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I. FENÓMENOS DE TRANSPORTE EN FERMENTACIÓN
SUMERGIDA PARA OBTENER ENZIMA α-AMILASA
BACTERIANA
Lena Prieto Contreras1*, Renata Grebechova 2 y Luz Mary Figueroa3
1,2,3
Universidad de La Salle. Bogotá, Colombia.
Dirección: Calle 10 # 2 – 70 Tel. 3535360, Ext. 2553
1*
[email protected]
RESUMEN
En esta investigación se evaluó la fermentación sumergida para obtener enzima αamilasa con la cepa de Bacillus subtilis ATCC 21556 en un biorreactor New Brunswick
modelo BioFlo 110, con 3 L de medio de cultivo que contenía lactosa como sustrato y con
adición permanente de 1 L/min de oxígeno. En estas condiciones, se hallaron los
fenómenos de transporte desarrollados, así: coeficiente de transferencia de película entre
la pared del biorreactor y el medio de 1,71 W/K.m2 para un calor generado de 0,2413 W;
coeficiente de transferencia de masa de 4,24 x 10-4 m/s; y una potencia disipada con
aireación de 0,1936 W; para un rendimiento de 0,060 kg de enzima/3L de medio de
cultivo.
Palabras claves: Bacillus subtilis, enzima α-amilasa, fenómenos de transporte
I. INTRODUCCIÓN
Los fenómenos de transporte definen
los comportamientos de una fermentación
sumergida
para
proponer
nuevos
volúmenes de producción a nivel
industrial.
Entre
los
criterios
de
producción utilizados con mayor éxito
están: potencia por unidad de volumen,
tiempo de mezcla, coeficiente volumétrico
de transferencia de masa y velocidad de
la punta del impulsor. Por ello, la
aplicación de estos criterios requiere un
profundo conocimiento del proceso y la
forma de obtención del producto.
Por consiguiente, el objetivo de esta
investigación
fue:
determinar
el
comportamiento de la fermentación desde
los fenómenos de transporte: consumo de
potencia, calor transferido y oxígeno
disipado en la operación durante el
proceso de producción y aislamiento de la
enzima α-amilasa con B. subtilis ATCC
21556.
Además,
se
obtendrá
conocimiento sobre los principios de
ingeniería de la fermentación sumergida
que compone el proceso de Biotecnología
para su aplicación a nivel industrial
(Scragg 2000), y será un aporte en este
campo importante hoy en día en la
industria de los alimentos.
Es así como, se destacan algunos
estudios sobre el efecto de la utilización
de la enzima α-amilasa en la industria de
alimentos y su efecto sobre los
carbohidratos, en la Universidad de
Buenos Aires (Pilosof y Barthlomai 2002);
también se investiga el efecto de
involucrar esta enzima en alimentos con
sorgo, en Venezuela (Plata et al. 2004); y
obtención de dextrinas a partir de
arracacha mediante el empleo de αamilasa, en la Universidad Católica de
Santa María en Perú (Oporto y Zuzunaga
2002).
Además de lo anterior, se han
realizado
investigaciones
sobre
fermentaciones para la obtención de
enzimas con destino a diferentes
procesos industriales, como: optimización
de la producción de α-amilasa que se
utiliza en la industria textil para el
ablandamiento de tejidos, utilizando un
subproducto de la industria láctea como
es el suero ácido de queso y la harina de
amaranto como aporte fundamental de
factores
de
crecimiento
del
microorganismo (Ferreyra et al. 2005); y
en la industria alimentaria, se ha
investigado sobre la adición de α-amilasa
y gluten vital en diferentes tipos de harina
trigo para la elaboración de pan de molde
(Acosta et al. 2004).
En
Colombia,
se
investigó
la
producción de la α-amilasa con células
libres y con células inmovilizadas de
Thermus sp. (Poutou et al. 1996). Por otra
parte, se está investigando la producción
y caracterización de α-amilasa obtenida
de cepas nativas de Bacillus sp., por
ejemplo, una cepa nativa se aisló de una
mina aurífera (Montoya y López 2001,
Vanegas et al. 2001). En la Universidad
De La Salle, se tiene la línea de
Investigación
en
Biotecnología
de
Enzimas, y se han realizado varias
investigaciones sobre la producción de
enzimas
obtenidas
a
partir
de
microorganismos (pectinasa y amilasa).
Grebechova y Prieto (2003a) evaluaron
dos cepas (ATCC 21556 y La Salle) de B.
subtilis para la obtención de α-amilasa y
concluyeron que la cepa ATCC 21556
produce significativamente más cantidad
de enzima que la cepa La Salle.
Grebechova y Prieto (2003b) evaluaron la
actividad amilolítica de la α-amilasa
producida por la bacteria B. subtilis ATCC
21556. Grebechova y Prieto (2004)
optimizaron
los
parámetros
para
fermentación sumergida a pequeña
escala (250 mL de medio de cultivo)
empleando B. subtilis ATCC 21556.
Por último, se destaca mostrar con los
fenómenos
de
transporte
de
la
fermentación sumergida para obtener
enzima α-amilasa, las características
reológicas del medio de cultivo, la
velocidad de agitación, el flujo de aire
para evaluar los números de potencia y
de Reynolds, el calor requerido para
favorecer el clima de crecimiento de los
microorganismos que producen los
productos de interés, la diferencia de
temperatura entre el biorreactor y el
medio ambiente, el área disponible para
transferencia de calor, las cantidades de
oxígeno que permiten el crecimiento de
los microorganismos a través del
metabolismo que desarrollan, la oxidación
de la fuente de carbono y su
transformación
en
productos
que
establecen una demanda de oxígeno que
es esencial satisfacer a través de la
aireación durante la realización de la
fermentación en el biorreactor.
II. MATERIALES Y MÉTODOS.
Se partió con los resultados del mejor
medio líquido experimental (E-1) de la
investigación de “Biotecnología de las
enzimas microbianas pectinasa y amilasa”
(Grebechova y Prieto 2004), que
contiene: lactosa 6%, extracto de
levadura 1%, extracto de maní 1% y sales
1,252%; y se realizó la fermentación
sumergida con la cepa B. subtilis ATCC
21556 en un biorreactor New Brunswick
modelo BioFlo 110, con volúmenes de 3 L
por triplicado, a las condiciones
estudiadas de: temperatura 37 oC, pH 6,0
- 6,5 y agitación entre 170 a 200 rpm
(Grebechova y Prieto 2004).
Inicialmente
se
pesaron
los
componentes del medio líquido y se
preparó 3 L de volumen. Después, se
alistó el inóculo con 300 mL del medio de
cultivo líquido y la cepa de B. subtilis
ATCC 21556 en estado de esporulación,
es decir, a las 24 horas de su incubación
a 37 oC. Se inoculó el medio de cultivo en
el
biorreactor
para
comenzar
la
fermentación durante 72 horas. A las
fermentaciones realizadas se halló las
cantidades
de:
sustrato,
biomasa,
producto, nutrientes, y energía empleada,
para calcular los balances de materia y de
energía
durante
la
multiplicación
bacteriana.
Con los cálculos balances de materia y
de energía, se determinaron los
fenómenos
de
transporte
que
comprenden: la potencia durante la
agitación,
los
coeficientes
de
transferencia de masa o de oxígeno que
se utilizó, y de transferencia de calor que
actuó en la fermentación sumergida.
Para hallar estos valores, se hallaron
los valores de viscosidades del medio de
cultivo (viscosímetro de caída de una
esfera de acero inoxidable marca
Gilmont 
 k   esfera   líquido  t caida ),
densidades (picnómetro), caudales de
oxígeno (1 L/min se empleó y se leyó
constantemente en el rotámetro del
biorreactor), velocidades de agitación, y
temperaturas cada 8 h durante la
fermentación; y por último, se midió las
características físicas del biorreactor New
Brunswick BioFlo 110, como diámetro del
vaso, diámetro del agitador y área de la
chaqueta de calentamiento.
2.1 Potencia de agitación.
Para la cuantificación, se determinaron
características principales del biorreactor
como: diámetro, tipo de impulsor, número
de impulsores, distancia entre impulsores,
número de paleta por impulsor, diámetro
del impulsor, longitud del eje de rotación,
número de deflectores y ancho de los
deflectores.
Además, se cuantificó el volúmen del
medio líquido y la altura del mismo en el
biorreactor.
2.2 Transferencia de calor.
Para evaluar esta parte, se hallaron: el
área de transferencia de calor disponible
por la camisa del biorreactor, el calor
generado por el cultivo, el oxígeno
consumido, el calor generado por la
agitación del medio, el calor entregado al
medio por la dispersión del aire, el
diámetro de la manguera que lleva el aire,
el flujo de aire, la densidad del aire y el
calor total generado en el biorreactor.
2.3 Transferencia de masa.
Para este componente de los
fenómenos de transporte, se hallaron
durante el desarrollo de la fermentación
sumergida: el caudal de aire para definir
la velocidad superficial del gas, el
diámetro de las burbujas de aire, el área
de la superficie de separación gas-líquido
por unidad de volumen de dispersión, el
coeficiente de transferencia de masa y el
coeficiente volumétrico de transferencia
de masa.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La fermentación sumergida para la
obtención de la enzima α-amilasa a partir
del crecimiento de la bacteria B. subtilis
ATCC 21556 en el medio líquido E-1,
produjo 0,060 kg de enzima/3 L de medio
de cultivo; este rendimiento se estableció
por medio de balance de materia. La
fermentación se desarrolló en un
biorreactor New Brunswick BioFlo 110, el
cual cuenta con 2 impulsores y 6 paletas
en cada impulsor, estos se encuentran
separados 13 cm; además, tiene 4
deflectores de 2 cm de ancho cada uno.
Los fenómenos de transporte presentados
durante la fermentación se presentan a
continuación.
3. 1 Potencia de agitación.
El biorreactor cuenta con un agitador
de impulsores de turbina doble: una en la
base y otra en la zona media. Este
agitador dispersa el calor y el oxígeno en
el medio líquido, por esto, la velocidad del
mismo es importante evaluarla así como
su consumo de potencia. El caudal de
aire fue de
1 L/min y se leyó
constantemente en el rotámetro del
biorreactor. Las ecuaciones que se
emplearon en los cálculos de potencia
están propuestas en Doran (1998) y
Duarte (1995).
El volumen del medio fue de 0,0039
m3, donde se originó un número de
Reynolds de 7170,63 y como este número
es > 1000, por consiguiente, el factor de
potencia fue de 5,7 (Duarte 1995) para el
impulsor de turbina con 4 deflectores.
También, se encontró la potencia disipada
por el impulsor en el líquido sin gasear
que fue de 0,101 W pues no se
presentaron vórtices durante la agitación;
y la potencia disipada en el líquido
gaseado fue de 0,1936 W con un número
de aireación de 0,029, para la agitación
del biorreactor a 180 rpm.
3.2 Transferencia de calor.
La fermentación sumergida recibió
calor por medio de la camisa que
envuelve al biorreactor, la cual se calienta
eléctricamente, sus medidas son: 0,62 m
de largo y 0,18 m de ancho. El área de
transferencia de calor fue de 0,09 m2,
calculada con el diámetro del biorreactor y
la altura del medio líquido. El calor
generado por el cultivo de bacterias fue
de -0,021 W, las cuales consumieron
1,55x10-5 mol/L.s de oxígeno.
El calor generado por la agitación del
medio de cultivo fue de 0,1936 W para
cada litro por minuto. Otro calor
cuantificado fue el entregado al medio por
la dispersión del aire de 0,026 W, donde
se consideró que el aire ingresa por una
manguera de 5/16 de pulgada de
diámetro con una velocidad de 0,338 m/s.
La pérdida de presión de las burbujas de
aire en el biorreactor para la altura del
medio (0,164 m) fue de 0,233 lbf/in2. Por
consiguiente, el calor total generado en el
biorreactor fue de 0,2413 W. Todas las
condiciones anteriores definieron un
coeficiente de transferencia de calor de
1,71 kW/m2.K entre el medio y la
superficie
interna
del
biorreactor
encamisado y, esto mostró que el calor
generado fue suficiente y no se requiere
área adicional pues el área de
transferencia disponible en la camisa fue
de 0,09 m2 > 1,76 x 10-5 m2 requeridos.
3.3 Transferencia de masa.
Para los cálculos de la transferencia de
oxígeno en el medio de la fermentación
sumergida, se hallaron: la velocidad
superficial de 7,06x10-4 m/s; la retención
de gas de 0,0046 con un diámetro de
burbujas de aire de 3,65x10-3 m; la
separación gas-líquido por unidad de
volumen de dispersión de 7,56 m-1. Todas
las
características
mencionadas
determinaron
un
coeficiente
de
transferencia de masa de 4,24x10-4 m/s y
un
coeficiente
volumétrico
de
transferencia de masa de 3,65x10-3 s-1.
Los valores anteriores se establecieron
por medio de la aplicación de los diversos
modelos matemáticos propuestos por
investigadores como: Nagata, McCabe,
Smith,
Van’t Riet, Nagai, Humphrey,
Ackley, Calderbank y Moo-Young (Prieto
y Grebechova 2006, Doran 1998, Duarte
1995); los cuales explicaron los
fenómenos de transporte presentados en
una fermentación sumergida de 3 L de
volumen de medio de cultivo líquido, y
que satisfacieron los requerimientos del
microorganismo B. subtilis ATCC 21556
para pasar a través de la biosíntesis del
sustrato de lactosa a la enzima α-amilasa
como producto principal.
Finalmente, se recomiendan los
siguientes factores geométricos del
biorreactor empleado: diámetro del
impulsor/diámetro del biorreactor=1/3;
ancho
de
deflectores/diámetro
del
biorreactor=1/9; altura entre la base y el
primer impulsor/altura entre impulsores=1;
y número de deflectores=4; para revisar
los cambios que se presenten en
fermentaciones sumergidas de volúmenes
mayores de producción.
IV. CONCLUSIONES
Los
fenómenos
de
transporte
evaluados en la fermentación sumergida
estudiada para producir enzima α-
amilasa, se proponen en el caso de pasar
a fermentaciones con volúmenes más
grandes, tanto de planta piloto como
industriales, donde se busca relacionar
estos fenómenos en los diversos tamaños
de producción. Es así como, se establece
que el coeficiente de transferencia de
calor varíe proporcionalmente al cuadrado
del diámetro del biorreactor, y que el
coeficiente de transferencia de masa
varíe proporcionalmente al cubo del
diámetro (Quintero, 1981), por lo cual se
propone
las
siguientes
relaciones,
respectivamente:
Otra
relación
propuesta
por
investigadores, es la potencia disipada
por unidad de volumen proporcional al
volumen del fermentador (Duarte, 1995),
para el caudal de 1 L/min de aire en la
fermentación estudiada se encontró una
relación de potencia-volúmen 0,0645,
puesto que se espera que a mayor
volumen de la fermentación la potencia de
trabajo del agitador disminuye (Quintero,
1981); por lo tanto, la otra relación
propuesta es:
Los coeficientes de transferencia de
calor en fermentaciones se recomiendan
entre 3 y 5 kW/m2.K, y en la investigación
se
determinó
un
coeficiente
de
transferencia de calor de 1,71 kW/m2.K,
valor cercano al límite inferior (Quintero
1981, Scragg 2000). Entonces, es
conveniente para nuevos volúmenes
evaluar estos parámetros propuestos de
los fenómenos de transporte y así
establecer más criterios para cambiar a
nuevas escalas de producción (Mukesh,
2002).
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fecha de consulta: Febrero 20 de 2006
Agradecimientos:
Al financiamiento de la investigación por
parte de la Universidad De La Salle. Al
Doctor Camilo Rozo Decano de la
Facultad de Ingeniería de Alimentos, y a
la
Doctora
Estrella
Cárdenas
Coordinadora de Investigación; por sus
valiosas colaboraciones y aportes.