Download fisiopatologia endocrina fasciculo 7

FISIOPATOLOGIA
ENDOCRINA:
Bioquímica y Métodos
Diagnósticos”
Directores:
M.A. Pisarev (CNEA, UBA, CONICET)
y R.S. Calandra (UNLP, CONICET)
Coordinadores: M.O. Suescun (UNLP, CONICET)
y G. Juvenal (CNEA, CONICET)
Química Montpellier
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
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Los conceptos que se expresan en
esta publicación son exclusiva responsabilidad
de su autor y no involucran necesariamente
el pensamiento del editor.
Química Montpellier
SEPARATA MONTPELLIER
Publicada por Química Montpellier S.A.
Virrey Liniers 673 - Buenos Aires
Director: Dr. Héctor Ascierto
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Introducción
Con este primer fascículo se inicia la publicación de una serie que intenta abarcar
los conceptos más actualizados acerca de la Fisiopatología Endocrinológica, en
sus aspectos bioquímicos y diagnósticos. Esta Especialidad ha realizado avances
notables, en función de los nuevos conocimientos que incluyen la Bioquímica,
la Biología Celular y Molecular y los Métodos Diagnósticos no invasivos, entre
otros.
Esta Obra está basada en la Maestría del mismo nombre que se dicta a nivel de
postgrado. El creciente y constante interés y apoyo de numerosos colegas nos
ha impulsado a emprender esta tarea, que no sería posible sin la invalorable
colaboración de los numerosos co-autores, que son al mismo tiempo docentes
de la Maestría. La excelencia académica de los co-autores y docentes, ha sido
reconocida por la CONEAU, otorgándole la Acreeditación y la Categorización
Máxima, el Ministerio Nacional de Educación validando el Título a nivel nacional
y los Colegios Médicos y Bioquímicos de la Provincia de Buenos Aires.
Para la concreción de este esfuerzo ha sido de fundamental importancia el
entusiasta apoyo que nos brindaron las autoridades de Química Montpellier S.A.,
sin cuya participación esta Obra no se habría concretado.
A todos ellos nuestro más sincero y profundo agradecimiento.
Química Montpellier
Pero esta Obra, no tendría sentido si no contáramos con la cálida recepción de
nuestros colegas de las diferentes profesiones y estudiantes avanzados vinculados
a la Endocrinología. Es a ellos a quienes está dedicada la misma.
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FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Contenido de la Obra:
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Principios del Metabolismo Celular.
Principios de Bioquímica y Genética Molecular en Eucariotes. Modelos Transgénicos.
Bases de la Genética en Endocrinología. Genoma.
Bases de la Inmunología en Endocrinología. Interacciones Inmuno-Endócrinas.
Introducción a la Endocrinología. Estructura y Función de las Hormonas. Secreción,
Producción, Cinética y Transporte Hormonal. Cronobiología. en Endocrinología.
Hormonas. Mecanismos de acción hormonal. Evaluación de un sistema hormonareceptor.
Exploración de la Función endócrina. Tipos de Ensayos. Control de Calidad. Tests
Funcionales. Radioisótopos. Valores normales y Pruebas Funcionales.
Hormonas Digestivas. Fisiopatología y Diagnóstico.
Bases Moleculares de la Tumorigénesis. Oncogenes. Factores de Crecimiento.
Neuroendocrinología. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.
Corteza Suprarrenal. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.
Metabolismo Hidrosalino. Hormonas: Hipotálamicas, Adrenal y
Cardiovasculares. Fisiopatología y su Diagnóstico.
Médula suprarrenal. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.
Tiroides. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico
Metabolismo del Calcio. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su
Diagnóstico.
Función Reproductiva Femenina. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico
Menopausia y Climaterio. Riesgos , Complicaciones y Laboratorio
Función Reproductiva Masculina. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.
Biología de la Reproducción. Fertilización e Implantación. Reproducción Asistida.
Anticoncepción. Unidad Fetoplacentaria.
Endocrinología Pediátrica. Desarrollo Normal. Fisiopatología y su Diagnóstico.
Cànceres Hormonodependientes. Fisiopatología y su Diagnóstico.
Páncreas Endocrino. Bases Fisiológicas. Fisiopatología y su Diagnóstico.
Trastornos de la Alimentación. Tejido Adiposo. Fisiopatología. Obesidad, Anorexia y
Bulimia.
Imágenes en el Diagnóstico de la Patología Endocrina.
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Fascículo I :
*Principios del
Metabolismo Celular
Silvia I. Gonzalez-Calvar
(IBYME, Fac de Medicina, UBA)
*Principios de Bioquímica y
Genética Molecular en Eucariotes
Víctor Romanowski, Daniel H. Grasso,
Mario O. Aguilar y Antonio Lagares
(IBBM, Fac Ciencias Exactas, UNLP y CONICET)
*Modelos Transgénicos
Susana B. Rulli
*Principios de Genética Médica.
Nestor O. Bianchi (1,2) y Alejandro D. Bolzán (1,3,4)
(IMBICE, CONICET, CICPBA, Fac Ciencias
Naturales y Museo, UNLP)
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(IBYME, CONICET)
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FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Principios del
Metabolismo Celular
Silvia Inés González Calvar
Aspectos generales
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Una característica esencial de los organismos
multicelulares es la diferenciación celular y la
distribución de funciones. Por lo tanto, diferentes
tejidos tienen requerimientos energéticos
y patrones metabólicos característicos. Las
señales hormonales integran y coordinan las
actividades metabólicas de los distintos órganos
de manera que regulan la distribución de
precursores y sustratos energéticos.
63 •
El mantenimiento de la vida requiere el
aporte constante de combustibles para los
tejidos del organismo. Estos combustibles
se usan para generar energía y preservar la
estructura y funcionamiento de cada uno de
los tejidos y órganos. Para que un individuo
sobreviva, durante la fase de alimentación
debe acumular el exceso calórico en forma de
glucógeno y triglicéridos (TG) a fin de utilizar
esas reservas durante el ayuno. Este aporte
calórico se obtiene a partir de la ingesta de
alimentos, los que son utilizados, directamente
o bien a través de la transformación en otras
sustancias, para obtener energía, reemplazar
las membranas celulares, organelas y diversos
componentes que sufren un recambio durante
el proceso de la vida. La fase anabólica
comienza con la ingestión de alimentos y
se manifiesta durante varias horas. La fase
catabólica usualmente comienza a observarse
pocas horas después de la última ingesta y se
prolonga hasta que el individuo se alimente
nuevamente. Durante esta fase el organismo
Química Montpellier
cambia el uso de combustibles exógenos a
endógenos; un cambio que se evidencia por
la movilización de sustratos a partir de su
almacenamiento en hígado o tejido adiposo.
Estas moléculas combustibles se oxidan a
dióxido de carbono y agua en presencia de
oxígeno. La energía liberada en el proceso
se conserva en enlaces de alta energía en las
moléculas de adenosin-tri-fosfato (ATP), para
ser usada en los procesos que la requieran.
Así, permanentemente, las fases anabólicas y
catabólicas alternan una con otra.
Los mecanismos regulatorios dirigen los
compuestos a través de las vías metabólicas
involucradas en almacenar y utilizar estas
moléculas combustibles. Estos mecanismos
están controlados por las necesidades de
energía del organismo, la concentración
de los combustibles disponibles y ciertas
hormonas (insulina, glucagon, catecolaminas,
glucocorticoides). Los cambios en algunos
de estos parámetros afectarán a los distintos
caminos metabólicos mediante la regulación
y control de la actividad de las enzimas claves
de los mismos. La función de este complejo
mecanismo es producir una respuesta graduada
frente a un estímulo dado y además, proveer
sensibilidad a diferentes tipos de estímulos,
de manera tal que se forme un flujo, a través
de esa vía, que cubra los requerimientos del
organismo.
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
La estrategia del metabolismo es formar
ATP, poder reductor y unidades estructurales
pequeñas para la síntesis de macromoléculas.
La molécula de ATP posee un alto potencial
transferencia de energía, lo que permite realizar
diferentes trabajos celulares: contracción
muscular, transporte activo, y biosíntesis. El ATP
es generado, principalmente, por la oxidación
de moléculas combustibles tales como glucosa,
ácidos grasos (AG) y aminoácidos (AA). El
intermediario común en la mayoría de estas
oxidaciones es la acetil Coenzima A (AcCoA).
La unidad acetilo es completamente oxidada a
dióxido de carbono por el Ciclo de los Ácidos
Tricarboxílicos Cítrico o Ciclo de Krebs (CTC)
con la concomitante formación de NADH y
FADH2. Estos cofactores reducidos transfieren
sus electrones a la Cadena Respiratoria (CR)
localizada en la membrana mitocondrial interna.
El flujo subsecuente de electrones desde NADH
y FADH2 a través de los distintos citocromos
hasta el oxígeno establece un bombeo de
protones hacia el espacio intermembrana
mitocondrial, generando un gradiente de
protones a ambos lados de dicha membrana.
La energía contenida en esta gradiente es
captada por ATPasa (también denominada
ATP sintasa) la que sintetiza ATP en un proceso
denominado Fosforilación Oxidativa (FO).
La glicólisis es otro proceso generador de
ATP, aunque en menor proporción por un
mecanismo denominado fosforilación a
nivel de sustrato, sin requerimiento de
oxígeno. Un aumento en los niveles de ATP
o NADH disminuye las actividades de las
enzimas regulatorias del CTC: citrato sintetasa,
isocitrato deshidrogenasa y alfa ceto glutarato
deshidrogenasa. El CTC tiene tanto un rol
catabólico como anabólico, ya que no sólo
degrada AcCoA sino que también provee
intermediarios para la biosíntesis, por ej. succinil
CoA para la síntesis del hemo.
Los caminos de biosíntesis y degradación
son casi siempre distintos. Las moléculas son
sintetizadas y degradadas por un conjunto
diferente de enzimas. Esta separación de
ambas vías metabólicas contribuye a un control
meta-bólico más efectivo ya que son reguladas
de manera diferencial y contrapuesta. Así,
las velocidades de las vías metabólicas son
reguladas por las actividades de las enzimas
claves y no por la ley de acción de masas.
REGULACIÓN
ENZIMATICA
La compleja red de reacciones en una célula
esta muy finamente regulada y coordinada por
diferentes mecanismos
1) Compartimentalización: glicólisis, ciclo de
las pentosas y la síntesis de AG tienen lugar en
el citosol, mientras que la oxidación de los AG,
el CTC y la FO ocurren dentro de la mitocondria.
Algunos procesos, como la gluconeogénesis y
la síntesis de urea, ocurren entre ambos compartimientos. El destino de ciertas moléculas
dependerá en qué compartimiento se encuentre.
Por ejemplo, los AG son transportados hacia la
matriz mitocondrial como esteres de carnitina,
donde luego son rápidamente degradados. En
contraste, en el citosol, los AG son esterificados
o exportados. Es importante recordar que la
membrana mitocondrial interna es altamente
selectiva.
2.-Interacciones alostéricas: ciertas enzimas
poseen, además del sitio catalítico, otro sitio,
denominado alostérico, que puede unirse
con diferentes compuestos (efectores). Esta
unión causa un cambio conformacional en el
sitio activo de modo tal que la enzima puede
presentar mayor (efector positivo o activador)
o menor (efector negativo o inhibidor)
actividad.
3.- Modificaciones covalentes: Algunas
enzimas claves de una vía metabólica, además
de ser reguladas alostéricamente, están
controladas por modificaciones covalentes
(fosforilaciones, adenilaciones, etc). Por
ejemplo, la actividad catalítica de glucógeno
fosforilasa aumenta, mientras que la glucógeno
sintetasa disminuye por fosforilación. Estas
modificaciones covalentes están catalizadas por
enzimas específicas, reguladas por hormonas.
Las modificaciones covalentes de las enzimas
son generalmente la etapa final de una cascada
de amplificación. Consecuentemente, los
caminos metabólicos pueden ser rápidamente
regulados por señales disparadoras, como se ve
en la acción estimulatoria de epinefrina sobre
la glucogenolisis.
Química Montpellier
Química Montpellier
Estrategia del metabolismo
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FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
4.- Niveles enzimáticos: las velocidades
de síntesis de algunas enzimas regulatorias
(inducción – represión) pueden variar en
respuestas a estímulos hormonales.
La activación e inhibición originadas por
interacciones alostéricas causan cambios
inmediatos en la actividad enzimática y
consecuentemente, en el metabolismo.
Las modificaciones covalentes lo afectan
más lentamente. Los cambios en los niveles
enzimáticos por inducción ó represión son
procesos que demoran algunas horas.
PRINCIPALES CAMINOS
METABÓLICOS Y SITIOS
DE CONTROL
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Metabolismo de los
hidratos de carbono
.8 •
Glucólisis: Esta secuencia de reacciones
citosólicas tiene como propósito la degradación
de glucosa para generar ATP por transferencia
del grupo fosfato desde intermediarios de alta
energía de este camino metabólico al ADP
(fosforilación a nivel de sustrato). Además,
en este proceso se forma NADH y esqueletos
carbonados que serán utilizados en otras
vías biosintéticas. La enzima regulatoria de la
glucólisis es la fosfofructoquinasa I. Esta enzima
es inhibida por altos niveles de ATP y citrato y es
estimulada por AMP. Por lo tanto, la velocidad de
esta vía depende de las necesidades energéticas
de la célula (que se evidencia por la relación ATP/
AMP) y por la necesidad de unidades estructurales
o esqueletos carbonados (que se evidencia por
los niveles celulares de citrato). En condiciones
de anaerobiosis el NADH formado en la glucólisis
es reoxidado por conversión de piruvato en
lactato por la enzima lactato deshidrogenasa.
En aerobiosis, los equivalentes de reducción
del NADH pueden ser transferidos a la CR y
el piruvato puede ser oxidado completamente
a CO2 en el CTC. Debido a que la membrana
interna mitocondrial es impermeable al NADH,
esta transferencia de equivalentes de reducción
Química Montpellier
desde el citosol a la mitocondria se realiza por
sistemas denominados lanzaderas (lanzadera
del malato – aspartato y lanzadera del glicerol3-fosfato). Para que el piruvato obtenido en la
glucólisis sea oxidado a CO2 y agua debe ser
previamente transformado irreversiblemente
en AcCoA mediante una descarboxilación
oxidativa catalizada por el complejo enzimático
piruvato deshidrogenasa (PDH).
Ciclo de las pentosas: esta serie de reacciones
tiene como objetivo la generación de NADPH
para las síntesis reductivas y la formación de
ribosa 5-fosfato para la síntesis de nucleótidos.
Este proceso está regulado a nivel de la enzima
glucosa 6 fosfato deshidrogenasa.
Gluconeogénesis: La glucosa puede ser
sintetizada por el hígado y los riñones a partir
de precursores tales como lactato, glicerol y
AA. Estos metabolitos pueden ser convertidos
a piruvato, el cual es carboxilado a oxalacetato
en la mitocondria. El oxalacetato es luego
decarboxilado y fosforilado en el citosol para
formar fosfoenolpiruvato. Luego por una serie
de reacciones similares a la glucólisis pero en
sentido inverso, se sintetiza fructosa 1,6bifosfato, compuesto que es hidrolizado por
una fosfatasa específica, a fructosa 6-fosfato,
el cual es convertido en glucosa 6-fosfato. El
hígado posee la enzima glucosa 6-fosfatasa
que convierte la glucosa 6-fosfato en glucosa.
Gluconeogénesis y glucólisis se regulan de
manera recíproca, es decir AMP y NADH inhiben
y citrato activa a la fructosa 1,6-bifosfatasa,
enzima clave de la gluconeogénesis. La fructosa
2,6-bifosfato es un metabolito sintetizado por
la fosfofructo quinasa II que activa la glucólisis
mientras que inhibe la gluconeogénesis.
Glucogenogénesis y glucogenólisis: El
glucógeno es un polímero ramificado de
unidades de glucosa, que sirve como reserva
energética en hígado y músculo. El intermediario
activado en su síntesis es la UDP-glucosa, la cual
es formada a partir de uridin tri-fosfato (UTP)
y glucosa 6-fosfato. La glucógeno sintetasa
cataliza la transferencia de glucosa desde la
UDP-glucosa hacia el hidroxilo terminal de la
cadena en crecimiento. La enzima glucógeno
fosforilasa cataliza la degradación de glucógeno para dar glucosa 1-fosfato. La síntesis y
degradación de glucógeno están coordinada-
mente reguladas por una cascada de reacciones
disparadas hormonalmente (insulina, glucagon,
catecolaminas), de modo tal que una de las vías
está activada y la otra inhibida. Estas enzimas
están reguladas por fosfo-defosforilación e
interacciones alostéricas.
Los niveles de glucosa plasmática son
regulados fundamentalmente por el hígado,
que responde a señales hormonales y a los
niveles de glucemia per se. El hígado y, en
menor proporción, el riñón pueden formar
glucosa libre por ser los únicos órganos que
poseen actividad de glucosa 6-fosfatasa. El
músculo tiene un importante depósito de
glucógeno como reserva energética. Este tejido,
como el cerebro, no posee glucosa 6-fosfatasa,
por lo que no tiene capacidad para exportar
glucosa. Cuando el músculo se contrae, hay
una activa glucólisis y si el aporte de oxígeno
no es suficiente, el piruvato formado no entra
al CTC y es reducido a lactato, el cual va hacia
el hígado donde se reconvierte en piruvato,
sustrato de gluconeogénesis. Este intercambio
se conoce como Ciclo de Cori y transfiere
parte de la carga metabólica del músculo al
hígado. Además, en el músculo en actividad,
se forma una gran proporción de alanina, por
transaminación de piruvato. La alanina, igual
que el lactato, puede ser convertida en glucosa
en el hígado (Ciclo de la alanina). En el
músculo en descanso, el metabolismo muscular
es diferente: el principal combustible son los
AA. En particular, en el músculo cardíaco los
cuerpos cetónicos sirven como fuente de
energía preferentemente a la glucosa.
Metabolismo de los lípidos
Síntesis y degradación de ácidos grasos: Los
AG son sintetizados en el citosol por la adición
de unidades de 2 carbonos a una cadena en
crecimiento o a una proteína transportadora de
acilos. El malonil CoA, intermediario activado,
es formado por la carboxilación de AcCoA.
Los grupos acetilos son transferidos desde
la mitocondria al citosol por la lanzadera del
citrato. Este transporte genera en el citosol
parte del NADPH necesario para la síntesis,
el resto proviene del ciclo de las pentosas.
El citrato estimula a la acetil CoA carboxilasa,
la enzima que cataliza el paso clave de esta
biosíntesis. Cuando el ATP y la AcCoA son
abundantes, el nivel de citrato aumenta, el
cual acelera la velocidad de síntesis de AG. Los
AG son degradados de manera diferente en un
compartimiento distinto. Ellos son degradados
a Ac CoA en la matriz mitocondrial por βoxidación, que entra, luego, al CTC si el aporte
de oxalacetato es suficiente. Alternativamente,
AcCoA puede dar origen a los cuerpos cetónicos.
El FADH2 y el NADH formado en la β-oxidación
transfieren sus electrones al O2 en la CR. La
β-oxidación continúa sólo si NAD+ y FAD son
regenerados. Por lo tanto, la velocidad de la
degradación de los AG está también acoplada
a las necesidades de ATP.
El hígado juega un rol central en el
metabolismo de los lípidos. Luego de una
ingesta, los combustibles son abundantes, y
el hígado, a partir de los hidratos de carbono,
sintetiza AG en el citosol, éstos se esterifican
a TG y son excretados a la sangre como
lipoproteínas. Simultáneamente, la oxidación
mitocondrial de los AG es impedida por el
malonil CoA. Este metabolito inhibe a la
carnitina acil transferasa I, involucrada en el
transporte de AG hacia la mitocondria donde
se localizan las enzimas de la β-oxidación.
Durante el ayuno, en el hígado se observa una
disminución de la síntesis de AG y por lo tanto
de malonilCoA, facilitándose la entrada de AG
a la mitocondria para ser oxidados.
El tejido adiposo es la reserva más
importante de triglicéridos. Es el órgano
principal de síntesis de AG, los cuales son
activados a AcCoA y transferidos al glicerol
para la formación de triacil glicéridos. El
glicerol 3-fosfato, un intermediario clave en
esta biosíntesis, proviene de la reducción de la
dihidroxi acetona fosfato, que se forma durante
la glucólisis. El tejido adiposo es incapaz de
fosforilar el glicerol endógeno porque carece
de glicerol kinasa . Por lo tanto, los adipocitos
necesitan glucosa para la síntesis de triglicéridos.
La lipasa hormono sensible (LHS) activada por
glucagon en el ayuno o catecolaminas en el
estrés, degrada estos TG a AG. Estos AG son
transportados por la albúmina al hígado,
donde son oxidados (β-oxidación) para generar
energía (ATP y coenzimas reducidas) necesaria
para la gluconeogénesis.
Química Montpellier
Química Montpellier
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
• 9.
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Metabolismo de lipoproteínas: Las lipoproteínas VLDL (lipoproteína de muy baja densidad)
son producidas en el hígado principalmente a
partir de los hidratos de carbono de la dieta.
Se denomina lipogénesis al proceso por el cual
la glucosa es convertida en piruvato, éste en
AcCoA, sustrato para la síntesis de AG. Estos
son luego esterificados con el glicerol fosfato
para formar triglicéridos, los que salen del
hígado como VLDL.
En el intestino se forman los quilomicrones
a partir de los lípidos de la dieta. Los TG de los
quilomicrones y VLDL son digeridos por lipoproteinlipasa (LPL), una enzima que se encuentra
en el endotelio de los capilares de los tejidos
periféricos. Los AG son liberados, tomados por
dichos tejidos y oxidados a CO2 y agua para
producir energía. LPL convierte el quilomicrón
en quilomicrón remanente, y a la VLDL en IDL
(lipoproteína de densidad intermedia) y ésta
en LDL (lipoproteína de baja densidad). Estos
productos que tiene un bajo contenido en TG
son tomados por el hígado por un proceso de
endo-citosis y degradados por acción lisosomal.
La endocitosis de LDL ocurre tanto en hígado
como en tejidos periféricos. Otra lipoproteína,
la HDL (lipoproteína de alta densidad) es la
encargada de transportar el colesterol desde
los tejidos periféricos hacia el hígado e
intercam-biar lipoproteínas y lípidos con los
quilomicro-nes y la VLDL. Inversamente la LDL
lleva colesterol a los tejidos.
Química Montpellier
Metabolismo de los aminoácidos:
10 •
El organismo mantiene en la sangre un pool
importante de amino ácidos (AA), de modo
tal que los tejidos disponen libremente de los
mismos, aún en una situación de ayuno, para
la obtención de energía, síntesis de proteínas y
derivados esenciales tales como neurotransmisores y hormonas. Los AA representan una
fuente importante de sustratos gluconeogénicos para el hígado. Este pool de AA deriva
de la dieta y del recambio de proteínas del
organismo y es metabolizado y degradado
fundamentalmente en el hígado. En este
proceso catabólico los AA se oxidan, y el
esqueleto carbonado se convierte en glucosa,
cuerpos cetónicos o dióxido de carbono. A partir
del nitrógeno amínico se genera amoniaco
(NH3), que es tóxico para las células y por lo
tanto se convierte en urea (exclusivamente
en el hígado) que se excreta por la orina. El
nitrógeno derivado del catabolismo de AA
en otros tejidos es convertido en alanina o
glutamina y transportado al hígado. Los
AA ramificados (valina, isoleucina, leucina)
son oxidados principalmente en el músculo
esquelético y otros tejidos, pero no en el
hígado. La glutamina juega un rol central
en el metabolismo intermedio. En el riñón,
la glutamina libera NH4+, que se excreta en
la orina, ayudando a mantener el pH del
organismo. En las células en rápido crecimiento
y recambio, como los enterocitos, linfocitos o
macrófagos, la glutamina es usada como
combustible, como dador de nitrógeno en
reacciones de biosíntesis de bases púricas
y como sustrato en la síntesis de proteínas.
Durante las condiciones de sepsis, trauma
o injuria el organismo atraviesa una fase
catabólica caracterizada por un balance
nitrogenado negativo, donde se observa
una degradación del músculo esquelético
que aumenta la disponibilidad de glutamina
y otros AA para la división celular y síntesis
de proteínas en las células involucradas en la
respuesta inmune y la cicatrización. En estas
condiciones, la proteólisis está aumentada
como consecuencia del aumento de los niveles
de glucocorticoides liberados desde la glándula
adrenal.
El progreso en el conocimiento de la
Biología Celular ha sido un factor decisivo en
el desarrollo concomitante de la Medicina y
el Laboratorio Endocrino. La interpretación
racional de los fenómenos fisiológicos y
patológicos, en paralelo con la incorporación
de nuevo equipamiento y metodologías serán
aún más trascendentes en el futuro y permitirán
una mejor calidad de vida de los individuos.
Bibliografía
• Biochemistry. L. Stryer. W.H.Freeman & Co. Eds., New York, USA,
1998.
• Principios de Bioquímica. A.L.Lehninger, D.L.Nelson, M.M.Cox,
Ediciones Omega S.A., Barcelona, España, 1995.
• Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations. T.M.Devlin
Editor, Willey-Liss., New York, USA, 1997
• Textbook of Endocrine Physiology. J.E.Griffin and S.R.Ojeda Eds,
Oxford University Press, New York, USA, 2000.
• Basic Medical Biochemistry. A Clinical Approach. D.B.Marks,
A.D.Marks, C.M.Smith. Williams and Wilkins Ed., Baltimore,
USA, 1996.
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Principios de Genética
Molecular de Eucariotas
Víctor Romanowski, Daniel H. Grasso,
Mario O. Aguilar y Antonio Lagares
INFORMACIÓN GENÉTICA
La caracterización estructural de los ácidos
nucleicos se inicia recién en el siglo XIX con la
descripción de la nucleína (ADN y proteínas).
Y sin conocer aun la estructura de los mismos,
a mediados del siglo XX se consigue mostrar
que el ADN era el componente cromosómico
ligado a la herencia en ensayos realizados con
bacterias (Griffith, 1928; Avery, MacLeod y
McCarthy, 1944; Hershey y Chase, 1952). Sin
embargo, el comienzo de la Genética Molecular
moderna es asociado con el descubrimiento
de la estructura de doble hélice del ADN
por Watson y Crick en el año 1953. Este
descubrimiento sentó las bases estructurales
iniciales que permitieron avanzar en el medio
siglo siguiente hacia la descripción molecular
del dogma central: ADN-ARN-proteína. Sin
embargo, hoy sabemos que, si bien el ADN es
el depositario de la información genética en
eucariotes y en procariotes (bacterias), muchos
de los virus que atacan estas células utilizan
ARN como material genético, dando lugar a
un flujo de información hacia la síntesis de
proteínas que no es el descripto en el dogma
central.
Presentamos a continuación algunas de las
características estructurales más relevantes del
ADN y ARN que puede analizarse a diferentes
niveles: estructura primaria, estructura
secundaria, y estructuras de orden superior.
Constituyentes nucleotídicos. Estructura
primaria (secuencia).
Los ácidos nucleicos son polinucleótidos. Los
nucleótidos por su parte están constituidos por
la unión de un azúcar a una base nitrogenada
(que forman un nucleósido), y a un grupo fosfato.
En el caso del ADN, el azúcar es la desoxiribosa,
mientras en el ARN se utiliza ribosa. En cuanto
a las bases, en el ADN encontramos adenina
(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T);
con uracilo (U) en lugar de timina en el ARN.
Los nucleótidos que forman parte del ADN
y ARN se presentan en la Figura 1. En los
ácidos nucleicos los nucleótidos de la figura
se encuentran unidos por enlaces fosfodiester
5’- 3’ (esto hace referencia a los carbonos del
azúcar) formando polímeros desde unas pocas
unidades hasta varios millones dependiendo del
ácido nucleico y del organismo. Cabe destacar
finalmente que en ciertos tipos de ARN, como
en los de transferencia (tARN), es muy frecuente
encontrar nucleótidos con otras bases (ej.
hipoxantina) o con bases modificadas.
Como veremos más adelante la biosíntesis
enzimática de ácidos nucleicos ocurre a partir
de nucleósidos 5’ trifosfatos (NTPs) para el caso
del ARN o de desoxinucleósidos-5’- trifosfatos
(dNTPs) para el caso del ADN. Vinculado a ello,
la inclusión de nucleósidos modificados
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Estructura de ácidos nucleicos
• 11
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Figura 1. Nucleótidos: se muestran los nucleósidos monofosfatos componentes del DNA
(desoxirribonucleótidos) (A), y del RNA (ribonucleótidos) (B)
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análogos a los utilizados in vivo es desde hace
tiempo una estrategia muy utilizada para
inhibir la replicación de células tumorales, y
también la replicación viral. Los nucleósidos
(profármacos) son transformados in vivo a sus
nucleótidos trifosfatos que son los inhibidores
directos del proceso de síntesis. En la Figura 2
se muestran algunos de los análogos utilizados
12 •
en el tratamiento de infecciones por el virus de
la inmunodeficiencia humana HIV-1/HIV-2.
La importancia del conocimiento del ADN
a nivel de estructura primaria (génica /extragénica) se sustenta en que la función codificada
por una región genómica particular depende
de su secuencia y, más propiamente, del modo
en que la misma es reconocida
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Figura 2. Análogos de nucleósidos inhibidores de la transcripción inversa.
Estructura secundaria del ADN:
La doble hélice
En el año 1953 Watson y Crick establecieron
mediante interpretación de espectros de rayosX, la estructura de doble hélice para el ADN
de doble cadena tipo B (puede consultarse
el trabajo original en http://biocrs.biomed.
brown.edu/Books/Chapters/ Ch%208/DHPaper.html).
Este arreglo conformacional del ADN
representa la forma natural en la que comúnmente se encuentra y aísla el ADN de doble
cadena. La estructura está básicamente
constituida por dos cadenas antiparalelas
(cadenas orientadas en forma opuesta
respecto de los hidroxilos 5’ y 3’ libres de
las desoxiribosas terminales) generando una
hélice con giro “a derecha” que presenta las
características estructurales que se describen
en la primera columna de la Tabla 1. La doble
hélice se estabiliza esencialmente por puentes
de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas entre
las bases nitrogenadas que se orientan hacia
el interior.
Los grupos fosfatos cargados negativamente
se localizan en la superficie de la hélice, orientados hacia el entorno acuoso.
Química Montpellier
por otras moléculas con función regulatoria
(esencialmente proteínas). Uno de los avances
más relevantes de la última década ligado
a la estructura primaria de ácidos nucleicos
ha sido la determinación de las secuencias
nucleotídicas completas de genomas de
diferentes organismos procariotas y eucariotas,
cubriendo varias decenas de bacterias
con características bioquímicas diferentes,
parásitos, plantas, y mamíferos incluyendo
ratón y el humano (puede accederse a la
base de datos del GenBank a través de NCBINational Center for Biotechnology Information
en la siguiente dirección electrónica: http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genomes/
index.html). Este avance directamente ligado
al desarrollo de nuevas tecnologías de manejo
de muestras y secuenciamiento automatizado
ha sentado las bases para el crecimiento de
una nueva disciplina, la Genómica, vinculada
al estudio estructural y funcional (individual
y comparado) de genomas completos. La
disponibilidad de la estructura primaria
completa de un genoma es una herramienta
esencial para el rápido avance hacia la
caracterización de defectos genéticos aún no
caracterizados que estén ligados a la expresión
de enfermedades específicas.
• 13
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Puede consultarse:
http://www.blc.arizona.edu/Molecular_
Graphics/DNA_Structure/DNA_
Tutorial.HTML, http://www.ncc.gmu.edu/
dna/, http://www.biology.arizona.edu/
biochemistry/activities/DNA/DNA_
intro.html
Además de la forma B, existen naturalmente
al menos otras dos formas de ADN doble
cadena que corresponden a los denominados
ADN A y ADN Z (este último formando una
hélice con giro “a izquierda” (Tabla 1, columnas
2 y 3). El uso de bacterias recombinantes y de
enzimas de modificación (metilación) que son
capaces de discriminar el tipo de estructura B ó
Z en el ADN sustrato, ha permitido demostrar
la existencia in vivo de regiones con estructura
Z en zonas específicas del ADN caracterizadas
por secuencias del tipo (purina-pirimidina)n, en
particular (CG)n. La estructura de ADN A, por su
parte, puede encontrarse en formas esporuladas
a las que confiere por ejemplo mayor resistencia
a la radiación. Es interesante que mutantes
carentes de proteínas denominadas SAPs son
incapaces de inducir la formación de ADN A,
hecho que sugiere la necesidad de las mismas
para la formación in vivo de esta variante
conformacional del ADN (la forma de ADN A
puede ser inducida in vitro por deshidratación
parcial del ADN tipoB). Hélices de tipo A se
encuentran también naturalmente en ARNs con
regiones con extensa autocomplementariedad
(ver estructuras secundarias en forma de tallohorquilla en rARNs) y en moléculas de ARN de
doble cadena como es el caso de los genomas
y de las formas replicativas de algunos virus.
Aunque las formas de doble hélice adoptadas
por el ADN han sido las más caracterizadas
desde el punto de vista estructural, existen virus
en los que la forma genómica de su ADN es
de simple hebra.
Tabla 1.
Química Montpellier
Características estructurales más relevantes de los tres tipos básicos
de ADN de doble cadena.
14 •
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Estructura terciaria del ADN.
Superenrollamiento, cromatina
El cálculo de la longitud de diferentes
genomas a ADN asumiendo una estructura
tipo B resulta en dimensiones inmensas con
relación al tamaño de las células que los
contienen (Tabla 2).
Existen por tanto arreglos estructurales
especiales que permiten el eficiente empaquetamiento y organización del material
genético, de modo que sea al mismo tiempo
accesible a los sistemas regulatorios que
hacen uso de la información almacenada.
Uno de los mecanismos que conducen
al empaquetamiento del ADN es el
superenrollamiento, es decir el giro sobre
si mismo de una doble hélice de ADN
circular o de extremos fijos. El superenrollamiento es inducido por las tensiones que se
generan cuando existen más (o menos) de
10,5 pb/vuelta de ADN tipo B, que son los
que corresponden a su estado relajado. Al
superen-rollarse, dicha tensión es distribuida en
toda la molécula alcanzando espontáneamente
una conformación más compacta y de menor
energía. Si bien el superenrollamiento
existe tanto en organismos procariotes
como eucariotes, en los primeros es mejor
comprendido por una cuestión de sencillez. La
inhibición de enzimas específicas ha mostrado
la importancia funcional del estado topológico
del ADN para el crecimiento bacteriano:
antibióticos que inhiben la enzima girasa,
una topoisomerasa de tipo II que modifica el
estado de superenrollamiento del ADN, inhiben
en crecimiento bacteriano.
Tabla 2
Considerar el superenrollamiento del ADN
en bacterias como un mero mecanismo para
compactar ADN parece hoy un argumento
incompleto dado el escaso conocimiento sobre
el rol de las diferentes formas topológicas del
ADN sobre la fisiología celular.
Un hecho significativo que refleja la
importancia del superenrollamiento en la
estructura y función genómica en eucariotes
es el elevado contenido de topoisomerasas
presente entre las proteínas del esqueleto
(scafold) de los cromosomas. Sobre dicho
esqueleto proteico, el ADN se encuentra,
además, cuidadosamente empaquetado
formando una compleja estructura dinámica
nucleoproteica, la cromatina (puede
consultarse en http:// www.ndsu. nodak.edu
/instruct/mcclean/plsc431/eukarychrom/
eukaryo3.htm), cuyo estado de condensación
tiene gran variación a lo largo del ciclo celular. El
estado de condensación de la cromatina en un
momento particular del ciclo es el resultado del
tipo de interacciones ADN-proteína existentes.
Las histonas (H1, H2A, H2B, H3, y H4), que
son los principales componentes proteico de
la cromatina, son proteínas con casi un tercio
de aminoácidos básicos (Lys, Arg) y representan
una masa total equivalente a la del propio ADN.
Las cinco histonas se encuentran entre las
proteínas más conservadas entre organismos
eucariotas distantes, hecho que refleja también
la existencia de mecanismos muy conservados
en lo que hace al depósito y uso dinámico de
la información dentro de los cromosomas.
Química Montpellier
Comparación del tamaño celular de diferentes ADNs respecto de su tamaño
(hipotético) bajo la forma tipo B
• 15
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Química Montpellier
Es interesante que en arquebacterias se han
encontrado proteínas con similitud a las
histonas. Además de las histonas existen en la
cromatina otras proteínas minoritarias como
protaminas, HMG (high mobility group),
proteínas del esqueleto nuclear (scafold) y
varias proteínas con actividad enzimática.
Como resultado de la asociación del ADN
con proteínas específicas pueden al menos
considerarse cuatro niveles de organización
(empaquetamiento): 1) nucleoso-mas de 10
nm, 2) fibras de 30 nm (solenoides de algo
más de 6 nucleosomas/vuelta), 3) asas de
eucromatina (50-100 kb de fibras de 30 nm) y
bucles de heterocromatina de aprox. 1 µm, y
4) cromosomas metafásicos. Los nucleosomas
y las fibras a que dan lugar han sido obtenidos
y caracterizados mediante la combinación
de métodos enzimáticos, microscópicos, y
de difracción. Cada nucleosoma incluye un
tramo de DNA de aproximadamente 200 pb,
una molécula de histona H1 y dos moléculas
de cada una de las otras histonas formando
un octámero. Algunas de las proteínas HMG
interactúan con el propio octámero mientras
que otras lo hacen con el ADN espaciador.
Como resultado final del proceso de
empaquetamiento, en la fase M el grado de
condensación del ADN es cercano a 50.000
(cociente entre el largo esperado para un ADN
extendido con estructura B, y el mismo ADN
empaquetado). En la interfase, por su parte, el
grado de condensación local de la cromatina
disminuye y es muy variable, hecho que permite
diferenciar regiones de eucromatina (no muy
condensada, transcripcionalmente activa) y
de heterocromatina (altamente condensada
aunque menor que la del cromosoma metafásico, intensamente teñida con May Grünwald
16 •
Giemsa, minoritaria) (http://cellbio.utmb.
edu/cellbio/ nucleus2.htm). En un proceso
opuesto, toda la cromatina adopta una forma
de tipo heterocromática al final de la fase G2.
La espectacular dinámica de estos procesos
está íntimamente ligada al delicado
equilibrio entre la necesidad de almacenar
la información y la necesidad de acceder
a la misma en forma adecuada. Existe de
todos modos heterocromatina constitutiva
(i.e. satélites en regiones teloméricas) que se
encuentra bajo dicha forma estructural en todo
el ciclo celular, descondensándose sólo para la
replicación en la fase S.
Los métodos de extracción de ADN más
utilizados hacen uso en general de agentes
enzimáticos (proteasas) y químicos (fenol)
que destruyen y desnaturalizan las proteínas
asociadas con el ADN. Es posiblemente por
esta razón que resulta frecuente referirse a
la estructura de los ácidos nucleicos como
moléculas desnudas. Como hemos visto, el
ADN interactúa in vivo con un número muy
grande de proteínas de distinto tipo. Muchas de
ellas cumplen su función como componentes
esencialmente estructurales (como histonas)
mientras otras, más diversas y dependientes
del estadío del ciclo celular y de la condición
fisiológica, ejercen funciones regulatorias por
interacción directa con secuencias específicas
del genoma (ej. factores de transcripción,
topoisomerasas). A pesar de esta aparente
dualidad entre componentes estructurales y
proteínas regulatorias, existen hoy evidencias
cada vez más concluyentes respecto de cómo
cambios finos en la estructura de la cromatina
(acetilaciones, fosforilaciones) afectan los
perfiles locales de expresión génica.
Replicación y ciclo celular
Una característica común a los organismos
vivos es la transferencia de todo o parte
(organismos sexuados) de su material genético
a la descendencia. La multiplicación viral, la
división binaria en procariotas y en eucariotas
unicelulares, y los procesos de reducción
cromosómica durante la gametogénesis
en organismos multicelulares sexuados van
siempre acompañados por una instancia de
copia y a veces de reducción del material genético que pasará a ser parte de
la progenie. La replicación es entonces el
conjunto de procesos bioquímicos que resultan
en la copia fiel del ADN genómico, o del ARN
genómico para el caso de varios tipos de virus.
No haremos aquí mención explícita a eventos
de replicación viral dado que pueden seguir
estrategias muy variadas.
Para el caso de la replicación del ADN en
bacterias y células eucarióticas se requieren
al menos los siguientes componentes que
hacen al funcionamiento de la maquinaria
de replicación: un ADN molde, sitio/s
de iniciación con secuencias específicas
(orígenes de replicación: ori, que dependen
del organismo), varias proteínas accesorias
(helicasas y proteínas de unión a simple hebra
que preparan la conformación del ADN en
forma de hebras abiertas para su copia,
topoisomerasas), enzimas polimerasas que
inician y sostienen el proceso de síntesis
a partir de dNTPs sustratos, y finalmente
ligasas que aseguran la continuidad de los
fragmentos sintetizados. En el propio origen
de replicación se separan ambas cadenas
por acción de proteínas específicas, se inicia
luego la síntesis de ADN dando lugar a una
horquilla de replicación que se desplaza
(en una o en ambas direcciones) a medida
que el nuevo ADN-copia es sintetizado. El
proceso central de polimerización es llevado
a cabo por las ADN polimerasas a partir de
los dNTPs. Las ADN polimerasas, sin embargo,
no son capaces de iniciar la síntesis de ADN
a partir de una hebra sencilla producto de
la apertura que ya hemos comentado de la
doble hebra. Por tanto, una vez que el ADN es
abierto actuará una ARN polimerasa (primasa
en E. coli) que formará un pequeño ARN
(cebador) que será posteriormente extendido
por las ADN polimerasas que ahora sí pueden
extender a partir del extremo 3’ el cebador
recién sintetizado (el cebador será finalmente
eliminado, ver más adelante). A pesar de que
este proceso ocurre de forma análoga en
ambas cadenas, la síntesis de cada una de las
hebras hijas no tiene lugar del mismo modo
debido a una de las características catalíticas
de las polimererasas. Una propiedad ubicua de
todas las polimerasas, tanto de ADN como
de ARN, es que la polimerización (crecimiento
de la cadena nueva) ocurre exclusivamente
en dirección 5’ – 3’. Por tanto, a medida que
la horquilla de replicación avanza, sólo una de
las dos hebras antiparalelas de ADN molde
se puede copiar en forma continua. La otra
hebra debe esperar a que la horquilla avance
y pueda realizarse la síntesis en dirección 5’
– 3’ en tramos discontinuos, dando lugar a
los llamados fragmentos de Okazaki (http://
www.johnkyrk.com/DNAanatomy.html). En
bacterias la polimerización de ambas cadenas
depende de la actividad de la ADNpol-III
que es la de mayor procesividad (número
de nucleótidos incorporados a la hebra en
crecimiento antes de que la enzima se disocie
del molde) comparada con la polimerasas
ADNpol-I y ADNpol-II. Más allá de esta
diferencia que hace a la función central de
la ADNpol-III en la polimerización de largos
fragmentos de ADN, las tres polimerasas
tienen actividad exonucleasa 3´ - 5’ que les
permite corregir errores durante la síntesis
(proofreading) y mejorar su fidelidad. Las ADN
polimerasas tienen en promedio una tasa de
error de aproximadamente 1 nucleótido cada
106 – 108 (comparar con el tamaño de un
genoma bacteriano que es en el orden de
106 pb).
La ADNpol-I tiene además una actividad
exclusiva exonucleasa 5’ - 3’. Esta enzima es
la responsable de remover los cebadores de ARN
que encabezan cada uno de los extremos 5’ en
que se ha iniciado la síntesis. La misma enzima
completa la síntesis de ADN en dichos espacios.
La ligasa unirá finalmente los extremos 3’ y 5’
contiguos resultantes, dando lugar a hebras
continuas terminadas. Debemos mencionar
además que en eucariotes existen sistemas
complementarios destinados a mantener el
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• 17
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18 •
largo de las regiones teloméricas (extremos
de los cromosomas). Téngase en cuenta que
en la doble hebra no es posible copiar desde
el extremo mismo las terminaciones 3’ de
las cadenas (recuérdese que la replicación
sólo se inicia con cebadores de ARN que son
finalmente removidos). Dicho problema se
corrige mediante la actividad de enzimas de
naturaleza ribonucleoproteica (telomerasas)
con capacidad de extender los telómeros y
contrarrestar asi el acortamiento que resulta de
los sucesivos eventos de replicación a lo largo
de la vida celular. La situación es diferente en
bacterias ya que en la mayoría de las especies
los cromosomas son circulares.
En células eucariotes existen más de cinco
ADN polimerasas diferentes: la ADNpolα que actúa a la vez de primasa e inicia la
polimeriza-ción del ADN, las ADNpol-δ y
ADNpol-ε responsables de la mayor parte de la
elongación, la ADNpol-γ que replica el genoma
mitocondrial, y la ADNpol-β que participa en los
procesos de reparación. Las tres polimerasas que
se encargan de la elongación tienen actividad
de proofreading y tienen alta procesividad. Otra
diferencia funcional con las enzimas bacterianas
es que los ARN cebadores son removidos por
nucleasas específicas y los espacios rellenados
por las mismas ADNpol-_ y ADNpol-_. Si
bien existen otras polimerasas recientemente
descubiertas, las mismas están asociadas a
procesos de reparación y recombinación.
Un aspecto del proceso de replicación al
que aún no hemos hecho referencia es el de
su duración y coordinación con el resto del
ciclo de división celular. ¿Cómo se realiza en
el momento y tiempo adecuados la replicación
de genomas que varían en tamaño desde unos
pocos millones de pares bases en bacterias,
hasta varias megabases en organismos
eucariotas (>109)? La respuesta a esta
cuestión debe encontrarse en la conjunción de
diferentes factores que incluyen la velocidad
de polimerización (500-1000 nucleótidos/
segundo en bacterias y 10-50 veces más
lenta en diferentes organismos eucariotas), la
procesi-vidad de las polimerasas, y el número
de orígenes/genoma. En E. coli, existe un único
origen de replicación para el cromosoma por
lo que existe un único replicón (región de
ADN que es replicada a partir de un mismo
origen de replicación). En eucariotes existen,
por el contrario, múltiples replicones en cada
cromosoma que permiten duplicar todo el
genoma dentro de la fase S del ciclo celular
(ver más adelante). Cómo es la coordinación
de la iniciación, elongación y terminación entre
los diferentes replicones es una cuestión de
resolución aun pendiente.
Ciclo celular en células
embrionarias tempranas y en
células somáticas
Una de las características distintivas entre
los organismos procariotas y las células eucariotas es el modo muy diferente en que cada
uno de ellos controla su respectivo ciclo celular.
Mientras en organismos procariotas el inicio
y control de la división está esencialmente
ligado a la disponibilidad de nutrientes,
las células eucariotas poseen un complejo
ciclo celular cuya dinámica y regulación
dependen del tipo de célula, del estadio de
desarrollo (en organismos pluricelulares), y de
una gran variedad de señales extracelulares
solubles y resultantes también del contacto
célula. La descripción de la pérdida de control
y desregula-ción del ciclo celular permite
ejemplificar hoy varios procesos de oncogénesis
a nivel molecular.
El ciclo celular de células somáticas en
un organismo adulto transcurre a través de
las siguientes fases: G1 (gap 1, luego de la
división celular preparación para la replicación),
S (síntesis de ADN), G2 (gap 2, preparación para
la mitosis luego de la replicación), y M (mitosis)
(puede verse http://vlib.org/Science/Cell_
Biology/cell_cycle.shtml, http://genomewww. stanford.edu/cellcycle/, http://
cellcycle-www.stanford.edu/cellcycle/). En
este esquema, el período de interfase incluye
las fases G1-S-G2. Algunos tipos celulares que
no ingresan a la fase S, como neuronas adultas
por ejemplo, salen de G1 e ingresan a un nuevo
estadio denominado Go, de latencia en lo hace
a la replicación y división. Otros tipos de células
que ingresan en Go pueden retomar su ciclo
celular activo por acción de estímulos externos
específicos.
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
a que hemos hecho referencia.
En el estudio de los componentes regulatorios del ciclo celular se han utilizado (y se
utilizan hoy) diferentes sistemas biológicos.
El uso de oocitos de Xenopus leavis, por
ejemplo, ha facilitado el descubrimiento
del factor promotor de la mitosis (MPF,
mitosispromoting factor), presente en
máxima concentración en el citoplasma de
células premitóticas. El trabajo con oocitos de
Xenopus y con huevos fecundados de erizo de
mar ha permitido manipular y microinyectar
citoplasma de los mismos sobre distintos
tipos de células para evaluar la presencia de
componentes con actividad promotora de la
mitosis y su variación a lo largo del ciclo (Figura
3). Estudios posteriores con otros organismos
han permitido determinar que el MPF es un
componente ubicuo desenca-denante de la
mitosis, y que está compuesto por una quinasa
(Cdk, cyclin dependent kinase), cuya actividad
y especificidad es dependiente de su unión
a una ciclina específica, la ciclina B. Hoy se
conocen varios complejos quinasa-ciclina
cuyas actividades regulan la transición entre
las diferentes fases del ciclo celular. Mientras
en levaduras y otros organismos existe una
única quinasa que varía su especificidad por
intercambio de ciclinas, en
Figura 3. Variaciones en la concentración de MPF y ciclina B a lo largo del ciclo celular en huevos
fecundados de erizo de mar. En la parte inferior de la figura se muestra la separación de proteínas de
cada fase del ciclo en SDS-PAGE (modificado de Alberts et al., 1995).
Química Montpellier
Otra variante del ciclo celular es la que tiene
lugar en células embrionarias tempranas, en
las que sólo se observa una secuencia -M-S-MS- dado que la interfase se requiere sólo para
la replicación del ADN. El citoplasma celular
del huevo y embrión temprano ya contienen
los componentes necesarios para una rápida
serie de transiciones -S-M-S- sin necesidad de
los períodos G1 y G2. Con una activa división
nuclear en esta fase temprana del desarrollo
casi no existe crecimiento citoplásmico. Sin
embargo, ¿qué ocurriría si la misma estructura
del ciclo celular del embrión temprano fuera
conservada durante el desarrollo y posterior
crecimiento, y mantenimiento de los tejidos?
En células de estadios embrionarios más
avanzados y del organismo adulto en general,
el ciclo celular debe sin duda dedicar parte
de su tiempo al propio crecimiento celular.
En las células somáticas se requiere entonces
un período de interfase que contemple la
producción de la biomasa celular además
de la replicación del material genético. En
este esquema existe por cierto una única
replicación/ciclo, y sólo en aquellas células que
alcanzaron el tamaño y contenido adecuados.
Estas observaciones denotan la existencia
de controles muy precisos que regulan la
transición entre cada una de las fases del ciclo
• 19
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
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mamíferos la situación es más compleja e
incluye varias quinasas y ciclinas (Cdk4-ciclina
D y Cdk6-ciclina D en fase G1 temprana,
Cdk2-ciclina E en fase G1 tardía; Cdk2-ciclina
A en fase S; y Cdk1-ciclina A y Cdk1-ciclina
B en fase M). Como el término lo indica, las
ciclinas son de aparición cíclica derivado de la
síntesis y degradación secuencial de las mismas.
Estas proteínas que se activan por acción
de quinasas y fosfatasas específicas, se
degradan en momentos muy precisos del ciclo
celular. En el caso de la ciclina B constituyente
del MPF, la degradación ocurre en proteasomas,
complejos proteolíticos macromoleculares
encargados de la degradación de proteínas
citoplásmicas marcadas específicamente con
cadenas de ubiquitina. Los complejos Cdk-
203 •
ciclina mitótica que aumentan su concentración
hasta alcanzar un pico en la fase pre-mitótica,
son los encargados de inducir los cambios
que llevan a la condensación cromosómica,
la disolución de la membrana nuclear, y
finalmente el inicio de la anafase por activación
por fosforilación del complejo promotor de la
anafase (APC, anaphase promoting complex).
Es interesante que también por actividad
quinasa del APC se desencadena la destrucción
de su propio activador, el MPF (Figura 4). La
inactivación del APC se extiende hacia la fase
G1 reiniciando el ciclo celular, con nuevo
aumento paulatino del MPF que alcanzará
su máximo al inicio de la fase M. La genética
de quinasas y ciclinas ha sido originalmente
analizada en mucho detalle utilizando levaduras
Figura 4: Representación esquemática de la participación del APC en la promoción de la anafase
y la degradación de la ciclina B del MPF (modificado de Lodish et al., 2002)
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
cuando se egresa de la fase S, y del huso
mitótico en fase M. Dependiendo del tipo de
células los puntos de control dominantes
(check points) suelen realizarse ya sea en la
transición G1-S (como en mamíferos), o en el
ingreso a G2 (como en levaduras) (Figura 5).
Una de las proteínas más estudiadas en relación
al punto de control G1 es el oncosupresor
p53. Si existe daño en el ADN la proteína p53
es fosforilada aumentando su estabilidad y
concentración celular, promoviendo entonces
la activación transcripcional de inhibidores de
complejos Cdk-ciclinas (como la proteína p21)
y, por tanto, deteniendo el ciclo celular.
Figura 5: Principales puntos de control en el ciclo celular de células de mamíferos
(Modificado de Lodish et al., 2002).
Las que siguen son algunas de las
características más relevantes de la proteína
p53: a) Es un factor de transcripción
oncosupresor. En su forma no fosforilada
es muy inestable y está normalmente
presente en muy bajas concentraciones. b) Los
daños del ADN por radiación u otras causas
de estrés activan ciertas quinasas (como la
ATM y quinasas dependientes de ADN) que
fosforilan la p53 y la estabilizan, aumentando
Química Montpellier
de fisión y de gemación, sistemas en los
que lamanipulación genética y construcción
de organismos recombinantes es mucho
más sencilla. Avances posteriores y la
disponibilidad de la secuencia completa del
genoma humano ha permitido identificar
los genes de las diferentes Cdks y de las
ciclinas antes mencionadas.Los procesos que
hemos descripto están finamente regulados y
coordinados, con puntos de control que tienden
a evitar la transición entre fases del ciclo si no
se han alcanzado, por ejemplo, estándares
adecuados de tamaño celular, integridad del
ADN, calidad del material genético replicado
• 21
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Química Montpellier
su concentración celular. En esas condiciones,
la p53 induce la transcripción de genes
responsables de su acción oncosupresora
(ej. p21). c) Es esencial para el control del
ciclo celular en la transición G1-S. d) Se
observan mutaciones en la proteína p53 en
más del 50% de los cánceres humanos.
Según hemos mencionado, p21 es
inhibidor general de complejos Cdk-ciclinas,
tanto tempranos como tardíos en el ciclo
celular (CIP, Cdk inhibitory proteins). Las
proteínas p27 y p57 son también de este
tipo. Otros inhibidores como p15 y p16 del
grupo INK4 (Inhibitors of kinase 4) inhiben
preferencialmente complejos tempranos Cdkciclinas como los que forman las Cdk 4 y Cdk6
que hemos mencionado precedentemente.
Mutaciones simples o concertadas en proteínas
y complejos involucrados en el control del ciclo
celular son frecuentemente los iniciadores de
procesos de oncogénesis (ej. mutaciones en el
APC, diferentes tipos de mutaciones en p53, en
p16, sobre-expresión de ciclina D, etc). Como
veremos en capítulos siguientes, cambios en
la expresión de las mismas proteínas salvajes
se pondrán también en juego en condiciones
normales toda vez que una acción hormonal
modifique la actividad del ciclo celular.
22 •
Flujo de la expresión génica
La transcripción y la traducción
La información genética que almacena el ADN
adquiere significado biológico para la célula
cuando se sintetizan las moléculas codificadas
por los genes a través de un proceso de dos
etapas conocidas como transcripción y
traducción, que en su conjunto constituyen
la expresión génica. Dado que en un organismo
multicelular todas las células poseen la misma
información genética, surge claramente que
los diferentes fenotipos celulares de cada
uno de los tejidos u órganos deben ser la
resultante de diferencias en la expresión génica.
Es por ello que la transcripción en células
eucariotas es necesariamente un proceso
complejo. No sólo presenta un alto poder de
discriminación entre qué debe ser transcrito
y qué no, sino que además la transcripción
es precisamente programada durante el
desarrollo y la diferenciación tisular. Es decir
que esta maquinaria debe poder responder:
“¿Qué? ¿Cuándo? ¿Dónde? y ¿Cómo?”. La
transcripción genera una hebra de ARN cuya
secuencia nucleotídica es complementaria a
una de las hebras del ADN, que actúa como
secuencia molde.
Figura 6. Transcripción en eucariotas y procariotas. La parte izquierda de la figura muestra
un esquema general de la transcripción de un gen eucariote, la maduración del transcripto
primario y posterior exportación del núcleo. A la derecha se muestra el proceso de transcripción
de un gen procariótico, intrínsecamente más simple que en eucariotes
En general, la transcripción da lugar a ARNs
pertenecientes a tres clases: ARN mensajero
(ARNm), ARN de transferencia (ARNt) y ARN
ribosómico (ARNr). También a través de este
proceso se generan otros ARNs tales como
los denominados ARNs pequeños nucleares
(snARNs) y los ARNs citoplásmicos pequeños
(scARN). Los transcriptos primarios producidos a
partir de la mayoría de los genes codificantes de
ARNr, ARNt y los pre-ARNm, experimentan un
procesamiento extenso antes de constituirse en
las formas maduras funcionales de estos ARNs
(ver Figura 6). Mediante el proceso denominado
traducción las moléculas de ARNm dictan el
ordenamiento de los aminoácidos en el proceso
de polimerización que conduce a la síntesis de
las proteínas. El ARNr y ARNt son componentes
claves del aparato de síntesis de proteínas.
En células eucarióticas además de las ARN
polimerasas de mitocondrias y cloroplastos,
existen tres enzimas nucleares que transcriben
diferentes porciones del genoma nuclear.
Cada una de las ARN polimerasas es una
enzima compleja con múltiples subunidades
(aproximadamente 12). La ARN polimerasa I es
la encargada de la síntesis de los ARNr; la ARN
polimerasa II de los ARN y la ARN polimerasa
III de los ARNt y snARNs. En todos los casos sin
embargo, el proceso de transcripción puede
ser dividido en las tres etapas de iniciación,
elongación y terminación que caracterizan
también la síntesis de otras biomacromoléculas
poliméricas. En cada una de esas etapas se
requieren además de la enzima polimerizante
otros factores accesorios. Estos factores
cumplen un rol importantísimo en el comienzo
de la transcripción, determinando qué región
del ADN se transcribirá y además con qué
frecuencia. Para ello estos factores reconocen y
se asocian a secuencias específicas de ADN que
forman parte de los denominados promotores.
Cada gen eucariota contiene además del
promotor una secuencia que estimula la
transcripción (enhancer) que frecuentemente se
encuentra distante del inicio de la transcripción,
y su modo de acción parece ser el de producir
un bucle en el ADN –tal vez mediado por
nucleosomas– ubicando las proteínas unidas
a esta secuencia estimuladora en contacto con
las proteínas unidas al promotor.
Control del inicio de la expresión
El control del inicio de la transcripción
constituye el mecanismo predominante
a través del cual las células procariotas y
eucariotas regulan la expresión génica,
y representa el punto de decisión para
reorientar la fisiología celular. Las organismos
unicelulares tanto procariotas (bacterias) como
eucariotas (levaduras) poseen muchos genes
que responden a condiciones nutricionales y
variaciones ambientales sintetizando nuevos
ARNm o incrementando el nivel de expresión.
En el caso de los eucariotas multicelulares
el control está dirigido a responder a
requerimientos que aparecen en momentos
precisos de la diferenciación y/o desarrollo (ver
http://web.indstate.edu/thcme/mwking/
gene-regulation.html #initiation).
Dado que los principios elementales que
gobiernan la regulación de la transcripción
fueron desarrollados a partir del conocimiento
de sistemas procariotas sencillos, comenzaremos
por hacer una breve reseña de ellos.
La única ARN polimerasa que poseen las
bacterias está constituída por cinco subunidades conocidas como subunidades grandes
β’ (156 kDa) y β (151 kDa), dos subunidades
pequeñas α (37 kDa), y una copia de la subunidad ó también llamada factor σ de tamaño
variable, que determina el conjunto de genes
a ser transcripto. El rol del factor σ consiste en
reconocer a un promotor singular y por ende
posicionar la polimerasa para que inicie la
transcripción a una distancia definida a partir de
la secuencia de reconocimiento. Se han descrito
varios factores σ según el gen o grupo de genes
(regulón) activados, los cuales se identifican con
un superíndice que hace referencia al tamaño
molecular de la proteína. Por ejemplo, los genes
requeridos para responder a adversidades
ambientales (stress) utilizan el factor σ32
mientras que los genes en respuesta al ayuno
de nutrientes nitrogenados depende del factor
σ54). La región promotora es decisiva para la
unión específica de la ARN polimerasa mediada
por el factor ó. La polimerasa se une a la región
promotora formando el denominado complejo
cerrado en el que las bases de la doble hebra
permanecen apareadas. La ARN polimerasa
inicia la transcripción de la mayoría de los
Química Montpellier
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
• 23
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
genes bacterianos a partir de una base definida
que está comprendida en la secuencia que se
encuentra previa al extremo 5´ de la región
codificante. Este sitio de iniciación (identificado
con la posición +1 de la unidad de transcripción)
define otra región 5´ adyacente, en la cual se
encuentran los sitios de control y unión de
la ARN polimerasa (región upstream o “rio
arriba”). En la etapa siguiente, la polimerasa
separa las hebras complementarias unidas por
puentes de hidrógeno y forma un complejo
abierto. Después de iniciada la transcripción y
avanzado unos 10 pares de bases, la subunidad
ó se libera, pudiendo formar parte de otro
complejo promotor-ARN polimerasa y reiniciar
la transcripción.
Como se mencionó anteriormente, la
frecuencia de inicio de la transcripción es un
punto clave para regular el nivel de la expresión
génica. Por ende, la constante de afinidad
del complejo promotor - holoenzima es el
factor determinante. Así, podemos imaginar
que para un mismo factor ó, variaciones en
la secuencia del promotor van a dar como
resultado diferentes frecuencias de iniciación,
es decir no todos los genes transcritos a partir
de un mismo factor ó poseen el mismo nivel
de expresión. A su vez, cambiando el factor
ó de la ARN pol se transcribirá otro conjunto
de genes.
El inicio de la transcripción en eucariotas
Los promotores reconocidos por la ARN
polimerasa II y sus respectivos factores de
transcripción (“Transcription Factors”, TF) se
caracterizan por presentar un alto grado de
variabilidad en su secuencia, adoptan un diseño
modular y abarcan una región no menor a 200
pb en la región 5´ previa al inicio. En la Tabla 3
se muestran algunos elementos importantes de
control para la ARN pol II y sus correspondientes
factores de transcripción.
Tabla 3.
Química Montpellier
Algunos elementos de control de la ARN pol II y sus correspondientes factores de
transcripción (TF)
24 •
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
la transcripción está mediada por un receptor
de naturaleza proteica que se une al esteroide
en el citoplasma celular. Cuando se establece
la unión hormona-receptor, el complejo
constituye una forma transcrip-cionalmente
activa, incrementando10 veces su afinidad
por el ADN. El complejo hormona receptores
direccionado al núcleo celular, donde reconoce
una secuencia denominada GRE (Elemento de
Respuesta a Glucocorticoide). El GRE se localiza
generalmente en un elemento enhancer que
puede encontrarse a varias kilobases en
dirección 5´- o 3´- del promotor. La unión del
complejo esteroide-receptor a la secuencia
“enhancer”, provoca la activación del promotor
cercano iniciando el proceso de transcripción.
Este tipo de activación del “enhancer”
constituye el mecanismo general por el cual se
regula un grupo amplio de genes involucrados
en la respuesta celular al esteroide.
Siguiendo este modelo de activación de
la transcripción, se ha encontrado que la
transcripción del gen de la insulina, que se
expresa específicamente en las células beta
de los islotes de Langerhans, es regulada
por el nivel sanguíneo de la glucosa. Se ha
identificado un elemento regulatorio que
actúa en cis, denominado RIPE3b, el cual
a través de la unión con la proteína MafA
resulta crítico para la regulación mediada por
glucosa. Usando procedimientos basados en
PCR cuantitativa del ARNm de mafA, se pudo
demostrar que es regulado positivamente por
glucosa y su detección significativa es específica
de las células beta. Se puede concluir que
MafA es un factor específico de células beta
que activa al gen de la insulina de una manera
dependiente de la glucosa.
Química Montpellier
Se han identificado tres tipos de secuencias
promotoras. La caja TATA es común y predomina
en los genes de transcripción rápida. La función
del elemento de control TATA aparentemente
es fijar el punto de inicio de la transcripción.
Un segundo tipo de iniciador comprende a
los llamados elementos iniciadores (Inr) que
poseen un residuo citosina en la posición -1
y uno de adenina en el sitio de inicio de la
transcripción. Otros genes se caracterizan por
poseer segmentos ricos en bases GC que son
reconocidos por el factor de iniciación SP1. La
región 5´ upstream del inicio de la transcripción
incluye además a otros elementos (enhancers)
consistentes en secuencias cortas conservadas
que son reconocidas apropiadamente por los
factores transcripcionales amplificantes.
En general, estos factores (TF), tanto los generales como los específicos, son de naturaleza
proteica que concurrentemente actúan sobre
el promotor del gen permitiendo la expresión
del mismo. Un factor de transcripción reconoce
secuencias concretas de bases de unos 8-10
nucleótidos, y se asocia a otros factores de
manera secuencial formando un complejo activador en el lugar del comienzo de la transcripción.
La unión cooperativa de múltiples activadores
a sitios cercanos forma un complejo multiproteico denominado amplisoma (ver Figura 7)
Los promotores eucariotas de la ARN pol
II contienen elementos de control diversos
y complejos. Debido a que la transcripción
de estos genes debe ser tejido-específica
y desarrollo-específica, requiere un ajuste
muy fino de regulación. En algunos casos
la transcripción debe responder también a
moléculas señal tales como las hormonas. La
activación por hormonas esteroideas a nivel de
• 25
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Química Montpellier
Figura 7. Modelo para la
ARNpol II de la formación
del complejo mínimo de
preiniciación (PIC) con
un promotor TATA. En su
forma más simple, la unión
de la Proteína de Unión a
TATA (TBP) inicia la secuencia.
Alternativamente se puede
utilizar TFIID, el cual incluye
TBP y factores asociados. La
serie de líneas punteadas
indican la fosforilación del
dominio C-terminal de pol II.
La fosforilación es necesaria
para la liberación de la
enzima del sitio de iniciación.
(modificado de G. Roeder,
Trends Biochem. Sci (1996)
21:327-3335)
26 •
La regulación parece ser más compleja si se
tiene en cuenta que otros factores específicos
para células beta también interactúan con el
promotor. Los factores IEF1 y IPF-1 se unen
respectivamente a las cajas E y A del promotor
del gen insulina.
Alguno de los efectos provocados por la
acción de la insulina son generados mediante
la modificación de los niveles de expresión
de genes insulinodependientes. Este proceso
consiste en una cascada de fosforilación que
culmina en la fosforilación de proteínas nucleares
de unión a ADN incrementando su capacidad
de actuar como factores de transcripción
(Figura 8). El complejo juego de factores de
trans-cripción y polimerasa no actúa sobre ADN
desnudo. La estructura de la cromatina nos induce
a preguntarnos ¿cómo se unen estas proteínas al
ADN en presencia de los nucleosomas?, ¿ cómo
sortean los nucleosomas la ARNpolimerasa?.
En este sentido, las enzimas histona
acetil transferasa y deacetilasa, juegan un rol
importante afectando la arquitectura de la
cromatina. Altos niveles de acetilación de las
histonas se correlacionan con una elevada tasa
de transcripción. Sorprendentemente, varias de
las proteínas del complejo de iniciación poseen
actividad acetilante de histonas.
Recientemente, se han descubierto en
levaduras y en eucariotes superiores factores
de remodelado de cromatina aunque no se
sabe aún cuál es su mecanismo de acción.
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Figura 8. Activación
de la expresión
génica por insulina.
La Figura ilustra el
proceso de activación de
la expresión de genes
nucleares mediante una
cascada de fosforilación
que se inicia con la
unión de la hormona
insulina a su receptor de
membrana (modificado
de Nelson & Cox, 2000).
como “splicing” (este término ha sido
adoptado en el idioma castellano, aunque en
algunas traducciones se lo menciona como
empalme) (ver http://www.cas.muohio.edu /
~wilsonkg/Bot203/Gene_expression/Introns/
introns.htm). El procesamiento de este ARN
primario tiene lugar en el núcleo celular en
unas estructuras denominadas spliceosomas
(o empalmosomas) que son complejos de
snARNs y proteínas específicas, y es importante
señalar que la capacidad catalítica para procesar
el ARN primario reside en el componente
ribonucleico del spliceosoma.
Química Montpellier
Maduración del ARNm
El producto de la transcripción del gen es una
molécula de ARN que se denomina transcripto
primario. Este ARN, al igual que el ADN del cual
ha sido copiado, contiene secuencias codificantes (exones) y también no codificantes (intrones)
y por ende no es traducible directamente
a proteína. Por ello, debe experimentar un
proceso que elimina los intrones y de este
modo obtener una molécula con la información
completa en forma consecutiva para producir
la proteína. El mecanismo de eliminar intrones
y empalmar los exones, se lo conoce en inglés
• 27
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Un caso muy interesante de maduración,
es aquel que permite que un único gen de lugar
a distintas proteínas a través de un splicing
alternativo (ver Figura 9). Esta modificación
consiste en que en uno de estos procesamientos
alternativos algunos exones son eliminados
junto con dos intrones flanqueantes.
Entonces, a partir de un único gen se
originará un único transcrito primario que por
empalme alternativo originará varios ARNm, los
que a su vez darán lugar a proteínas distintas.
Un ejemplo de este tipo de maduración es el
caso de las IgM y las IgD, inmunoglobulinas
localizadas en la membrana de los linfocitos
B, ambas codificadas por el mismo gen pero,
según la maduración alternativa que tenga
lugar se generará el mensajero de la IgM o de
la IgD. Sin dudas, este caso representa otro
ejemplo que se aparta del dogma adoptado
inicialmente: un gen una proteína.
Química Montpellier
Figura 9. Splicing alternativo: El gen de calcitonina. Las señales alternativas para la poliadenililación
que son usadas por los tejidos tiroides y neural para realizar esplicing alternativo están indicadas como
pA1 y pA2, en el esquema del gen de la parte superior de la figura. El exon 1 y la parte 3'- del exon 5 (5b)
codifica las secuencias 5'- y 3'- no traducidas. El exon 4 codifica el gen maduro de calcitonina en tiroides
mientras que el gen relacionado CGRP (calcitonin gene-related peptide) sintetizado en el tejido neural es
codificado por la parte 5'- del exon 5(5a). (adaptado de Strachan, T. & Read, A.P., 1999)
28 •
Otras de las modificaciones postranscripcionales que sufre el ARNm, es el agregado
en el extremo 5´ del capuchón cap y una
cola de poliadenina en el extremo 3´ (poli-A)
(figura 6). Cuando se han realizado todas estas
modificaciones, entonces el ARN se considera
maduro para avanzar en la etapa siguiente
de la expresión génica: la traducción. Las
moléculas maduras de ARNm deben ser
movilizadas desde el núcleo al citosol a través
de los poros nucleares. Durante el proceso de
síntesis los ARNs se unen a proteínas nucleares
que conducen a la formación de un complejo
ribonucleoproteico (RNPm) asociado al CBC (cap
binding complex) el cual es reconocido por las
proteínas que forman el complejo de proteínas
del poro nuclear. Se inicia así el pasaje a través
de poro liderado por el CBC y acompañado por
algunas de las proteínas asociadas al ARNm,
mientras que otras proteínas se disocian y
quedan retenidas en la matriz nuclear. Una
vez en el citosol, el complejo ribonucleico
experimenta la liberación de proteínas que
son reimportadas al núcleo para su reciclado,
y el ARNm queda disponible para interactuar
con proteínas de RNPm citosólicas, entre las
cuales se encuentra la proteína fijadora de
poli-A (PABP).
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
La secuencia ARNm se lee en los ribosomas
en grupos de tres nucleótidos denominados
codones, que codifican un aminoácido o
indican el fin de lectura. Existen 64 codones
posibles formados por combinaciones de las
cuatro bases A, C, U y G. Sin embargo, solo
existen 20 aminoácidos codificados y cada
uno puede tener más de un codón, por esta
característica se dice que el código genético
es degenerado. No todos los codones se
traducen en aminoácidos; existen tres de
ellos que codifican la señal que determina la
terminación de la traducción (codones UAG,
UGA y UAA). En la mayoría de los casos el
codón de inicio es AUG (metionina). El ARN es
un mensaje sin comas ni puntos, resultando
importante la identificación correcta del
inicio o el primer codón. En bacterias el
reconocimiento del codon de iniciación se
hace a través de la subunidad menor de los
ribosomas, la cual interactúa con una secuencia
de aproximadamente 8 nucleótidos del ARNm,
ubicada muy próxima al inicio. Esta secuencia
que se aparea con el extremo de la subunidad
ribosomal 16S es conocida como la secuencia
Shine-Dalgarno en honor a sus descubridores.
El reconocimiento del codon de iniciación es
diferente en eucariotes, en el cual la subunidad
ribosómica 40S se une al casquete metilado 5´
(cap) y comienza a “deslizarse” sobre el ARNm
hasta encontrar un triplete AUG aceptable. El
concepto de aceptabilidad significa que el
AUG se encuentra rodeado por determinadas
secuencias preferenciales. Tanto en procariotas
como eucariotas se requiere la participación de
factores de iniciación formando complejos que
previenen la asociación prematura de las
subunidades ribosomales.
Las moléculas que “traducen” la secuencia
nucleotídica en secuencia de aminoácido son
los ARNs de transferencia (ARNt). Este tipo
de ARN transporta un aminoácido mediante
una unión de tipo éster entre carboxilo del
aminoácido y el OH 3’ del ARN, forma que
se denomina aminoacil-ARNt Esta molécula,
reconoce el codón correspondiente a ese
aminoácido (en el ARNm) mediante una
secuencia de tres nucleótidos complementaria a
dicho codón que se denomina anticodón (en el
ARNt). La polimerización progresa siguiendo la
plantilla del ARN hasta encontrar un codón de
terminación. De manera similar a la iniciación,
las etapas de extensión y terminación requieren
factores de naturaleza proteica.
Generalmente, una molécula de ARNm es
traducida simultáneamente por varios complejos
ribosómicos (polisomas o polirribosomas), y una
vez culminada la síntesis del polipéptido los
ribosomas van siendo liberados y reciclados
para reiniciar una nueva ronda de traducción.
Los polipéptidos nacientes van adquiriendo el
plegamiento que conducirá a su estructura
nativa una vez liberado de los ribosomas,
asistidos por proteínas acompañantes o
chaperonas.
A diferencia de lo observado en células
procariotas, las células eucariotas utilizan
frecuentemente el control de la traducción
como mecanismo de regulación. En parte,
este control ocurre a nivel de disponibilidad
del ARNm (estabilización, degradación,
accesibilidad). Algunos ARNms específicos
pueden ser secuestrados mediante combinación
de proteínas específicas de unión a ARN o con
pequeñas moléculas de ARNs (ARNi, ARNs
de interferencia). Por ejemplo, la síntesis de
globina en los reticulocitos requiere de un
adecuado aporte de grupos hemo. La célula
posee una proteínquinasa denominada
inhibidor hemo-controlado (HCI). En presencia
de niveles adecuados de grupos hemo, la
quinasa es inactiva, pero si el nivel es bajo,
la HCI fosforila al factor de iniciación (de la
traducción) (elF2). En el estado fosforilado
eIF2 permanece establemente unido al factor
eIF2B impidiendo que se recicle para una nueva
iniciación y deteniendo, por ende, la síntesis
proteica.
Direccionamiento de las proteínas
La célula eucariota es una estructura multicompartimentalizada. Cada organela requiere
diferenes proteínas, de las cuales sólo unas
pocas son sintetizadas en la organela misma.
Algunas otras proteínas son exportadas de las
célula tales como las proteínas de la matriz
extracelular, enzimas proteolíticas y hormonas
peptídicas ( por ejemplo insulina y glucagón).
La diversidad de destinos nos indica que debe
Química Montpellier
Traducción: cambiando los códigos.
• 29
Química Montpellier
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
30 •
existir un sofisticado mecanismo para «marcar»
y ubicar en su correcto lugar a la proteína recién
sintetizada.
Las proteínas que se localizan en el
citoplasma, mitocondrias, cloroplastos y núcleo
se sintetizarán a partir de polisomas libres en
el citoplasma. Los diferentes destinos de estas
proteínas estarán indicados en su secuencia
aminoacídica. Las proteínas que se localizarán
en mitocondrias poseen una secuencia de
aminoácidos en el extremo N-terminal que
es reconocida por proteínas de la membrana
externa e interna de la mitocondria que forman
un poro a través del cual migrará el polipéptido.
La secuencia señal N-terminal es hidrolizada
en el interior de la mitocondria por proteasas
específicas. La proteína naciente es asistida
por chaperonas antes y después del pasaje al
interior de la mitocondria.
El proceso de direccionamiento de las proteínas
nucleares se diferencia en varios aspectos a
los de localización en otras organelas aunque
comparte con estos el hecho de que la proteína
posee una secuencia aminoacídica característica
que indica su destino. En este caso la secuencia
señal consiste en una secuencia de aminoácidos
básicos. La naturaleza de esta secuencia señal
adquiere sentido biológico si consideramos que
la mayoría de las proteínas nucleares interactúan
con los ácidos nucleicos, para lo cual emplean
frecuentemente aminoácidos básicos. A diferencia
del proceso de localización mitocondrial, la
proteína se localizará en el núcleo después de
haber sido sintetizada, es decir es un proceso posttraduccional y la secuencia señal no es eliminada
de la proteína. Evidentemente, este mecanismo
debe ser necesariamente así debido a que el
núcleo es una organela que a lo largo del ciclo
celular sufre un proceso de desensamblaje, con
lo cual el contenido es liberado al citoplasma. Si
la secuencia señal fuese removida, la proteína
no podría ser recapturada por el núcleo una
vez finalizada la mitosis.
Las proteínas destinadas a las membranas
celulares, lisosomas o la matriz extracelular
utilizan un sistema de distribución especial. La
estructura clave en este sistema es el retículo
endoplasmático rugoso (RER) y el aparato de
Golgi. La proteína destinada a alguno de estos
compartimentos posee una secuencia señal Nterminal que al momento de ser sintetizada y
emerger del ribosoma, es reconocida por una
partícula de reconocimiento de señal (SRP) de
naturaleza ribonucleoproteica. El complejo SRPpéptido naciente (unido al polisoma) se asocia
con una proteína de membrana del RER; luego
se libera la SRP y continúa la traducción pero
el polipéptido naciente pasará hacia el lumen
del RER ayudado por la proteína de membrana.
Antes de finalizar la síntesis y translocación del
péptido la secuencia señal es eliminada por una
peptidasa específica. Las proteínas que van al
lumen del RER, pueden ser transportadas en
vesículas hacia el aparato de Golgi (donde
sufren una serie de glicosila-ciones) y, a partir de
allí, mediante exocitosis podrán ser exportadas
al espacio extracelular.
A partir de este panorama, claramente se
puede inferir que de la misma forma en que
una maleta mal etiquetada en un aeropuerto es
un dolor de cabeza para su dueño, una falla en
este mecanismo de direccionamiento produce
graves consecuencias para el funcionamiento
celular.
Destrucción programada de proteínas
Durante el ciclo de vida celular numerosas
proteínas son sintetizadas; sin embargo, no
todas son requeridas en forma permanente,
de hecho algunas son necesarias en
momentos precisos del ciclo celular y deben
ser rápidamente eliminadas una vez que
cumplieron su cometido (ver sección Ciclo
celular en células embrionarias tempranas
y en células somáticas). Del mismo modo
aquellas proteínas que han sido dañadas
deben ser eliminadas. Es decir, que la célula,
así como posee mecanismos de regulación de
la síntesis de las proteínas, también debe poseer
mecanismos selectivos de degradación.
Las células eucariotas poseen dos
procedimientos diferentes para la degradación
proteica. Los lisozomas contienen las enzimas
proteo-líticas que degradarán cualquier proteína
atrapada en el lisozoma. Conjuntamente con
este proceso en el citoplasma se encuentra un
sistema de degradación altamente selectivo. A
continuación haremos una breve descripción
de este importante sistema.
Como mencionamos anteriormente,
una característica fundamental del sistema
de degradación citosólica es su capacidad
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Tecnología del ADN recombinante
El estudio del funcionamiento de los genes
depende en gran medida de la capacidad
de aislar y estudiar secuencias nucleotídicas.
Antes del advenimiento de la tecnología de
ADN recombinante, las únicas oportunidades
de contar con una población homogénea de
moléculas de un ácido nucleico se reducía a
los genomas de virus (esencialmente, paquetes
discretos de genes), a los ADNs satélites
(secuencias altamente repetidas de ADN), a
los ARNs ribosómicos (más del 90% del ARN
celular) y de transferencia. Estos se podían
purificar en forma relativamente sencilla debido
a la posibilidad de aislar los virus o a la gran
abundancia relativa dentro de la célula.
La tecnología de ADN recombinante
extiende la posibilidad de estudiar cualquier
secuencia de ADN o ARN en forma general
e independiente de su abundancia relativa y
complejidad.
Mediante el uso de dos herramientas
fundamentales de esta tecnología se logra
el estudio y manipulación de secuencias que
forman parte de una población compleja de
moléculas de ADN: el clonado de ADN y la
hibridación molecular.
Clonado de ADN: El segmento de ADN de interés
debe ser amplificado de manera que pueda ser
purificado a homogeneidad. A continuación,
su estructura y función pueden ser estudiadas
mediante los métodos de secuenciación,
expresión in vitro o en sistemas modelo,
mutagénesis para cambiar su estructura, etc.
Hibridación molecular: El fragmento de
interés no es amplificado pero es detectado
específicamente en una mezcla compleja de
muchas secuencias.
Química Montpellier
de distinguir las proteínas que deben ser
degradadas, es decir, estas proteínas deben
estar marcadas para poder ser identificadas.
Para ello, este sistema utiliza una proteína
denominada ubiquitina. La ubiquitina es un
polipéptido de 76 aminoácidos ampliamente
distribuido en los sistemas eucariotas.
Las proteínas que posean unidas varias
moléculas de ubiquitina serán sustrato del
sistema proteolítico. La unión del péptido de
ubiquitina a las proteínas es un proceso en
cuatro etapas:
• La ubiquitina forma parte de una proteína
fusión, la cual debe ser clivada para dar
ubiquitina libre (primer paso)
• La ubiquitina libre es activada mediante
su unión por un enlace tiol a una enzima
activante en un proceso dependiente de ATP
(segundo paso)
• La molécula de ubiquitina es luego
transferida a una segunda enzima (tercer
paso), la cual transferirá la ubiquitina a la
proteína a ser degradada mediante unión
en residuos de Lys. (cuarto paso).
Dependiendo del modo y cantidad en que
ha sido ubiquitinilada una proteína, esta marca
le indicará a la célula o bien una localización
celular o la digestión proteolítica en partículas
denominadas proteasomas.
La estructura del proteasoma (26 S) ha sido
determinada a alta resolución y consiste en un
barril de 28 subunidades, sorprendentemente
similar en estructura a la chaperonina procariótica
GroEL. Ambos sistemas aceptan polipéptidos
desplegados (proteínas parcial o totalmente
desnaturalizadas) en su interior, pero mientras
que GroEL protege la cadena polipeptídica el
proteasoma lo degrada.
• 31
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Química Montpellier
Clonado molecular
El clonado de ADN es un método general
para amplificar selectivamente secuencias
nucleotídicas y generar poblaciones
homogéneas de ADN
Para estudiar genes es esencial contar con
métodos que permitan su purificación. Dado
que los genomas de mamíferos son complejos,
cualquier gen específico o fragmento de ADN
de interés representa solamente una ínfima
fracción del ADN de una célula. Por ejemplo,
el gen de la β-globina comprende solamente
0,00005% de los 3 mil millones de pares de
bases (3000 megabases o 3000 Mb) del ADN
genómico humano; aún el enorme gen de la
distrofina de 2,5 Mb (el gen más largo que se
conoce) da cuenta de tan sólo 0,08% del ADN
humano.
Precisamente, la tecnología del ADN
recombinante se desarrolló con el fin de contar
con métodos generales para estudiar una
secuencia específica dentro de una población
compleja de ADN
En principio existen dos alternativas para
contar con las cantidades necesarias de un gen
o una secuencia nucleotídica pura: el clonado in
vivo y la amplificación enzimática de secuencias
específicas (PCR).
El clonado molecular in vivo consiste en
la inserción de una mezcla de fragmentos del
ADN a estudiar en un vector. Este último es
molécula de ADN capaz de replicarse en
forma independiente cuando se la introduce
en una célula huésped. Luego de introducir las
moléculas recombinantes (vector + fragmento
de ADN foráneo) en las células (proceso de
transformación), éstas pueden cultivarse de tal
manera que cada célula original se replicará
para formar una población genéticamente
homogénea (clon) conteniendo, además de
su propio ADN genómico, el vector con un
ADN insertado. Utilizando métodos habituales
32 •
en microbiología se pueden aislar millones
de colonias aisladas con diferentes ADNs
insertados. De esta manera, cada colonia
(clon) se convier-te en una fuente inagotable
de producción de un determinado fragmento
de ADN foráneo.
El conjunto de estos clones se puede
contener en una colección completa de
fragmentos del ADN en estudio, insertados
en un vector (genoteca, biblioteca de ADN,
library).
¿Qué ácidos nucleicos pueden ser
clonados? Tipos de colecciones de clones
Cualquier secuencia nucleotídica puede ser
insertada en un vector y propagada en bacterias
u otros organismos. Sin embargo debe tenerse
en cuenta que las manipulaciones de corte con
enzimas de restricción y ligación para producir
moléculas recombinantes sólo son practicables
con ADN. Para estudiar los productos de ARN
que funcionan en una célula (ARNm, ARNr,
ARNt, snARNs, scARNs) éstas secuencias deben
ser copiadas a ADN mediante el uso de una
transcriptasa reversa (ADN polimerasa ARN
dependiente aislada de retrovirus). De esta
manera se obtiene lo que se conoce como
ADN complementario o cADN, que puede ser
manipulado de la misma manera que el ADN
genómico.
Así se pueden obtener dos tipos de
colecciones de fragmentos de ADN :
“bibliotecas” genómicas y de cADN
(genomic & cADN libraries). Es interesante la
comparación de la información proveniente
de la secuencia de estas dos colecciones de
fragmentos de ADN ya que, por ejemplo,
permite definir la estructura de intrones y
exones de los genes estudiados (presentes en
las secuencias obtenidas de los clones de ADN
genómico y ausentes en los de cADN).
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Figura 10: Clonado
ordenado de secuencias
genómicas en diferentes
vectores. Fragmentos de ADN
progresivamente más pequeños
son subclonados hasta llegar
a plásmidos que contienen
inserciones cuya secuencia
parcial puede ser determinada.
Este tipo de información puede
ser luego compilada para
obtener en forma ordenada
la secuencia nucleotídica del
cromosoma entero.
Clonado, paso a paso
Cuando se pretende generar una colección de
fragmento de mayor longitud, se debe recurrir
a digestiones parciales.
2) Inserción del ADN foráneo en un vector:
generación de moléculas recombinantes o
quimeras
Los vectores más ampliamente usados
son plásmidos – ADNs circulares capaces de
replicarse en bacterias o levaduras en forma
independiente del cromosoma de la célula en
la que se introducen. Los plásmidos que se usan
como vectores se han modificado de tal manera
Química Montpellier
Un ejemplo: construcción de bibliotecas
1) Fragmentación del ADN
Existen alternativas para fragmentar el
ADN a estudiar: digestión con enzimas de
restricción o ruptura mecánica. Aquí se debe
recordar que la frecuencia de corte de una
enzima de restricción depende del tamaño de
la secuencia de reconocimiento: así una enzima
que reconoce una secuencia de cuatro pares
de bases, cortará en promedio una vez cada
256 (1 vez cada 44) pares de bases, mientras
que una que reconoce un sitio de seis, cortará
cada 4096 (1 vez cada 46) pares de bases.
• 33
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Química Montpellier
que contienen una serie de sitios de restricción
únicos, generalmente como parte de una zona
conocida como sitio de clonado múltiple (MCS
o polylinker), un marcador de selección (un gen
de resistencia a un antibiótico, por ejemplo)
y un origen de replicación relajado (permite
producir múltiples copias del plásmido por
célula).
Para generar los ADNs recombinantes, el
plásmido se corta con una enzima de restricción
(seleccionada del conjunto de sitios únicos) que
genere extremos compatibles con los de los
fragmentos a clonar (lo más simple es usar la
misma enzima para cortar ambos ADNs). En
la mezcla de millones de fragmentos de ADN
con millones de moléculas del vector cortado se
obtendrán mediante la ayuda de una ligasa un
conjunto de moléculas recombinantes. En este
conjunto tendremos distintos tipos de productos
de ligación: un fragmento foráneo insertado en
un vector, fragmentos que se unieron por sus
extremos y vectores recircularizados sin ningún
ADN extraño insertado.
Actualmente existen métodos alternativos
al uso de ligasas para unir el vector y ADN foráneo en una sola molécula recombinante. Estos
métodos más recientes que consisten en el uso
de recombinasas requieren, sin embargo, el uso
de vectores especiales y fragmentos foráneos
con secuencias de ADN específicas que puedan
ser reconocidas por la recombinasa. Por esta
razón no se utilizan recombinasas para la
construcción de bibliotecas genómicas en
las que los fragmentos de digestión tienen
exactamente la secuencia presente en el
genoma. Es frecuente el uso de recombinasas
en la construcción de bibliotecas de cADN,
o en el clonado de productos de PCR (ver
más adelante) a los que puede modificarse
fácilmente la secuencia terminal para
que sea reconocido por la enzima (http:
//www.orbigen.com/XiClone.html).
34 •
3) Transformación: introducción del ADN
en bacterias
Las moléculas de ADN del paso anterior se
introducen en bacterias sensibles al antibiótico
que se usará como método de selección. Para
que estas macromoléculas puedan entrar a la
célula (estado de competencia) se modifica
la estructura de la membrana bacteriana
mediante tratamientos químicos específicos
(por ejemplo tratamiento con soluciones de
cloruro de calcio), o sometiendo a las células
bacterianas a un pulso de diferencia de
potencial que abre poros en forma transitoria
(electroporación).
4) Propagación selectiva de clones de
bacterias con plásmidos recombinantes
Las bacterias transformadas con moléculas
de plásmido recombinante y recircularizado
pueden crecer en un medio selectivo que
contiene un antibiótico (ampicilina, si el
marcador de selección del plásmido es el gen de
la β-lactamasa), mientras que aquellas que no
incorporaron ningún plásmido no sobrevivirán.
Existen diversas estrategias para disminuir
y hasta eliminar las chance de crecimiento
de bacterias con plásmidos sin ADN foráneo
(desfosforilación del vector, inserción del ADN
foráneo en un gen tóxico, diferenciación de
plásmidos recombinantes y vectores sin inserto,
etc.). Inicialmente, las bacterias transformadas
se deben distribuir sobre un medio de cultivo
selectivo agarizado de tal manera que cada
célula dé origen a una colonia (plaqueo). Así
tendremos colonias con diferentes plásmidos
recombinantes separadas sobre la superficie
del medio semisólido. Ese conjunto de colonias
es una colección de clones (DNA library,
genoteca, biblioteca de ADN), que permitió
tener separados diferentes fragmentos de
ADN insertados en plásmidos.
5) Aislamiento del ADN recombinante
Cada uno de los clones puede ser tomado de
la placa anterior y cultivado en forma separada
para aislar y estudiar su ADN plasmídico.
¿Cuánto ADN pueden ser insertado en un
vector? Tipos de vectores
Si bien los plásmidos son los vectores más
utilizados por la facilidad de su manipulación,
pueden resultar inapropiados para algunos
tipos de estudio. Cuando el propósito es
contar con secuencias clonadas del ADN de
un organismo, se utilizan distintos vectores de
clonado de acuerdo a la longitud promedio de
los fragmentos (insertos) a clonar:
Nótese que la diferente capacidad de cada
vector para incorporar y mantener en forma
estable ADN foráneo se corresponde con las
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
características funcionales de cada replicón
en sus respectivas células/sistemas de origen
(ver replicación). Aunque utilizando vectores
apropiados los ADN insertados deberían ser
idénticos a los existentes en el genoma del
cual provienen, la estructura de largos insertos
pueden sufrir en algunos casos rearreglos no
deseados. Por tanto, la estructura del ADN en
clones de interés debe ser siempre cotejada con
la estructura genómica por análisis de Southern
blot (ver más abajo).
Utilizando apropiadamente estos vectores,
se han obtenido colecciones de fragmentos de
ADN que permitieron reconstruir genomas
completos de organismos de diferente
complejidad. Además del genoma humano, el
estudio de los genomas completos de diferentes
organismos modelo permite abordar estudios
de gran importancia en el campo biomédico.
(La expresión de genes clonados en
sistemas heterólogos se tratará más adelante)
Tabla 4
Vectores con capacidad para el clonado de fragmentos de ADN
de diferentes tamaños
La detección de secuencias nucleotídicas
y sus alteraciones en forma específica es
una herramienta fundamental en genética
molecular. Todas las metodologías que se
utilizan con este fin se basan en la hibridación
de ácidos nucleicos, es decir en la capacidad
de una hebra de ácido nucleico de interactuar
y asociarse con una secuencia complementaria
para formar una molécula de doble hebra.
Las condiciones de hibridación dependen
precisamente de la estabilidad de esta
doble hebra (ver estructura de ADN y http:
//www.ncbi. nlm.nih.gov).
Tipos de sondas
Los ácidos nucleicos que pueden servir
como sondas incluyen los siguientes tipos de
moléculas:
ADNds (fragmento de ADN clonado en un
plásmido, fragmento de restricción aislado de
un plásmido recombinante, producto de PCR)
ADNss (ADN clonado en M13, oligonucleótido
sintético)
ARNss (producto de trasncripción in vitro de
un fragmento de ADN clonado en un plásmido
a continuación de un promotor fuerte)
Química Montpellier
Sondas de ácidos nucleicos y PCR
• 35
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Tipos de marcación: radiactiva y no
radiactiva
Para la detección de los híbridos formados
entre la molécula blanco y la sonda, ésta
puede ser marcada mediante la incorporación
de precursores radiactivos o derivatizados
con fluoróforos, biotina u otros grupos
(digoxigenina) indicadores. En el primer caso
la detección es mediante autorradiografía,
mientras que en los siguientes el nucleótido
modificado es reconocido directamente por
fluorescencia, o indirectamente por avidina
(o estreptavidina) o un anticuerpo conjugados
con una enzima. En este caso el producto de
la reacción enzimática puede ser fluorescente
o coloreado. Las reacciones de marcación
de sondas consisten en versiones in vitro de
la replicación (extensión de primer, random
priming, nick translation) o de la transcripción
(secuencia clonada a continuación de un
promotor fuerte como el reconocido por la
ARN polimerasa del fago T7).
Química Montpellier
Formatos de hibridación
36 •
Si bien la desnaturalización de ácidos
nucleicos y su reasociación ocurren en
solución, la mayor parte de las aplicaciones
de la hibridación requiere que la molécula
blanco se encuentra fijada a un soporte
sólido, que se incuba con la sonda. El exceso
de sonda es lavado y sólo queda donde se ha
asociado con secuencias complementarias,
permitiendo su detección y ubicación en
diferentes situaciones:
In situ (cortes de tejido, células en cultivo,
cromosomas metafásicos, etc.)
Southern blot (ADN digerido con enzimas
de restricción, fragmentos resueltos por
electroforesis y trasferidos a una membrana
de hibridación: se usa para detectar qué
fragmentos contienen las secuencias de un
determinado gen y definir si existe alguna
modificación de la secuencia que conduce
a un polimorfismo de sitios de restricción y
longitudes de fragmentos o RFLP; ver Fig. 11)
Northern blot (ARN resuelto por electroforesis
y trasferido a una membrana de hibridación:
permite ver el tamaño de un ARNm y el nivel
de expresión de un determinado gen)
Microarrays (Una serie de oligonucleótidos
con secuencias específicas de diferentes
genes unidos en posiciones establecidas de
un portaobjetos son hibridados con sondas
de ADNc que representan la copia de todos
los RNAs presentes en un tipo celular: Esta
técnica permite el análisis simultáneo de los
niveles de expresión de miles de genes en
diferentes condiciones metabólicas, estímulos
externos, infecciones, etc.).
Amplificación de secuencias nucleotídicas
PCR (polymerase chain reaction): Es la
aplicación de la síntesis in vitro de ADN que
revolucionó la biología molecular y amplió las
posibilidades de la medicina, la antropología,
las ciencias forenses y ambientales, entre otras,
al permitir la caracterización de muestras que
contienen al menos una molécula (¡una!) de
ADN.
Utilizando oligonucleótidos sintéticos (primers)
complementarios a ambos lados de una
secuencia blanco (por ejemplo, un fragmento
de un gen), desoxinucleósidos trifosfato
(dNTPs) y una ADN polimerasa resistente a
temperaturas altas (Taq DNA pol) se repiten
ciclos de desnaturalización, hibridación y
extensión (síntesis de ADN a partir de los
primers usando como molde el ADN blanco)
que conducen a un aumento geométrico de
la secuencia flanqueada por los primers (ver
Figuras 12 y 13 y http://www.dnalc.org/
Shockwave/pcranwhole.html, http://www.
biochem. arizona.edu/classes/bioc471/
pages/Lecture12/Lecture12.html).
RT-PCR: Cuando las secuencias nucleotídicas
que se pretende amplificar pertenecen a una
molécula de ARN, también puede utilizarse
la PCR luego de copiar el ARN a ADN en
una reacción catalizada por una trascriptasa
reversa.
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Figura 11: Southern blot. Las
muestras de ADN a analizar
se digieren con enzimas de
restricción seleccionadas y los
fragmentos se resuelven por
electroforesis. Estos fragmentos
se transfieren a una membrana
de nylon o de nitrocelulosa
y se hibridan con una sonda
radiactiva.
Existen alternativas de
marcación de sondas
que incluyen nucleótidos
modificados con fluoróforos
o grupos detectables con
anticuerpos conjugados con
enzimas o con estreptavidina
conjugada a enzimas. Los
sustratos usados permiten
detectar el producto por el
color o por luminiscencia
(adaptado de Strachan, T. &
Read, A.P., 1999). (RT: Reverse
Figura 12: Amplificación de
ácidos nucleicos en el tubo de
ensayo (PCR) En cada ciclo de
PCR se requieren tres pasos a
diferentes temperaturas para
completar una ronda de síntesis
de ADN synthesis. Inicialmente,
el ADN de doble hebra debe ser
desnaturalizado de manera que
los oligonucleótidos sintéticos
(primers) puedan encontrar sus
secuencias complementarias en
las hebras simples (hibridación
a una temperatura dependiente
de la secuencia del primer). Una
vez unidos a esas secuencias los
primers son extendidos por la
ADN polimerasa, que incorpora
dNTPs a 72o. El siguiente ciclo
comienza nuevamente con la
desnaturalización, sigue con la
hibridación y, finalmente, con
la extensión. La repetición de
este proceso genera un millón
de copias de cada molécula de
ADN blanco (target). Este número
puede variar dependiendo del
rendimiento de cada etapa
Química Montpellier
Transcriptase) de retrovirus.
• 37
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Figura 13: Amplificación exponencial de ADN mediante PCR A la derecha se esquematiza el
proceso de PCR y a la izquierda se indica el número de copias que se obtiene en cada ciclo a partir de
cada molécula blanco al comienzo de la reacción, suponiendo un rendimiento del 100% en cada etapa.
En realidad, la cantidad de un producto de PCR puede ser calculada teniendo en cuenta el número de
moléculas del ADN molde al comienzo de la reacción, la eficiencia de cada ciclo y el número de ciclos de
acuerdo a la siguiente ecuación:
producto de PCR = (masa de ADN blanco) x (1 + % eficiencia) x no de ciclos
Usando esta ecuación, puede calcularse que se requieren 26 cycles para producir ~1 mg del producto de
PCR a partir de 1 pg of de secuencia blanco (amplificación: 106) si la eficiencia de cada ciclo es 70% [1
mg prod. PCR = (1 pg molde) x (1 + 0.7) x 26].
Química Montpellier
Expresión de genes clonados
38 •
La tecnología del ADN recombinante
permite introducir genes en organismos uni o
multicelulares y expresarlos. Este aspecto de la
tecnología tiene dos aplicaciones generales: (1)
producción y aislamiento de grandes cantidades
de un producto génico (proteína o ARN) en un
sistema heterólogo para estudios básicos
o fines terapéuticos (hormonas peptídicas,
factores de crecimiento, etc.), (2) expresión del
gen incorporado en un organismo con fines
terapéuticos (terapia génica) y (3) alteración
permanente del genoma de todas las células
de un organismo (transgénico) para que se
exprese allí un gen incorporado artificialmente.
En todos los casos se utilizan distintos vectores
de expresión.
Sistemas procarióticos (proteínas silvestres,
productos de fusión)
Escherichia coli es una bacteria modelo muy
fácil de cultivar en el laboratorio y que permitió
muchos avances en biología molecular. Por esa
misma razón fue posible desarrollar estrategias
de expresión de genes clonados en plásmidos.
Básicamente, los vectores de expresión usados
son plásmidos en los que el sitio de clonado
está precedido por un promotor inducible
y una secuencia de unión a ribosomas y
seguido por una secuencia de terminación
de la transcripción. De esta manera, cualquier
ADN insertado en ese sitio de clonado
será transcripto en E. coli. Ese producto de
transcripción (ARNm) será traducido siempre
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
tiene sus limitaciones, ya que las bacterias no
poseen los mismos sistemas de procesamiento
de proteínas que las células eucarióticas y
además, a menudo, los polipéptidos sobreexpresados forman cuerpos de inclusión
difíciles de solubilizar y renaturalizar.
Sistemas eucarióticos (levaduras, líneas
celulares de vertebrados, células de insectos
y baculovirus)
Las limitaciones de los sistemas de expresión
en E. coli apuntadas más arriba, especialmente
la falta de glicosilación de proteínas, hacen
necesario el uso de células eucarióticas
para poder contar con proteínas procesadas
correctamente. Sin embargo, la mayoría de los
sistemas eucarióticos no permiten la expresión
de proteínas a niveles tan altos como los
promotores fuertes usados en E. coli.
En general los vectores de expresión
eucarióticos contiene tipos de elementos
similares a sus contrapartes procarióticas:
• un marcador de selección eucariótico
• un promotor eucariótico
• señales de terminación de la transcripción y
traducción
• una señal de poliadenilación
• origen de replicación eucariótico (no es
necesario si se trata de un vector integrativo)
Los sistemas más sencillos, son sin duda los
de levaduras (los eucariotas más sencillos),
para los cuales existe una tecnología de cultivo
en gran escala desarrollada por la industria de
la cerveza. También es posible contar con
un repertorio de promotores inducibles y las
manipulaciones genéticas de las levaduras
son relativamente fáciles de realizar. La
selección de las levaduras recombinantes
se basa en el uso de células receptoras
auxótrofas (incapaces de crecer en ausencia
de un determinado aminoácido, por ejemplo)
y de plásmidos de expresión que contienen
como marcador de selección un gen que les
restituye la capacidad de crecer en ausencia
de determinado nutriente (enzima que permite
restablecer la síntesis del aminoácido). Las
estrategias de expresión en levaduras incluyen
los vectores que permanecen como elementos
extra cromosómicos (plásmidos) y aquellos que
pueden recombinarse con el DNA cromosómico
(integrativos).
Química Montpellier
que contenga un marco de lectura abierto (un
ORF que comienza con codón de iniciación
-ATG- y finaliza con uno de los codones de
terminación –TAA, TGA, TAG). El producto
resultante es un polipéptido definido por
la secuencia del ORF. Sin embargo, muchas
veces puede resultar conveniente generar un
producto de fusión, que resulta del agregado
de secuencias codificantes unidas en fase al ORF
anterior. Estos productos de fusión contienen las
secuencias aminoacídicas extra en el extremo N
o C terminal. Estas porciones de la proteína de
fusión pueden resultar útiles para estabilizarla
en la bacteria y permitir su aislamiento por
cromatografía de afinidad. Así los productos
de fusión con glutatión S transferasa (GST)
pueden ser aislados con glutatión unido al
soprte de la columna; aquellos que contienen
una secuencia biotinilable en E. coli poseen
afinidad por estreptavidina, los que tienen 610 residuos de histidina pueden ser separados
con una columna con un complejo de Ni2+,
etc. El primer producto de la ingeniería genética
que se distribuyó comercialmente fue la insulina
humana producida en E. coli por Genentech.
En ese caso, se utilizaron dos bacterias en las
que se expresaron por separado los polipéptidos A y B de la insulina como productos
de fusión con β-galactosidasa; luego de la
purificación por afinidad con anticuerpos antiβ-galactosidasa, se liberaron los péptidos A y
B por un tratamiento con CNBr y se asociaron
para producir la insulina.
Una de las aplicaciones más populares
de los sistemas de expresión procarióticos
(casi exclusivamente en E. coli) consiste en
poder contar con grandes cantidades de
un polipéptido para generar anticuerpos
específicos para diferentes usos. Este hecho
hace posible la producción de anticuerpos aún
contra polipéptidos que se expresan a niveles
ínfimos en el organismo original.
Por otra parte, el clonado de ADNc
en vectores de expresión permite generar
libraries de expresión (de ADNc) en las que
un determinado clon puede ser identificado
por su reactividad con un anticuerpo. Cabe
recordar que las bacterias no realizan splicing
de preARNm y serían incapaces de eliminar
intrones de un gen eucariótico.
La versatilidad de los sistemas procarióticos
• 39
Química Montpellier
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
40 •
Las células de insectos son excelentes
huéspedes para la expresión de proteínas. Para
ello, se usan vectores derivados de baculovirus.
Estos virus son capaces de infectar invertebrados (en su mayoría insectos) y producir grandes
cantidades de una proteína(poliedrina), que forma poliedros que encierran a los viriones en el
núcleo de las células infectadas. La poliedrina
se acumula hasta formar alrededor del 50%
de la proteína total de la célula. Como esta
pro-teína no es imprescindible para la viabilidad
del virus en cultivos celulares, su gen puede ser
reemplazado por aquél que se desea expresar
en gran cantidad y en un entorno eucariótico
más complejo que el de las levaduras. Debido
al gran tamaño del genoma viral, resulta
conveniente insertar el gen a expresar en un
vector de transferencia (plásmido con un sitio
de clonado entre las regiones flanquentes del
ORF de poliedrina) y luego cotransfectar células
con esta construcción y el ADN viral. Luego
se seleccionan los baculovirus recombinantes
que se generan por recombinación homóloga
a nivel de las secuencias comunes del plásmido
y del genoma viral. Los virus recombinantes
se usan como inóculo de nuevos cultivos
celulares, generando niveles del producto del
gen clonado similares a los de la poliedrina.
La tecnología de aislamiento de baculovirus
recombinantes se ha simplificado notablemente
y existen opciones de expresión de múltiples
subunidades proteicas en una misma célula
para producir estructuras complejas.
En términos generales, cualquier virus
puede convertirse en un vector de expresión
aprovechando la posibilidad de inserción
y sustitución de genes para generar
recombinantes. Una ventaja adicional de los
virus es que la evolución los ha transformado
en los mejores vehículos de transferencia de
genes: la infección es la manera más eficaz de
introducir los genes en una célula. Así se han
desarrollado vectores derivados de retrovirus,
adenovirus, herpesvirus, etc. Diferentes
versiones de vectores virales y plasmídicos
pueden utilizarse para introducir y expresar
genes clonados en una diversidad de células
de vertebrados e invertebrados.
Bibliografía general
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4thed Garland Publishing, Inc. 2002)
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(Washington, D.C.), distribución fuera de Norteamérica a cargo de Oxford
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• Basic Medical: Biochemistry. A Clínical Approach. D.B.Marks, A.D.Marks,
C.M.Srnith. Williarns and Wilkins Ed., Baltimore, USA, 1996.
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Willey-Liss., New York, USA, 1997
• Textbook of Endocrine Physiology. J.E.Griffin and S.R.Ojeda Eds, Oxford
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• Molecular Biology Weaver, R:F. (1999). WCB/McGraw-Hill
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John Wiley & Sons, Inc. / BIOS Scientific Publishers Ltd.
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• http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/
• http://library.advanced.org/18617/
• http://www.tigr.org/
• http://www.ornl.gov/hgmis/
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Modelos Transgénicos
Susana B. Rulli
pronuclear, el más comúnmente aplicado en
la actualidad (1). Si bien el ratón es la especie
más utilizada en tecnología transgénica, se ha
extendido también a otras especies tales como
rata, conejo, cerdo, cabra, vaca y primates. La
técnica consiste en microinyectar secuencias
de ADN directamente en el pronúcleo
masculino de ovocitos fertilizados, los cuales
se transfieren posteriormente a oviductos
de hembras seudopreñadas que cumplirían
el rol de madres sustitutas (Figura 1). Si el
material genético es integrado en alguno de
los cromosomas, el animal nacerá con una
copia de esta nueva información en cada
célula, que será posteriormente transmitida a
su descendencia. El primer fenotipo evidente
derivado de esta técnica, fue descripto en
ratones transgénicos portadores del gen de
la hormona de crecimiento (GH) de rata,
donde la sobre-expresión de GH derivó en
el desarrollo de ratones gigantes (2). A partir
de ese momento, se han logrado importantes
avances en diversas áreas de la biomedicina y
la genética utilizando modelos transgénicos. La
Tabla 1 muestra ejemplos de ratones transgénicos y sus fenotipos característicos (3-6).
Química Montpellier
La tecnología basada en la generación de
animales modificados genéticamente ha dado
una nueva dimensión al estudio de la función
de los genes in vivo. Con anterioridad a la
revolución de la genética molecular aplicada,
el único método práctico para estudiar la
regulación y función de los genes de mamíferos
ha sido a través de la utilización de mutantes
espontáneos. En la actualidad, es posible
insertar nuevos genes funcionales, inactivar y
modificar los ya existentes en un organismo
vivo, o alterar espacial o temporalmente su
expresión, a través de la manipulación genética.
La tecnología transgénica permite crear
modelos animales que posibilitan el estudio
de patologías humanas, la identificación de
las bases moleculares de la enfermedad y el
desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.
La metodología transgénica ha dado
sus primeros pasos hace alrededor de tres
décadas, a partir de la infección de embriones
de ratón preimplantatorios con retrovirus,
donde se ha podido demostrar que el ADN
proviral es capaz de integrarse al genoma
del ratón y ser transferido a las subsiguientes
generaciones. Posteriormente, se desarrolló el
método de transgénesis por microinyección
• 41
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Tabla1:
Química Montpellier
Modelos representativos de ratones transgénicos con sobreexpresión:
42 •
Gen
Fenotipo
Hormona liberadora de GH
Acromegalia
Hormona liberadora de corticotrofina
Síndrome de Cushing
P450 aromatasa
Criptorquidismo, tumor testicular
Prolactina
Tumor mamario en hembras; hiperplasia
de próstata
Gonadotrofina coriónica humana
Tumores ovárico, mamario e hipofisario
Leptina
Desaparición de tejido adiposo, hipofagia
Hormona folículo estimulante
Infertilidad en ambos sexos
Figura 1: Producción de ratones transgénicos por microinyección pronuclear.
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
A partir del reciente desarrollo de técnicas
de recombinación homóloga entre ADN exógeno y la secuencia endógena del genoma, en
combinación con la disponibilidad de cultivos
de células embrionarias de ratón (células
ES: embryonic stem cells), se ha ampliado
enormemente el espectro de posibilidades en la
manipulación del genoma murino, en particular
las mutaciones dirigidas o ratones “knock-out”
(Figura 2). Esta tecnología permite la eliminación
o mutación de secuencias específicas de las
células ES, introduciendo ADN al genoma vía
recombinación homóloga (1). Dicho fragmento
de ADN debe contener, además de la secuencia
homóloga del gen de interés, el cual puede
estar mutado o delecionado, elementos
necesarios para la selección in vitro de clones
de células ES modificados genéticamente.
Las células ES derivan de la masa interna de
blastocistos, son pluripotentes, y por lo tanto,
tienen la capacidad de originar diferentes tipos
de tejidos (estructuras epiteliales, musculares,
nerviosas, etc). Estas células son transfectadas
con el transgen por electroporación, y aquellas
seleccionadas positivamente para la presencia
de dicho transgen, son reinyectadas en blastocistos, donde se incorporan como parte
del embrión en desarrollo, constituyendo
una “quimera”. Estos embriones son posteriormente transferidos a úteros de hembras
seudopreñadas. Las crías nacidas a partir de
las quimeras son, generalmente, de diferente
color de pelaje que las provenientes de los
blastocistos donantes, con el fin de poder
diferenciar fácilmente a la progenie transgénica. Cuando las técnicas de recombinación
sitio-específica son utilizadas para reemplazar
genes funcionales en un determinado locus, se
habla de “knock-in”. Ejemplos de modelos de
ratones “knock-out” con relevancia biomédica
en Tabla 2 (3-6) (en Internet, ejemplos en http:
//www.biomednet.com/db/mkmd).
Tabla2:
Gen
Fenotipo
Leptina
Obesidad, hipogonadismo, infertilidad
Subunidad α glicoproteica
Hipogonadismo, hipotiroidismo
Hormona liberadora de tirotrofina
Hipotiroidismo
α Inhibina
Tumores de granulosa/Sertoli; infertilidad
Receptor de prolactina
Infertilidad en ambos sexos
Receptor de homona luteinizante
Organos sexuales atrofiados, infertilidad
en ambos sexos
Receptores de estrógenos α/β
Múltiples alteraciones reproductivas
Química Montpellier
Modelos representativos ratones “knock-out”:
• 43
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Química Montpellier
Figura 2: Producción de ratones “knock-out” por recombinación homóloga.
44 •
La estrategia basada en mutaciones dirigidas
nos permite estudiar fenómenos relacionados
con “pérdida de función”, opuestamente a
aquellos enfocados a la ”ganancia de función”,
logrados a través de técnicas de microinyección
pronuclear. Actualmente, la utilización de
ratones modificados genéticamente representa
una de las herramientas de investigación más
potentes y completas de las ciencias biológicas.
El constante desarrollo de innovadoras
metodologías transgénicas, permitirá avanzar
en la generación de nuevos y más eficientes
modelos animales de diferentes especies en
el futuro.
Bibliografía:
• Hogan B, Beddington R, Constantini F, Lacy E. Manipulating the mouse
embryo. A laboratory manual. Second edition. Spring Cold Harbor
Laboratory Press, NY, 1994.
• Palmiter RD, Brinster RL, Hammer RE, Trumbauer ME, Rosenfeld MG,
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and where will they lead us? Endocr Rev 20:358-417, 1999.
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luteinizing hormone receptor function. Mol Cell Endocrinol 187:49-56,
2002.
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Principios de
Genética Médica
Mendelismo- Los organismos eucariontes
(organismos con membrana nuclear) poseen
un sistema genético diploide, lo cual implica
que el genoma de un individuo fue recibido por
mitades de cada uno de sus dos progenitores.
La aparición de la meiosis es el fenómeno
evolutivo esencial para el establecimiento de un
sistema diploide bisexual. El proceso meiótico
tiene dos finalidades. En primer lugar generar
un proceso de recombinación entre los dos
cromosomas homólogos de cada par, y luego
efectuar un mecanismo reduccional por el cual
la gameta madura solo recibe un cromosoma
de cada par, el cual es una mezcla de los dos
elementos existentes en la célula diploide.
En el proceso de fertilización la unión de las
dos gametas haploides genera un embrión
diploide.
Los genes ubicados en un mismo cromosoma se denominan sinténicos. Durante la
re-combinación meiótica se intercambian
segmentos cromosómicos (crossing-over)
entre los dos cromosomas homólogos
(segregación). En consecuencia, las chances de
intercambio de genes entre los dos miembros
de un par cromosómico es una cuestión
probabilística. Cuanto mas alejados estén dos
genes sinténicos mayores serán las probabilides
de que se separen por recombinación.
Opuestamente, aquellos genes sinténicos
que se encuentren cercanos segregarán en
forma conjunta y se identificarán como genes
ligados, o en desequilibrio de ligamiento.
El nivel de ligamiento génico es inversamente
proporcional a la distancia que separa dos
genes; en general a 1 megabase de distancia
intergénica (megabase o Mb = 1 x 106 pares
de bases) las probabilidades de recombinación
serán de 1% y estas chances aumentarán, hasta
llegar a una segregación al azar o equilibrio
de ligamiento cuando la distancia que separa
dos genes sinténicos excede los 50-60 Mb. La
recombinación al azar de los genes ubicados en
distintos cromosomas o de los genes sinténicos
en equilibrio de ligamiento constituye la ley
de segregación independiente o segunda
ley de Mendel.
Los cromosomas son unidades discretas
formadas por ADN y proteínas. El ADN es
constante mientras que la asociación de éste
con las proteínas varía y depende del estadio
del ciclo celular y del estado de funcionamiento
del gen. En el ser humano existen 23 pares
cromosómicos y, con excepción del par XY que
será descrito en detalle más adelante, todos los
demás pares son homólogos (similitud entre
los dos elementos de un par). Dentro de un par
cromosómico homólogo existen lugares o loci
(locus en singular) donde se ubican los genes
homólogos o alelos (genes que codifican
una determinada proteína o controlan una
determinada función). En ocasiones, los genes
homólogos pueden tener múltiples alelos, por
variación en su composición de nucleótidos,
pero solamente dos de ellos, uno por cada locus
cromosómico homólogo, estarán presentes en
un individuo. Cuando los dos alelos homólogos
de un individuo son iguales, el locus se definirá
Química Montpellier
Néstor O. Bianchi y Alejandro D. Bolzán
• 45
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Química Montpellier
como homocigota. En el caso de que cada
locus esté ocupado por un alelo diferente,
el individuo será heterocigota para dicho
locus.
El gen CYP2D6 correspondiente a la familia
de genes del complejo citocromo P450 es un
ejemplo de polialelismo (los acrónimos que
identifican los genes se escriben con
todas las letras en mayúscula en los seres
humanos y con la primera letra mayúscula
y las demás en minúscula en las otras
especies). En el ser humano CYP2D6 posee
14 alelos que difieren en su composición de
bases y en sus acciones fenotípicas. La función
de CYP2D6 es metabolizar más de un 30%
de los compuestos químicos exógenos que se
incorporan al organismo. En consecuencia, de
acuerdo al par de alelos que posea un individuo
será un metabolizador rápido, intermedio
o lento para distintos agentes químicos y
mostrará sensibilidad y/o resistencia variables
a distintos compuestos medicamentosos.
En un locus heterocigota puede suceder que
un único alelo de los dos alelos homólogos sea
suficiente para cumplir su función y expresarse
en el fenotipo. A dicho alelo se lo llama
dominante. En otros casos, para que aparezca
un efecto en el fenotipo, se requiere la acción
sumatoria de dos alelos iguales (homocigosis) y
en estas condiciones los alelos se definen como
recesivos. Finalmente, puede acontecer que en
un individuo heterocigota cada uno de los dos
alelos diferentes tenga efectos en el fenotipo.
En esta eventualidad los dos genes homólogos
se definen como co-dominantes. Dominancia
y recesividad corresponden a la primera ley
de Mendel.
46 •
Cuando todos los portadores de un gen
dominante en condición heterocigota o de
un gen recesivo en condición homocigota
muestran la manifestación fenotípica del
gen se dice que la penetrancia génica es
completa. Alternativamente, cuando parte de
los individuos portadores de un gen dominante
o de un par de alelos recesivos muestran acción
fenotípica de estos genes la penetrancia del
gen es incompleta y el grado de penetrancia
se expresa como porcentaje de individuos que
muestran manifestaciones fenotípicas del gen
en relación al total de individuos que son
portadores del gen en cuestión.
La acción fenotípica de un gen dominante
o de un par de alelos recesivos puede ser
similar en todos los portadores; en tal caso
se habla de expresividad génica constante.
Cuando el fenotipo de los portadores difiere
(pleiotropismo) la expresividad del gen es
variable. En el caso de enfermedades con
componente genético, la expresividad variable
corresponde a las distintas formas clínicas de
la afección. La penetrancia y expresión de un
gen pueden ser moduladas por la acción de
otros genes (mecanismo epigenético), por
metilación génica o factores ambientales.
La hiperplasia endocrina múltiple tipo 2
(MEN2 por multiple endocrine neoplasia) es un
síndrome hereditario dominante originado por
mutaciones del proto-oncogene RET ubicado
en 10cen-10q11.2 (ver más adelante el sistema
de nomenclatura cromosómica). La afección
se caracteriza por la asociación de carcinoma
medular de tiroides, hiperplasia o adenoma
de paratiroides con hiperparatiroidismo y
feocromocitoma. La penetrancia del gen es
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Mutaciones- Se denomina mutación a
cualquier cambio en el ADN que se transmita a
las células hijas o a generaciones subsiguientes y
que no sea debido a la recombinación meiotica.
El tipo de mutación más frecuente es el cambio
de una base por otra. Cuando este reemplazo
ocurre entre bases complementarias (A↔T o
C↔G) la mutación se denomina transición; si
ocurre entre bases no complementarias (A↔
G o G↔T) es una transversión. La relación
de frecuencia de transiciones a transversiones
es de 20 a 1. En conjunto los cambios de
base en el ADN son identificados por el
acrónimo SNPs derivado de “single nucleotide
polymorphisms”. En total se han descripto
aproximadamente dos millones de SNPs, lo cual
implica, en promedio, un cambio de base por
cada 1500 nucleótidos del genoma. Además,
se estima que unos 20.000 SNPs ocurren en
los genes produciendo cambio de codones
y la producción de proteínas anormales por
incorporación de aminoácidos no canónicos
en la cadena polipeptídica. En otros casos
el cambio de base ocurre en una posición
del codón (generalmente la 3ª, y menos
frecuentemente la 2ª posición) que no altera
el tipo de aminoácido codificado. En estas
circunstancias el polipéptido producido por
el gen no cambia y la mutación se denomina
silenciosa. En ocasiones los cambios de
base pueden ocurrir en una región del intron
involucrada en el procesamiento, lo cual
puede generar procesamiento alternativo con
producción de proteínas anormales.
Otros tipos de mutaciones son las inserciones o pérdidas (deleciones) de uno o unos
pocos nucleótidos. Cuando esta alteración
ocurre en un exon genera un corrimiento en
la lectura de los codones a partir del punto de
la inserción/deleción y una expresión anormal
del gen.
Química Montpellier
completa para el carcinoma de tiroides, por
lo tanto en niños con antecedentes familiares
de MEN2 se aconseja efectuar la búsqueda de
mutaciones en RET y si estas se encuentran,
efectuar una tiroidectomía y paratiroidectomía
preventivas. En relación al feocromocitoma, la
penetrancia es incompleta. Recientemente se ha
encontrado que el desarrollo de feocromocitoma
en varios de los casos con MEN2 depende de
la coexistencia de mutaciones en RET con
mutaciones en un segundo gen supresor de
tumores denominado VHL, el cual mapea
en 3p25-26. En consecuencia, la aparición
de feocromocitoma en algunos casos con
síndrome MEN2 depende de un mecanismo
epigenético por interacción de dos genes.
La diabetes tipo MODY (maturity-onset
diabetes of the young) tiene transmisión
hereditaria dominante y penetrancia
incompleta. La forma más frecuente de MODY
se debe a la mutación del gen HNF-1 alpha
(hepatocyte nuclear factor) ubicado en 12q.
Sin embargo, existen otras formas de MODY
originadas por mutaciones de HNF-1 beta,
HNF-4 alpha, IPF-1 (insulin promoter factor-1)
o ND1-beta 2 (neuro D1). Las formas clínicas de
MODY varían según la mutación causante. En
estos casos no se trata de expresividad variable,
sino de seudo-expresividad variable por
mutaciones en genes diversos con expresión
fenotípica similar.
• 47
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Química Montpellier
La mutación más frecuente en la fibrosis
quística es una deleción de tres pares de bases,
denominada ΔF508 la cual ocurre en el exon
10 del gen CFTR. Asimismo, deleciones en
la región codificante del gen SRY dan lugar
anomalías en la diferenciación de la gónada
embrionaria y la aparición de mujeres XY con
disgenesia gonadal.
En el dominio de un gen (se denomina
dominio al segmento de ADN que comprende
a los exones, intrones y estructuras reguladoras
de un gen) pueden existir tripletes que se
repiten en tandem de 5 a 50 veces. Cuando
estos repetidos ocurren en un exon dan lugar
a polipéptidos con secuencias de aminoácidos
idénticos. Por causas no bien establecidas,
en la línea germinal de algunos individuos
acontece un aumento en el número de
tripletes repetidos lo cual produce gametas
con cientos de repeticiones o expansión
de tripletes. Los individuos resultantes del
proceso de fertilización con estas gametas
tienen deficiencia o falta de expresión del gen
que contiene la expansión de tripletes en su
48 •
dominio.El síndrome de X frágil (FRAXA), el
cual es la causa más frecuente de discapacidad
mental en niños después del síndrome de
Down, se debe a una expansión del triplete
CGG del gen FMR-1 del cromosoma X, con un
aumento en el número de repetidos de 5-50
en individuos normales a más de 200 en casos
con FRAXA. En la distrofia miotónica el triplete
GCT, ubicado en el dominio del gen miotoninaproteína- kinasa (MPK) se expande de unas
10-30 copias a más de 200 copias. La corea
de Huntington acontece por una expansión de
cientos de veces del triplete CAG en el dominio
de un gen ubicado en 4p16.3. La ataxia de
Friedreich, la atrofia muscular espino-bulbar y
la enfermedad de Machado-Joseph son otras
de las enfermedades causadas por expansión
de triplete. En general, en estas afecciones, la
expansión de triplete se acentúa en la línea
germinal del paciente, lo cual genera en su
descendencia el fenómeno de anticipación,
caracterizado por la aparición de la enfermedad
en edades más tempranas y con síntomas mas
graves que los observados en el progenitor.
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
extensión. Cada nucleosoma más un segmento
internucleosómico totalizan 206 bp y esta hilera
de cuentas o fibrilla primaria de cromatina
tiene un diámetro de 11 nm (nm = 1 x 10 -9 mt).
En el siguiente estado de empaquetamiento la
fibrilla primaria se enrolla formado una serie
de solenoides con aspecto de un resorte en
espiral; cada vuelta del solenoide comprende
6-8 nucleosomas y la estabilidad del solenoide
se mantiene mediante la unión de moléculas de
histona H1 a la parte externa de la estructura
en espiral formando la fibrilla de cromatina
secundaria de 30 nm de diámetro (Figura 2).
La fibrilla de cromatina de 700 nm de diámetro,
característica de las regiones hetero-cromáticas
del núcleo en interfase, se origina mediante un
enrollamiento adicional de la fibrilla secundaria.
Finalmente, el máximo nivel de condensación y
empaquetamiento se observa en el cromosoma
en estadio de metafase; una unidad de longitud
de la fibrilla de 1400 nm del cromosoma
metafásico equivale aproximadamente a
50.000 unidades de longitud de la cadena
de ADN.
Figura 1. Nucleosoma. En el centro se ve el octámero formado
por 2 moléculas de H2A (verde), H2B (amarillo), H3 (rojo), H4 (marrón).
En el exterior del octámero se enrolla la cadena de DNA.
Química Montpellier
Fibrilla de cromatina, cromosomas- La
cantidad promedio de ADN de un cromosoma
humano de tamaño mediano equivale aproximadamente a 1.3 x 108 pares de bases. La
distancia entre dos nucleótidos consecutivos en
una cadena de ácido nucleico es de 3.4 Ångstrom
(Å = 1 x 10 -10 mt); por lo tanto la extensión
de la molécula de ADN en un cromosoma
promedio es aproximadamente 5.5 cm. Una
célula diploide humana tiene 46 cromosomas
y el ADN del complemento diploide debe ser
acomodado en el núcleo, el cual es una esfera
de unos 5-8 μm de diámetro. Para resolver
este problema topológico la célula emplea
niveles crecientes de enrollamiento del ADN.
En un primer estadio se forma una fibrilla
tipo hilera de cuentas, donde cada cuenta
es un octámero formado por cuatro pares
de moléculas de histonas de las variedades
H2A, H2B, H3 y H4. La cadena de ADN da
13/4 vueltas alrededor del octámero formando
el nucleosoma (Figura 1), el cual se conecta
a los dos nucleosomas vecinos en la cadena
mediante un segmento de ADN de 60 bp de
• 49
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Figura 2- Fibrilla de cromatina de 30 nm. Las estructuras roja y azul representan proteínas de
asociación con la membrana nuclear (rojo) o con otras fibrillas de cromatina (azul).
Modificado de : www.average.org~pruss.nucleosomes/html
Química Montpellier
Además de la fibrilla de cromatina, los
cromosomas tienen otras dos estructuras
esenciales: los telómeros y el centrómero.
Los extremos de los cromosomas de los
vertebrados comprenden los telómeros, los
cuales están formados por miles de repeticiones
en tandem del hexámero 5’-TTAGGG-3’. En las
células humanas, la longitud de los telómeros
varía entre 5 a 20 Kb La función principal
de estas estructuras es facilitar la replicación
del ADN en las regiones terminales de los
cromosomas.
Durante cada ciclo de replicación del ADN se
pierden algunos de los hexámeros del telómero,
los cuales son repuestos por la acción de la
enzima telomerasa.
50 •
La caída en los niveles de telomerasa y la
subsiguiente disminución en el número de
hexámeros en los telómeros es parte del proceso
de envejecimiento celular. Opuestamente, en
la transformación celular cancerosa existe
una marcada actividad de telomerasa la cual
asegura la reposición de hexámeros en los
telómeros de las células en división
La segunda estructura constante de los
cromosomas es el centrómero. El ADN en la
zona del centrómero de los primates y del ser
humano está formado por repeticiones de
una secuencia de unos 171 bp constituyendo
el ADN alfoide, el cual es específico para cada
par cromosómico (debido a esta especificidad
el DNA alfoide se utiliza para la identificación
cromosómica mediante técnicas de FISH, ver
más abajo). Durante la profase y metafase
mitóticas, el cromosoma ya dividido consiste de
dos cromátidas que se mantienen asociadas por
el centrómero. Asimismo, un conjunto de varias
proteínas se asocia con la fibrilla de cromatina
en la región del centrómero formando el
kinetocoro, al cual se conectan las fibras del
huso mitótico promoviendo la separación de
las dos cromátidas durante la anafase.
El estudio de los cromosomas y de sus
anomalías se denomina citogenética.
Las anomalías cromosómicas son responsables de una gran proporción de enfermedades
genéticas, observándose en alrededor de 1/150
nacidos vivos, y constituyen la causa principal
de retraso mental y de aborto espontáneo.
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Los estudios citogenéticos se realizan
en extendidos de cromosomas en etapa de
metafase. La concentración de células en este
estadio se obtiene mediante tratamiento de 1-3
hs. de las células vivas con colchicina, la cual
inhibe la formación del huso mitótico e impide
la progresión de la mitosis más allá de la etapa
de metafase. Luego las células se distienden
con solución hipotónica, se fijan y se realizan
extendidos, los cuales se tiñen con Giemsa o
algún otro colorante apropiado. En los cromosomas metafásicos el centrómero permite
dividir al cromosoma en un brazo largo (q) y
un brazo corto (p), y clasificar los cromosomas
en metacéntricos, submetacéntricos, subterminales y acrocéntricos de acuerdo a que
el centrómero esté en posición mediana o
progresivamente desplazado hacia uno de los
extremos.
Se denomina cariotipo a la presentación de
los cromosomas ordenados por tamaño y forma
(en función de la posición del centrómero). El
cariotipo normal de una mujer se designa 46XX
y el de un varón normal, 46XY.
En el cariotipo humano los pares cromosómicos 1-3 (grupo A) son metacéntricos
largos (centrómero en posición más o menos
mediana), los pares 4-5 (grupo B) subterminales largos (centrómero cercano a un telómero),
los pares 6-12 y X (grupo C) submetacéntricos
medianos (centrómero desplazado de la
posición mediana), los pares 13-15 (grupo
D) acrocéntricos medianos (centró-mero muy
cercano a un telómero), los pares 16-18 (grupo
E) submetacéntricos pequeños, los pares 1920 (grupo F) metacéntricos pequeños, y los
pares 21-22 más el cromosoma Y (grupo G),
acrocéntricos pequeños.
En el período inicial de la Citogenética
sólo era posible determinar con seguridad el
número cromosómico e identificar algunos
pares cromosómicos por su tamaño y ubicación del centrómero. Sin embargo, para otros
pares cromosómicos la identificación era
tentativa, ya que el tamaño total y de cada
brazo no eran propiedades suficientes para
una caracterización exacta del cromosoma.
Debido a estas limitaciones, el análisis preciso de las anomalías cromosómicas era en
ocasiones dificultoso. Recién a partir de la
década 1970-1980 fue posible identificar con
exactitud cada uno de los pares cromosómicos,
gracias al desarrollo de las llamadas técnicas
de bandeo.
Mediante una ligera digestión con tripsina de los extendidos cromosómicos y la
subsiguiente tinción con Giemsa se induce
la aparición de una secuencia de bandas
cromosómicas oscuras y claras, denominadas
bandas G por Giemsa; estas bandas son
constantes y específicas de cada par cromosómico permitiendo la identificación de los
mismos. Las bandas G oscuras son ricas en
bases AT y contienen la mayor parte de los
genes específicos de tejidos (genes activos en
un, o unos tejidos y silenciosos en los demás).
Las bandas claras son ricas en AG y en ellas se
encuentran los genes constitutivos (genes
activos en todos los tejidos). El número total
de bandas G en el complemento cromosómico
humano depende del grado de elongación del
cromosoma, el cual a su vez es inversamente
proporcional al tiempo de tratamiento con
colchicina. Los cromosomas con condensación
mediana muestran aproximadamente unas
400 bandas. A mayor elongación se observa
que algunas bandas están formadas por dos
o más bandas oscuras y las correspondientes
interbandas claras, con un total de unas 550
bandas por cariotipo. Finalmente el número de
bandas en un complemento con cromosomas
de elongación máxima es aproximadamente
850. Cabe señalar que el bandeo G es el más
utilizado en la clínica médica.
Química Montpellier
Si bien a mediados del siglo XIX fue posible
visualizar los cromosomas al microscopio, recién
a partir de la década de 1950 se desarrollaron
las técnicas que permitieron una mejor
visualización e identificación de los cromosomas
humanos. En efecto, la ciencia de la citogenética humana moderna data de 1956, cuando
Tjio y Levan, empleando técnicas efectivas para
el análisis cromosómico establecieron que el
número normal de cromosomas humanos es
46. Desde entonces, el análisis cromosómico se
ha convertido en un procedimiento diagnóstico
importante en la medicina clínica.
• 51
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Las bandas G han generado un sistema
de nomenclatura cromosómica que se usa de
referencia pare indicar la posición de los genes
en el cromosoma. Para un número total de
400 bandas el cromosoma se identifica por
su numeración; a continuación se identifica
el brazo (p o q); las bandas o regiones
se numeran consecutivamente desde el
centrómero hacia los extremos de los brazos;
convencionalmente el centrómero es la región
10 y la primera región y banda hacia q o p es
la 11 y así sucesivamente. Un ejemplo ilustrará
el sistema: 1p31 indica el cromosoma 1, brazo
corto, región 3, banda 1. Para números totales
de 550 y 850 bandas se agregan sub-bandas
numeradas consecutivamente a partir del
centrómero; los números de las sub-bandas se
indican después de un punto. Así, por ejemplo,
para 550 y 850 bandas 1p31 se transforma en
1p31.1, 1p31.2 y 1p31.3 por la sub-división de
la banda 1 en tres sub-bandas (1-3).
Química Montpellier
En el sitio de INTERNET
www.pathology.washington.edu/
cytopages pueden obtenerse los esquemas
de los bandeos cromosómicos G para 400,
550 y 850 bandas y el detalle completo de
nomenclatura para cromosomas normales.
52 •
Química Montpellier
Las bandas Q y H son similares a las bandas
G y son inducidas por tinción con los colorantes
fluorescentes quinacrina o Hoescht los cuales
se unen preferentemente a las regiones ricas
en AT. Tienen la desventaja de que para su
visualización se requiere de un microscopio de
fluorescencia y que este bandeo desaparece
más o menos rápidamente, a diferencia de las
bandas G que son permanentes. Las bandas
C son inducidas por tratamientos suaves con
álcali y coloración con Giemsa. Revelan las
zonas heterocromáticas ricas en secuencias
repetidas, y por lo tanto en el ser humano
aparecen preferentemente en las regiones
pericentroméricas. Existen además otros tipos
de bandeo cromosómico, tales como el bandeo
por enzimas de restricción y el bandeo NOR
(nucleolar organizing regions) el cual identifica
regiones nucleolares con genes ribosómicos
activos; estas técnicas de bandeo son poco
empleadas en citogenética clínica y tienen
mayor uso en investigación.
Hacia mediados de la década de 1980
se dio un gran avance en el campo de la
citogenética, con la aparición de la técnica
de hibridación in situ fluorescente (FISH,
fluorescence in situ hybridization), producto
de la combinación de la citogenética con la
genética molecular. El empleo de FISH permite
la identificación precisa de cromosomas enteros
o regiones cromosómicas, y por ende, facilita
la detección de anomalías tanto numéricas
como estructurales. La técnica de FISH
consiste en hibridar una sonda fluorescente con
cromosomas ya fijados y procesados. La sonda
es un segmento de ADN complementario de
regiones cromosómicas ricas en secuencias
repetidas. Empleando sondas afines a los
ADN alfoides puede identificarse cada par
cromosómico tanto en metafase, como
en cualquier otro estadio del ciclo celular,
incluyendo el núcleo en interfase. Asimismo,
usando sondas marcadas con compuestos que
emiten fluorescencia con longitud de onda
diferente pueden reconocerse con facilidad
los distintos cromosomas por diferencias
de color, sin tener que recurrir al empleo
de bandas G, las cuales requieren cierto
nivel de entrenamiento del observador. Para
individualizar la región cromosómica en la cual
híbrida la/s sonda/s se utiliza un microscopio
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Entre otras cosas, el FISH es de gran utilidad
para el diagnóstico prenatal de Síndrome
de Down (ver más abajo) pues permite
rápidamente identificar el centrómero de los
tres cromosomas 21 en las células en interfase
del líquido amniótico, sin tener que esperar
los 10 a 15 días que se requieren para cultivar
estas células y analizar los cromosomas en
metafase.
Existe actualmente una gran variedad de
sondas para FISH, lo que facilita la identificación
y análisis de las anomalías cromosómicas, tanto
numéricas como estructurales. De este modo,
las llamadas sondas de pintura cromosómica
(sondas para cromosomas enteros o whole
chromosome painting, como las que se
muestran en la Figura 3, marcadas con un
fluorocromo rojo -Texas Red- y uno verde –FITC) permiten identifican pares de cromoso-mas
específicos y por lo tanto, facilitan la detección
de translocaciones recíprocas y no recíprocas
o inserciones.
Este tipo de sondas, puede utilizarse
también para determinar el número de copias
de un cromosoma específico (por ejemplo, el
21 en el Síndrome de Down) lo que permite
analizar la pérdida o ganancia de cromosomas
(anomalías numéricas) en células en interfase.
La sonda pancentromérica (constituida por una
selección de secuencias alfoides que hibridan
simultáneamente con todos los centrómeros)
permite la identificación y análisis de cromosomas dicéntricos o multicéntricos y en anillo.
Figura 3: FISH (pintura cromosómica) sobre metafase humana normal con sondas específicas para los
cromosomas 1 (rojo, Texas Red) y 2 (verde, FITC). El resto de los cromosomas se observa de color azul
debido a la tinción con el fluorocromo DAPI. (Foto: Dr. Bolzán).
Química Montpellier
de fluorescencia, equipado con los filtros
adecuados al fluorocromo empleado para
marcar cada sonda.
• 53
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Química Montpellier
Las sondas centrómero-específicas están
constituidas por secuencias alfoides específicas
para cada par cromosómico, y permiten
detectar la presencia y número de copias
de un determinado cromosoma, ya sea en
metafase o en interfase (Figura 4). Las sondas
teloméricas o subteloméricas son específicas
para cada par y para cada brazo cromosómico,
y permiten identificar translocaciones a nivel
subtelomérico, frecuentes en enfermedades
relacionadas con trastornos neurológicos.
Las sondas brazo-específicas, permiten la
identificación de inversiones pericéntricas
(es decir, que incluyen al centrómero),
mientras que existen sondas que identifican
54 •
determinadas bandas cromosómi-cas, y que
permiten identificar la presencia de inversiones
paracéntricas (es decir, que no incluyen al
centrómero).
Cabe señalar que existen kits comerciales de
pintura cromosómica que permiten detectar en
forma simultánea varios pares de cromosomas
humanos, ampliando así el espectro de análisis
en cuanto a número de cromosomas se refiere,
a lo que se agrega el desarrollo más reciente
de kits que permiten, mediante el uso de
un equipamiento adecuado, la detección
simultánea de todos los pares de cromosomas
humanos en una misma metafase (FISH de 24
colores, M-FISH, Rx-FISH y SKY-FISH).
Figura 4: FISH sobre metafase e interfase humanas normales con sondas de DNA alfoide (centrómeroespecíficas) para los cromosoms 8 (FITC, verde) y 17 (Rodamina, rojo). Contratinción con DAPI.
Foto: Qbiogene (USA)..
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
de los otros cromosomas, por lo tanto será
el último integrante del complemento en
iniciar y terminar la duplicación del ADN. En
el momento de la inactivación, la elección del
X a heterocromatinizar (X de origen paterno
o materno) es al azar para cada célula. Sin
embargo, una vez elegido el X a inactivar la
progenie de la célula mantendrá silencioso
al mismo cromosoma X. Por lo tanto, los
mamíferos hembras son un mosaico con dos
líneas celulares: una con el X paterno y otra
con el X materno inactivo. En los casos en que
existen cromosomas X en exceso, solamente
un cromosoma X se mantiene activo, con lo
cual se cumple el proceso de compensación
de dosis, lo que se expresa con la ecuación:
Xht = nX -1, donde ht indica heterocromático
y n indica número). La translocación de XIST
a un autosoma puede generar la inactivación
del autosoma; un cromosoma X reordenado
siempre se inactiva, salvo que se pierda el XIST
y no pueda producirse la inactivación..
Si una mutación recesiva esta ligada al X
(X*) el varón X*Y padecerá la enfermedad.
Las mujeres X*X serán un mosaico con X*
activo/X inactivo y viceversa; en consecuencia
no padecerán, o tendrán formas atenuadas
de la afección. Los varones X*Y tendrán
descendencia masculina normal (esperma
Y con ovocito X) y descendencia femenina
portadora (esperma X* con ovocito X). La
hemofilia, la ceguera al color y el síndrome de
X frágil (FRAXA) son ejemplos de enfermedades
ligadas al sexo. La distrofia muscular de
Duchenne y el testículo feminizante también
son enfermedades ligadas al sexo; sin embargo,
por letalidad en la primera y por infertilidad en
la segunda no puede observarse la forma de
transmisión de la afección por vía masculina.
Química Montpellier
Cromosomas Sexuales, Compensación
de Dosis y Enfermedades Ligadas al SexoEn los mamíferos el sexo heterogamético
(XY) es el masculino y el homogamético (XX)
el femenino.
En casi todos los mamíferos el cromosoma X
mide el 5% del conjunto cromosómico haploide
mientras que el cromosoma Y es siempre más
pequeño. En el ser humano el cromosoma Y
mide 1,2 a 1,6% del conjunto haploide, y por
lo tanto el genoma de las mujeres es 3,2 a
3,8% mayor que el genoma de los varones.
Para compensar esta diferencia de tamaño o
dosis del genoma, en la mujer se inactiva un
cromosoma X de tal manera que en ambos
sexos solamente existirá un único cromosoma
X activo o hemicigótico (expresión de un
solo gen, por lo cual no existe ni dominancia
ni recesividad). En el ser humano, la inactivación
de un cromosoma X ocurre aproximadamente
en el día 16 post-fertilización, cuando el
embrión femenino tiene unas 500-1000
células y se halla en la etapa de gástrula. La
inactivación del X depende del gen XIST (X
inactivation specific transcript).
En el momento de la inactivación del X,
uno de los alelos XIST se inactiva por causas no
bien conocidas (probablemente por la acción
epigenética de otro gen) y el cromosoma
X con el gen XIST inactivo mantiene todos
sus otros genes activos. Opuestamente, en
el otro cromosoma X, la expresión de XIST
produce un mRNA no codificante que tiene
la función de silenciar los demás genes del
cromosoma. El cromosoma X inactivo se
mantiene condensado (heterocromático)
durante la interfase produciendo la cromatina
sexual o corpúsculo de Barr. Durante la
replicación, el X inactivo debe decondensarse
a partir de una conden-sación mayor que la
• 55
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Síndromes por aberraciones cromosómicas- A partir del descubrimiento por Lejeune
y cols. (1959) de que el Síndrome de Down
estaba asociado a la presencia de un cromosoma del grupo G en exceso (el cromosoma 21),
nació la llamada Citogenética clínica, que
trata de la relación entre Síndromes clínicos
y anomalías cromosómicas. Como ya se
mencionó, las anomalías cromosómicas pueden
ser numéricas o estructurales, y afectan a los
autosomas o a los cromosomas sexuales.
Algunas generalidades vinculadas a los
síndromes por aberraciones cromosómicas
son las siguientes:
A- Los síntomas de los síndromes por anomalías
cromosómicas son debidos a desequilibrio
de dosis génica (más de dos genes en los
casos de aumento en el número de cromosomas o regiones cromosómicas; un
único gen [haploinsuficiencia] en los casos
de ausencia de un cromosoma o región
cromosómica).
B- Las alteraciones de número de los cromosomas sexuales son siempre menos deletéreas que las alteraciones de número de
los autosomas.
C- Las aberraciones cromosómicas con efectos
fenotípicos más acentuados terminan en la
pérdida del embrión. Solamente son viables
las aberraciones menos deletéreas.
Química Montpellier
D- Algunos síntomas son comunes a gran
parte de los síndromes por aberraciones cromosómicas; p.ej.: retardo de crecimiento,
microcefalia, retardo mental, implantación
baja de orejas.
56 •
E- En los casos de trisomías (un cromosoma en
exceso), monosomías (un único cromo-soma
de un par cromosómico) o en los síndromes
por pérdida de un brazo o segmento
cromosómico la mayor parte de los síntomas
se deben al desequilibrio de dosis de una
región crítica y no al desequilibrio de dosis
de todo el cromosoma o región en exceso o
deficiente. Así, por ejemplo, en el síndrome
de Down, gran parte de los síntomas se
debe al aumento de dosis de los genes en
la banda 21q22.3 y no a la presencia de un
cromosoma 21 en exceso.
F- Gran parte de los procesos cancerosos
muestran alteraciones de número y
estructurales de los cromosomas, las
cuales son con frecuencia específicas de la
afección.
Principales Síndromes por aberraciones
cromosómicas- La cantidad de afecciones por
anomalías cromosómicas es muy extensa por lo
cual sería imposible detallarlas en este fascículo.
No obstante, vamos a señalar brevemente
los principales Síndromes por aberraciones
cromosómicas, recomendando al lector
dirigirse al sitio de OMIM (Online Mendelian
Inheritance in Man) en INTERNET, donde
entrando por nombre de enfermedad, sitio cromosómico o acrónimo de gen puede obtener
la descripción clínica y la causa cromosómica
o génica de todas las enfermedades con
componente genético. Además, el sistema
de nomenclatura completo para aberraciones
cromosó-micas humanas puede consultarse en:
An Internacional System for Human Genetic
Nomenclature, Editor F. Mitelman, Editorial
Karger, 1995.
A-Síndromes por anomalías autosómicas:
1-Numéricas (Están asociadas generalmente
a edad materna avanzada y se originan en
su mayoría por no disyunción en meiosis I
materna).
Síndrome de Down o trisomía 21: Es
la patología de origen cromosómico más
frecuente en relación al retardo mental, siendo
su incidencia de 1/700 recién nacidos.
Síndrome de Edwards o trisomía 18:
Tiene una frecuencia de 1/6000 a 8000 recién
nacidos. De éstos, sólo un 10 % sobrevive al
año de vida.
FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Síndrome de Patau o trisomía 13: Su
frecuencia es de 1/13000 recién nacidos. Sólo
el 5 % vive más de tres años.
2-Estructurales (En la mayor parte de los casos,
aparecen “de novo”).
Síndrome de Wolf: Se identifica citogenéticamente por una deleción del brazo corto del
cromosoma 4.
Síndrome de Cri du Chat: Se identifica
citogenéticamente por una deleción del brazo
corto del cromosoma 5.
enumeración y descripción de estos síndromes
excede el marco de este fascículo. Un detalle de
los síndromes por aberraciones cromosómicas
puede encontrase en: Schinzel, A. Catalogue of
unbalanced chromosome aberrations in man.
1ª Edición pp. 963, 2001 y en el capítulo 14
del libro Genética Humana, de A. J. Solari, Edit.
Panamericana, 1999, 2ª. Edición.
Cuándo debe solicitarse un estudio
cromosómico- A continuación se enumeran
los casos en los cuales es aconsejable indicar
un estudio cromosómico:
Diagnóstico prenatal
1-Numéricas
Síndrome de Turner: Su incidencia es
de 1/2500 recién nacidos (mujeres). Es una
monosomía del cromosoma X. El 99 % de
las concepciones 45,X terminan en aborto
espontáneo. No existe relación con edad
materna avanzada. El 50 % de los casos
posee cariotipo 45,X, mientras que el 50 %
restante posee mosaicismo. En un 75 % de
los casos, el cromosoma X ausente es el de
origen paterno.
Síndrome XXX: Su incidencia es de 1/1000
recién nacidos. Su aparición se relaciona con
edad materna avanzada.
Síndrome de Klinefelter: Su incidencia es
de 1/1000 recién nacidos. Su aparición puede
ser debida a edad materna avanzada, o a no
disyunción en la meiosis paterna. El 80 % de
los casos presente un cariotipo 47,XXY.
Síndrome XYY: Su incidencia es de 1/1000
recién nacidos.
2-Estructurales:
Existen diversas patologías asociadas a
alteraciones estructurales de los autosomas
y cromosomas sexuales. Sin embargo la
A- Embarazo de mujeres añosas (más de 35
años de edad).
B- Embarazadas con antecedentes familiares
de síndromes por aberraciones cromosómicas.
C- Embarazadas con antecedentes familiares
de enfermedades hereditarias de etiología
desconocida, con el fin de descartar
cromosomopatías.
En pediatría
A- Malformaciones congénitas.
B- Dismorfismo facial.
C- Retraso de desarrollo psicomotor
D- Estatura baja y/o retardo de crecimiento.
E- Pubertad retardada.
En obstetricia y ginecología
A- Abortos recurrentes.
B- Infertilidad masculina con o sin atrofia
testicular.
C- Esterilidad femenina.
Química Montpellier
B-Síndromes por anomalías en los
cromosomas sexuales:
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FISIOPATOLOGIA ENDOCRINA: Bioquímica y Métodos Diagnósticos
Próximos Fascículos
Fascículo II :
Fascículo III :
Bases de la Inmunología en
Endocrinología. Interacciones
Inmuno-Endocrinas
Exploración de la Función
Endócrina.
Parte I. Carlos A. Fossati, Fernando G.
Chirdo, Guillermo H Docena y, Martín Rumbo
.
Parte II. Amada Segal-Eiras y María V.
Crocce.
Introducción a la
Endocrinología. Estructura
y Función de las Hormonas.
Secreción, Producción, Cinética
y Transporte Hormonal.
Ricardo S. Calandra
Cronobiología en
Endocrinología
Conceptos elementales del uso de
radioisótopos.
Mario A. Pisarev
Tipos de Ensayos.
María O. Suescun y Silvia I. GonzalezCalvar
Control de Calidad.
Zulema Farinati , Silvia Quiroga y
Martha Torres
Pruebas Funcionales y Valores
normales.
Sergio Damilano, Laura E.
Boero,Cecilia A. Fenili, Mirta S.
Gurfinkiel y Alberto G. Del Río
Daniel P. Cardinali
Hormonas. Mecanismos de
acción hormonal.
Hormonas Peptídicas
Guillermo J. Juvenal
Evaluación de un sistema
hormona-receptor
Juan C. Calvo
Química Montpellier
Hormonas Esteroideas
Isabel A. Luthy
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