Download Utilización de Marcadores Moleculares en el

Trigo
Utilización de Marcadores Moleculares en el
Mejoramiento de Trigo
Ings. Agrs. Mercedes
Nisi, Leonardo
Vanzetti, Carlos
Bainotti,
Beatriz Formica,
Jorge Nisi, Marcelo
Helguera
INTA Marcos Juárez,
Córdoba
Genes de Calidad y
Resistencia a Enfermedades
A partir de la incorporación de los marcadores moleculares
en el mejoramiento del trigo, es posible modificar el
escenario para reemplazar el concepto de producción de un
solo tipo de trigo de exportación (commodity) por el de
producción de especialidades con mayor valor agregado en
el componente tecnológico. También permite proteger el
cultivo contra enfermedades mediante la incorporación de
nuevas fuentes de resistencia a patógenos
La realidad actual enfrenta al mejoramiento
con la creciente demanda de diversificar la
producción de trigos en función de requerimientos industriales específicos (pan, pastas, galletitas, etc.) impulsada por sectores
del mercado interno e internacional; y con el
hecho de que las nuevas variedades de trigo
no permanecen mucho tiempo en el mercado
porque se vuelven susceptibles a patógenos.
Esto último es la resultante de la estrecha
variabilidad genética del cultivo para resistencia a patógenos -en general en el proceso
de mejora se priorizan aspectos relacionados
con adaptación a diferentes ambientes y rendimiento- y por otro lado, las nuevas condi-
ciones de manejo de cultivo pueden favorecer el desarrollo de hongos.
Una forma de resolver de modo eficiente esta
coyuntura consiste en complementar los programas de mejoramiento tradicionales con
herramientas biotecnológicas; los marcadores moleculares, el cultivo de tejidos y la
transformación genética son las de mayor
difusión en el cultivo de trigo. A partir de la
incorporación de estas herramientas en el
mejoramiento es posible modificar el escenario del trigo reemplazando el concepto de
producción de un solo tipo de trigo de exportación (commodity) por el de producción de
especialidades derivadas de trigo con mayor
l Figura 1. Patrones diferenciales de ADN producto de PCR para individuos portadores de alelos WxA1b, WxB1b y
WxD1b de trigo hexaploide. A. Marcador para el alelo WxA1b (waxy nulo genoma A), 1 Kern (normal), 2 TH7 (nulo),
3 Komugi Nourin67 (nulo), 4 Fumigi Komugi (nulo). B. Marcador para el alelo WxB1b (waxy nulo genoma B), 1 Buck
Brasil (normal), 2 Buck Farol (normal), 3 TH7 (nulo), 4 Buck Poncho (normal). C. Marcador para el alelo WxD1b
(waxy nulo genoma D), 1 Fumigi Komugi (normal), 2 Kern (normal), 3 TH7 (nulo), 4 Neepawa (normal). La punta de
flecha blanca indica el fragmento polimórfico ligado al carácter waxy en cada uno de los tres casos. M: en todos los
casos estándar de longitud de fragmentos de ADN. La punta de flecha negra indica fragmento de 500bp.
A
B
1
2
3
4
M
C
1
2
M
3
4
M
1
3
4
<
<
<
<
<
2
<
<
<
<
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valor agregado en el componente tecnológico y protegiendo el cultivo contra enfermedades mediante la incorporación de nuevas
fuentes de resistencia a patógenos como
roya de la hoja, fusariosis de la espiga, etc.
Todos estos casos tratan de la manipulación
de caracteres simples o genes principales de
caracterescomplejos,dondelabiotecnología
es, comparativamente, más eficiente que el
mejoramiento tradicional. No sucede lo
mismo con caracteres más complejos como
por ejemplo, tolerancia a salinidad, tolerancia a sequía, alto rendimiento, etc., donde el
mejoramiento tradicional es más efectivo.
La selección asistida por marcadores moleculares (SAM) es en la actualidad la vía más
económica para capitalizar el creciente caudal de información genómica de trigo y especies emparentadas e incorporar rápidamente
caracteres valiosos en un germoplasma cualquiera. Esta tecnología se basa en identificar
una secuencia singular o única de ADN (marcador molecular) cercana a un carácter de
interés agronómico (por ejemplo un gen de
resistencia a roya de la hoja). Una vez logrado, las plantas portadoras de ese carácter
agronómico son rápidamente seleccionadas
en poblaciones segregantes según presenten
o no el marcador. El proceso de selección
"molecular" se independiza del fenotipo y
del ambiente y puede hacerse en cualquier
estadio fenológico de la planta.
La mecánica de incorporar caracteres
agronómicos en un individuo utilizando marcadores moleculares no genera las controversias en la opinión pública que actualmente
poseen los organismos transgénicos. Países
como EE.UU., Canadá, Australia, Inglaterra y
Francia tienen incorporada la selección asistida por marcadores moleculares al mejoramiento tradicional de trigo para resolver problemas puntuales de calidad industrial y susceptibilidad a ciertas enfermedades. En la
Argentina, el Programa Nacional de
Mejoramiento de Trigo del INTA ha incorporado la SAM en las siguientes áreas de investigación:
GERMOPLASMA DE TRIGO CON CALIDADES
DIFERENCIADAS
Contenido de proteína en grano
La presencia de un gen principal proveniente
de una translocación de T. dicoccoides en el
l Figura 2. Separación de gliadinas de diferentes cultivares argentinos mediante electroforesis ácida (APAGE). Los cuatro grupos de gliadinas (ω, γ, β y α,
según su movilidad electroforética creciente) se indican
por llaves. En las calles, de izquierda a derecha: 1Prointa Colibrí; 2- Buck Panadero; 3- Coop. Liquén; 4Buck Pronto; 5- Buck Arriero; 6- Prointa Bon. Alazán; 7Baguette 10; 8- Klein Martillo.
1
2 3 4
5
6 7 8
cromosoma 6B de la variedad Glupro permite aumentar hasta un 13% el contenido
de proteína en grano sin afectar el rendimiento, característica deseable tanto para
trigos panaderos como para candeales.
Existen marcadores moleculares ligados a
este gen que permiten incorporar este
carácter en cualquier germoplasma
mediante un proceso de SAM. Actualmente,
el Instituto de Recursos Biológicos del
Centro Nacional de Investigaciones
Agropecuarias del INTA Castelar está incorporando este carácter en germoplasma
argentino siguiendo un programa de retrocruzas asistido por el marcador ligado.
Absorción de agua en harina a través de
modificacióndeladurezadelendospermade
grano
La textura del endosperma afecta marcadamente la dureza del grano de trigo y condiciona su uso industrial. Durante la molienda de granos con endosperma duro se
dañan físicamente los gránulos de almidón
mientras que la molienda de trigos blandos
produce harinas con gránulos de almidón
intactos. Las harinas con gránulos de
almidón dañado absorben mayor cantidad
de agua y son preferidas para la preparación de pan mientras que las harinas con
gránulos intactos absorben menos agua y
se prefieren para galletas dulces y bizco-
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chuelos. La textura del endosperma está
regulada por un complejo de proteínas
denominado friabilinas que incluye puroindolina A, puroindolina B (pinA y pinB) y una
tercer proteína llamada GSP (grain soft protein). Distintas mutaciones en pinA o pinB
han sido asociadas con granos de textura
de endosperma duro. En un trabajo se
observó que variedades de trigos duros con
pinA mutada son de textura más dura que
variedades con la mutante de pinB.
También, en 1999, científicos desarrollaron
marcadores moleculares que identifican las
mutantes de ambos genes. Estudios preliminares realizados en el IRB del INTA
Castelar sobre 101 variedades panaderas
argentinas presentaron en su totalidad dos
variantes genotípicas igualmente representadas: pinB mutada y pinA normal o la
inversa, pinA mutada y pinB normal, que es
lo esperable para trigos duros. Estrategias
para modificar el grado de textura de grano
podrían considerarse a partir de la manipulación de las variantes alélicas detectadas.
Por un lado, sería esperable un mayor
grado de dureza si se combinaran en un
genotipo ambas mutantes. Sin embargo,
dado el estrecho ligamiento entre los genes
que codifican estas proteínas, la probabilidad de detectar esta recombinante es muy
baja. Algo más sencillo de implementar es
el reemplazo de la combinación de puroin-
dolinas mutada y normal de una variedad
dura por una combinación de ambas
puroindolinas normales correspondiente a
una variedad blanda y de este modo
"ablandar" la textura de una variedad dura.
En el IRB del INTA Castelar y en la Estación
Experimental Agropecuaria Marcos Juárez
de INTA se han iniciando trabajos para convertir variedades duras en blandas, aptas
para galleta o bizcochuelo, siguiendo la
hipótesis de reemplazo de combinación de
puroindolinas duras por puroindolinas
blandas, ya que existe demanda harinera
para esta calidad diferenciada y no hay
material específicamente desarrollado en el
país.
Propiedades físico-químicas del almidón
El almidón de trigo tradicional está constituido por dos tipos de carbohidratos, amilopectina (78-65%) y amilosa (22-35%).
Cuando el almidón del grano se compone
exclusivamente de amilopectina adquiere
una textura cerosa al tacto y se lo conoce
como almidón waxy. La enzima GBSS (granule-bound starch synthase), codificada
por el locus Waxy (Wx) es responsable de la
síntesis de la amilosa del almidón. El trigo
hexaploide presenta tres loci Wx - Wx-A1a,
Wx-D1a y Wx-B1a - localizados en los brazos
cortos de los cromosomas 7A, 7D y en el
brazo largo del cromosoma 4A, respectivamente. A mediados de la década del 90, se
l Figura 3. Incorporación mediante selección asistida por marcadores moleculares del gen Lr47 en germoplasma susceptible a roya de la hoja. A. variedad originalmente susceptible (Prointa Oasis) recurrente en el programa de retrocruza. B. individuo portador del gen Lr47 seleccionado en una población segregante.
A
LESIONES
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B
PRODUCIDAS POR
R
OYA DE LA HOJA
AUSENCIA
DE LESIONES DE
R
OYA DE LA HOJA
Trigo
l
Figura 4. Toma laboratorio Biotecnología EEA Marcos Juárez
estableció una relación directa entre la
reducción del contenido de amilosa y la
presencia de alelos nulos para los loci WxWx-A1b, Wx-D1b y Wx-B1b. Además se analizaron colecciones de trigos de todo el
mundo y detectaron variedades nulas simples, dobles y triples para los loci Wx.
Trigos panaderos portadores de alelos
nulos Wx son de interés para la producción
de harina de trigo apta para elaborar un
tipo de pastas que se consumen principalmente en China y Japón denominados
"noodles". En el INTA Marcos Juárez se
diseñaron marcadores para las mutantes
Wx4A1b, Wx7A1b y Wx7D1b que permiten la
selección de estos fenotipos en poblaciones segregantes de manera sencilla y eficiente (Fig. 1). Estos marcadores están siendo utilizados para seleccionar germoplasma waxy parcial (Wx4A1b), apto para la elaboración de noodles y para desarrollar germoplasma triple nulo (Wx4A1b, Wx7A1b y
Wx7D1b) para la producción de almidón
waxy de trigo, un potencial sustituto para
almidones waxy de maíz y papa.
Constitución de gluteninas y gliadinas para
distintos usos industriales.
En trigos hexaploides y candeales la calidad
industrial está determinada por un componente ambiental y por un componente
genético (composición de proteínas de
reserva del endosperma o gluten). Dentro
de estas proteínas, las gluteninas y gliadinas son los principales determinantes de
las propiedades visco-elásticas del gluten
en el proceso de elaboración del pan, pastas, bizcochuelos, etc.
Las gluteninas son subunidades poliméricas que forman extensos entramados en la
masa de harina mediante uniones tipo
puentes disulfuro. Estas subunidades se
clasifican según su movilidad en electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) en gluteninas de alto y bajo peso molecular
(HMWGs y LMWGs).
Las gliadinas son proteínas monoméricas
que según su movilidad electroforética a
pH ácido (A-PAGE) se clasifican en gliadinas, en orden decreciente de movilidad. En
la región electroforética correspondiente a
- gliadinas, también puede aparecer un tercer grupo de proteínas conocidas como
secalinas, codificadas por la translocación
de centeno 1BL/1RS.
Como corolario de numerosos estudios de
interacción entre parámetros de calidad
panadera y constitución de proteínas de
gluten (principalmente HMWGs y secalinas)
se creó un índice de denominado GLU-1,
con valor máximo de 10. En general, valores
altos de este índice (8-10) se correlacionan
con mayor fuerza de gluten, que es una
característica deseable para panificación
industrial y congelados, mientras que valores bajos del índice GLU-1 (5-7) se asocian
con baja tenacidad del gluten, lo que es
deseable para panificación directa y galleta
cracker. Este índice ha sido utilizado como
criterio de selección en programas de mejo-
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ramiento para trigos duros tipo pan de
Canadá y Australia, donde actualmente no
se utilizan líneas avanzadas con HMWGs de
índice GLU-1 inferior a 10. En el INTA, un
estudio reciente realizado sobre variedades
argentinas categorizadas por la CONASE
(Comisión Nacional de Semillas), permitió
determinar la utilidad del índice GLU-1
como criterio de selección para el
desarrollo de germoplasma con buena calidad panadera. El INTA está realizando trabajos de caracterización de HMWGs de las
variedades y líneas de mejoramiento utilizadas en el país a fin de seleccionar padres
de índice GLU-1 ideal y buena calidad panadera, para el desarrollo de germoplasma de
calidad panadera superior (colecciones
núcleo para calidad panadera).
En relación al efecto de gluteninas y gliadinas sobre la calidad de trigos candeales, un
ensayo desarrollado por el INTA reveló
interacción significativa entre alelos de
HMWGs y parámetros de calidad de pasta.
El germoplasma evaluado presentó escasa
variabilidad alélica para LMWGs y gliadinas. En función de estos resultados el INTA
prevé incrementar la variabilidad genética
de LMWGs y gliadinas del germoplasma
candeal mediante cruzamientos amplios
entre variedades candeales y trigos panaderos que serán los aportantes de variabilidad genética para LMWGs y gliadinas.
Una característica particular de las gliadinas es su gran variabilidad genética. Esta
variabilidad puede ser visualizada por electroforesis ácida (A-PAGE) bajo la forma de
diferentes patrones de bandas proteicas
(Fig. 2). Esta variabilidad ha sido utilizada
por el INASE para confeccionar patrones
identificatorios de las variedades registradas hasta el año 1996. El INTA está actualizando esta información con los patrones de
nuevas variedades a fin de utilizar esta
herramienta para identificación varietal,
que es una demanda de comercialización
básica para implementar la clasificación de
trigos por grupos de calidad.
RESISTENCIA GENÉTICA A ENFERMEDADES
FÚNGICAS
Roya de la hoja
La acumulación sucesiva de diferentes
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fuentes de resistencia a una enfermedad en
un mismo genotipo es un proceso conocido
como "piramidización" y resulta una estrategia promisoria para lograr resistencia
durable en el tiempo. Esta idea es de difícil
implementación en el mejoramiento tradicional debido a que una vez incorporado un
gen de resistencia en una línea se torna difícil monitorear la incorporación de otros
genes de resistencia al mismo patógeno,
debido a que todas las plantas presentan el
mismo fenotipo "resistente", a menos que
el proceso de selección sea asistido por
marcadores moleculares para cada uno de
los genes que se desea piramidizar. El INTA,
en colaboración con J. Dubcovsky (Dpt. of
Agronomy, UC Davis CA, EE.UU.), desde
hace algún tiempo está trabajando sobre
germoplasma local en la piramidización de
nuevas fuentes de resistencia a Roya de la
hoja asistida por marcadores moleculares.
Para ello cuenta con marcadores públicos
para los genes Lr47, Lr37 y Lr51.
Poblaciones avanzadas (F3BC5) portadoras
de Lr47 se comportaron como resistentes a
las razas de la roya de la hoja presentes en
la región de Marcos Juárez durante los anos
1999, 2000, 2001 y 2002 (Fig. 3). El mismo
comportamiento presentaron plantas portadoras de Lr51 frente a las razas de roya de
la hoja presentes en Marcos Juárez durante
la campaña 2002. Para el caso de Lr37, si
bien existen reportes sobre razas locales de
roya de la hoja que han quebrado su resistencia, ligado a este gen se encuentran los
genes Sr38 y Yr17 que aun son efectivos
frente a roya del tallo y roya amarilla.
Fusariosis de la espiga de trigo (FET)
El uso de cultivares resistentes es una de
las medidas mas económicas para reducir
el daño causado por la FET.
Desafortunadamente, numerosas evaluaciones sobre líneas de trigo de los más
diversos orígenes no han permitido identificar germoplasma inmune a la enfermedad.
De todos modos es posible observar variación en la respuesta al patógeno frente a
distintas líneas de trigo. A partir de esta
información se identificaron tres fuentes
principales de resistencia a la enfermedad:
trigos invernales del este de Europa, trigos
primaverales de Brasil e Italia, trigos primaverales de China y Japón.
Trigo
Dentro del grupo de trigos de China y Japón
se destaca el cultivar Sumai3. Para este
caso se han publicado recientemente marcadores ligados a una región genómica que
explica entre un 41 y un 24% de la resistencia a FET en dos poblaciones independientes. Este locus de carácter cuantitativo (en
inglés QTL) se ubica en el cromosoma 3BS y
se halla ligado a microsatélites que pueden
ser utilizados para selección asistida.
La resistencia a FET disponible en los cultivares de trigo argentinos es de tipo parcial
o incompleta por lo que se expresa no como
ausencia de síntomas sino como niveles
más bajos de intensidad. En la actualidad,
un grupo de cultivares entre los que se
cuentan ACA 223, Buck Guapo, Buck Farol,
Klein Cacique, Klein Escorpión, Klein
Sagitario, Prointa Granar, Prointa Molinero,
entre otros, poseen ese tipo de resistencia.
El INTA esta trabajando en la incorporación
del QTL proveniente de Sumai3 en germoplasma local a fin de incrementar la resistencia a este patógeno.
CONCLUSIONES
Con la incorporación de la selección asistida por marcadores dentro del mejoramiento tradicional es posible dar solución a las
demandas específicas de calidad industrial
o a los problemas de susceptibilidad a ciertos patógenos en líneas avanzadas de
mejoramiento que de otro modo serían eliminadas del programa.
Cada día es mayor el volumen de información genómica-molecular que se publica
sobre trigo en relación a caracteres de
interés agronómico. El modo más sencillo y
eficiente de incorporar esta información en
el desarrollo de nuevas variedades de trigo
es a través del mejoramiento asistido por
marcadores moleculares.
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