de normalidad
Kolmogorov-Smirnova
Shapiro-Wilk
Estadístico
gl
Sig.
Estadístico
gl
RAIZ_70_30
,356
5
,037
,715
5
TALLO_70_30
,473
5
,001
,552
5
HOJAS_70_30
,299
5
,164
,850
5
RAIZ_50_50
,358
5
,035
,771
5
TALLO_50_50
,348
5
,048
,770
5
HOJAS_50_50
,366
5
,027
,723
5
Sig.
0,014
0,000
0,196
0,046
0,045
0,017
Los datos generan una distribución no paramétrica por lo que se analizó los mismos con la Prueba
de Kruskal-Wallis (3 o más variables) y Prueba de Mann-Whitney (2 variables).
Se plantearon las siguientes hipótesis para las pruebas estadísticas utilizadas en esta investigación:
3.9.1.
Comparación de extractos (70:30)
3.9.1.1.
Pruebas no paramétricas: Prueba de Kruskal-Wallis (70:30).
 Ho: las medias de los halos de inhibición de los extractos de raíz, tallo y hojas (órgano
vegetativo) obtenidos con solvente (70:30) son similares.

3.9.2.
Ha: las medias de los halos de inhibición de los extractos de raíz, tallo y hojas (órgano
vegetativo) obtenidos con solvente (70:30) no son similares.
Comparación de extractos (50:50)
3.9.2.1.
Pruebas no paramétricas: Prueba de Kruskal-Wallis 50:50
 Ho: las medias de los halos de inhibición de los extractos de raíz, tallo y hojas (órgano
vegetativo) obtenidos con solvente (50:50) son similares.

Ha: las medias de los halos de inhibición de los extractos de raíz, tallo y hojas (órgano
vegetativo) obtenidos con solvente (50:50) no son similares.
49
3.9.3.
3.9.3.1.
Comparación de órganos vegetativos (70:30) y (50:50)
Pruebas no paramétricas: Prueba de Prueba de Mann-Whitney: Raíz

Ho: las medias de los halos de inhibición de los extractos de raíz obtenidos con diferentes
solventes (70:30) y (50:50) son similares.

Ha: las medias de los halos de inhibición de los extractos de raíz, obtenidos con diferentes
solventes (70:30) y (50:50) no son similares.
3.9.3.2.
Pruebas no paramétricas: Prueba de Prueba de Mann-Whitney: Tallo
 Ho: las medias de los halos de inhibición de los extractos de tallo obtenidos con diferentes
solventes (70:30) y (50:50) son similares.

3.9.3.3.
Ha: las medias de los halos de inhibición de los extractos de tallo, obtenidos con diferentes
solventes (70:30) y (50:50) no son similares.
Pruebas no paramétricas: Prueba de Prueba de Mann-Whitney: Hojas

Ho: las medias de los halos de inhibición de los extractos de hojas obtenidos con diferentes
solvente (70:30) y (50:50) son similares.

Ha: las medias de los halos de inhibición de los extractos de hojas, obtenidos con
diferentes solventes (70:30) y (50:50) no son similares.
3.9.4.
3.9.4.1.
Evaluación de CMI en extractos (70:30) para raíz, hojay tallo
Prueba de Wilcoxon con cambios de signos.

Ho: No Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el
diámetro del halo.

Ha: Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el
diámetro del halo.
3.9.5.
3.9.5.1.

Evaluación de CMI en extractos (50:50) para raíz, hoja y tallo
Prueba de Wilcoxon con cambios de signos.
Ho: No Existe influencia en la aplicación de diferentes concentración de extracto sobre el
diámetro del halo.
50

Ha: Existe influencia en la aplicación de diferentes concentración de extracto sobre el
diámetro del halo.
51
CAPITULO IV
RESULTADOS
4.1.
RESULTADOS TAMIZAJE FITOQUÍMICO DE Petiveria alliacea L.
4.1.1.
Hojas
4.1.1.1.
Extracto etéreo de hojas
Tabla 1: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto etéreo de hojas
Metabolito
Secundario
Lactonas y
Coumarinas
Alcaloides
Alcaloides
Alcaloides
TriterpenosEsteroides
Ensayo
Resultado
Baljet
-
Dragendorff
Mayer
Wagner
LiebermannBurchard
+
Figura 8: Ensayo Liebermann- Burchard positivo para Triterpenos-Esteroides en extracto etéreo
de hojas.
4.1.1.2.
Extracto alcohólico de hojas
Tabla 2: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto alcohólico de hojas.
Metabolito
Secundario
Azucares reductores
Ensayo
Resultado
Catequinas
Resinas
Fehling
+
-
52
Lactonas
TriterpenosEsteroides
Saponinas
Fenoles y Taninos
Baljet
LiebermannBurchard
Espuma
Cloruro férrico
+
+
Aminoacidos
Quinonas
Flavonoides
Cardenólidos
Ninhidrina
Borntrager
Shinoda
Kedde
Antocianidina
Dragendorff
Mayer
Wagner
+
+
+
+
+
Alcaloides
Alcaloides
Alcaloides
+
+
Figura 9: Ensayo de catequinas positivo hojas extracto alcohólico.
Figura 10: Ensayo de Baljet positivo para Lactonas en extracto alcohólico de hojas
Figura 11: Ensayo de Liebermann- Burchard positivo para Triterpenos-Esteroides en extracto
alcohólico de hojas.
53
Figura 12: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto alcohólico de hojas.
Figura 13: Ensayo de cloruro férrico positivo para Fenoles y Taninos en extracto alcohólico de
hojas.
Figura 14: Ensayo de ninhidrina positivo para Aminoacidos en extracto alcohólico de hojas.
Figura 15: Ensayo de shinoda positivo para Flavonoides en extracto alcohólico de hojas.
Figura 16: Ensayo de antocianidina positivo en extracto alcohólico de hojas.
54
Figura 17: Ensayo de Dragendorff positivo para Alcaloides en extracto alcohólico de hojas.
Figura 18: Ensayo de Wagner positivo para Alcaloides en extracto alcohólico de hojas.
4.1.1.3.
Extracto acuoso de hojas.
Tabla 3: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto acuoso de hojas.
Metabolito
Secundario
Ensayo
Resultado
Azucares reductores
Fehling
+
Saponinas
Taninos
Flavonoides
Alcaloides
Espuma
Cloruro férrico
Shinoda
Dragendorff
+
-
Alcaloides
Alcaloides
Mayer
Wagner
Mucilagos
1 o 2 gotas de
ensayo de principios
amargos
+
+
+
55
Figura 19: Ensayo de Fehling positivo para Azucares Reductores en extracto acuoso hojas.
Figura 20: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto acuoso hojas.
Figura 21: Ensayo de Mayer positivo para Alcaloides en extracto acuoso hojas.
Figura 22: Ensayo de Wagner positivo para Alcaloides en extracto acuoso hojas.
4.1.1.4.
Ensayos complementarios de hojas.
Tabla 4: Resultados de tamizaje fitoquímico ensayos complementarios en hojas.
Metabolito
Secundario
Resultado
Glusidos
cianogénicos
-
56
Observaciones
Aceites
Hidrocarburos
Carotenos
4.1.2.
4.1.2.1.
+
-
Esencial
Tallo
Extracto alcohólico de tallo
Tabla 5: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto alcohólico de tallo.
Metabolito
Secundario
Ensayo
Resultado
Azucares reductores
Catequinas
Resinas
Fehling
+
-
Lactonas
Triterpenos y
Esteroides
Saponinas
Fenoles y Taninos
Baljet
LiebermannBurchard
Espuma
Cloruro férrico
+
+
++
+
Aminoácidos
Quinonas
Flavonoides
Cardenólidos
Ninhidrina
Borntrager
Shinoda
Kedde
Antocianidina
Dragendorff
Mayer
Wagner
+
+
+++
-
Alcaloides
Alcaloides
Alcaloides
Figura 23: Ensayo de Resinas positivo en extracto alcohólico de tallo.
57
Figura 24: Ensayo de Baljet positivo para Lactonas en extracto alcohólico de tallo.
Figura 25: Ensayo de Liebermann- Burchard positivo para Triterpenos y Esteroides en extracto
alcohólico de tallo.
Figura 26: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto alcohólico de tallo.
Figura 27: Ensayo de cloruro férrico positivo para Fenoles y Taninos en extracto alcohólico de
tallo.
Figura 28: Ensayo de ninhidrina positivo para Aminoácidos en extracto alcohólico de tallo.
58
Figura 29: Ensayo de antocianidina positivo en extracto alcohólico de tallo.
Figura 30: Ensayo de Dragendorff positivo para Alcaloides en extracto alcohólico de tallo.
4.1.2.2.
Extracto acuoso de tallo.
Tabla 6: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto acuoso de tallo.
Observaciones
Ensayo
Resultado
Azucares reductores
Fehling
+
Saponinas
Fenoles y Taninos
Espuma
Cloruro férrico
+
-
Flavonoides
Alcaloides
Alcaloides
Alcaloides
Shinoda
Dragendorff
Mayer
Wagner
Mucilagos
1 o 2 gotas de
ensayo de principios
amargos
+
59
Figura 31: Ensayo de Fehling positivo para Azucares Reductores en extracto acuoso de tallo.
Figura 32: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto acuoso de tallo.
4.1.2.3.
Ensayos complementarios de tallo.
Tabla 7: Resultados de tamizaje fitoquímico ensayos complementarios de tallo.
Metabolito
Secundario
Glusidos
cianogénicos
Aceites
Hidrocarburos
Carotenos
4.1.3.
Resultado
Observaciones
+
-
Esencial
Raíz
4.1.3.1.
Extracto alcohólico de raíz.
Tabla 8: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto alcohólico de raíz.
Metabolito
Secundario
Ensayo
Resultado
Catequinas
Resinas
+
Azucares reductores
Fehling
-
Lactonas
Triterpenos y
Esteroides
Baljet
LiebermannBurchard
+
60
Saponinas
Fenoles y Taninos
Espuma
Cloruro férrico
+
Aminoácidos
Quinonas
Flavonoides
Cardenólidos
Ninhidrina
Borntrager
Shinoda
Kedde
Antocianidina
Dragendorff
Mayer
Wagner
+
+
+++
-
Alcaloides
Alcaloides
Alcaloides
Figura 33: Ensayo de resinas positivo en extracto alcohólico de raíz.
Figura 34: Ensayo de Liebermann- Burchard positivo para Triterpenos y Esteroides en extracto
alcohólico de raíz.
Figura 35: Ensayo de cloruro férrico positivo para Fenoles y Taninos en extracto alcohólico de
raíz.
61
Figura 36: Ensayo de ninhidrina positivo para Aminoácidos en extracto alcohólico de raíz.
Figura 37: Ensayo de antocianidina positivo en extracto alcohólico de raíz.
Figura 38: Ensayo de Dragendorff positivo para Alcaloides en extracto alcohólico de raíz.
4.1.3.2.
Extracto acuoso de raíz.
Tabla 9: Resultados de tamizaje fitoquímico extracto acuoso de raíz.
Metabolito
Secundario
Azucares reductores
Ensayo
Resultado
Fehling
-
Saponinas
Fenoles y Taninos
Espuma
Cloruro férrico
+
-
Flavonoides
Shinoda
-
Alcaloides
Alcaloides
Alcaloides
Dragendorff
Mayer
Wagner
Mucilagos
++
+
-
62
1 o 2 gotas de
ensayo de principios
amargos
+
Figura 39: Ensayo de espuma positivo para Saponinas en extracto acuoso de raíz.
Figura 40: Ensayo de Dragendorff positivo para Alcaloides en extracto acuoso de raíz.
Figura 41: Ensayo de Wagner positivo para Alcaloides en extracto acuoso de raíz.
4.1.3.3.
Ensayos complementarios de raíz.
Tabla 10: Resultados de tamizaje fitoquímico ensayos complementarios de raíz.
ENSAYO
Resultado
Glusidos
cianogénicos
-
Aceites
Hidrocarburos
Carotenos
+
-
63
Observaciones
Secante
4.2.
PRUEBAS FÍSICAS
Tabla 11: Resultados de pruebas físicas de extractos fluidos.
Extractos
fluidos
Hojas 50:50
Hojas 70:30
Raíz 50:50
Raíz 70:30
Tallos 50:50
Tallos 70:30
pH
Densidad
7,024
7,142
6,778
6,589
6,315
6,109
0,9727
0,9920
0,9828
0,9467
0,9913
0,9809
Índice de
refracción
1,3480
1,3470
1,3470
1,3590
1,3425
1,3485
4.3.
PERFIL CROMATOGRÁFICO
Cromatografía en capa fina.
A continuación se detalla el orden de siembra de los extractos obtenidos a partir de órganos
vegetativos secos y frescos que servirá de guía para visualizar en las placas cromatografías.
Extractos secos: Orden de siembra
1. Etéreo de las hojas secas.
2. Hidroalcohólico de hojas secas.
3. Hidroalcohólico de raíces secas.
4. Hidroalcohólico de tallos secos.
5. Acuoso de hojas secas.
6. Acuoso de raíces secas.
7. Acuoso de tallos secos.
Figura 42:Extractos secos: Orden de siembra
Extractos frescos: Orden de siembra.
1. Raíces frescas Etanol: Agua (50:50).
2. Raíces frescas Etanol: Agua (70:30).
3. Tallos frescos Etanol: Agua (50:50).
64
4. Tallos frescos Etanol: Agua (70:30).
5. Hojas frescas Etanol: Agua (50:50).
6. Hojas frescas Etanol: Agua (70:30).
Figura 43: Extractos frescos: Orden de siembra
4.3.1. Ensayos para alcaloides
Fase móvil 1.
Fase estacionaria: Silica gel.
Fase móvil: Acetato de etilo: Metanol: Agua (100:13,5:10).
Revelador: Dragendorff (acético).
Resultado: No existió presencia de manchas color naranja después del revelado en la cromatografía
desarrollada.
65
Figura 44: Ensayo de alcaloides fase móvil 1, placas cromatográficas sin revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
Figura 45: Ensayo de alcaloides fase móvil 1, placas cromatográficas con revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca
Fase móvil 2
Fase estacionaria: Silica gel.
Fase móvil: Butanol:Ácido acético: Agua (10:1:3).
Revelador: Dragendorff (acético).
Resultado: No existió presencia de manchas color naranja después del revelado en la cromatografía
desarrollada.
66
Figura 46: Ensayo de alcaloides fase móvil 2, placas cromatográficas sin revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
Figura 47: Ensayo de alcaloides fase móvil 2, placas cromatográficas con revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
Fase móvil 3
Fase estacionaria: Silica gel.
Fase móvil: Cloroformo: Metanol (19:1).
Revelador: Dragendorff (acético).
Resultado: No existió presencia de manchas color naranja después del revelado en la cromatografía
desarrollada.
Figura 48: Ensayo de alcaloides fase móvil 3, placas cromatográficas sin revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
67
Figura 49: Ensayo de alcaloides fase móvil 3, placas cromatográficas con revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
4.3.2. Ensayo para aminoácidos
Fase móvil 1.
Fase estacionaria: Silica gel.
Fase móvil: Butanol: Ácido acético: Agua (10:1:3).
Revelador: Solución de ninhidrina 2%. Solubilizar 2g de ninhidrina en 100mL de agua destilada.
Resultado: Una vez pulverizado el revelador en la placa desarrollada existió la presencia de
manchas color violeta:
Tabla 12: Resultados de ensayos para aminoácidos con fase móvil 1.
Extracto
Hidroalcohólico de raíces secas
Hidroalcohólico de tallos secos
Acuoso de raíces secas
Acuoso de tallos secos
Mancha
1
1
1
1
68
Rf
0,2692
0,2564
0,2564
0,2564
Figura 50: Ensayo de aminoácidos fase móvil 1, placas cromatográfícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
Figura 51: Ensayo de aminoácidos fase móvil1, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
Fase móvil 2
Fase estacionaria: Silica gel.
Fase móvil: Butanol: Ácido acético: Agua (4:1:1).
Revelador: Solución de ninhidrina 2%. Solubilizar 2g de ninhidrina en 100mL de agua destilada.
69
Resultado: Una vez pulverizado el revelador en la placa desarrollada existió la presencia de
manchas color violeta:
Tabla 13: Resultados de ensayos para aminoácidos con fase móvil 2.
Extracto
Etéreo de las hojas secas
Hidroalcohólico de hojas secas
Hidroalcohólico de raíces secas
Hidroalcohólico de tallos secos
Acuoso de hojas secas
Acuoso de raíces secas
Acuoso de tallos secos
Raíces frescas Etanol: Agua (50:50)
Raíces frescas Etanol: Agua (70:30)
Tallos frescos Etanol: Agua (50:50)
Tallos frescos Etanol: Agua (70:30)
Hojas frescas Etanol: Agua (50:50)
Hojas frescas Etanol: Agua (70:30)
Mancha
1
1
2
1
2
1
2
3
1
2
1
2
1
2
1
1
1
1
1
1
Rf
0,1266
0.1013
0,1772
0,2152
0,4304
0,1013
0,1519
0,4304
0,0886
0,1899
0,3544
0,4557
0,1266
0,2278
0,1795
0,1795
0,2308
0,2179
0,2179
0,2179
Figura 52: Ensayo de aminoácidos fase móvil 2, placas cromatografícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
70
Figura 53: Ensayo de aminoácidos fase móvil2, placas cromatografícas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
4.3.3. Ensayo para esteroles.
Fase estacionaria: Silica gel.
Fase móvil: Éter de petróleo: Acetona (80:20).
Revelador: Lieberman Burchard. (5mL de anhídrido acético + 5mL de H2SO4 + 50mL de Etanol).
Resultado: Luego de pulverizar el revelador en la placa cromatográfica desarrollada, y calentarla a
110ºC por 10 minutos existió presencia de manchas fluorescentes en la longitud de onda de 365nm,
para los extractos:
Tabla 14: Resultados de ensayos para esteroles.
Extracto
Etéreo de las hojas secas
Mancha
Acuoso de raíces secas
Acuoso de tallos secos
Raíces frescas Etanol: Agua (50:50)
Raíces frescas Etanol: Agua (70:30)
Tallos frescos Etanol: Agua (50:50)
Tallos frescos Etanol: Agua (70:30)
Hojas frescas Etanol: Agua (50:50)
Hojas frescas Etanol: Agua (70:30)
71
1
2
3
4
5
1
1
1
1
1
1
1
1
Rf
0,0649
0,2857
0,4935
0,7403
0,8961
0,0390
0,0390
0,4744
0,6538
0,5128
0,5769
0,5000
0,8205
Figura 54: Ensayo de esteroles con una sola fase móvil, placas cromatografías sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
Figura 55: Ensayo de esteroles con una sola fase móvil, placas cromatografícas con revelador a
longitud de onda 365 nm para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
72
4.3.4. Ensayos para Flavonoides.
Fase móvil 1
Fase estacionaria: Silica gel
Fase móvil: Forestal (Ácido acético©: Ácido clorhídrico: Agua) (10:3:30)
Revelador: Acetato de plomo al 25% básico.
Resultado: Luego de pulverizar el revelador en la placa cromatográfica desarrollada, y observar a
365nm existió presencia de manchas fluorescentes para los extractos.
Tabla 15: Resultados de ensayos para flavonoides fase móvil 1.
Extracto
Etéreo de las hojas secas
Hidroalcohólico de hojas secas
Hidroalcohólico de tallos secos
Raíces frescas Etanol: Agua (50:50)
Raíces frescas Etanol: Agua (70:30)
Hojas frescas Etanol: Agua (50:50)
Hojas frescas Etanol: Agua (70:30)
Mancha
1
1
1
1
1
1
1
Rf
0,3846
0,7179
0,7179
0,9091
0,8961
0,7922
0,7532
Figura 56: Ensayo de flavonoides con fase móvil 1, placas cromatografícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
73
Figura 57: Ensayo de flavonoides con fase móvil 1, placas cromatografícas con revelador a
longitud de onda de 365 nm para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta
seca.
Fase móvil 2
Fase estacionaria: Silica gel
Fase móvil: BAW (Butanol: Ácido acético: Agua) (4:1:5).
Revelador: Acetato de plomo al 25% básico.
Resultado: Luego de pulverizar el revelador en la placa cromatográfica desarrollada, y observar a
365nm existió presencia de manchas fluorescentes para los extractos.
Tabla 16: Resultados de ensayos para flavonoides fase móvil 2.
Extracto
Etéreo de las hojas secas
Hidroalcohólico de hojas secas
Hidroalcohólico de tallos secos
Acuoso de hojas secas
Hojas frescas Etanol: Agua (50:50)
Hojas frescas Etanol: Agua (70:30)
74
Mancha
1
1
1
1
1
2
1
2
Rf
0,7324
0,2676
0,2817
0,2817
0,2778
0,8889
0,3065
0,9028
Figura 58: Ensayo de flavonoides con fase móvil 2, placas cromatografícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
Figura 59: Ensayo de flavonoides con fase móvil 2, placas cromatografícas con revelador a
longitud de onda de 365 nm para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta
seca.
Fase móvil 3
Fase estacionaria: Silica gel.
Fase móvil: Ácido acético 50% en agua.
Revelador: Acetato de plomo al 25% básico.
75
Resultado: Luego de pulverizar el revelador en la placa cromatográfica desarrollada, y observar a
365nm existió presencia de manchas fluorescentes para los extractos.
Tabla 17: Resultados de ensayos para flavonoides fase móvil 3.
Extracto
Etéreo de las hojas secas
Hidroalcohólico de hojas secas
Hidroalcohólico de raíces secas
Hidroalcohólico de tallos secos
Acuoso de hojas secas
Acuoso de raíces secas
Acuoso de tallos secos
Raíces frescas Etanol: Agua (50:50)
Raíces frescas Etanol: Agua (70:30)
Tallos frescos Etanol: Agua (50:50)
Tallos frescos Etanol: Agua (70:30)
Hojas frescas Etanol: Agua (50:50)
Hojas frescas Etanol: Agua (70:30)
Mancha
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Rf
0,3846
0,5897
0,6667
0,5641
0,6538
0,6667
0,6026
0,6133
0,6667
0,6933
0,6267
0,6533
0,6000
Figura 60: Ensayo de flavonoides con fase móvil 3, placas cromatografícas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
76
Figura 61: Ensayo de flavonoides con fase móvil 3, placas cromatografícas con revelador a
longitud de onda de 365 nm para extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta
seca.
4.3.5.
Ensayos para Naftoquinonas
Fase móvil 1
Fase estacionaria: Silica gel.
Fase móvil: Éter de petróleo: Acetato de etilo (7:3).
Revelador: Hidróxido de potasio al 10% en metanol.
Resultado: Luego de pulverizar el revelador en la placa cromatográfica desarrollada, se observó
presencia de manchas cafés:
Tabla 18: Resultados de ensayos para naftoquinonas fase móvil 1.
Extracto
Etéreo de las hojas secas
77
Mancha
1
2
3
4
5
Rf
0,2267
0,3867
0,4800
0,8133
0,9067
Figura 62: Ensayo de naftoquinonas con fase móvil 1, placas cromatografías sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca
Figura 63: Ensayo de naftoquinonas fase móvil1, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
Fase móvil 2
Fase estacionaria: Silica gel.
Fase móvil: Benceno: Éter de petróleo (2:1).
Revelador: Hidróxido de potasio al 10% en metanol.
Resultado: Luego de pulverizar el revelador en la placa cromatográfica desarrollada, se observó
presencia de manchas cafés.
78
Tabla 19: Resultados de ensayos para naftoquinonas fase móvil 2.
Extracto
Etéreo de las hojas secas
Mancha
1
2
3
4
5
6
Rf
0,1558
0,3117
0,4286
0,6104
0,6753
0,7922
Figura 64: Ensayo de naftoquinonas con fase móvil 2, placas cromatografías sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
Figura 65: Ensayo de naftoquinonas fase móvil 2, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
79
4.3.6.
Ensayo para Antraquinonas.
Fase estacionaria: Silica gel.
Fase móvil: Benceno: Acetato de etilo: Ácido acético (75:24:1).
Revelador: Hidróxido de potasio al 10% en metanol.
Resultado: Luego de pulverizar el revelador en la placa cromatográfica desarrollada, se observó
presencia de manchas cafés.
Tabla 20: Resultados de ensayos para antraquinonas.
Extracto
Etéreo de las hojas secas
Mancha
Hojas frescas Etanol: Agua (70:30)
1
2
3
1
Rf
0,2278
0,5570
0,6709
0,2533
Figura 66: Ensayo de antraquinonas, placas cromatográficas sin revelador para extractos obtenidos
a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
80
Figura 67: Ensayo de antraquinonas, placas cromatográficas con revelador para extractos obtenidos
a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
4.3.7.
Ensayo para Cardiotónicos
Fase móvil 1
Fase estacionaria: Silica gel.
Fase móvil: Cloroformo: Acetona (90:10).
Revelador: Reactivo Kedde: 1 g de ácido 3,5 dinitrobenzoico se disuelve en una mezcla de 50mL
de metanol y 50mL de hidróxido de potasio 2N.
Resultado: Luego de pulverizar el revelador en la placa cromatográfica desarrollada, se observó
presencia de manchas color violeta azulado:
Tabla 21: Resultados de ensayos para cardiotónicos fase móvil 1.
Extracto
Etéreo de las hojas secas
Hojas frescas Etanol: Agua (70:30)
81
Mancha
1
2
1
Rf
0,1600
0,9200
0,1447
Figura 68: Ensayo para cardiotónicos, placas cromatográficas sin revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
Figura 69: Ensayo para cardiotónicos, placas cromatográficas con revelador para extractos
obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
Fase Móvil 2
Fase estacionaria: Silica gel.
Fase móvil: Cloruro de metileno: Metanol: Agua (87:12:1).
Revelador: Reactivo Kedde: 1 g de ácido 3,5 dinitrobenzoico se disuelve en una mezcla de 50mL
de metanol y 50mL de hidróxido de potasio 2N.
Resultado: Luego de pulverizar el revelador en la placa cromatográfica desarrollada, se observó
presencia de manchas color violeta azulado:
82
Tabla 22: Resultados de ensayos para cardiotónicos fase móvil 2.
Extracto
Etéreo de las hojas secas
Hojas frescas Etanol: Agua (70:30)
Mancha
1
1
2
Rf
0,9733
0,6250
0,7375
Figura 70: Ensayo para cardiotónicos con fase móvil 2, placas cromatográficas sin revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
Figura 71: Ensayo para cardiotónicos con fase móvil 2, placas cromatográficas con revelador para
extractos obtenidos a partir de planta fresca y a partir de planta seca.
83
4.4.
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
Tabla 23: Codificación de bacterias.
Bacterias
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Código
B1
B2
B3
Tabla 24: Resultados de ensayo de actividad antibacteriana en función de la presencia de halo de
inhibición en extractos fluidos.
Planta
Partes
Etanol Agua
Concentraciones
mg/ml
Tallos
70:30
50:50
70:30
50:50
70:30
50:50
750
535.7
285.7
85.7
625
666
Hojas
Raíz
Volumen de
Extracto
ul
200
200
200
200
200
200
Presencia de
halo
B1 B2 B3
-
Figura 72: Ensayo de actividad antibacteriana para Pseudomonas aeruginosa en los seis extractos
fluidos.
84
Figura 73: Ensayo de actividad antibacteriana para Staphylococcus aureus en los seis extractos
fluidos.
Figura 74: Ensayo de actividad antibacteriana para Staphylococcus epidermidis en los seis
extractos fluidos.
85
Tabla 25: Codificación levadura.
Levadura
Candida albicans
Código
H1
Tabla 26: Resultados de ensayo de actividad antimicótica para Candida albicans en función de la
presencia de halo de inhibición.
Planta
Tallos
Hojas
Raíz
Partes
Concentraciones
Volumen
de
Extracto
Etanol Agua
mg/ml
ul
H1
70:30
750
200
+
50:50
535.7
200
+
70:30
285.7
200
+
50:50
85.7
200
+
70:30
625
200
+
50:50
666
200
+
Presencia de
halo
Figura 75: Ensayo de actividad antimicótica para Candida albicans en hojas para extractos fluidos
obtenidos a partir de etanol: agua (70:30) y etanol: agua (50:50).
86
Figura 76: Ensayo de actividad antimicótica para Candida albicans en tallos para extractos fluidos
obtenidos a partir de etanol: agua (70:30) y etanol: agua (50:50).
Figura 77: Ensayo de actividad antimicótica para Candida albicans en raíz para extractos fluidos
obtenidos a partir de etanol: agua (70:30) y etanol: agua (50:50).
En función de estos resultados se procede a realizar el ensayo de Concentración Mínima Inhibitoria
para Candida albicans.
87
4.5.
CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA
Tabla 27: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido
de raíces obtenido a partir de etanol: agua (70:30).
RAÍZ 70:30
C1
Diámetro del halo (cm)
Concentración
inicial S1
Volumen
tomado
Concentración
final S2
Concentración
sembrada S3
(mg/ml)
(ml)
(mg/ml)
(mg/200uL)
x1
x2
x3
625.000
3.36
210.00
42.00
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
C2
625.000
1.68
105.00
21.00
0.50
C3
625.000
0.84
52.50
10.50
0.50
0.40
0.70
0.53
C4
625.000
0.42
26.25
5.25
0.00
0.00
0.00
0.00
C5
625.000
0.21
13.13
2.63
0.00
0.00
0.00
0.00
C6
625.000
0.11
6.56
1.31
0.00
0.00
0.00
0.00
C7
625.000
0.05
3.28
0.66
0.00
0.00
0.00
0.00
Figura 78: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de raíz obtenido a partir de
etanol: agua (70:30) para las concentraciones uno, dos y tres.
88
Tabla 28: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido
de tallos obtenido a partir de etanol: agua (70:30).
TALLOS 70:30
Concentración Volumen Concentración Concentración
inicial S1
tomado
final S2
sembrada S3
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
Diámetro del halo (cm)
(mg/ml)
(ml)
(mg/ml)
(mg/200uL)
x1
x2
x3
750.000
750.000
750.000
750.000
750.000
750.000
750.000
2.80
1.40
0.70
0.35
0.18
0.09
0.04
210.00
105.00
52.50
26.25
13.13
6.53
3.23
42.00
21.00
10.50
5.25
2.63
1.31
0.65
0.90
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.40
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.50
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.60
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
Figura 79: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de tallos obtenido a partir
de etanol: agua (70:30) para la concentración uno.
Tabla 29: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido
de hojas obtenido a partir de etanol: agua (70:30).
HOJAS 70:30
C1
Diámetro del halo (cm)
Concentración
inicial S1
Volumen
tomado
Concentración
final S2
Concentración
sembrada S3
(mg/ml)
(ml)
(mg/ml)
(mg/200uL)
x1
x2
x3
285.700
7.35
209.99
42.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
0.70
0.90
C2
285.700
3.68
104.99
21.00
1.00
C3
285.700
1.84
52.48
10.50
0.20
0.20
0.20
0.20
C4
285.700
0.92
26.23
5.25
0.20
0.30
0.20
0.23
C5
285.700
0.46
13.13
2.63
0.00
0.00
0.00
0.00
C6
285.700
0.23
6.56
1.31
0.00
0.00
0.00
0.00
C7
285.700
0.11
3.28
0.66
0.00
0.00
0.00
0.00
89
Figura 80: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de hojas obtenido a partir
de etanol: agua (70:30) para las concentraciones uno, dos, tres y cuatro.
Tabla 30: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido
de raíces obtenido a partir de etanol: agua (50:50).
RAÍZ 50:50
C1
Diámetro del halo (cm)
Concentración
inicial S1
Volumen
tomado
Concentración
final S2
Concentración
sembrada S3
(mg/ml)
(ml)
(mg/ml)
(mg/200uL)
x1
x2
x3
666.000
3.15
209.99
42.00
0.50
0.50
0.60
0.53
0.30
0.40
0.33
C2
666.000
1.58
105.00
21.00
0.30
C3
666.000
0.79
52.50
10.50
0.00
0.00
0.00
0.00
C4
666.000
0.39
26.24
5.25
0.00
0.00
0.00
0.00
C5
666.000
0.20
13.12
2.62
0.00
0.00
0.00
0.00
C6
666.000
0.10
6.56
1.31
0.00
0.00
0.00
0.00
C7
666.000
0.05
3.26
0.65
0.00
0.00
0.00
0.00
90
Figura 81: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de raíz obtenido a partir
de etanol: agua (50:50) para las concentraciones uno, dos.
Tabla 31: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido
de tallos obtenido a partir de etanol: agua (50:50).
TALLOS 50:50
C1
Diámetro del halo (cm)
Concentración
inicial S1
Volumen
tomado
Concentración
final S2
Concentración
sembrada S3
(mg/ml)
(ml)
(mg/ml)
(mg/200uL)
x1
x2
x3
535.700
3.92
209.99
42.00
0.40
0.60
0.40
0.00
0.50
0.47
C2
535.700
1.96
105.00
21.00
0.20
C3
535.700
0.98
52.50
10.50
0.00
0.00
0.00
0.00
C4
535.700
0.49
26.25
5.25
0.00
0.00
0.00
0.00
C5
535.700
0.25
13.12
2.62
0.00
0.00
0.00
0.00
C6
535.700
0.12
6.54
1.31
0.00
0.00
0.00
0.00
C7
535.700
0.06
3.27
0.65
0.00
0.00
0.00
0.00
91
0.23
Figura 82: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de tallos obtenido a partir
de etanol: agua (50:50) para las concentraciones uno, dos.
Tabla 32: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido
de hojas obtenido a partir de etanol: agua (50:50).
HOJAS 50:50
Diámetro del halo (cm)
Concentración Volumen Concentración
inicial S1
tomado
final S2
Concentración
sembrada S3
(mg/ml)
(ml)
(mg/ml)
(mg/200uL)
x1
x2
x3
C1
85.700
---
---
---
---
---
---
---
C2
85.700
---
NA
---
---
---
---
---
10.28
0.30
0.30
0.00
0.20
0.20
C3
85.700
6.00
51.42
0.20
C4
85.700
3.00
25.71
5.14
0.30
C5
85.700
1.50
12.86
2.57
0.00
0.00
0.00
0.00
C6
85.700
0.75
6.43
1.29
0.00
0.00
0.00
0.00
C7
85.700
0.38
3.21
0.64
0.00
0.00
0.00
0.00
92
0.23
Figura 83: Halos de inhibición para Candida albicans en extracto fluido de hojas obtenido a partir
de etanol: agua (50:50) para las concentraciones tres y cuatro.
Tabla 33: Resultados de diámetros de halos de inhibición para Candida albicans con fluconazol.
Concentración
sembrada
(mg/200uL)
42
21
10.5
5.25
2.625
1.305
0.645
Diámetro del halo (cm)
x1
x2
x3
3
2.2
2.5
1
1
1
1
2.5
2
2.5
1
1
1
1
2.8
3.3
2.5
2.5
3
3
1
93
2.77
2.50
2.50
1.50
1.67
1.67
1.00
Figura 84: Halos de inhibición para Candida albicans con fluconazol para las concentraciones
uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis y siete.
4.5.1.
Resultados de evaluación estadística de CMI.
4.5.1.1.
Verificación de la Normalidad de los datos
Primeramente se verificó que las muestras tomadas provienen de una población con distribución
Normal, esto se realiza con las pruebas de Kolmogorov - Smirnov o con la prueba de Shapiro-Wilk
(menor a 20 datos), luego a demostrar:
Ho: Las muestras provienen de una población con distribución normal.
Ha: Las muestras no provienen de una población con distribución normal.
4.5.1.2.
Análisis de Normalidad
Tabla 34: Pruebas de normalidad
Pruebas de normalidad
Kolmogorov-Smirnova
Estadístico
gl
Shapiro-Wilk
Sig.
Estadístico
gl
Sig.
RAIZ_70_30
0,356
5
0,037
0,715
5
0,014
TALLO_70_30
0,473
5
0,001
0,552
5
0,000
HOJAS_70_30
0,299
5
0,164
0,850
5
0,196
RAIZ_50_50
0,358
5
0,035
0,771
5
0,046
TALLO_50_50
0,348
5
0,048
0,770
5
0,045
HOJAS_50_50
0,366
5
0,027
0,723
5
0,017
94
Resultado
De la prueba de Normalidad de Shapiro- Wilk, todos los valores de significancia son menores que
0,05 (95% de confiabilidad), excepto Hojas 70:30, luego rechazamos Ho: Las muestras no
provienen de una población con distribución Normal, excepto la muestra Hojas 70:30, con esto se
procede a realizar pruebas no paramétricas para determinar la semejanza de las medidas de
tendencia central
4.5.1.3.
Evaluación de Concentración mínima inhibitoria en Extractos (70:30).
Tabla 35: Resultados del extracto (70:30)
Concentración Diámetro promedio del Diámetro promedio del Diámetro promedio
sembrada S3
halo (cm) Raíz
halo (cm) Tallo
halo (cm) Hojas
(mg/200uL)
42,00
0,50
0,6
1.00
21,00
0,50
0
0,90
10,50
0,53
0
0,20
5,25
0
0
0,23
2,63
0
0
0
1,31
0
0
0
0,66
0
0
0
del
4.5.1.3.1. Raíz
Hipótesis
Ho: No Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el
diámetro del halo.
Ha: Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el diámetro
del halo.
95
4.5.1.3.1.1.
Prueba de Wilcoxon con cambios de signos.
RAIZ
Correlaciones
CONCENTRACI
ON
Rho de Spearman
CONCENTRACION
Coeficiente de correlación
Sig. (bilateral)
N
DIAMETRO
Coeficiente de correlación
Sig. (bilateral)
N
Estadísticos de prueba
DIAMETRO
1,000
-,866
.
,333
3
3
-,866
1,000
,333
.
3
3
a
DIAMETRO CONCENTRAC
ION
b
Z
-1,826
Sig. asintótica (bilateral)
,068
a. Prueba de Wilcoxon de los rangos con
signo
b. Se basa en rangos positivos.
Figura85: Prueba de Wilcoxon para raíz (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows.
Figura 86: Concentración versus diámetro para raíz (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows.
Resultado
De la prueba de Wilcoxon Sig = 0,068 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad, por lo tanto no
existe influencia de aplicación de diferentes concentraciones de extracto 70:30 de raíz sobre el
diámetro del halo de inhibición.
En el rango de concentración evaluado de 0,66 a 42 mg/200 uL, la concentración más baja en la que
se presenta halo de inhibición es: 10,50 mg/200uL, por debajo de esta concentración el crecimiento
de Candida albicans es evidente.
96
4.5.1.3.2.
Hojas
4.5.1.3.2.1.
Prueba de Wilcoxon con cambios de signos.
Hipótesis
Ho: No Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el
diámetro del halo.
Ha: Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el diámetro
del halo.
sobre el diámetro del halo.
Rangos
Rango promedio
Suma de rangos
DIAMETRO -
Rangos negativos
N
5
a
3,00
15,00
CONCENTRACION
Rangos positivos
0
b
,00
,00
Empates
0
Total
c
5
a. DIAMETRO < CONCENTRACION
b. DIAMETRO > CONCENTRACION
c. DIAMETRO = CONCENTRACION
Estadísticos de prueba
a
DIAMETRO CONCENTRAC
ION
b
Z
-2,023
Sig. asintótica (bilateral)
,043
a. Prueba de Wilcoxon de los rangos con
signo
b. Se basa en rangos positivos.
Figura 87: Prueba de Wilcoxon para hojas (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows.
Resultado
De la prueba de Wilcoxon Sig = 0,043 es menor que 0,05 (95% de confiabilidad, por lo tanto existe
influencia de aplicación de diferentes concentraciones de extracto 70:30 de hoja sobre el diámetro
del halo de inhibición.
En el rango de concentración evaluado de 0,66 a 42 mg/200 uL, la concentración más baja en la que
se presenta halo de inhibición es: 5.25 mg/200uL, por debajo de esta concentración el crecimiento
de Candida albicans es evidente.
97
Figura88: Concentración versus diámetro para hojas (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows.
4.5.1.3.3. Tallos
Hipótesis
Ho: No Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el
diámetro del halo.
Ha: Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el diámetro
del halo.
4.5.1.3.3.1.
Prueba de Wilcoxon con cambios de signos.
Rangos
Rango promedio
Suma de rangos
DIAMETRO -
Rangos negativos
N
5
a
3,00
15,00
CONCENTRACION
Rangos positivos
0
b
,00
,00
Empates
0
Total
c
5
a. DIAMETRO < CONCENTRACION
b. DIAMETRO > CONCENTRACION
c. DIAMETRO = CONCENTRACION
Estadísticos de prueba
a
DIAMETRO CONCENTRAC
ION
b
Z
-2,023
Sig. asintótica (bilateral)
,043
a. Prueba de Wilcoxon de los rangos con
signo
b. Se basa en rangos positivos.
Figura 89: Prueba de Wilcoxon para tallos (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows.
98
Resultado
De la prueba de Wilcoxon Sig = 0,043 es menor que 0,05 (95% de confiabilidad, por lo tanto existe
influencia de aplicación de diferentes concentraciones de extracto 70:30 de tallo sobre el diámetro
del halo de inhibición.
En el rango de concentración evaluado de 0,66 a 42 mg/200 uL, la concentración más baja en la que
se presenta halo de inhibición es: 42 mg/200uL, por debajo de esta concentración el crecimiento de
Candida albicans es evidente.
Figura 90: Concentración versus diámetro para tallos (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows.
4.5.1.4.
Evaluación de CMI en extractos (50:50)
Tabla 36: Resultados del extracto (50:50)
Concentración
sembrada S3
(mg/200uL)
42,00
21,00
10,50
5,25
2,63
1,31
0,66
Diámetro promedio del Diámetro promedio del Diámetro promedio
halo (cm) Raíz
halo (cm) Tallo
halo (cm) Hojas
0,53
0,33
0,00
0
0
0
0
0,47
0,23
0
0
0
0
0
99
na
na
0,20
0,23
0
0
0
del
4.5.1.4.1.
Raíz
Hipótesis
Ho: No Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el
diámetro del halo.
Ha: Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el diámetro
del halo.
4.5.1.4.1.1.
Prueba de Wilcoxon con cambios de signos.
Rangos
N
DIAMETRO
CONCENTRACION
- Rangos negativos
Rangos positivos
Empates
Rango promedio Suma de rangos
3
a
2,00
6,00
0
b
,00
,00
0
Total
c
3
a. DIAMETRO < CONCENTRACION
b. DIAMETRO > CONCENTRACION
c. DIAMETRO = CONCENTRACION
Estadísticos de prueba
a
DIAMETRO CONCENTRAC
ION
b
Z
-1,604
Sig. asintótica (bilateral)
,109
a. Prueba de Wilcoxon de los rangos con
signo
b. Se basa en rangos positivos.
Figura 91: Prueba de Wilcoxon para raíz (50:50) sistema SPSS 19.0 para Windows.
Resultados
De la prueba de Wilcoxon Sig = 0,109 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad, por lo tanto no
existe influencia de aplicación de diferentes concentraciones de extracto 50:50 de raíz sobre el
diámetro del halo de inhibición.
En el rango de concentración evaluado de 0,66 a 42 mg/200 uL, la concentración más baja en la que
se presenta halo de inhibición es: 21 mg/200uL, por debajo de esta concentración el crecimiento de
Candida albicans es evidente.
100
Figura 92: Concentración versus diámetro para raíz (50:50) sistema SPSS 19.0 para Windows.
4.5.1.4.2.
Hojas
Hipótesis
Ho: No Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el
diámetro del halo.
Ha: Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el diámetro
del halo.
4.5.1.4.2.1.
Prueba de Wilcoxon con cambios de signos.
Rangos
N
DIAMETRO
CONCENTRACION
-
Rango promedio
Suma de rangos
Rangos negativos
3
a
2,00
6,00
Rangos positivos
0
b
,00
,00
Empates
0
Total
c
3
a. DIAMETRO < CONCENTRACION
b. DIAMETRO > CONCENTRACION
c. DIAMETRO = CONCENTRACION
Estadísticos de prueba
a
DIAMETRO CONCENTRAC
ION
b
Z
-1,604
Sig. asintótica (bilateral)
,109
a. Prueba de Wilcoxon de los rangos con
signo
b. Se basa en rangos positivos.
Figura 93: Prueba de Wilcoxon para hojas (50:50) sistemaSPSS 19.0 para Windows.
101
Resultados
De la prueba de Wilcoxon Sig = 0,109 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad, por lo tanto no
existe influencia de aplicación de diferentes concentraciones de extracto 50:50 de hojas sobre el
diámetro del halo de inhibición.
En el rango de concentración evaluado de 0,66 a 42 mg/200 uL, la concentración más baja en la que
se presenta halo de inhibición es: 5.25 mg/200uL, por debajo de esta concentración el crecimiento
de Candida albicans es evidente.
Figura 94: Concentración versus diámetro para raíz (50:50) sistema SPSS 19.0 para Windows.
4.5.1.4.3. Tallo
Hipótesis
Ho: No Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el
diámetro del halo.
Ha: Existe influencia en la aplicación de diferentes concentraciones de extracto sobre el diámetro
del halo.
102
4.5.1.4.3.1.
Prueba de Wilcoxon con cambios de signos.
Rangos
N
Rango promedio Suma de rangos
DIAMETRO -
Rangos negativos
3
a
CONCENTRACION
Rangos positivos
0
b
Empates
0
Total
2,00
6,00
,00
,00
c
3
a. DIAMETRO < CONCENTRACION
b. DIAMETRO > CONCENTRACION
c. DIAMETRO = CONCENTRACION
Estadísticos de prueba
a
DIAMETRO CONCENTRAC
ION
b
Z
-1,604
Sig. asintótica (bilateral)
,109
a. Prueba de Wilcoxon de los rangos con
signo
b. Se basa en rangos positivos.
Figura 95: Prueba de Wilcoxon para tallos (50:50) sistema SPSS 19.0 para Windows.
Figura 96: Concentración versus diámetro para tallos (50:50) sistema SPSS 19.0 para Windows.
103
Resultados
De la prueba de Wilcoxon Sig = 0,109 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad, por lo tanto no
existe influencia de aplicación de diferentes concentraciones de extracto 50:50 de tallo sobre el
diámetro del halo de inhibición.
En el rango de concentración evaluado de 0,66 a 42 mg/200 uL, la concentración más baja en la que
se presenta halo de inhibición es: 21 mg/200uL, por debajo de esta concentración el crecimiento de
Candida albicans es evidente.
4.5.1.5.
Comparación de Extractos (70:30)
4.5.1.5.1. Prueba de Kruskal-Wallis (70:30).
Hipótesis
Ho: las medias de los halos de inhibición de los extractos de raíz, tallo y hojas (órgano vegetativo)
obtenidos con solvente (70:30) son similares.
Ha: las medias de los halos de inhibición de los extractos de raíz, tallo y hojas (órgano vegetativo)
obtenidos con solvente (70:30) no son similares.
Rangos
ORGANO VEGETATIVO
DIAMETRO
N
Rango promedio
RAIZ
3
4,00
TALLO
1
6,00
HOJAS
4
4,50
Total
8
Estadísticos de contraste
a,b
DIAMETRO
Chi-cuadrado
Gl
,506
2
Sig. asintót.
0,776
Figura 97: Prueba de Kruskal-Wallis para extractos (70:30) sistema SPSS 19.0 para Windows.
Resultados
De Prueba de Kruskal-Wallis Sig = 0,776 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad, luego las tres
muestras presentan valores estadísticamente similares
104
4.5.1.6.
Comparación de Extractos (50:50)
4.5.1.6.1. Prueba de Kruskal-Wallis 50:50
Hipótesis
Ho: las medias de los halos de inhibición de los extractos de raíz, tallo y hojas (órgano vegetativo)
obtenidos con solvente (50:50) son similares.
Ha: las medias de los halos de inhibición de los extractos de raíz, tallo y hojas (órgano vegetativo)
obtenidos
con
solvente
(50:50)
no
son
similares.
Rangos
ORGANO VEGETATIVO
DIAMETRO
N
Rango promedio
RAIZ
2
5,00
TALLO
2
3,75
HOJAS
2
1,75
Total
6
Estadísticos de contraste
a,b
DIAMETRO
Chi-cuadrado
Gl
Sig. asintót.
3,162
2
,206
Figura 98: Prueba de Kruskal-Wallis para extractos (50:50) sistema SPSS 19.0 para Windows.
Resultados
De la prueba de Prueba de Kruskal-Wallis Sig = 0,206 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad,
luego las tres muestras presentan valores estadísticamente similares.
En forma general no existe diferencia estadística entre las medidas de las tres muestras
4.5.1.7.
Comparación de órganos vegetativos (70:30) y (50:50).
4.5.1.7.1.
Prueba de Mann-Whitney: Raíz
Hipótesis
Ho: las medias de los halos de inhibición de los extractos de raíz obtenidos con diferentes solventes
(70:30) y (50:50) son similares.
105
Ha: las medias de los halos de inhibición de los extractos de raíz, obtenidos con diferentes
solventes (70:30) y (50:50) no son similares.
Rangos
CONCENTRACIONES
VALORES
N
Rango promedio Suma de rangos
Raíz 70 30
3
3,17
9,50
Raíz 50 50
2
2,75
5,50
Total
5
Estadísticos de contraste
a
VALORES
U de Mann-Whitney
2,500
W de Wilcoxon
5,500
Z
-,304
Sig. asintót. (bilateral)
Sig.
exacta
[2*(Sig.
,761
,800
b
unilateral)]
Figura 99: Prueba de Mann-Whitney para extractos de raíz (50:50) y (70:30) sistema SPSS 19.0
para Windows.
Resultados
De la prueba de Prueba de Mann-Whitney Sig = 0,80 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad,
luego las dos concentraciones presentan valores estadísticamente similares en la raíz.
4.5.1.7.2.
Prueba de Mann-Whitney: Tallo
Hipótesis
Ho: las medias de los halos de inhibición de los extractos de tallo obtenidos con diferentes solventes
(70:30) y (50:50) son similares.
Ha: las medias de los halos de inhibición de los extractos de tallo, obtenidos con diferentes
solventes (70:30) y (50:50) no son similares.
106
Rangos
CONCENTRACIONES
VALORES
N
Rango promedio Suma de rangos
Tallo 70 30
1
3,00
3,00
Tallo 50 50
2
1,50
3,00
Total
3
Estadísticos de contraste
a
VALORES
U de Mann-Whitney
,000
W de Wilcoxon
3,000
Z
-1,225
Sig. asintót. (bilateral)
Sig.
exacta
[2*(Sig.
,221
0,667
b
unilateral)]
Figura 100: Prueba de Mann-Whitney para extractos de tallo (50:50) y (70:30) sistema SPSS 19.0
para Windows.
Resultados
De la prueba de Prueba de Mann-Whitney Sig = 0,667 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad,
luego las dos concentraciones presentan valores estadísticamente similares en el Tallo.
4.5.1.7.3.
Prueba de Mann-Whitney: Hojas
Hipótesis
Ho: las medias de los halos de inhibición de los extractos de hojas obtenidos con diferentes
solventes (70:30) y (50:50) son similares.
Ha: las medias de los halos de inhibición de los extractos de hojas, obtenidos con diferentes
solventes (70:30) y (50:50) no son similares.
107
Rangos
CONCENTRACIONES
VALORES
N
Rango promedio Suma de rangos
Hoja 70 30
4
4,00
16,00
Hoja 50 50
2
2,50
5,00
Total
6
Estadísticos de contraste
a
VALORES
U de Mann-Whitney
2,000
W de Wilcoxon
5,000
Z
-,953
Sig. asintót. (bilateral)
Sig.
exacta
[2*(Sig.
,340
,533
b
unilateral)]
Figura 101: Prueba de Mann-Whitney para extractos de hojas (50:50) y (70:30) sistema SPSS 19.0
para Windows.
Resultados
De la prueba de Prueba de Mann-Whitney Sig = 0,533 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad,
luego las dos concentraciones presentan valores estadísticamente similares en las hojas.
108
CAPITULO V
CONCLUSIONES Y DISCUSIONES
Conclusiones.
1. El tamizaje fitoquímico del extracto etéreo y alcohólico de hojas, tallo y raíz de Petiveria
alliacea L., indicó poseer cantidad baja de triterpenos-esteroides.
2. El tamizaje fitoquímico del extracto alcohólico de hojas, tallo y raíz de Petiveria alliacea
L., indicó poseer cantidad baja de aminoácidos, fenoles, taninos y antocianidinas.
3. El tamizaje fitoquímico del extracto alcohólico de tallo y raíz de Petiveria alliacea L.,
indicó poseer cantidad baja de Resinas.
4. El tamizaje fitoquímico del extracto alcohólico de hojas, tallo de Petiveria alliacea L.,
indicó poseer cantidad baja de lactonas y flavonoides.
5. El tamizaje fitoquímico del extracto acuoso de hojas, tallo y raíz de Petiveria alliacea L.,
indicó poseer cantidad baja de saponinas y principios Amargos.
6. El tamizaje fitoquímico del extracto acuoso de hojas y tallo de Petiveria alliacea L., indicó
poseer cantidad baja de azucares reductores.
7. La cromatografía de capa fina en tres fases móviles diferentes para todos los extractos de
hojas, raíz y tallo de Petiveria alliacea L., indicó la ausencia de alcaloides.
8. Mediante el perfil cromatográfico se determinó la presencia de aminoácidos en hojas, raíz y
tallo de Petiveria alliacea L., presentando manchas para todos los extractos utilizando la
fase móvil Butanol: Ácido acético: Agua (4:1:1).Las manchas que presentan mayor
intensidad corresponden a los extractos de raíces frescas etanol:agua (50:50) y raíces
frescas etanol: agua (70:30).
9. Mediante cromatografía de capa fina se determinó la presencia de flavonoides en hojas, raíz
y tallo en Petiveria alliacea L. en todos los extractos.
10. Mediante cromatografía de capa fina se determinó la presencia de esteroles en hojas, raíz y
tallo en Petiveria alliacea L., en los siguientes extractos









Etéreo de las hojas secas.
Acuoso de raíces secas.
Acuoso de tallos secos.
Raíces frescas Etanol: Agua (50:50).
Raíces frescas Etanol: Agua (70:30).
Tallos frescos Etanol: Agua (50:50).
Tallos frescos Etanol: Agua (70:30).
Hojas frescas Etanol: Agua (50:50).
Hojas frescas Etanol: Agua (70:30).
11. Mediante cromatografía de capa fina se determinó la presencia de naftoquinonas en hojas
de Petiveria alliacea L., utilizando dos fases móviles diferentes para el siguiente extracto:

Etéreo de las hojas secas.
12. Mediante cromatografía de capa fina se determinó la presencia de antraquinonas y
cardiotónicos en hojas de Petiveria alliacea L. para los siguientes extractos :


Etéreo de las hojas secas.
Hojas frescas Etanol: Agua (70:30).
109
13. La levadura Candida albicans presento sensibilidad a los 6 tipos de extractos de Petiveria
alliacea L. ensayados al generar halos de inhibición.
14. Las bacterias Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas
aeruginosa son resistentes a los 6 tipos de extractos de Petiveria alliacea L. ensayados, al
no generarse halos de inhibición.
Lo anterior permite afirmar que los seis extractos de Petiveria alliacea L .ensayados tienen
actividad antimicótica y carecen de actividad antibacteriana.
15. La prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis indicó que no hay influencia del órgano
vegetativo sobre el diámetro del halo de inhibición.
16. La prueba no paramétrica de Mann-Whitney indicó que no hay influencia de los extractos
(70:30)y (50:50) sobre el diámetro del halo de inhibición.
17. La prueba no paramétrica de Wilcoxon indicó que no hay influencia de la aplicación de
diferentes concentraciones de extracto 70:30 de raíz sobre el diámetro del halo de
inhibición.
18. La prueba no paramétrica de Wilcoxon indicó que hay influencia de la aplicación de
diferentes concentraciones de extracto 70:30 de hoja y tallo sobre el diámetro del halo de
inhibición.
19. La prueba no paramétrica de Wilcoxon indicó que no hay influencia de la aplicación de
diferentes concentraciones de extracto 50:50 de raíz, hoja y tallo sobre el diámetro del halo
de inhibición.
20. La concentración mínima inhibitoria para extracto de raíz (70:30) de Petiveria alliacea L
es: 10,50 mg/200uL.
21. La concentración mínima inhibitoria para extracto de hoja (70:30) de Petiveria alliacea L
es: 5.25 mg/200uL.
22. La concentración mínima inhibitoria para extracto de tallo (70:30) de Petiveria alliacea L
es: 42.0 mg/200uL.
23. La concentración mínima inhibitoria para extracto de raíz (50:50) de Petiveria alliacea L
es: 21.0 mg/200uL.
24. La concentración mínima inhibitoria para extracto de hoja (50:50) de Petiveria alliacea L
es: 5.25 mg/200uL.
25. La concentración mínima inhibitoria para extracto de tallo (50:50) de Petiveria alliacea L
es: 21.0 mg/200uL.
Discusiones.
Para verificar los resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico de los extractos alcohólicos y
acuosos de hojas, raíz y tallo de Petiveria alliacea L., que indicó la presencia de alcaloides, se
realizó una cromatografía de capa fina en tres fases móviles diferentes y no se presentó manchas de
color naranja después del revelado en los siguientes extractos:






Etéreo de las hojas secas.
Hidroalcohólico de hojas secas.
Hidroalcohólico de raíces secas.
Hidroalcohólico de tallos secos.
Acuoso de hojas secas.
Acuoso de raíces secas.
110
 Acuoso de tallos secos.
 Raíces frescas Etanol: Agua (50:50).
 Raíces frescas Etanol: Agua (70:30).
 Tallos frescos Etanol: Agua (50:50).
 Tallos frescos Etanol: Agua (70:30).
 Hojas frescas Etanol: Agua (50:50).
 Hojas frescas Etanol: Agua (70:30).
En función de lo anterior se determinó la ausencia de alcaloides en hojas raíz y tallo de Petiveria
alliacea L., es posible que el falso positivo se manifieste por la presencia de Nitrógeno que es un
elemento común en las estructuras de aminoácidos y alcaloides.
Para verificar los resultados del tamizaje fitoquímico que indicó la presencia de aminoácidos, se
realizó la cromatografía de capa fina y se determinó la presencia de aminoácidos en hojas, raíz y
tallo en Petiveria alliacea L., utilizando dos fases móviles diferentes ya que una vez pulverizado el
revelador en la placa desarrollada existió la presencia de manchas color violeta para los siguientes
extractos:













Etéreo de las hojas secas.
Hidroalcohólico de hojas secas.
Hidroalcohólico de raíces secas.
Hidroalcohólico de tallos secos.
Acuoso de hojas secas.
Acuoso de raíces secas.
Acuoso de tallos secos.
Raíces frescas Etanol: Agua (50:50).
Raíces frescas Etanol: Agua (70:30).
Tallos frescos Etanol: Agua (50:50).
Tallos frescos Etanol: Agua (70:30).
Hojas frescas Etanol: Agua (50:50).
Hojas frescas Etanol: Agua (70:30).
Las manchas que presentan mayor intensidad corresponden a los siguientes extractos:


Raíces frescas Etanol: Agua (50:50).
Raíces frescas Etanol: Agua (70:30).
En función de lo anterior se puede mencionar que este metabolito secundario se encuentra presente
en hojas, raíz y tallo de Petiveria alliacea L. y que por la intensidad de las manchas resultantes se
concentra en mayor cantidad en la raíz.
Se conoce que los precursores de los compuestos con actividad antimicrobiana de Petiveria alliacea
son algunos aminoácidos que contienen azufre. En las raíces de esta planta se han aislado cinco
aminoácidos en cantidades variables entre los que se encuentran la S-metil-cisteína, S-etil-cisteína y
S-propil-cisteína. Estos tres aminoácidos han sido encontrados en cantidades muy bajas en las raíces
de esta planta (< 3μg/g de peso fresco). Sin embargo, las concentraciones reportadas en este órgano
de la S-(2-hidroxietil) cisteína (0,2 mg/g de peso fresco) y de la S-bencil-cisteína (<10μg/g de peso
fresco) indican que a partir de estos dos aminoácidos, se obtienen otros dos compuestos conocidos
trivialmente como 6-hidroxietina y petiverina que constituyen los principales precursores de los
111
metabolitos secundarios a los que se le atribuye la actividad antimicrobiana. (Sariego; Marin;
Ochoa; Viera, 2013).
En función de lo anterior se puede indicar que la actividad antimicótica se la puede atribuir a los
aminoácidos que detalla la literatura investigada.
Concentración mínima inhibitoria
Raíz
La concentración mínima inhibitoria para extracto de raíz (70:30) de Petiveria alliacea L es: 10,50
mg/200uL.
La concentración mínima inhibitoria para extracto de raíz (50:50) de Petiveria alliacea L es: 21.0
mg/200uL.
De la prueba de Wilcoxon Sig = 0,068 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad, por lo tanto no
existe influencia de la aplicación de diferentes concentraciones de extracto70:30 de raíz sobre el
diámetro del halo de inhibición.
De la prueba de Wilcoxon Sig = 0,109 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad, por lo tanto no
existe influencia de aplicación de diferentes concentraciones de extracto 50:50 de raíz sobre el
diámetro del halo de inhibición.
En función de lo anterior se puede indicar que en el rango de concentración evaluado de 0,66 a 42
mg/200 uL, por encima de las concentraciones mínimas inhibitorias detalladas anteriormente el
valor del diámetro de halo presenta valores estadísticamente similares por lo que no es necesario
incrementar la concentración por sobre la concentración mínima inhibitoria para incrementar el
halo de inhibición, por debajo de esta concentración el crecimiento de Candida albicans es
evidente.
Hoja
La concentración mínima inhibitoria para extracto de hoja (70:30) de Petiveria alliacea L es: 5.25
mg/200uL.
De la prueba de Wilcoxon Sig = 0,043 es menor que 0,05 (95% de confiabilidad, por lo tanto existe
influencia de aplicación de diferentes concentraciones de extracto 70:30 de hoja sobre el diámetro
del halo de inhibición.
En función de lo anterior se puede indicar que en el rango de concentración evaluado de 0,66 a 42
mg/200 uL, por encima de la concentración mínima inhibitoria detallada anteriormente el valor del
diámetro de halo no presenta valores estadísticamente similares por lo que es necesario incrementar
la concentración por sobre la concentración mínima inhibitoria para incrementar el halo de
inhibición, por debajo de esta concentración el crecimiento de Candida albicans es evidente.
La concentración mínima inhibitoria para extracto de hoja (50:50) de Petiveria alliacea L es: 5.25
mg/200uL.
De la prueba de Wilcoxon Sig = 0,109 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad, por lo tanto no
existe influencia de aplicación de diferentes concentraciones de extracto 50:50 de hojas sobre el
diámetro del halo de inhibición.
112
En función de lo anterior se puede indicar que en el rango de concentración evaluado de 0,66 a 42
mg/200 uL, por encima de la concentración mínima inhibitoria detallada anteriormente el valor del
diámetro de halo presenta valores estadísticamente similares por lo que no es necesario incrementar
la concentración por sobre la concentración mínima inhibitoria para incrementar el halo de
inhibición, por debajo de esta concentración el crecimiento de Candida albicans es evidente.
Tallo
La concentración mínima inhibitoria para extracto de tallo (70:30) de Petiveria alliacea L es: 42.0
mg/200uL.
De la prueba de Wilcoxon Sig = 0,109 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad, por lo tanto no
existe influencia de aplicación de diferentes concentraciones de extracto 70:30 de tallo sobre el
diámetro del halo de inhibición.
En el rango de concentración evaluado de 0,66 a 42 mg/200 uL, la concentración mínima inhibitoria
corresponde al valor superior del rango, por lo que la comparación no es necesaria.
La concentración mínima inhibitoria para extracto de tallo (50:50) de Petiveria alliacea L es: 21.0
mg/200uL
De la prueba de Wilcoxon Sig = 0,109 es mayor que 0,05 (95% de confiabilidad, por lo tanto no
existe influencia de aplicación de diferentes concentraciones de extracto 50:50 de tallo sobre el
diámetro del halo de inhibición.
En función de lo anterior se puede indicar que en el rango de concentración evaluado de 0,66 a 42
mg/200 uL, por encima de la concentración mínima inhibitoria detallada anteriormente el valor del
diámetro de halo presenta valores estadísticamente similares por lo que no es necesario incrementar
la concentración por sobre la concentración mínima inhibitoria para incrementar el halo de
inhibición, por debajo de esta concentración el crecimiento de Candida albicans es evidente.
113
CAPITULO VI
RECOMENDACIONES
Se recomienda en función de los resultados de esta investigación una vez demostrada la actividad
de Petiveria alliacea L y las concentraciones mínimas inhibitorias de los órganos vegetativos sobre
Candida albicans la realización de una formulación por vía tópica para la elaboración de un
producto natural.
114
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