Download PCR - FCQ-MicrodeAlimentos

Probes and polymerase chain
reaction for detection of
food-borne bacterial pathogens.
J.E. Olsen a* * , S. Aabo b, W. Hill ‘, S. Notermansd, K. Wernars,
P.E. Granum e, T. Popovicf, H.N. Rasmussena, 0. Olsvik
226259 Sánchez García Yanira Ivonne
Métodos rápidos de
identificación.
Hibridación de ADN
PCR
Técnicas de
ADN
Cultivo
Microbiológico
Directamente de la comida
Introducción
Usando fragmentos
clonados de los
genes que codifican
las toxinas LT y ST.
Escherichia coli
enterotoxigénica
• En 1980, Mosley et al.
En muestras clínicas en crudo por hibridación de colonias.
Hibridación
• Proceso más común para detectar un gen particular
o un segmento de un ácido nucleico. La variante que
mas se utiliza es el uso sondas.
Sondas moleculares
• Fragmentos cortos y de una sola cadena de ADN o
ARN, marcados con átomos radioactivos. Las sondas
se aparean con secuencias específicas, que permiten
la identificación de un fragmento determinado de
ADN que forma parte de una molécula mucho mayor.
Técnica de hibridación de
colonias.
Metodos de ADN
para la detección
de bacterias
No se aplican en
alimentos.
• Puede deberse a…
• Dependen de los procedimientos tradicionales de cultivo.
• Dependen del uso de marcadores radioactivos.
• Sin embargo, estos métodos son cada vez más utilizados.
• Presencia de enzimas inhibitorias
• Accesibilidad del organismo diana.
• Número de patógenos suele ser reducido y viene acompañado de
un elevado número de microorganismos banales
• La normativa
Ensayos de diagnóstico.
El principio esencial de los
métodos de detección basados ​en
ácidos nucleicos es la específica
formación de moléculas de ácidos
nucleicos de doble cadena a partir
de dos moléculas
complementarias de cadena
sencilla en las condiciones físicas y
químicas definidas.
Hibridación.
In vitro
Hibridación
Sonda (H)
Una de las cadenas
se produce en el
laboratorio
Mientras que la
otra hebra la
proporciona el
organismo diana.
Si se forman híbridos
entre:
La sonda y el ácido
nucleico objetivo.
Hibridación
de fase
sencilla
Hibridación
de colonias
Reacción en cadena de la
polimerasa.
Un
fragmento
de ADN
específico
se
amplifica
durante
un
proceso
cíclico de
3 pasos…
El ADN diana se desnaturaliza a alta
temperatura.
2 oligonucleótidos sintéticos
(primers) son reconocidos por
cadenas opuestas (hibridación)
La polimerización se realiza con el
oligonucleótido como cebador y el
ADN como diana.
Especificidad.
Bacterias patógenas específicas.
Salmonella.
Salmonella
Familia
Enterobacteriaceae
Método de cultivo estandar
Cultivo
Pruebas bioquímicas
Sondas de poli y oligonucleótidos
para la detección de Salmonella.
La falta de
genes
específicos para
las toxinas u
otros factores
de virulencia.
Se han
seleccionado y
estudiado al aza
fragmentos
cromosómicos
clonados.
Entre 1983 y
1992, se han
publicado 6
diferentes
sondas.
5 de las cuales
son fragmentos
de ADN críptico.
ADN críptico.
• Cuando no se tiene evidencia de que tipo de función realizan
los genes que lleva un plásmido.
• En muchos casos si se puede asignar una función:
Plásmidos inv
Codificación a factores
de virulencia.
Plásmidos ent
Plásmidos
Codificación a factores
de resistencia a
antibióticos
Codificación a
plásmidos sexuales
Β- lactamasas
plasmídicas.
• Gopo et al. (1988) aislaron 1.8 kb de una sonda marcada de
biotina.
• Confirmó la presencia de 40 seritopos sin reacciones cruzadas a
15 sepas no-Salmonella.
• Era tan sensible como la marcada con Radio.
Salmonella
Pares de bases
Radio
Un fragmento de 1.8 kp identificó 327 cepas de Salmonella sin hibridación a 59
cepas no-Salmonella
Una sonda de 2.3 kb hibridizó 396 cepas de Salmonella pertenecientes a 214 serotipos
No hibridizó con 178 cepas no-Salmonella de 52 especies ertenecientes a 23 géneros
Técnicas no-isotópicas o
colorimétricas
Sonda
marcada
con S35
Técnicas isotrópicas.
Sonda
marcada
con
digoxigenina
Estudios comparativos sobre los
ensayos con sondas de hibridación.
Métodos basados en
ADN.
Sondas desarrolladas
por Fits et al. (1983)
Cultivo estándar.
• Wilson et al. (1990).
• Hibridación colorimétrica.
• 48 horas.
• Ha remplazado el jit de sondas de Fitss et al.
• Brailey et al. (1991)
SalmonellaTek
I-2- TEST
Hibridación
colorimétrica
Método de
cultivo
99.6%
92.8%
97.5%
91.2%
Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) para la detección de Salmonella.
• 7 ensayos de PCR.
• Widjojoatmodjo et al. (1991).
• Primers aislados de genes de replicación
• Rahn
et al (1992)
• Partículas
magnéticas cubiertas de anticuerpos específicos.
• Utilizó
cebadores
seleccionados
de lareaction
secuencia
del(MIPA)
ge de Inv
• Magnetic
InmunoPolymerase chain
Assay
A Salmonella
• Lisados bacterianos centrifugados
•
•
•
•
630 cepas
de Salmonella.
• 25 cepas
de Salmonella y 19 cepas de no- Salmonella fueron identificados
correctamente.
• 575
Way
etpertenecían
al.
(1993) a 102 serotipos específicos
• 142 cepas de no- Salmonella de 21 géneros.
Cebadores
creados
partir de
H-li
y elg gen Hin flagelin
7 UFC7
• PCR
limite deadetección
de 10
• Dos cepas de cada una de las subespecies Iserotipos: S.
5 UFC7 g
• MIPA
 ylimite
de detección
de 10resultados
Salmonela
móvil.
Senftenberg
S. litchfield
dieron
negativos falsos.
E. coli
Microbiología
de alimentos
Vibrio
Yersinia
enterocolitica
Campylobacter
Listeria
monocytogenes
Staphylococcus
aureus
Baciluis cereus
Clostridium
perfinges
Clostridium
botulinum
CONCLUSIONES.