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Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas II. BIOLOGÍA DE LAS MICOBACTERIAS 2.1. EL GÉNERO MYCOBACTERIUM. Las bacterias pertenecientes al género Mycobacterium en general cumplen con las siguientes características:
· Bacilos aerobios obligados.
· Inmóviles.
· No esporulados.
· Miden de 0,2um a 0,4um x 2um a 10 um.
· Son bacilos ácido alcohol resistentes, debido a la complejidad de la pared celular que poseen.
· In vitro, su crecimiento es lento, dividiéndose cada 12 o 24 horas.
· Mycobacterium leprae no puede ser cultivado in vitro.. 2.2. ESTRUCTURA NUCLEAR Las características hereditarias de todo ser viviente están determinadas por la estructura del genoma. El material genético de una célula esta compuesto por ácido desoxirribonucleico (DNA) organizados en uno o más cromosoma (el material genético es denominado como el genoma de un organismo).
Eliel Mendoza Wong 12 Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas Como sabemos, toda célula existente en el planeta tierra, posee un genoma que se encarga de transmitir y expresar su información genética. En el caso de las células procariotas, el genoma o DNA está compuesto por un único cromosoma o DNA de doble hélice en forma circular. (A esta forma se le denomina nucleoide, el cual no se encuentra unido a la membrana celular de la bacteria y está suelto en el citoplasma. La secuencia del genoma de las Micobacterias, en promedio, comprenden de almenos 400 genes. el DNA mide aproximadamente de 300 a 1400 um de largo y se presenta en la célula súper enrollado (la molécula de cadena doble está enrollada sobre si misma como una banda elástica entrelazada.). 2.3. ESTRUCTURA DE LA PARED CELULAR Las características más importantes del género Mycobacterium, están determinadas por la complejidad de su pared celular. Las micobacterias poseen una pared celular compleja y rica en lípidos. Esta pared celular es la responsable de muchas de las propiedades características de las bacterias:
· Su ácido alcohol resistencia
· Crecimiento lento
· Resistencia a detergentes
· Resistencia a antibacterianos comunes
· Antigenecidad
Eliel Mendoza Wong 13 Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas Los lípidos de la pared celular de los microorganismos pertenecientes a los géneros Mycobacterium, Nocardia y Corynebacterium, constituyen más del 60 % del peso seco de la pared bacteriana. En sus paredes contienen unas moléculas llamadas ácidos micólicos. Además, la pared celular de las Micobacterias contiene una capa de peptidoglicano, cuya estructura es similar a la encontrada en las paredes de las bacterias Gram negativas, denominado: lipoarabinomanano (LAM), esta molécula es compleja, y se extiende desde la membrana plasmática hasta la superficie celular. El LAM es análogo desde el punto de vista de estructural y funcional al lipopolisácarido de las bacterias Gram negativas. El peptidglicano está unido a un polisacárido ramificado llamado arabinogalactano por enlaces fosfodiéster. Los extremos dístales del arabinogalactano están esterificados con el ácido micólico de alto peso molecular. Estos glucolípidos de alto peso molecular tienen un esqueleto carbonado cuya longitud oscila entre C78 Y C90. En Mycobacterium tuberculosis, el único ácido micólico 6,6'­dimicoliltrehalosa es conocido como el factor cordón. El complejo peptidoglicano­ácido micólico­arabino­galactano forma el esqueleto de las paredes celulares de las micobacterias. Las cadenas hidrocarbonadas de los ácidos micólicos están intercaladas con la de los numerosos lípidos y glucolípidos asociados con la pared. los lípidos asociados con la pared incluyen grupos acil grasos de longitud media (C24 A C36) y corta (C12 a C20).
Eliel Mendoza Wong 14 Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas Los lípidos de la pared celular de las micobacterias vuelven hidrófoba a la Micobacteria, esta capacidad hacen que las micobacterias sean resistentes a la coloración con tinciones básicas de anilina, a menos que éstas se apliquen con calor o detergentes, o durante periodos prolongados. Las micobacterias resisten a la decoloración con una mezcla de 3 % de ácido clorhídrico y 95 % de etanol, esta propiedad las ha hecho llamar bacterias ácido­alcohol­resistentes. Es por esta propiedad, que las Micobacterias, se tienen que teñir fucsina carbólica (técnicas de Ziehl­ Neelsen/Kinyoung), o con los fluorocromos (Auramina y Rodamina).
Eliel Mendoza Wong 15 Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas 2.3.1. ÁCIDOS MICÓLICOS. Los ácidos micólicos son β­hidroxiácidos grasos grandes, α­sustituidos, que se presentan como ésteres unidos a polisacáridos de la pared celular. Los ácidos micólicos varían en el número de átomos de carbono; aquellos con 30 carbonos (C30) se encuentran entre las corinebacterias (ácidos corinemicolénicos), los de C50 se encuentran en especies de Nocardia (ácidos nocárdicos) y aquellos con 90 carbonos (C90) o más constituten a los ácidos encontrados en el género Mycobacterium. 2.3.2 EL FACTOR CORDÓN. Esta molécula está asociada con la virulencia de Mycobacterium tuberculosis y con una amplia gama de actividades biológicas, que incluyen la citotoxidad de la membrana celular, la inhibición de la migración de los polimorfonucleares, la inducción de la formación de granulomas, actividad adyuvante, actividad antitumoral y habilidad para activar la vía alterna del complemento. Figura 2.3.2. Molécula del factor cordón
Eliel Mendoza Wong 16 Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas 2.4 CRECIMIENTO. El crecimiento de las micobacterias en general es muy largo en comparación con las bacterias no ácido alcohol resistentes, esto debido a la capacidad hidrófoba de la pared celular, que las hace agruparse, inhibiendo la permeabilidad celular a los nutrientes. Sin embargo el optimó crecimiento, varia con las necesidades nutricionales de cada especie del género Mycobacterium. Existen las micobacterias no patógenas que crecen hasta en grifos de agua. Mycobacterium tuberculosis, que es la especie mas patógena para el humano, manifiesta su crecimiento intensificado al cultivarse a una atmósfera de 10% de dióxido de carbono y con pH de 6.5 a 6.8. Mycobacterium leprae posee un parasitismo intracelular de tal forma que no en crece en medios de cultivo in vitro y su crecimiento en cultivos celulares es difícil de obtener. Tabla.2.4. Crecimiento de las Micobacterias con mayor importancia clínica en el humano. CRECIMIENTO ESPECIE Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium kansasii Mycobacterium scrofulaceum Lento Lento Lento Lento Lento Rápido Lento Lento No crece en medios convencionales Rápido Mycobacterium avium­intracellulare Mycobacterium fortuitum Mycobacterium Marinum Mycobacterium ulcerans Mycobacterium leprae Mycobacterium smeagmatis * LENTO: Se desarrollan colonias en 10 días o más *RAPIDO: Se desarrollan colonias en 7 días o meno
Eliel Mendoza Wong 17 Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas 2.5. CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE LAS MICOBACTERIAS Existen ciertas características bioquímicas que se manifiestan en las micobacterias, y son observadas cuando estas son cultivadas in vitro. De tal forma que en el Laboratorio, tales características pueden ser utililizadas para su identificación. 2.5.1. PRODUCCIÓN DE PIGMENTO (FOTORREACTIVIDAD). Las micobacterias son capaces de producir pigmentación en ausencia o presencia de luz. Si la colonia produce una pigmentación en ausencia de luz, es denominada "Escotodromógena", en cambio si la colonia produce la pigmentación al exponerse a la luz esta se denomina "Fotocromógena". Por lo general las micobacterias producen un color amarillo­gamuza, a excepciones de algunas que producen colores grisáceos y naranjas. 2.5.2. ACUMULACIÓN DE NIACINA. Todas las micobacterias producen niacina; sin embargo, solamente Mycobacterium tuberculosis, M. simiae y ocasionalmente cepas de M. africanum, M. bovis, M. marinum y M. chelonae carecen de las enzimas necesarias para convertir la niacina a ribonucleótido de niacina (dinucleótido de adenina nicotinamida o NAD).
Eliel Mendoza Wong 18 Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas 2.5.3. REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS. Sólo unas pocas especies de micobacterias, en especial Mycobacterium tuberculosis, producen nitrorreductasa, la cual cataliza la reducción de nitratos a nitritos. En la reacción, se extrae oxígeno del nitrato: NO3 + 2e­ + 2H ­­­­­­ NO2 + H2O 2.5.4. ACTIVIDAD DE LA ENZIMA CATALASA. La mayoría de las micobacterias producen catalasa: sin embargo no todas las especies pueden producir una reacción positiva después de calentar el cultivo a 68ºC durante 20 minutos (catalasa termoestable).La mayoría de las cepas de Mycobacterium tuberculosis y otros miembros del complejo M. tuberculosis no producen "catalasa termoestable", excepto para ciertas cepas isoniazida resistentes (INH). 2.5.5. ACTIVIDAD DE LA ENZIMA ARILSULFATASA. la arilsulfatasa es una enzima que cliva fenolftaleína libre a partir de la sal tripótasica del disulfito de fenolftaleína.esta propiedad bioquímica es utilizada para diferenciar a micobacterias de crecimiento lento (complejo M.fortuitum­chelonei +) de las bacterias no fotocromógenas (complejo Micobacterium avium­intracellulare ­).esta enzima también es producida por M. marinum, M. kansasii, M. szulgai y M.xenopi.
Eliel Mendoza Wong 19 Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas 2.5.6. ACTIVIDAD DE LA ENZIMA UREASA. La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de Mycobacterium, que pueden hidrolizar la urea para formar amoníaco y dióxido de carbono. El amoníaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, lo que produce alcalinización y aumento del pH del medio. Como prueba bioquímica, se utiliza para diferenciar M. scrofulaceum (+) de M. gordonae (­) . También diferencia M. gastri (+) de micobacterias no cromógenas. 2.5.7. ACTIVIDAD DE LA ENZIMA PIRAZINAMIDASA. La pirazinamidasa es una enzima que deamina la pirazinamida para formar ácido pirazinoico. Ladesaminación de la pirazinamida a ácido pirazinoico en 4 días es una caractéristica fenotípica utíl que diferencía M. marinum (+) de M. kansasii (­). 2.5.8. INCORPORACIÓN DE HIERRO. Algunas micobacterias como M. fortuitum y M. phlei tienen la capacidad de incorporar sales de hierro solubles en un medio de cultivo. Mycobacterium chelonae no capta el hierro.
Eliel Mendoza Wong 20 Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas 2.5.9. CAPACIDAD DE CRECIMIENTO EN CLORURO DE SODIO AL 5% Existen micobacterias capaces de crecer en un medio de cultivo el cual contenga cloruro de sodio al 5 por ciento como: M. flavescens, M. triviale y todas las micobacterias de crecimiento rápido, excepto M. chelonae sub chelonei. De las otras, solo M. triviale crece en medios con 5 % de cloruro de sodio.
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