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Tema 6: MÉTODOS PARA EL ESTUDIO DE HORMONAS
6.1. Radioinmunoanálisis.
6.2. Enzimoinmunoanálisis.
6.3. Fluoroenzimoinmunoanálisis.
6.4. Quimioluminoinmunoanálisis.
INTRODUCCIÓN
Para la determinación de hormonas y sus metabolitos pueden utilizarse diversos
métodos: químicos, espectrofotométricos, cromatográficos.
Los más utilizados son las técnicas inmunoquímicas: radioinmunoanálisis (RIA),
enzimoinmunoanálisis
(EIA),
fluoroinmunoanálisis
(FIA)
y
quimioluminoinmunoanálisis.
6.1. RADIOINMUNOANÁLISIS
Es una técnica inmunológica propuesta en 1959 por Yallow y Berson, que tiene una
gran aplicación en clínica.
Permite la cuantificación exacta de compuestos biológicos presentes en el organismo
en concentraciones tan bajas como ng/ml (nanogramo=10-9 g) o incluso de pg/ml
(picogramo=10 -12 g), incluso hacerlo en mezclas con enormes cantidades y
diversidad de materiales extraños, por lo que no es necesario purificar previamente
la muestra.
Fundamento:
El radioinmunoanálisis se basa en una reacción antígeno-anticuerpo.
Los anticuerpos deben ser específicos contra la substancia que queremos
determinar, y tener una gran afinidad.
La cantidad de anticuerpo añadida al análisis es limitada, e inferior a la cantidad de
antígeno total. Por lo que va a quedar saturado con él.
El antígeno es la hormona (de la muestra) que queremos determinar, (antígeno
frío).
Además del antígeno (hormona) presente en la muestra problema, se va a añadir
una cantidad constante y conocida de antígeno pero marcado (antígeno caliente).
Los antígenos marcados se forman sustituyendo algunos de los átomos normales del
antígeno por los correspondientes isótopos radiactivos (H3 =tritio, P32 ), o
introduciendo radioisótopos extraños en la molécula (yodo=I125 unido a un resto de
TYR).
Los dos tipos de antígenos, frío y caliente, van a competir, en igualdad de
condiciones, por unirse con el anticuerpo disponible.
Las concentraciones del antígeno marcado y del anticuerpo son constantes, la única
variable del sistema es la concentración de antígeno no marcado (muestra
problema).
Cuanto mayor sea la cantidad de antígeno frío en la muestra problema, este
desplazará al antígeno caliente y por tanto se fijarán al anticuerpo cantidades
menores de antígeno marcado.
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Así pues, la formación de complejos radiactivos (Ag*-Ac) varía en función de la
concentración del antígeno no marcado: a mayor concentración de antígeno no
marcado, mayor formación de complejos antígeno-anticuerpo no marcados, y menor
formación de complejos radiactivos, y viceversa.
Separación de las fases ligada y no ligada
Tras la reacción antígeno-anticuerpo, en el tubo de reacción encontraremos:
•
•
las fracciones libres, constituidas por antígeno frío y antígeno marcado
las fracciones ligadas formadas por complejos antígeno-anticuerpo y antígeno
marcado -anticuerpo.
Sin embargo, la radiactividad total en el tubo permanece constante antes y después
de la reacción, por lo que hay que separar la fase ligada de la no ligada y contar la
radiactividad en una de ellas, sin interferencia de la otra.
Hay diferentes métodos de separación están basados en las distintas propiedades del
antígeno libre y del complejo antígeno-anticuerpo:
•
•
Adsorción: Con carbón activo, dextrano o resinas. Adsorben (se unen)
específicamente la fase libre (antígenos frío y caliente) pero no se unen a los
complejos antígeno-anticuerpo que quedarían en solución. Tras centrifugación,
el carbón sedimenta en el fondo del tubo con la fase no ligada mientras que la
fase ligada queda en el sobrenadante, que se aspira o decanta. Este método
se utiliza cada vez menos.
Precipitación química: Hay substancias como el etanol, el propilenglicol o el
sulfato amónico que alteran la solubilidad de las proteínas provocando su
precipitación. Precipitan los complejos ligados. Tras centrifugación, quedan
los complejos ligados en el sedimento y la fracción libre en el sobrenadante,
que se elimina por aspiración o decantación.
•
Precipitación inmunológica: Se utiliza un segundo anticuerpo contra el
anticuerpo del sistema. La unión del segundo anticuerpo al complejo antígenoanticuerpo da lugar a un complejo de gran tamaño, en general insoluble y
fácilmente precipitable. Tras incubación y centrifugación, la fase libre queda en
el sobrenadante y se separa por aspiración o decantación. Este método es
muy utilizado en RIA.
•
Fase sólida: Consiste en inmovilizar al anticuerpo a un soporte sólido, que
puede ser la propia pared del tubo, bolitas de vidrio, partículas de Sephadex
(polímero). La separación se consigue simplemente aspirando el medio de
incubación. Este método tiende cada vez más a utilizarse por ser sencillo,
práctico, más corto y requiere menos manipulación, e incluso permite su
automatización.
Una vez separadas las fases, normalmente, se lee la radiactividad de la fase ligada
utilizando un contador gamma (γ), si el isótopo utilizado para el marcaje es I125 , o un
contador beta (β) en el caso de haber marcado con tritio (3 H). Un contador de
centelleo no detecta directamente la presencia de un radioisótopo sino que la
muestra radiactiva se halla dispersa en el centelleador. El centelleador es un líquido
(líquido de centelleo) con propiedades fluorescentes. Como consecuencia de las
desintegraciones radiactivas se excitan las moléculas del líquido de centelleo y
emiten fluorescencia que es detectada en el contador.
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Construcción de la curva patrón
Para poder relacionar los valores de radiactividad obtenidos con la concentración de
hormonas, hay con construir una curva patrón que relacione estos parámetros.
La curva patrón se prepara al mismo tiempo que el análisis de las muestras
problema, aplicando la técnica a una serie de tubos que contienen cantidades
conocidas de la hormona a determinar (antígeno no marcado patrón) y las mismas
cantidades de antígeno marcado y de anticuerpo que se usan en el análisis:
•
•
En el primer tubo no hay antígeno no marcado, por lo que todos los centros de
unión del anticuerpo serán ocupados por el antígeno marcado. A este punto de
máxima unión del antígeno marcado se llama B0 o Bmáx , que representa la
radiactividad máxima que se puede unir.
Los siguientes tubos tienen concentraciones conocidas cada vez mayores de
hormona, a mayor concentración de antígeno no marcado menor formación de
complejos antígeno marcado -anticuerpo, ya que ambos antígenos compiten
por unirse al anticuerpo.
Los resultados obtenidos nos permiten construir una curva patrón representando
gráficamente la radioactividad obtenida (ó el % sobre Bo) en estos tubos (eje de
ordenadas, eje Y).frente a las concentraciones conocidas de antígeno no marcado
contenida en cada uno de los tubos (eje de abscisas, eje X).
Ejemplo de curva patrón: (100 de Ag*)
Ag frio
% Ac-Ag *
100%
25
50
100
200
400
700
900
1900
50%
500
1000
1500
2000
%AcAg*
80 %
67 %
50 %
33 %
20 %
13 %
10 %
5%
Ag frío
La conc entración de hormona en las muestras problema se calcula interpolando en
esta curva patrón la medida de radiactividad obtenida para cada tubo problema. La
curva patrón se puede representar gráficamente como una recta utilizando un papel
semilogarítmico, lo que facilita la lectura de los resultados.
Como en cualquier método analítico, hay una variabilidad experimental debida a
numerosos factores (reactivos, aparatos, operador, etc.) por lo que es frecuente que
todas las determinaciones se hagan por duplicado. Si los resultados obtenidos son
similares, el resultado final se calculará como la media aritmética de los dos valores.
Tanto los contadores beta como gamma, en la actualidad, disponen de programas
informáticos para cada una de las determinaciones hormonales, por lo que son
capaces de hacer todos los cálculos de forma automática, representar la curva
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patrón, y leer en ella los problemas, mostrando directamente los resultados finales
del análisis.
ENZIMOINMUNOANÁLISIS (EIA)
Son técnicas inmunoquímicas cuantitativas basadas en reacciones antígenoanticuerpo como en el RIA, y siguiendo un protocolo experimental similar. La
diferencia consiste en que, en este caso, el marcaje se hace con un enzima en
vez de con un isótopo radiactivo.
Se puede marcar tanto el antígeno como el anticuerpo (hay distintas estrategias).
La cuantificación se hace, por tanto, basándose en la medida de la actividad del
enzima marcador.
Tras la formación del complejo antígeno-anticuerpo, en el momento adecuado, se
añade un sustrato que es catalizado por el enzima transformándose en un
compuesto coloreado lo que permite la medida de la actividad enzimática con ayuda
de un espectrofotómetro. Esta medida de la actividad nos servirá para calcular la
concentración de la molécula problema.
Al igual que en el cado del radioinmunoanálisis es necesario elaborar una curva
patrón.
Con objeto de aumentar la sensibilidad de este análisis es frecuente utilizar el
sistema biotina-streptavidina, que actúa como mecanismo multiplicador. Así, por
ejemplo, el anticuerpo está unido a varias moléculas de biotina (vitamina). Cada
molécula de biotina se une específicamente a varias moléculas de estreptavidina
(similar a la avidina de huevo, pero de origen bacteriano y mayor afinidad). El
enzima está unido a la streptavidina. De esta forma se consigue un efecto
multiplicador de la señal. (Ej. 3 moléculas de biotina por anticuerpo x 4 moléculas de
streptavidina, cada una con un enzima, se unen a cada molécula de biotina= 12enzima en vez de una).
Las técnicas enzimáticas presentan numerosas ventajas respecto al
radioinmunoanálisis (RIA):
• no utilizan compuestos radiactivos lo que facilita la manipulación y evita la
necesidad de instalaciones y licencias específicas)
• reactivos de larga duración
• posibilidades de automatización (estaciones automáticas ELISA)
• gran sensibilidad
Los EIA pueden ser de dos tipos: homogéneos y heterogéneos.
• Los ensayos homogéneos no requieren lavado o separación física de las
sustancias reaccionantes antes de medir la actividad enzimática.
• Los ensayos heterogéneos sí necesitan la separación física de los
reaccionantes en las fracciones libre y ligada antes de la determinación de la
actividad del enzima marcador.
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EIA homogéneo
No requiere la separación de las fracciones ligada y libre resultantes de la reacción
inmunológica. Los reactivos necesarios son el anticuerpo y el antígeno marcado con
el enzima.
Fundamento: Se basa en la competencia por el anticuerpo entre la sustancia
problema y la marcada con el enzima.
• Cuando el antígeno marcado se une al anticuerpo, este impide el acceso del
sustrato al centro activo del enzima, por lo que anula su actividad.
• A mayor concentración de la molécula problema, menor cantidad de antígeno
marcado se unirá al anticuerpo, quedando mayor cantidad de antígeno
marcado libre con el enzima activo dando una mayor actividad. En resumen, a
mayor concentración mayor actividad, sin necesidad de separar las fracciones.
EIA heterogéneo
Requiere la separación de las fracciones ligada y libre resultantes de la reacción
inmunológica. En esta modalidad, los reactivos son el anticuerpo y el antígeno
marcado con el enzima.
Fundamento: El antígeno de la muestra problema y el marcado compiten por el
anticuerpo, de forma que cuanto mayor sea la cantidad de antígeno presente en la
muestra problema, mayor cantidad de antígeno marcado con el enzima quedará sin
unirse al anticuerpo. En este caso la actividad del enzima no se anula por la unión
antígeno-anticuerpo.
Se separan los complejos antígeno (marcado y no marcado)-anticuerpo, se añade el
sustrato del enzima para que se produzca la reacción enzimática y se mide su
actividad. La actividad será inversamente proporcional a la cantidad de antígeno en
la muestra.
ELISA
Hay una variedad del EIA en la que se utiliza una fase sólida como método de
separación, lo que es lo más habitual, recibe el nombre de ELISA (enzyme linked
immunosorbent assay).
ELISA tipo sándwich de antígeno
Es la variedad de ELISA más utilizada y que da mejores resultados.
Reactivos: Anticuerpo monoclonal ligado a la fase sólida, anticuerpo monoclonal
marcado con el enzima.
Se usan dos anticuerpos monoclonales diferentes contra determinantes distintos del
mismo antígeno, lo que permite que los dos se puedan unir al antígeno al mismo
tiempo, pero por sitios diferentes.
Los
anticuerpos
específicos
se
encuentran en exceso unidos a la fase
sólida (V.g. la pared del tubo de
análisis), de forma que toda la
hormona presente en la muestra
problema reacciona con ellos quedando
inmovilizada.
A continuación se lava el tubo para
eliminar el resto de moléculas sin
interés (no unidas).
Se añade un exceso de anticuerpos
marcados con el enzima. Estos
anticuerpos también se unen al
antígeno del complejo inmovilizado,
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pero por otro determinante antigénico diferente.
Tras otro lavado que elimina el exceso de anticuerpo marcado no unido, se añade el
sustrato y se cuantifica la reacción. La formación de producto será directamente
proporcional a la concentración de antígeno en la muestra.
FLUOROINMUNOANÁLISIS (FIA)
Esta técnica sigue un protocolo básicamente igual al descrito para EIA, con la
diferencia de utilizar como marcador una molécula fluorescente o un sustrato que
por la acción de un enzima se transforma en una molécula fluorescente. La lectura
de fluorescencia es utilizada para el cálculo de los resultados en la misma forma que
en RIA.
NOTA: Las moléculas fluorescentes son aquellas que al ser excitadas por una radiación con una longitud
de onda determinada, inmediatamente emiten una radiación con una longitud de onda mayor que es
medida por un espectrofluorímetro. (fluorescencia es distinto que fosforescencia)
QUIMIOLUMINOINMUNOANÁLISIS
Esta técnica sigue un protocolo básicamente igual al descrito para EIA, con la única
diferencia de utilizar como enzima ligada un enzima (ej. peroxidasa) que cataliza la
oxidación de un sustrato adecuado (ej. luminol + peróxido de hidrógeno). Este
sustrato , al oxidarse, alcanza un estado de excitación electrónica, y al volver
posteriormente los electrones a sus órbitas primitivas de menor energía, emiten la
diferencia en forma de energía luminosa (=luminiscencia).Esta energía luminosa es
medida en un luminómetro. La lectura de luminiscencia es utilizada para el cálculo de
los resultados en la misma forma que en RIA.
Preguntas de revisión
1. ¿Qué reactivos se utilizan para hacer un radioinmunoanálisis?
2. Al realizar un radioinmunoanálisis, ¿por qué es necesario separar las fases
libre y ligada?
3. ¿Cómo realizaría una curva patrón?
4. Imagine que está evaluando la concentración de una hormona por
radioinmunoanálisis y considerando que está detectando únicamente la
radiactividad debida a la fase ligada ¿esperaría obtener más señal en una
muestra con más o con menos cocentración de hormona? Justifique su
respuesta.
5. ¿En qué consiste un enzimoinmunoanálisis?
6. ¿Cuál es la diferencia entre el enzimoinmunoanálisis homogéneo y el
heterogéneo?
7. ¿Cuál es el fundamento de dicha diferencia?
8. Cuando se realiza un enzimoinmunoanálisis tipo sándwich de antígeno, el
anticuerpo que se utiliza ¿debe estar en exceso o en defecto frente a la
concentración de antígeno? ¿por qué?
9. ¿Cuál es la molécula marcadora en el fluorinmunoanálisis? ¿con qué aparato
se detecta dicha señal?
10. En el quimioluninoinmunoanálisis es muy frecuente utilizar luminol, peróxido
de hidrógeno y peroxidasa. Comente el papel que desempeña cada uno estos
reactivos.
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