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Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1993,12 (2), 385-404
Hibridización de ácidos nucleicos y
amplificación en cadena por polimerasa en el
diagnóstico de enfermedades infecciosas
de los animales
M. R O D R Í G U E Z y A . A . S C H U D E L *
Resumen: Los autores describen el uso de métodos de detección de ácidos
nucleicos genómicos - hibridización de ácidos nucleicos y amplificación en
cadena por polimerasa (polymerase chain reaction) - en el diagnóstico de
enfermedades infecciosas de animales domésticos.
La amplificación en cadena por polimerasa es una poderosa herramienta
que permite la amplificación exponencial in vitro de un fragmento genómico
específico del ácido desoxirribonucleico. En la actualidad se la utiliza para
estudiar la patogenia a nivel molecular de numerosas enfermedades infecciosas
y también como un eficaz método diagnóstico.
Dado que posee gran especificidad y una sensibilidad superior a la de los
métodos convencionales, y que no requiere infraestructura compleja, será en un
futuro cercano la tecnología de uso diario de veterinarios de campo,
funcionarios del área de salud y laboratorios de diagnóstico veterinario.
P A L A B R A S CLAVE: Amplificación
Diagnóstico - Sanidad animal - Sondas.
en cadena por polimerasa
-
INTRODUCCIÓN
El diagnóstico de e n f e r m e d a d e s infecciosas ha sufrido limitaciones r e s u l t a n t e s
de la complejidad de las técnicas, la infraestructura necesaria y la lentitud de los
procedimientos disponibles para la detección y caracterización de patógenos. Con el
advenimiento de la tecnología de sondas moleculares, los veterinarios de c a m p o ,
funcionarios de sanidad animal y l a b o r a t o r i o s de diagnóstico p o d r á n disponer de
nuevos métodos que ofrecen una sensibilidad y especificidad similar o superior a la de
los procedimientos convencionales y que, además, al ser métodos rápidos (resultados
en el mismo día), dan la oportunidad de tomar medidas de control más racionales.
La presencia de agentes infecciosos en muestras de tejido o muestras fluidas puede
ponerse de manifiesto a través de su visualización microscópica, actividad biológica o la
detección de sus componentes estructurales - proteínas antigénicas y ácidos nucleicos.
* Instituto de Virología, Instituto nacional de tecnología agropecuaria, Centro de investigaciones
en ciencias veterinarias, C.C. 77, Morón 1708, Argentina.
386
La secuencia nucleotídica del genoma de cada patógeno es única, esto es, diferente a la
de otros microorganismos y de los ácidos nucleicos del animal huésped. Este hecho
representa la base del desarrollo de recientes técnicas diagnósticas: la hibridización de
ácidos nucleicos y la amplificación en c a d e n a p o r polimerasa (polymerase
chain
reaction: P C R ) . Sus características y aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades
infecciosas de animales domésticos son decritas en esta revisión. A fin de obtener una
visión más amplia, el lector podrá consultar excelentes publicaciones previas sobre estas
tecnologías (15,20,24,27,52,56,57,61,67).
CONSIDERACIONES TÉCNICAS
La detección de ácidos nucleicos se basa en la p r o p i e d a d de cadenas simples y
complementarias de reasociase. Si una de estas cadenas (sonda) es marcada, es posible
detectar la presencia de la otra en una muestra mediante una prueba de hibridización.
Por otra parte, si se utilizan dos pequeñas sondas (cebadores o primers) en condiciones
de reacción adecuadas, es posible detectar hasta mínimas cantidades de ácido nucleico
en un patógeno a través de una prueba PCR (Fig. 1).
Dot blot
Marcación radioactiva
In situ
Marcación no
radioactiva
Reacción en
cadena por
polimerasa
Los resultados pueden leerse en geles de
agarosa o por hibridización
Hibridización
Amplificación
Biotina
Digoxigenina
Sulfonilación
FIG.l
Las técnicas de detección de ácidos nucleicos dominantes para la detección
de agentes infecciosos
Extracción de ácidos nucleicos
El paso inicial d e la detección d e ácidos nucleicos ( A N ) es su extracción de la
muestra. G e n e r a l m e n t e , muestras fluidas u h o m o g e n e i z a d a s son incubadas con
detergentes y digeridas con proteasa a fin de liberar a los A N que se s e p a r a n de
proteínas, lípidos y restos celulares m e d i a n t e una extracción fenólica. El A N se
precipita con etanol y se siembra en una m e m b r a n a de nylon o nitrocelulosa p a r a
hibridizar, o bien es usado directamente en PCR.
Cuando el A N de interés es ácido ribonucleico (ARN), deben tomarse precauciones
para evitar su degradación por ribonucleasas (ARNsas). Todo material, vidrio o agua
que tomara contacto con la muestra debe tratarse. D e b e utilizarse material plástico
descartable autoclavado y guantes en todo momento. Las muestras deben procesarse en
frío y rápidamente. Inhibidores de ARNsas como vanadil-ribocomplejos y extractos de
placenta (ARNsin) son útiles para evitar esta degradación (64).
387
Los métodos tradicionales de extracción han sido en algunos casos reemplazados con
éxito por protocolos más sencillos. Ejemplos de éstos son la purificación del ácido
desoxirribonucleico ( A D N ) de citomegalovirus a partir de muestras de orina con polvo
de vidrio (11) y la liberación de genomas del virus de la hepatitis B presentes en suero,
mediante incubación de la m u e s t r a a 100°C p o r unos m i n u t o s ( F . E . Baralle,
comunicación personal).
Hibridización
Clásicamente las sondas se producen por inserción de secuencias del gene de interés en
el A D N de plásmidos o vectores bacteriófagos, que pueden ser propagados para obtener
cantidades adecuadas de sonda (2). D e la biblioteca de secuencias genómicas obtenidas
se seleccionan clones con determinadas características: especificidad, sensibilidad y
reactividad con un amplio espectro de cepas de campo. La pureza del A N que se utiliza
como sonda es fundamental para evitar señales de fondo que harían difícil la interpretación
de los resultados. La excisión del fragmento de A D N clonado reduce el ruido de fondo
debido a hibridización inespecífica con secuencias del huésped o contaminantes.
Una estrategia alternativa para la producción de sondas es el uso de oligonucleótidos
sintéticos, sondas A R N y productos de PCR. El diseño de sondas de oligonucleótidos se
basa en la información existente de la secuencia del patógeno. Pueden ocurrir diferencias
de bases c u a n d o estas sondas son utilizadas p a r a detectar aislados de campo con la
consiguiente reducción del grado de interacción e n t r e sonda y A N blanco. Varios
autores han señalado que si se eligen regiones genómicas conservadas y si las condiciones
de hibridización son optimizadas, este tipo de sonda puede ser útil para la detección de
virus (9,10, 30). Las sondas de A R N , que deben ser manejadas teniendo en cuenta la
presencia de ARNsas en el medio, pueden ser sintetizadas in vitro en grandes cantidades
usando plásmidos recombinantes especiales, como los que contienen el promotor SP6.
Dado que las sondas de A R N son de cadena simple (ss) no existe reasociación que
compita con el A N blanco d u r a n t e la hibridización, lo que garantiza una m a y o r
sensibilidad (1). Si la P C R ha sido optimizada para un microorganismo particular, se
pueden producir sondas para su detección utilizando cebadores (primers) marcados o
desoxirribonucleótidos unidos a residuos de biotina o digoxigenina.
Las sondas p u e d e n ser marcadas con isótopos o marcadores no radioactivos tales
como la biotina o la digoxigenina. Esto se lleva a cabo a través del reemplazo de una
proporción de nucleótidos de la sonda por nucleótidos marcados (nick translation y
random priming) o agregando nucleótidos marcados a un extremo de la sonda (end
labelling). El A N p u e d e ser t a m b i é n q u í m i c a m e n t e modificado (sulfonado) de tal
manera que su presencia es d e t e c t a b l e p o r m e d i o de un a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l
específico. A u n q u e el P ha sido el marcador de elección cuando una alta sensibilidad
es esencial, existen muchos informes y la propia experiencia de los autores, que indican
que p u e d e ser r e e m p l a z a d o por m a r c a d o r e s no radioactivos. Estos últimos ofrecen
importantes ventajas operativas tales como larga vida útil y ausencia de riesgos para la
salud del operador.
3 2
La biotina presenta una gran afinidad con la avidina. Si esta última es marcada con
una enzima como peroxidasa o fosfatasa alcalina, es posible leer los resultados de una
reacción de hibridización por m é t o d o s colorimétricos. E n forma similar, el h a p t e n o
digoxigenina es usado para marcar sondas que son detectables por anticuerpos antidigoxigenina conjugados con enzimas. Fluorocromos conjugados a biotina o anticuerpos
han sido utilizados con éxito en p r u e b a s de hibridización in situ p e r m i t i e n d o la
localización de secuencias particulares en cortes de tejido y monocapas celulares.
388
Una prueba de hibridización se lleva a cabo incubando en condiciones apropiadas
una sonda marcada por algún medio con la m e m b r a n a en la que se han sembrado los
A N extraídos de muestras. Luego de varios lavados, la m e m b r a n a es expuesta a una
película sensible a radiaciones si la sonda fue marcada con isótopos, o procesada para la
visualización colorimétrica de los resultados si se utilizó marcación no radioactiva (27).
Amplificación en cadena por polimerasa
Esta técnica, descrita por p r i m e r a vez p o r Saiki y col. (63), hace posible la
amplificación de una secuencia de A D N específica un millón de veces o más. Si la
secuencia de interés es A R N debe sintetizarse una copia A D N por transcripción reversa
antes de realizar la prueba P C R . E s t a reacción requiere un proceso de ciclado que
comprende tres etapas:
a) desnaturalización del A D N ,
b) anillado de cebadores, y
c) extensión de cebadores.
D u r a n t e la desnaturalización a 93°C-95°C, las dos cadenas de A D N se separan.
Durante el anillado los cebadores se unen a regiones complementarias que bordean la
secuencia blanco a la derecha (5') o a la izquierda (3'). Durante la primera extensión, se
producen nuevas cadenas de A D N al agregar nucleótidos, en el extremo 3 ' de cada
cebador anillado, a la cadena de A D N suelta. Este proceso ocurre mediante el efecto
catalítico del A D N polimerasa termoestable. El número de copias de A D N se duplica
al final de cada ciclo, y luego de 30 a 45 ciclos, se a c u m u l a n millones de copias
(denominadas amplicones) de la secuencia de interés (Fig. 2).
2 cadenas
(original)
(a)
(b)
4 cadenas
( p r i m e r ciclo)
(c)
8 cadenas
(segundo ciclo)
(d)
M i l l o n e s de copias
(30-40 ciclos)
FIG.2
El proceso de la amplificación en cadena por polimerasa
Las cadenas de ácido desoxirribonucleico ( A D N ) del patógeno (a) son separadas (desnaturalizadas)
a 94°C y los cebadores (primers) hibridizan (anillan) a sus secuencias complementarias a 37-60°C (b).
E n un tercer paso (extensión) una A D N polimerasa termoestable produce cadenas complementarias
a 72°C (c). Si este proceso de «3 pasos» es repetido 30 a 40 veces se produce una acumulación
exponencial de copias de A D N (d) y la secuencia blanco de origen es amplificada millones de veces
389
Selección de cebadores (primers)
Los cebadores son oligonucleotidos sintéticos ss cuya secuencia es complementaria
al extremo izquierdo de una de las c a d e n a s o al e x t r e m o d e r e c h o de la otra del
fragmento g e n ó m i c o q u e se ha de amplificar. A fin de diseñar c e b a d o r e s p a r a la
detección de un patógeno en particular es necesario contar con datos de la secuencia de
su genoma. Generalmente las zonas genómicas más adecuadas para pruebas de P C R
sobre material de campo son aquellas que están conservadas entre los aislados, aunque
diferencias de 2 o 3 bases no inhiben necesariamente la amplificación enzimática.
Luego de la selección de un fragmento genómico para P C R se trata de identificar
cebadores (pares de oligonucleótidos 18-24 mer) con ciertas características:
- contenido de 40% a 60% de G+C,
- ausencia de polipurinas o polipirimidinas,
- ausencia de estructura secundaria, y
- ausencia de complementariedad, en particular en el extremo 3 ' entre cebadores,
para evitar la formación de un artefacto denominado «dímero de cebadores».
Existen programas de computación, accesibles por pedido, que son útiles para llevar
a cabo la selección (62). D a d o que la eficiencia de la prueba P C R disminuye cuando la
longitud del fragmento que se ha de amplificar aumenta, los cebadores seleccionados no
deben estar separados entre sí por más de 600 bases.
Optimización de la amplificación en cadena por polimerasa
Los c o m p o n e n t e s básicos de una reacción de P C R son los c e b a d o r e s ,
deoxinucleótidos ( d N T P s ) , un buffer que contiene cloruro de magnesio, una A D N
polimerasa termoestable y A D N blanco. La concentración de los componentes y los
parámetros de duración y temperaturas de ciclado deben ajustarse para la amplificación
eficiente de cada A D N . U n punto inicial sería 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada
primer, una concentración de Cl Mg de 1,5 mM, 2,5 unidades de enzima y 10.000 copias
de A D N blanco semipurificado. La temperatura de anillado es definida inicialmente
por las características de los cebadores, mientras que la desnaturalización y extensión
generalmente se llevan a cabo a 94°C y a 7°C, respectivamente. Treinta y cinco ciclos de
90 seg para cada paso en general permiten visualizar la banda amplificada en geles de
agarosa. El paso siguiente consiste en determinar la concentración óptima de Cl Mg,
entre 1 y 6 mM. Si se detectan en el gel productos inespecíficos además del amplicón del
tamaño esperado, puede ser necesario elevar la temperatura de anillado, optimizar la
concentración de cebadores o ensayar otros cebadores. Luego deben realizarse pruebas
disminuyendo el número de moléculas de A N blanco y preparando muestras artificiales
que incluyen controles positivos y negativos. F i n a l m e n t e , a fin de d e t e r m i n a r la
sensibilidad y especificidad del protocolo desarrollado, se debe examinar un número
significativo de muestras de campo y controles negativos, y comparar los resultados con
aquellos obtenidos con técnicas de referencia convencionales.
2
2
Detección de amplicones
El producto de la prueba P C R (amplicón) generalmente se detecta como una banda
en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio. Su tamaño, comparado con los pesos
moleculares de referencia, corresponde a la longitud de la secuencia blanco definida por
los cebadores. La identidad del producto amplificado es confirmada por hibridización
390
con un oligonucleótido sonda cuya secuencia es complementaria a una zona interna de
una de las cadenas del amplicón, y por la presencia de sitios de restricción que cortan el
amplicón en fragmentos de t a m a ñ o predecible visibles en gel de agarosa. La
hibridización se lleva a cabo con producto de P C R sembrado en membranas (técnica
del dot blot) o luego de la transferencia de ácidos nucleicos presentes en gel de agarosa
a una membrana (técnica del Southern blot).
Estos procedimientos son relativamente complejos y excesivamente largos para el
laboratorio de diagnóstico microbiológico. U n a alternativa interesante que podría
permitir el procesamiento de un gran número de muestras simultáneamente y aún su
automatización, es la captura específica del amplicón por una fase sólida, seguida de
una detección colorimétrica. Esta estrategia utiliza placas de 96 pozos a los cuales se ha
unido covalentemente una sonda de captura (55). Las moléculas de P C R generadas
usando cebadores marcados con biotina son atrapadas y la presencia de los híbridos
detectada con un conjugado estreptavidina-peroxidasa en presencia de un sustrato
cromogénico (35).
Organización del laboratorio para las pruebas de amplificación en cadena por
polimerasa y prevención de contaminación
Resultados falsos positivos de la prueba P C R resultan de la contaminación de una
muestra por amplicones de reacciones previas. Dado que en cada reacción positiva se
p r o d u c e n millones de copias y que sólo son necesarias unas pocas moléculas
contaminantes p a r a producir un resultado falso positivo, d e b e n t o m a r s e ciertas
precauciones. La incorporación de controles positivos, negativos y sin A D N en cada
prueba resulta esencial para detectar este fenómeno denominado «carryover». Varias
normas, además de una buena práctica de laboratorio, deben ser adoptadas (37):
- usar diferentes laboratorios y equipos para manipulaciones pre y post-PCR,
- autoclavar el agua, buffers, puntas de pipeta y material plástico y exponer las
mesas de trabajo a luz ultravioleta,
- preparar alíquotas de reactivos de uso diario en un ambiente libre de producto
amplificado,
- agregar el A D N al final a cada tubo.
Los experimentos críticos deben repetirse y siempre que sea posible debe utilizarse
en ellos dos pares de cebadores que amplifiquen fragmentos genómicos distintos.
APLICACIONES DIAGNÓSTICAS
Aunque las pruebas de hibridización sirven muy bien algunos propósitos específicos, su
sensibilidad relativamente baja y la complejidad de su realización han limitado su aplicación
en laboratorios de diagnóstico. Esta tecnología ha sido extensamente revisada recientemente
por Knowles y Gorham (36). Por otra parte, la alta sensibilidad de la prueba PCR, que es
usualmente superior a la de las técnicas convencionales, hace de esta técnica una verdadera
candidata para reemplazar muchos de los procedimientos utilizados actualmente para la
detección rápida de patógenos. Gracias al hecho que muy pocas moléculas de ácido
nucleico genómico son suficientes para detectar un patógeno, los laboratorios que
implementan la prueba P C R con propósitos diagnósticos son cada vez más numerosos.
391
A diferencia de las técnicas convencionales que r e q u i e r e n una infraestructura
distinta para cada grupo de microorganismos, la implementación de la p r u e b a P C R
necesita reactivos y procedimientos similares para todos los patógenos.
Detección del virus de la fiebre aftosa por amplificación en cadena por polimerasa
Con propósitos ilustrativos se describirá a continuación el desarrollo y evaluación de
un protocolo para la detección del virus de la fiebre aftosa (VFA) por PCR. Se eligió para
amplificación enzimática el gen que codifica para la polimerasa viral, localizado cerca del
extremo 3 ' del genoma viral, p o r q u e su secuencia, además de ser disponible, está
altamente conservada en los distintos serotipos (45). Se identificaron oligonucleótidos con
varias características, incluyendo la ausencia de estructura segundaria y un contenido
G+C de 50% a 60%, mediante la utilización de un programa de computación (62). La
concentración de los diferentes reactivos y los parámetros de duración y temperatura de
ciclado fueron optimizados utilizando un plásmido en el cual se había insertado la
secuencia de interés. Las condiciones de transcripción reversa fueron definidas utilizando
ARN viral purificado. La extracción de A R N de muestras se realizó según el protocolo
desarrollado ad hoc por Meyer y col. (47). Los resultados se leyeron en geles de agarosa
teñidos con bromuro de etidio y fueron confirmados por hibridización de los productos
amplificados sembrados en membrana de nylon con una sonda de 30 bases marcada con
digoxigenina (Rodríguez y col., manuscrito en preparación).
A fin de d e t e r m i n a r la sensibilidad y especificidad de la p r u e b a , se realizaron
experimentos utilizando diluciones de suspensiones virales de los serotipos A , O y C,
muestras artificiales y tejidos t o m a d o s en la necropsia de bovinos infectados
experimentalmente (Cuadros I y II). A d e m á s , se obtuvieron datos adicionales que
indicaron una especificidad de 100% al examinarse 50 muestras de distintos tejidos
(epitelio lingual, faringe, ganglio linfático, esófago, pulmón y riñon) de bovinos sanos e
infectados experimentalmente (P. Murphy y col., comunicación personal).
Los resultados experimentales indican que la p r u e b a de P C R desarrollada para la
detección del V F A es específica y que su sensibilidad es por lo menos del mismo orden
de magnitud que la de los m é t o d o s convencionales cuando los resultados se leen en
geles de agarosa. U n a sensibilidad m a y o r se observa luego de la hibridización del
producto de P C R . Se r e q u i e r e n m e n o s de 24 horas p a r a procesar muchas muestras
simultáneamente y luego de su optimización la detección del V F A por este método no
necesita una infraestructura compleja.
CUADRO I
Evaluación de la sensibilidad de la amplificación en cadena por polimerasa
para la detección del virus aftoso utilizando diluciones virales
de los serotipos A, O y C
Stock viral
Serotipo
Título
(log DL /ml)
Sensibilidad
6,90
7,04
7,04
6,80
1,90
0,27
0,27
0,19
10
No.
No.
No.
No.
644
547
622
578
°i
°i
A87
C85
50
(DL50)
D L : dosis media para ratones recién nacidos
Los resultados fueron leídos en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio,
y confirmados por hibridización
5 0
392
CUADRO II
Evaluación de la sensibilidad y especificidad de la amplificación en cadena por
polimerasa para la detección del virus de la fiebre aftosa utilizando muestras
artificiales (a) y carne y epitelio tomados en la necropsia de animales
experimentalmente infectados (b)
Muestra
Título
(DL /0,25 ml)
Resultados di
de
la PCR
Oí
Ol
Oí
54,00
5,40
. 0,54
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
A
O
1,98
15,70
1,98
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
1,00
1,24
1,00
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Serotipo
50
a)
Homogenato normal
Homogenato normal
Homogenato normal
Homogenato normal
b)
Carne infectada
Carne infectada
Carne infectada
Carne normal
+ stock No. 567
+ stock No. 567
+ stock No. 567
+ PBS
01
01
01
Epitelio
Epitelio
Epitelio
Epitelio
infectado'
infectado'
infectado'
normal
21
21
21
c
A
O
c
El ensayo se realizó con alícuotas de 0,25 ml de homogenatos 1/10 y los resultados fueron leídos en
geles de agarosa y confirmados por hibridización
PCR: amplificación en cadena por polimerasa
PBS: phosphate-buffered saline
(1) muestras tomadas a los 3 días p.i.
(2) muestras tomadas a los 16 días p.i.
OTRAS APLICACIONES DE LA AMPLIFICACIÓN EN CADENA
POR POLIMERASA PARA LA DETECCIÓN Y
CARACTERIZACIÓN DE AGENTES INFECCIOSOS
Virus
Virus de la peste porcina africana
Se diseñaron y sintetizaron cuatro primers y una sonda oligonucleotídica con el
propósito de amplificar un fragmento de 740 pares de bases (pb) correspondientes a una
zona conservada del genoma viral del virus de la peste porcina africana. Se amplificó
específicamente un fragmento de 640 pb y se realizaron ensayos con t e m p l a d o s
extraídos de órganos y plasma de animales infectados. Se determinó que la prueba P C R
es más rápida y sensible que los métodos convencionales (73).
Virus de la leucemia endógena aviar
A través del uso de métodos de amplificación del A D N se secuenciaron genes de la
envoltura viral encontrándose que secuencias de sub-grupo específicas poseen una alta
homología con las de R A V - O (Rous-associated virus type O) (60).
393
Poliomavirus
aviar
Se desarrolló un ensayo P C R para la detección del poliomavirus llamado B F D V
(budgerigar fledgling disease virus). El ensayo utiliza un solo grupo de primers
complementarios a una zona del gen de la p r o t e í n a VP1 de B F D V . La p r u e b a es
áltamente específica y sensible, y permite detectar 20 copias del genoma viral. E s t e
estudio sugiere la posibilidad de infección p e r s i s t e n t e de aves adultas y de la
transmisión in ovo (58).
Virus de la lengua azul
Se a d o p t ó una p r u e b a P C R p a r a la detección de secuencias g l o b a l m e n t e
conservadas, serogrupo específicas del A R N del virus de la lengua azul (BTV) (210 pb)
de serotipos d e t e c t a d o s en E s t a d o s U n i d o s de A m é r i c a . R e s u l t a d o s p r e l i m i n a r e s
indican que es posible detectar menos de 2 fg de secuencias blanco del A R N de BTV,
equivalentes a 7.500 partículas virales (16). Utilizando primers complementarios al
segmento 7 de BTV-ISA, fue posible detectar 6 moléculas por muestra del segmento 7
cadena doble (ds) A R N como t a m b i é n A R N purificado de otros serotipos. Se
obtuvieron resultados positivos en glóbulos rojos de bovinos infectados conteniendo 16
T C I D p e r o no 1,6 T C I D (81). Primers construidos en base a la secuencia del
segmento 3 que codifica p a r a la p r o t e í n a reactiva V P 3 se usaron p a r a d e t e c t a r
diferentes serogrupos en plaquetas, buffy coat y glóbulos rojos de ovinos infectados (43).
5 0
Coronavirus
5 0
bovino
Se sintetizaron por P C R sondas A D N ss y ds p a r a la detección del Coronavirus
bovino (BCV) utilizando plásmidos recombinantes como templado. Mediante P C R de
fragmentos específicos se detectaron aproximadamente 10 genomas virales luego de la
lectura en geles de agarosa (78). El diagnóstico de BCV en 134 muestras clínicas fue más
eficiente por hibridización con sondas ss que con sondas ds sintetizadas por P C R o con
una combinación de 6 sondas plasmídicas de secuencias no yuxtapuestas (79).
Herpesvirus bovino tipo 4
Se comparó la prueba PCR con las técnicas de hibridización y aislamiento en cultivo
de tejidos para la detección del herpesvirus bovino tipo 4 (BHV-4) en tejidos de conejos
e x p e r i m e n t a l m e n t e infectados. Se d e t e c t ó el virus p o r P C R en varios órganos,
incluyendo tejido nervioso, que dieron resultados negativos p o r las otras técnicas
utilizadas (50).
Virus de la inmuno deficiencia
bovina
La infección de células de p u l m ó n e m b r i o n a r i o bovino con virus de la
inmunodeficiencia bovina fue monitoreada por la formación de sincicios y transcripción
reversa seguida por PCR; se determinaron las ventajas de esta última técnica (33).
Virus de la leucemia
bovina
Se detectó A D N proviral en A D N linfocítico y tumoral en todos los estadios de la
infección de bovinos p o r amplificación enzimática e hibridización del p r o d u c t o
amplificado (51). La prueba PCR para gag-p24, env-gp51, previa transcripción reversa,
fue utilizada para examinar la presencia de A D N específico en células mononucleares
periféricas de animales seropositivos y seronegativos. El protocolo permitió detectar
1 genoma viral entre 100.000 células (49). Utilizando cebadores para los genes pol y px
del virus de la leucemia bovina se amplificaron consistentemente hasta 10 copias del
394
A D N del virus. Esta técnica se utilizó con éxito en un estudio a ciegas de células
mononucleares sanguíneas de 18 bovinos (72).
Papillomavirus
bovino
Por PCR se detectó A D N del papillomavirus bovino (BPV) en el 70% de partidas
comerciales de suero fetal bovino observándose una correlación de 100% con los datos
obtenidos por aislamiento (69). Se detectaron genomas de BPV por P C R en cortes de
tejido fijado con formol de 20 sarcoides equinos utilizando primers correspondientes al
marco de lectura abierta de la zona E5 del genoma viral de los tipos 1 y 2 de BPV. Estos
resultados apoyan la visión generalizada que sugiere que el B P V desempeña un papel
importante en los sarcoides equinos (74).
Rotavirus
bovino
Por PCR se amplificó A D N copia (cADN) del gen completo que codifica el antígeno
neutralizante mayor. La prueba PCR posee 100.000 y 5.000 veces más sensibilidad que
el electroferotipo y la hibridización respectivamente, para la detección de rotavirus
bovino en materia fecal (89).
Virus de la diarrea viral bovina
A través de la amplificación y secuenciado de la región que codifica para la proteína
pl25 de un par homólogo del biotipo del virus de la diarrea viral bovina (BVDV), cepas
Pe 515 citopatogénicas y no citopatogénicas fueron d e t e c t a d a s (18). Por m e d i o de
primers de 20 pb localizados en la región conservada cercana al extremo 3 ' genómico
fue posible obtener un producto de 205 pb a partir del A D N del B V D V . La p r u e b a
permitió detectar una molécula de c A D N clonado lo que demuestra que la sensibilidad
de PCR es superior a 1 T C I D (42). La prueba P C R fue 10 veces más sensible que los
métodos convencionales para la detección de B V D V (77). Primers que amplifican la
zona 6322-7475 de la cepa N A D L se usaron para detectar B V D V en suero y glóbulos
blancos de bovinos persistentemente infectados (8). Seis secuencias de 20 bases de
distintas áreas genómicas fueron seleccionadas por análisis de homología de las cepas
N A D L y Osloss de B V D V . La sonda c o r r e s p o n d i e n t e al extremo 5 ' del A R N viral
(ND001), detectó el 86% de los aislamientos citopáticos y no citopáticos analizados
(38). Utilizando primers de la región gp 48 de la cepa citopática N A D L se d e t e c t ó
B V D V en muestras de suero de animales p e r s i s t e n t e m e n t e infectados (6).
Oligonucleótidos cebadores degenerados diseñados en base a la secuencia de dos cepas
de B V D V y una de peste porcina clásica permitieron detectar al A R N viral en células
infectadas in vitro y en linfocitos circulantes (83).
5 0
Virus de la artritis/encefalitis
caprina
Los virus de la artritis/encefalitis caprina y del Maedi-Visna fueron detectados por
PCR (90).
Virus del moquillo
Morbillivirus de Phoca vitulina y cADN obtenido del morbillivirus de la peste bovina
fueron detectados por P C R (25).
Virus de la arteritis infecciosa equina
Mediante transcripción reversa y PCR con tres diferentes pares de primers se detectó
A R N genómico en muestras clínicas con una sensibilidad de hasta 600 P F U / m l en
plasma seminal (14).
395
Herpesvirus equino tipo 1
Se examinaron por P C R cultivos celulares normales e infectados y 63 muestras de 29
fetos equinos abortados. Resultados generados en menos de 24 horas y evaluados en
geles de agarosa y por hibridización con un oligonucleótido sonda marcado con biotina
mostraron una fuerte correlación con aquellos obtenidos por aislamiento (3). A D N no
purificado derivado de cultivos infectados con herpesvirus equinos tipos 1 y 4 fue
amplificado por P C R utilizando un par de oligonucleótidos cebadores. Restricción
enzimática con P V u I I seguida p o r electroforesis revelaron un polimorfismo de los
fragmentos de restricción enzimática lo que permitió la diferenciación de los dos tipos
virales (53).
Virus de la anemia infecciosa
equina
Se detectaron por P C R genomas del virus de la anemia infecciosa equina ( E I A V ) ,
cepa CL22, en células m o n o n u c l e a r e s periféricas de equinos infectados (87). Se
monitoreó la presencia de secuencias provirales en células mononucleares de sangre
periférica en tres equinos por P C R . Luego de cada episodio virémico los niveles de
provirus en monocitos periféricos disminuyeron a menos de 1 copia en 5 x 10 células (54).
6
Virus de la leucemia felina
La prueba P C R fue utilizada para examinar la patogénesis de la coinfección de gatos
con virus de la inmunodeficiencia felina y virus de la leucemia felina (FeLV) (76). H a
sido también utilizada para la detección de FeLV en neuroblastomas olfatorios felinos (68).
Virus de la fiebre aftosa
Se logró una rápida y sensible detección del virus de la fiebre aftosa en tejidos
porcinos y bovinos por amplificación enzimática del gen de la polimerasa viral. La
sensibilidad del método fue de menos de 1 T C I D mediante hibridización del producto
amplificado a una sonda marcada. No se observó reactividad cruzada con otros doce
virus, incluyendo enterovirus (47).
5 0
Virus de la peste porcina clásica
Luego de la transcripción reversa del A R N total aislado de tejidos infectados, el
cADN fue amplificado por PCR con una sensibilidad de 10.000 T C I D . La sensibilidad
aumentó 1.000 veces luego de la reamplificación con c e b a d o r e s i n t e r n o s (nested
primers) (40).
5 0
Virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar
El gen del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar (IALV) homólogo del de la
glicoproteína B (g B) del virus herpes simplex tipo 1 fue identificado por amplificación
del A D N genómico de I A L V (59).
Virus de la bronquitis
infecciosa
Se desarrolló una técnica de P C R que permite la tipificación de aislamientos del
virus de la bronquitis infecciosa causantes de nefritis (39).
Influenzavirus
A fin de determinar la persistencia del influenzavirus en gansos luego de la infección
por vía oral, se realizó una prueba P C R del gen de la hemoaglutinina; no se encontró
ARN viral en muestras de bazo (82).
396
Virus del Maedi-Visna
Utilizando múltiples cebadores que generan segmentos de A D N con extremos
complementarios es posible detectar el virus del Maedi-Visna en cultivos celulares
infectados con una sensibilidad superior de dos órdenes de magnitud a la de los métodos
existentes (26). Un aislamiento de un virus (EV-1) similar al virus del Maedi-Visna obtenido
de una oveja con signos de artritis y neumonía fue analizado por PCR con el propósito de
demostrar el grado de homología con cepas conocidas del virus del Maedi-Visna (65).
Virus de la fiebre catarral maligna (alcelaphine herpesvirus type 1)
Dos pares de cebadores de 30 bases, correspondientes a la secuencia nucleotídica del
herpesvirus tipo 1 fueron utilizados con éxito para la prueba P C R de lisados celulares
crudos (31). U n fragmento del virus de la fiebre catarral maligna ( A H V - 1 ) fue
subclonado en P V C 1 8 y secuenciado. Se desarrolló PCR de dos pasos basándose en un
fragmento del A D N de A H V - 1 clonado. Cinco aislamientos de A H V - 1 y A H V - 2
fueron específica e idénticamente positivos. Los herpesvirus bovinos B H V - 1 , BHV-2 y
B H V - 4 no pudieron ser d e t e c t a d o s p o r esta p r u e b a . P o r esta técnica se detectó
0,01 T C I D de AHV-1 (34).
5 0
Virus de la enfermedad de
Aujeszky
Secuencias genómicas del virus de la e n f e r m e d a d de Aujeszky ( P R V ) fueron
amplificadas por PCR a partir de cultivos infectados, células nasales y órganos de cerdos
con infección aguda y latente (5). Una prueba P C R de 25 ciclos permitió la detección de
P R V presente en homogenatos celulares en 1 hora con una sensibilidad igual a la de los
métodos convencionales (32). A fin de investigar varios aspectos de la latencia de P R V
en cerdos, se utilizó amplificación enzimática in vitro basada en P C R con primers del
gen gpll en A D N extraído de ganglios trigéminos de porcinos latentemente infectados
con PRV. Cien fg de P R V - A D N se detectaron en geles y 1 fg (equivalente a 6 genomas
virales) por PCR combinada con hibridización (41). Se detectó A D N de P R V latente en
7 de 8 muestras utilizando cebadores correspondientes a los genes gX y gII por P C R
combinada con hibridización (44). U n p r o t o c o l o de P C R (bases 433-651 de gp50)
permitió detectar consistentemente en 24 horas P R V en m u e s t r a s de amígdala
examinadas con el propósito de detectar latencia viral (85). A D N latente de P R V fue
detectado por PCR en ganglios trigéminos de 10 cerdos infectados por vía intranasal
con vacunas preparadas con cepas TK negativas de P R V a los 81 días o más luego de la
infección (80).
Virus de la rabia
Se investigó m e d i a n t e P C R el sitio de multiplicación de un virus de la vaccinia
recombinante ( V V T G g R A B ) que expresa la glicoproteína G del virus de la rabia en
comparación con la cepa parental Copenhagen, luego de la administración oral a zorros.
La prueba P C R permitió detectar V V T G g R A B en las amígdalas y mucosa bucal de
zorros a las 24 y 48 h, en el paladar blando del 50% de los animales a las 24 h y luego de
48 h en un 30% más. Se inocularon zorros con virus aislado de amígdalas 24 h luego de
la administración oral (con o sin amplificación en cultivo de tejido) para realizar ambos
pasajes. No se detectó virus en ningún caso luego de este pasaje. La inocuidad de
V V T G g R A B para zorros fue demostrada (75). Se usó PCR para examinar la patogenia
del virus rábico en ratones luego de la inoculación en el músculo masetero. Se detectó
A R N de cadena positiva en estadios tempranos en ganglios trigéminos; en estadios más
tardíos (96 h p.i.), A R N de cadena positiva fue detectado en grandes cantidades en el
músculo masetero (71).
397
Bacterias
Brucella abortus
Se desarrolló una prueba específica y sensible de P C R para el gen que codifica una
proteína de superficie capaz de detectar 0,1 pg de A D N de la cepa 19 (menos de 100
bacterias) utilizando cebadores que permiten la amplificación de un fragmento de 635 pb
de un gen proteico 43KD de membrana exterior de la cepa 19 de Brucella abortus (21).
Escherichia coli
Se d e s a r r o l l a r o n p r o t o c o l o s de P C R q u e p o s e e n la misma sensibilidad y
especificidad que los m é t o d o s convencionales p a r a d e t e c t a r c o n t a m i n a c i ó n p o r
Escherichia coli en agua (4), queso (46), excremento de cerdo (29) y carne (84). H a sido
posible la amplificación enzimática, m e d i a n t e cebadores con inosina, de diferentes
alelos del gen que codifica para la toxina termoestable tipo I de E. coli enterotoxigénica
(13). La amplificación del o p e r ó n mal B de cepas E. coli A I I E produjo fragmentos
específicos de A D N . El límite de detección fue de 10 bacterias. La prueba fue validada
con 27 cepas enterotoxigénicas (13).
Leptospira spp.
Se desarrolló una p r u e b a P C R p a r a d e t e c t a r un fragmento de 631 pb del A D N
ribosomal 16S bacteriano de la región 5 ' (28). Cuando se aplicó P C R en muestras de
orina bovina, se detectaron hasta 5-10 leptospirae por ml (23).
Listeria monocytogenes
Se detectó Listeria monocytogenes
en p r o d u c t o s alimenticios a través de la
amplificación enzimática de secuencias específicas b a c t e r i a n a s utilizando cinco
oligonucleótidos como cebadores (7). Se amplificaron por P C R fragmentos genómicos
correspondientes a las hemolisinas alfa y beta en salchichas cocidas y leche en 48 h. La
sensibilidad fue de 10 L. monocytogenes/10 ml de leche (22). Resultados variables se
obtuvieron al utilizar P C R para L. monocytogenes en muestras de queso (84). A través
de PCR se determinó que la ausencia del gen que codifica para el fosfatidil inositol está
asociada a la patogenia de L. monocytogenes (12).
Mycobacterium paratuberculosis
Una sonda ( P C R 278) so obtuvo por amplificación por P C R de un fragmento de
278 pb de la región 5'de IS 900, un elemento de inserción contenido en el genoma de
Mycobacterium paratuberculosis. Cuando esta sonda fue usada en conjunto con PCR, se
obtuvo una sensibilidad de 10 fg de material inicial de M. paratuberculosis, equivalente
a dos genomas bacterianos (48).
Mycobacterium tuberculosis
Un p r o d u c t o específico de 396 p b se o b t u v o p o r P C R en ausencia de reacción
cruzada con 10 diferentes cepas de Mycobacterium incluyendo aquellas del complejo
M. tuberculosis. El producto de P C R fue detectado por hibridización aun cuando sólo
10 fg de A D N de M. tuberculosis fueron utilizados como blanco. Se obtuvo una buena
correlación con métodos convencionales y una sensibilidad de 10 fg de A D N purificado
(17). Se desarrolló una p r u e b a P C R , realizable en 48 h, para el segmento repetitivo
IS 6110 (123 pb) del cromosoma de M. tuberculosis a partir de muestras de esputo (19).
El protocolo P C R fue el m é t o d o más sensible p a r a el diagnóstico de la meningitis
tuberculosa (70).
398
Salmonella spp.
C e b a d o r e s específicos y un m é t o d o i n m u n o m a g n é t i c o (partículas magnéticas
cubiertas con anticuerpos m o n o c l o n a l e s ) fueron utilizados p a r a amplificar un
fragmento de 163 pb del genoma de Salmonella typhimurium. Por este método se logró
amplificar por P C R 25 cepas de Salmonella p e r o no otras 19 Enterobactereaceae.
La
sensibilidad del método fue de 100 P F U (88).
Otros patógenos
Mycoplasma spp.
U s a n d o c e b a d o r e s diseñados p a r a las secuencias de los genes del A D N 16S de
Mycoplasma pneumoniae y M. genitalis, se desarrolló una prueba de amplificación in
vitro específica y sensible que permitió detectar hasta 100 células de M. pneumoniae y
1.000 células de M. genitalis (66).
Toxoplasma spp.
Muestras de tejido de fetos abortados fueron examinadas en vistas de detectar la
presencia de Toxoplasma p o r amplificación p o r P C R del gen p30. Se d e m o s t r ó la
presencia del agente en todos los casos (86).
T E C H N I Q U E S D ' H Y B R I D A T I O N D E S A C I D E S N U C L É I Q U E S ET
D'AMPLIFICATION EN CHAÎNE PAR POLYMÉRASE APPLIQUÉES A U
DIAGNOSTIC DES MALADIES INFECTIEUSES ANIMALES. - M. Rodríguez et
A.A. Schudel.
Résumé : Les auteurs décrivent l'application des techniques de détection des
acides nucléiques génomiques - hybridation des acides nucléiques et
amplification en chaîne par polymérase (polymerase chain reaction : PCR) au diagnostic des maladies animales.
La technique PCR est un outil biologique puissant qui permet
l'amplification enzymatique exponentielle in vitro d'une séquence d'acide
désoxyribonucléique
donnée. Cette technique est actuellement appliquée à
l'étude de la pathogénie moléculaire de nombreuses maladies infectieuses ainsi
qu'au diagnostic.
La technique PCR qui est, en général, plus sensible et plus spécifique que les
méthodes traditionnelles et ne nécessite pas d'installations complexes, devrait
prochainement
devenir la méthode de prédilection des laboratoires de
diagnostic, des vétérinaires praticiens et des autorités sanitaires.
MOTS-CLÉS : Amplification en chaîne par polymérase - Diagnostic - Santé
animale - Sondes.
*
399
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