Download expresion diferencial de los receptores a serotonina

EXPRESION DIFERENCIAL DE LOS RECEPTORES A SEROTONINA (5-HT) EN
EL CEREBELO DE RATA.
De los Reyes Guillen F.X.(1); Berumen L.C.(2); García-Alcocer G.(2); Rodríguez Torres A.(2)
(1) Escuela de Ciencias Biológicas/ Universidad Autónoma de Coahuila.
(2) Facultad de Ciencias Químicas / Universidad Autónoma de Querétaro.
RESUMEN.
La serotonina es un neurotransmisor que interviene en diversos mecanismos fisiológicos y
estados de conducta; en mamíferos se han descubierto muchas enfermedades por trastornos
de esta sustancia como migraña, Alzheimer, autismo, trastornos mentales al paso del
tiempo se han descubierto nuevos receptores serotonina, sin embargo faltan muchos por
descubrir y definir su participación en la trasmisión serotoninérgica. En este trabajo se
estudio la expresión de receptores diferencial en corteza y medula cerebelosa de rata.
INTRODUCCION.
La serotonina (5-HT) ha fascinado y confundido a los científicos desde su descubrimiento
en 1948. Las funciones de esta sustancia eran desconocidas hasta que se desarrollaron
fármacos serotoninérgicos que han permitido conocer su aplicación en diversas
fisiopatologías. Está presente en los organismos vivos y se encuentra principalmente en las
células enterocromafines del tracto gastrointestinal además de algunas neuronas; es
sintetizada a partir del aminoácido esencial triptófano que se convierte en 5-HTP (5hidroxitriptofano) por la enzima triptófano hidroxilasa, posteriormente se transforma
rápidamente en 5-HT mediante la enzima L-aminoácido aromático decarboxilasa; se
degrada a 5-HIAA mediante la acción de la monoaminooxidasa.
Los niveles de 5-HIAA en el cerebro y el líquido cefalorraquídeo (LCR) son reflejo de la
liberación y recambio de la 5-HT en el sistema nervioso central (SNC); existen neuronas
que contienen 5-HT que dirigen proyecciones hacia áreas cerebrales; tálamo, hipotálamo y
astas posteriores de la medula espinal. La 5-HT tiene diversas funciones como
neurotransmisor mediador inflamatorio a través de la interacción de diversos receptores de
la membrana. Además está implicada en diversos mecanismos fisiológicos entre los que
destacan sueño y la vigilia, la regulación de las hormonas hipotalámicas e hipofisarias, la
actividad nerviosa simpática, la secreción del LCR, la termorregulación, la tensión arterial
y la agregación plaquetaria. En el cerebro de los mamíferos la 5-HT influencia la conducta
más integrada y compleja, participando en la función alimentaria, reproductiva, afectiva y
defensiva. La alteración del sistema serotoninérgico interviene, entre otros procesos, en la
fisiopatología de los trastornos afectivos, de ansiedad, pánico y agresividad, los trastornos
del movimiento, la isquemia cerebral, la hipertensión endocraneal, los trastornos
alimentarios, la percepción del dolor, la émesis y la cardiopatía isquémica. El estudio de los
receptores de la 5-HT ha sido arduo y laborioso: Gaddum y Picarelli definieron en 1957 dos
tipos de receptor para la 5-HT, los receptores D, antagonizados por la dibencilina, y los
receptores M, bloqueados por la morfina, aunque estas acciones eran débiles; Peroutka y
Snyder demostraron en 1979 la captación [3H]-5-HT y [3H]-espiperona en dos fracciones:
5-HT1 que tenía mucho mayor receptividad para 5-HT y 5-HT2 que mostró ser mejor
receptor para espiperona, distintas de la membrana de neuronas de la corteza cerebral de la
rata, parecido al sistema de receptores hechos por Bradley en 1986 solo que había otra
clasificación 5-HT3 conformado por los antiguos receptores M. En la actualidad se conocen
muchos receptores de 5-HT y se estudia su ubicación; la localización de receptores implica
la importancia de su función dentro del sistema nervioso.
EXPERIMENTAL.
Extracción de Proteína.
Se les extrajo tejido a tres ratas hembra de edad adulta los cuales fueron, cerebelo, cerebro e
hipocampo (parte del sistema límbico); se realizó la disección de corteza y médula para el
cerebelo, posteriormente los tejidos fueron puestos en tubos eppendorf y pesados en la
micro balanza para determinar la cantidad de buffer de extracción de proteínas Tris 50 mM
pH 7.4 con el que serían homogenados; todo esto se realizó sobre hielo seco para conservar
el tejido en buen estado. Se continuó la extracción durante 2 horas en movimiento rodeados
por hielo, después de ese tiempo fueron puestos en la microcentrifuga refrigerada a 10
grados centígrados por una hora para separar el pellet del sobrenadante en tubos eppendorf
tarados y pesados e inmediatamente puestos en hielo.
Determinación de proteína (Bradford).
Se realizó curva estándar utilizando proteína albumina; ésto nos permitió comparar estas
concentraciones conocidas con las de las muestras problema y así determinar la cantidad de
proteína de las muestras. El ensayo se hace de la siguiente manera: se preparan 18 celdas
para la curva estándar de albumina y 12 para las muestras, 6 de sobrenadante y 6 del pellet.
Se le agrega el volumen de agua destilada y el volumen de albumina y reactivo de Bradford
señalada por el protocolo de Bradford Biorad (tabla1).
Tabla 1. Diluciones para la curva estándar de la solución stock.
La curva estándar se realiza con una solución stock 0.1 μg/μl de albumina a partir de una
solución concentrada (comercial) de 1.41 mg/ml. Tomando 100 μl de la solución comercial
de albumina y agregando 1310 μl de agua destilada. Para las muestras se agregó a cada
celda 795 μl de H2O, 5 μl de la muestra y 200 μl. del reactivo de Bradford.
Análisis de Bradford
Se determinó la cantidad de proteína mediante una hoja de cálculo en el programa de Excel
mediante las absorbencias de cada una de las muestras y las siguientes fórmulas.
X= (abs. de muestra-0.4826)/ (0.0482), proteína= (volumen)*(X)
Para trabajar las muestras con cantidades de proteína de 75 µg/ pozo, se diluyó el volumen
respectivo en solución E (Amortiguador de muestra) el cual contiene: Tris-HCl 0.5M 10%
SDS pH6.8, Glicerol 10%, Azul de bromofenol 0.125%, 2-β mercaptoetanol 0.5% (para
condiciones reductoras).
Electroforesis vertical
Se prepararon geles de acrilamida con las siguientes características (gel inferior 12% y gel
concentrador 4%) el proceso de la elaboración de estos geles fue el siguiente: se preparó en
un tubo falcon de 50 ml (Tabla 2a y 2b); primero se colocó entre los vidrios el gel
resolvedor (12%) hasta 2 cm antes de la parte superior del vidrio delgado y se le añadió una
capa de agua para evitar la formación de meniscos o jorobas en el gel; después de 30
minutos solidificó y se agregó el gel de 4% colocando peines de 15 pozos y 1 mm de
grosor; se lavó y se colocó en la cámara de electroforesis con buffer de electrodo 1X hasta
el tope para revisar posibles fugas.
Tabla 2a (gel revolvedor de 12%) y 2b (gel concentrador de 4%)
Se utilizaron 12 pozos para las muestras, 6 de sobrenadante y 6 de pellet (15 µl de cada
muestra) comparando muestra de médula y corteza; 1 pozo se utilizó para el marcador de
peso molecular (10 µl); se corrieron a un voltaje de 100 volts durante 1 hora.
Transferencia de geles (Western Blot)
El gel se colocó durante 15 minutos en el amortiguador de transferencia para equilibrarlo,
al mismo tiempo en otro recipiente se pusieron a remojar las 2 membranas de nitrocelulosa,
4 papeles filtro y 4 fibras en amortiguador de transferencia y sobre ese mismo
amortiguador se armó el cassette de transferencia (sándwich) en el siguiente orden: lado
negro del cassette, fibra, papel filtro, gel, membrana, papel filtro, fibra, lado rojo del
casette; se cerró y se colocó en la cámara de transferencia llenándola con buffer de
transferencia, colocando un recipiente de hielo al lado del cassette y un agitador magnético
adentro de la cámara; se cerró y se corrió a 200 mA sobre un termoagitador durante una
hora. Posteriormente se sacó el cassette y se retiró la fibra y el papel filtro para marcar la
localización del gel por detrás de las membranas. Se retiraron las membranas para hacerles
3 lavados con PBS 1X colocándolas cada una en un recipiente y se dejaron en movimiento
en un agitador rocker durante 10 minutos; esto se hizo 3 veces y después se agregó leche al
3% en PBS por 1 hora; posteriormente se hicieron 3 lavados con PBS, para después incubar
con 3.33 µl del anticuerpo primario (cabra) en 100 ml de leche al 1% en PBT y se dejó toda
una noche en movimiento para que el anticuerpo se uniera a las proteínas. A la mañana
siguiente se hicieron 3 lavados con PBS por 10’ cada uno y se preparó el anticuerpo
secundario en leche al 3% en PBT (1:3000) y se expuso el anticuerpo a las membranas por
2 horas, después del tiempo se le hicieron 3 lavados con PBS para quitar residuos y se
procedió al revelado: en un cuarto completamente oscuro se puso a incubar membrana en
ECL por 5 minutos y se pasó a una bolsa cuidando que no hubiera burbujas de aire
atrapadas. Se colocó en un hipercassette con una placa de rayos X arriba de la bolsa y se
cerró exponiendo durante 10 minutos, después de eso la placa se sumergió durante un
minuto en la solución reveladora y se le hizo 1 lavado con agua durante 1 minuto; después
se sumergió en la solución fijadora durante 1 minuto y se lavó nuevamente; es
impresindible la oscuridad ya que se velan las placas por la luz.
DISCUSION DE RESULTADOS.
Con base en la determinación de cantidad de proteína por el método de Bradford (Figura 1)
se prepararon alícuotas para separación por electroforesis y posterior identificación por
western blot.
Figura 1. Curva estándar de albumina BSA con muestras.
Se cargaron los geles de acrilamida con 75µg de muestra tanto de corteza como de médula
por triplicado en 4 experimentos distintos resultando mayor expresión de receptor para
corteza que para médula de cerebelo.
A
B
Figura 2. Bandas inmunorreactivas (flecha) en membranas de western blot para receptor a
serotonina en corteza (A) y médula (B) cerebelosa.
CONCLUSIONES.
Con base en la mayor expresión de receptores en corteza se sugiere la expresión
mayoritaria de los mismos en los cuerpos neuronales. Sin embargo se encuentran proteínas
de receptor expresadas en médula.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
Gottfries CG. “Distrubance of the 5-hydroxytryptamine metabolism in brains from patients
with Alzheimer’s dementia”. J Neurol Transm 1990
Igual M.M. “El mundo de la serotonina y sus receptores. Aspectos fisiopatológicos,
clínicos y terapéuticos” Medicina clínica 101 (4). 1993
Rapport MM, Green AA, Page IH. “Serum vasoconstrictor (serotonin): IV. lsolation and
characterisation”. J Biol Chem, 176, 1243-1251, 1948.