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Artrópodos y Salud Enero-Mayo, 2015. Vol. 2 No. 1
Efecto de la eliminación con antibióticos de bacterias simbióticas del
intestino medio sobre parámetros biológicos de Aedes aegypti (L.)
EFECTO DE LA ELIMINACIÓN CON ANTIBIÓTICOS
DE BACTERIAS SIMBIÓTICAS DEL INTESTINO
MEDIO SOBRE PARÁMETROS BIOLÓGICOS DE Aedes
aegypti (L.).
https://germanfebres.wordpress.com/2012/02/02/mas-de-cien-billones-de-bacterias-habitan-en-nuestro-cuerpo/
Jesús Dávila-Barboza, Mayela Montes-Rincón, Gustavo Ponce-García, Ma. Eugenia Cisneros. Adriana E.
Flores. Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas, Área de Fisiología y
Toxicología de Insectos del Laboratorio de Entomología Médica. Av. Universidad s/n. Cd. Universitaria, C.P.
66455, San Nicolás de los Garza, Nuevo León. México.
Resumen. Se evaluaron algunos parámetros biológicos posteriores a la eliminación de
bacterias simbióticas de Aedes aegypti (L.) usando el antibiótico penicilina. La administración de
penicilina (200ppm) incluida en solución de sacarosa al 10% posterior a 5 días de inanición
mostro ser una técnica efectiva para el consumo por parte del mosquito y la eliminación 100% de
las bacterias simbióticas del intestino medio de hembras de Ae. aegypti. Esto se comprobó
posteriormente en cultivos con medios BHI y LB. Dicha eliminación mostro tener efectos
notorios en la fecundidad y la supervivencia de las hembras de la colonia tratada, así como su
descendencia (F1), mientras que no se mostró cambio significativo en la fertilidad y longitud alar.
Palabras claves: Aedes aegypti, simbiontes, parámetros biológicos.
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Efecto de la eliminación con antibióticos de bacterias simbióticas del
intestino medio sobre parámetros biológicos de Aedes aegypti (L.)
Introducción
Los
insectos
albergar
muchos
microorganismos que colonizan y crecen
dentro de sus tejidos, principalmente en el
sistema digestivo. Estos, están involucrados
en varios procesos fisiológicos, incluyendo
la digestión de los alimentos, la nutrición, la
fijación del nitrógeno y la reproducción. En
particular, se ha demostrado el papel de las
bacterias asociadas al intestino medio en la
digestión de alimentos en varias especies de
insectos (4).
Las bacterias asociadas con el intestino
de varias especies de mosquitos han sido
ampliamente estudiadas tanto en laboratorio
como en campo (3, 11), informes recientes
han demostrado que estas bacterias parecen
reforzar el sistema inmune del mosquito e
indirectamente mejorar la protección contra
parásitos de la malaria (5,6). Sin embargo,
poco se sabe sobre el papel funcional de
estos microorganismos en la digestión de los
alimentos. Un estudio (11) propuso que las
bacterias presentes en el intestino de Aedes
aegypti (L.) podrían desempeñar un papel en
el metabolismo de azúcares. Su función en la
digestión de la sangre no se ha determinado
hasta la fecha, a pesar de que es bien sabido
que la población bacteriana aumenta
sustancialmente después de alimentarse de
sangre (3,11,15), lo que sugiere una posible
contribución al proceso digestivo como se
observa en otros insectos (2)
Koga et al. llevaron a cabo la
eliminación selectiva de simbiontes por
antibióticos como ampicilina y rifampicina
para su eliminación en algunos áfidos con la
finalidad de entender las funciones
biológicas de estos simbiontes (13). Se ha
estudiado el aporte de los simbiontes en la
mejora nutricional en hormigas del genero
Camponotus, consideradas omnívoras; que
al comparar con grupos aposimbioticos esta
mejora se llegaba a compensar con la
proporción de dietas ricas en aminoácidos
esenciales (8). Evans et al. al incrementar la
infección por Wolbachia pipientis, simbionte
de Ae. aegypti aumenta la actividad con
respecto a: la búsqueda de pareja,
hospederos humanos, lugares de descanso y
sitios de ovoposición además de la tasa
metabólica (7).
En Ae. aegypti la ingestión de diversos
antibióticos afectan la lisis de glóbulos rojos,
retardo en la digestión de proteínas de la
sangre y la reducción en la producción de
huevos; esto último tomando en cuenta que
la proteína de la sangre suple de
aminoácidos necesarios para la síntesis de
vitelogenina,
indispensable
para
la
9
producción de huevos ( ).
El enfoque de este estudio fue el de
evaluar el efecto que tienen ciertos
antibióticos sobre algunos parámetros
biológicos mediante la eliminación de
bacterias simbióticas del intestino medio de
Ae. aegypti, basados en la hipótesis de que
las bacterias simbióticas habitantes del
intestino medio de este mosquito, tienen un
papel esencial en la fisiología del insecto
alterando la producción de huevos, su
viabilidad y el desarrollo de su
descendencia.
Materiales y Método
Material biológico. Se utilizó una
colonia de Ae. aegypti recolectada en la
localidad de Motul de Carrillo Puerto,
Yucatán, México. Los mosquitos (machos y
hembras) fueron mantenidos en jaulas de
20x20x20 cm y se alimentaron con una
solución azucarada al 10% y a las hembras
se les proporcionó Rattus norvergicus
(Berkenhout) como fuente de sangre. Se
colocaron vasos de plástico con agua y tiras
de papel filtro como superficie de
ovoposición en cada jaula. Los huevos
ovipuestos se recolectaron cada semana;
retirando y sustituyendo las papeletas las
cuales se mantuvieron húmedas de 48 a 72
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intestino medio sobre parámetros biológicos de Aedes aegypti (L.)
hrs, después fueron secadas a temperatura
ambiente por dos días para asegurar el
proceso embrionario. Los huevos se
colocaron en charolas plásticas con agua
destilada y un poco de levadura para su
eclosión. Las larvas se alimentaron con
proteína de hígado (MP Biomedicals, LLC),
las pupas se transfirieron a vasos dentro de
jaulas para la obtención de adultos.
Tratamiento
con
antibióticos.
Inicialmente, las jaulas se limpiaron con
etanol al 70% antes de la introducción de las
pupas. Los mosquitos adultos (estos
representan la generación parental) se
sometieron a inanición por 5 días para
posteriormente ser alimentados con una
solución al 10% de sacarosa estéril mezclada
con penicilina (200 ppm). Las hembras del
grupo control se alimentaron solamente con
solución de sacarosa al 10% estéril sin
antibióticos. La alimentación se realizo
durante nueve días consecutivos posteriores
a los cuales recibieron una alimentación de
sangre.
Recuento bacteriano. Veinticuatro
horas después de la alimentación con el
antibiótico, los mosquitos tratados con
penicilina se esterilizaron superficialmente
por inmersión durante un minuto en etanol al
70% y se enjuagaron en un buffer fosfato
salino (PBS). Esto se hizo por triplicado. Del
último lavado con etanol se tomaron 100 µl
para ser sembrados como control en medio
Brain Heart Infusion (BHI) (Sigma-Aldrich
Co.) y medio Luria Bertani (LB) (DIBICO
S.A. DE C.V.) (12). Los mosquitos se
disectaron bajo microscopio estereoscópico
en un portaobjetos con PBS estéril. El
intestino medio fue lavado en PBS estéril y
transferido a un tubo de 2 ml con 100 µl de
PBS. El contenido del tubo se mezcló a
fondo con un vórtex y fue diluido en serie
(10-1 hasta 10-7), una alícuota de 100 µl de
cada tubo se transfirió a las placas Petri con
medio BHI y con un duplicado en medio LB.
Las placas se incubaron a 34 °C durante 24-
48 h. Se realizo el conteo de colonias y se
registraron como unidades formadoras de
colonias (UFC/ml). Como control positivo se
realizo el mismo procedimiento en
mosquitos sin tratamiento con antibiótico
(1,11).
Evaluación
de
la
fecundidad.
Mosquitos hembra (generación parental)
tratados con antibiótico (Colonia1, n=30) y
controles (C. Control, n=19), se alimentaron
con sangre, de manera que los huevos se
pudieran desarrollar y así determinar la
fecundidad; esperando una semana para
llevar a cabo el conteo de los huevos. El
número de huevos puestos por hembra en el
papel filtro se registró semanalmente,
siguiendo este proceso hasta la muerte de la
última hembra y calculándose así la
fecundidad promedio por hembra por
semana (dividiendo el total de huevos por
semana sobre el total de hembras vivas). Los
resultados de fecundidad fueron analizados
por la prueba no paramétrica de KruskalWallis (P< 0.05) comparando las colonias
entre tratamientos y control.
Fertilidad. Posterior a la ovoposición,
las tiras de papel filtro con huevos
provenientes de las colonias de cada
tratamiento y control se colocaron en
charolas con agua y un poco de levadura
para su eclosión. La fertilidad se determino
por el número de larvas en función al
número de huevos puestos por semana.
Supervivencia.
Las
pupas
que
resultaron de las larvas del apartado previo
se transfirieron a una jaula hasta la
emergencia de los adultos. Se calculó el
porcentaje de supervivencia tomando en
cuenta el número de adultos obtenidos en
función del número de larvas vivas
recuperadas por semana. De estas larvas se
tomo una parte (Colonia α, n= 43)
correspondiendo a la F1 y se midieron los
parámetros antes descritos para la
generación parental.
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Longitud alar. Bajo el microscopio
estereoscopio con ocular graduado se
tomaron las medidas de las alas de los
mosquitos como referencia del tamaño de los
mismos. Esto se hizo con la Colonia Control,
Colonia1 generación parental (tratada con
antibióticos), Colonia α (F1) y los mosquitos
de la F2.
Resultados y Discusión
Eliminación de bacterias simbióticas
del intestino medio por penicilina. Se
realizo la recuperación de bacterias
simbióticas del intestino medio (resultados
no mostrados) de Ae. aegypti en medios BHI
y LB, los cuales resultaron ser muy efectivos
como auxiliares para este objetivo (11). La
administración de penicilina incluida en la
solución de sacarosa al 10% posterior a los 5
días de inanición mostro ser una técnica
efectiva para ser ingerida por el mosquito.
La eliminación de bacterias mediante
penicilina en una concentración de 200 ppm
resulto ser eficiente para la eliminación de
bacterias simbióticas, comparada con otros
antibióticos como la ampicilina y
rifampicina (13), tetraciclina y carbenicilina
(9).
Fecundidad, fertilidad, supervivencia
y longitud alar. Los resultados de los
primeros tres parámetros se observan en la
tabla 1. Mosquitos hembra de la Colonia
Control mostraron una fecundidad promedio
semanal entre 28.92 y 45.29 huevos
mostrando una diferencia significativa (P<
0.05) en comparación con los mosquitos
tratados con el antibiótico (Colonia1) cuyos
valores fueron de 6.8 a 32.65 huevos Estos
resultados coinciden con los obtenidos por
García-Mungía (10) quien reporta una
fecundidad de 27 – 48 huevos. La Colonia α
resultó con valores más bajos, de 6.5 a 14.4
huevos en promedio por semana. Al final del
experimento (hasta la muerte de la última
hembra) se calculo el promedio total de
huevos/hembra durante toda su vida notando
una diferencia mayor del 50% entre la
Colonia Control (106.93 huevos) y la
Colonia α (21.70 huevos).
Tomando en cuenta que algunas
bacterias simbióticas intervienen en la
digestión de sangre (9) y por lo tanto en el
aprovechamiento las proteínas, esto pudo
afectar directamente a los individuos de la
Colonia 1 y su descendencia, la Colonia α.
Dado que el numero de huevos que no llego
a madurar fue superior en esta última con
hasta un 31.58% (Fig. 1).
Fig. 1. Huevo de Ae. aegypti de la colonia α (F1)
derecha, al lado de un huevo de la colonia control
(izquierda) mostrando falta de maduración.
El porcentaje de fertilidad también
mostro un decremento en la cantidad de
larvas para la Colonia α con valores mínimos
de un 3.47%; sin embargo los porcentajes de
supervivencia fueron los más altos para esta
misma con hasta un 100% de adultos/larva.
La longitud alar de los mosquitos
hembra entre las C. Control, Colonia 1 y
Colonia α mostraron valores promedio
similares (2.751, 2.663 y 2.530 mm,
respectivamente) y en machos (1.57, 1.57 y
1.95 mm, respectivamente), sin embargo los
mosquitos de la F2 mostraron un desarrollo
alar comparativamente mayor (2.87 mm
hembras y 2.56 mm machos).
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Tabla 1. Fecundidad, fertilidad y supervivencia, registrados semanalmente en mosquitos hembras de Ae. aegypti
tratados y sin tratar con antibiótico además de la F1 resultante de los mosquitos tratados.
% de
Fecundidad
% de
# de
% de
Colonia Semana Hembras Total huevos
promedio Larvas
Adultos
fertilidad
hembras supervivencia
inmaduros /semana
41.27
1
15
619
0%
249
38.29%
43
25
17.27%
28.92
2
13
376
0%
95
25.00%
94
98.95%
Control
41.71
3
7
249
14.73%
45.29
4
7
317
0%
249
78.55%
5
2
2.01%
106.93
Total
15
1604
2.68%
32.92
1
26
849
0%
19.15
2
26
498
0%
316
63.45%
79
27
25%
26.41
3
22
578
0.52%
254
43.94%
160
90
59.04%
1
9.90
4
10
99
0%
6.80
5
5
34
0%
79.54
Total
26
2068
0.15%
16.10
1
20
288
10.56%
10
3.47%
10
4
100%
9.50
2
6
39
31.58%
9
23.08%
9
7
100%
α
9.17
3
6
51
7.27%
39
76.47%
32
9
82.05%
21.70
Total
20
434
13.59%
Conclusiones
La administración de antibióticos
incluidos en una solución de sacarosa al 10%
posterior a los 5 días de inanición mostro ser
una técnica efectiva para la ingestión por
parte del mosquito. Los medios de cultivo
BHI y LB mostraron ser apropiados como
auxiliares para el aislamiento de bacterias
simbiontes.
La
penicilina
a
una
concentración de 200 ppm mostro ser
efectiva en la eliminación de las bacterias
simbióticas del intestino medio de Ae.
aegypti; la eliminación de estas mostro tener
efectos significativos (p<0.05) en la
fecundidad y la supervivencia en la Colonia
Literatura Citada
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α (F1); mientras que en la fertilidad y
desarrollo, en base a su longitud alar, no se
mostró alteración significativa. El porcentaje
de huevos no fértiles pudo ser por causa de
la eliminación de algunas bacterias
simbióticas; las cuales podrían ser
transmitidas transovaricamente. Para esto se
propone un estudio de las bacterias
simbióticas que estén estrechamente
relacionadas con el aparato reproductivo o
los túbulos de Malpighi de los mosquitos, así
como la caracterización y evaluación de la
contribución digestiva de las bacterias
aisladas.
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