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Especificidad de las pruebas de PCR simple y anidada, dirigida al gen de la
proteína MPB70 del Complejo Mycobacterium tuberculosis
Jaramillo Meza L1, Quevillon CE2, Díaz OF1*, Santillán FMA1
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INIFAP CENID-Microbiología, Km 15.5 Carretera México-Toluca, Col. Palo Alto, CP
05110, México D.F, [email protected]; 2Université de Montréal
La proteína MPB70 es uno de los principales componentes de Mycobacterium bovis y
de otras especies que conforman el complejo Mycobacterium tuberculosis, por lo que,
se considera un antígeno conveniente para el desarrollo de métodos diagnósticos
inmunológicos y moleculares. Sobre la base, una PCR simple que amplifica una región
de 372 pb del gen de la proteína, fue establecida por Cousins y col., (1991);
posteriormente para incrementar la sensibilidad, Estrada y col., (2004) desarrollan una
PCR anidada que amplifica una región interna del amplicon de 372pb, obteniendo un
producto de 208 pb. Sin embargo, no existen estudios que muestren la especificidad de
las pruebas, por lo que, existe inquietud de que se presenten resultados falsos
positivos al aplicarse en muestras biológicas. El objetivo del estudio fue evaluar la
especificidad de ambas pruebas de PCR, para lo cual se emplearon las siguientes
cepas de micobacterias: Mycobacterium: M. bovis ATCC, M. bovis AN5, M. bovis BCG
cepa Danesa, M. tuberculosis, M. kansasii, M. avium, M. microti, M. fortuitum, M. phlei,
M. chelonae, M. abuense, M. rhodesiae, M. mucogenicum y otros géneros bacterianos
relacionados y no relacionados, como: Nocardia asteroides, Corynebacterium
pseudotuberculosis, C. xerosis y Staphylococcus aureus. Los microorganismos se
cultivaron y extrajo su ADN. Para la PCR se consideraron variaciones en la
temperatura de alineación de 52°C a 62°C. Los iniciadores para la PCR simple fueron:
TB1-F, 5’GAACAATCCGGAGTTGACAA3’ y TB1-R, 5’AGCACGCTGTCAATCATGTA3’.
Para la PCR anidada se emplearon los iniciadores M22/3, 5’GCTGACGGCTGCACT
GTCGGGC3’ y M22/4, 5’CGTTGGCCGGGCTGGTTTGGCC3’. Los productos se
analizaron en geles de agarosa al 1.5 %. En el análisis no se observaron amplicones a
la temperatura de alineación de 62°C en la PCR simple, para ninguno de los
microorganismos, sin embargo se observó amplificación en las demás temperaturas
ensayadas tanto para las especies del complejo M. tuberculosis, como para M. kansasii,
los controles negativos permanecieron como tal en los ensayos. En la PCR anidada
todos los productos fueron visibles, bajo las condiciones establecidas originalmente,
para las especies del complejo M. tuberculosis. Lo relevante del análisis fue observar
que bajo las condiciones de temperatura de alineación establecidas por Cousins y col.,
(1991), los productos que de ella derivaron y que se utilizaron en la PCR anidada se
generaron amplicones del mismo tamaño para las especies no tuberculosas: M.
kansasii, M. abuensi y M. phlei. Mayormente, el análisis de la secuencia nucleotídica
reportada del gen de la proteína MPB70 mediante BLASTn señala un alineamiento de
más del 70% con las especies de micobacterias no tuberculosas, M. smegmatis, M.
gilvum (flavescens) y M. neoaurum. Así, pese a la mayor sensibilidad de detección (5fg)
que ha mostrado la PCR anidada, su especificidad se muestra comprometida, de
acuerdo a los resultados del análisis, señalando con ello, la posibilidad de encontrar
resultados falsos positivos al complejo tuberculosis al aplicarse en muestras biológicas;
debido a ello su empleo debe acompañarse de otros métodos diagnósticos para
confirmar los resultados, dado que ello tiene injerencia tanto en el diagnóstico per se
como en estudios epidemiológicos que se realicen sobre la enfermedad.