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FUNCIÓN BIOLÓGICA DE LAS PROTEÍNAS
1. ENZIMAS
1.1 ASPECTOS GENERALES
Los enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son proteínas
Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan
indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente
desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran
su consecución ( Figura 1).
Figura 1. Reacción catalizada por una enzima
1.2 CARACTERÍSTICAS DE LA ACCIÓN ENZIMÁTICA
La característica más sobresaliente de los enzimas es su elevada especificidad. Esta es
doble y explica que no se formen subproductos:
1. Especificidad de sustrato. El sustrato (S) es la molécula sobre la que el enzima
ejerce su acción catalítica. El enzima sacarasa actúa sobre la sacarosa, la
amilasa sobre el almidón.
1
2. Especificidad de acción. Cada reacción está catalizada por un enzima
específico. Por ejemplo, el enzima sacarasa es muy especifico: rompe el enlace
glucosidico de la sacarosa
Sin embargo hay distintos grados de especificidad. La sacarasa es muy específico
de la sacarosa (sustrato natural), mientras que la maltosa y la isomaltosa son
sustratos análogos. El enzima actúa con máxima eficacia sobre el sustrato natural
y con menos eficacia sobre los sustratos análogos
La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que
representa el estado de transición.
E+S
ES
E+P
El sustrato se une al enzima a través de numerosas interacciones débiles como son:
puentes de hidrógeno, electrostáticos, hidrófobos, etc, en un lugar específico, el
centro activo o sitio activo. Este centro es una pequeña porción del enzima,
constituido por una serie de aminoácidos que interaccionan con el sustrato.
1.3 SITIO ACTIVO
Las moléculas de enzimas contienen hendiduras o cavidades denominadas
sitio activo. El sitio activo está formado por las cadenas laterales de residuos
específicos, lo que ocasiona que tenga un arreglo tridimensional particular, diferente
al resto de la proteína. Este sitio es afín por la estructura tridimensional del sustrato
(Figura 2).
enzima
+
sustrato
sitio activo
sitio activo
vacío
ocupado
2
Figura 2. Representación de la formación del complejo enzima-sustrato.
Es decir, el sitio activo esta formado por ciertos aminoácidos que forman un
microambiente característico dentro de la propia cadena y que llevan a cabo la
reacción; generalmente existe sólo uno por molécula de enzima.
Las enzimas adquieren su poder catalítico cuando presentan una estructura
secundaria y terciaria muy específica, de tal manera que los aminoácidos
componentes
del
sitio
activo
se
encuentran
vecinales
formando
dicho
microambiente. Así por ejemplo, la quimotripsina crea su centro activo con los
aminoácidos histidina y serina localizados en las posiciones 57 y 195 respectivamente;
se puede decir que forzosamente esta molécula debe adquirir una estructura
tridimensional, de tal manera que dichos aminoácidos sean adyacentes.
1.4 EFICIENCIA CATALITICA
La mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas son muy eficientes y
transcurren desde 106 hasta 1014 veces más rápido que la misma reacción no
catalizada (Tabla 1). Típicamente, cada molécula de enzima es capaz de transformar
cada segundo de 100 a 1000 moléculas de substrato en producto. El número de
estas moléculas transformadas a producto por molécula de enzima en cada
segundo, se conoce como el número de recambio.
Tabla1 . Eficiencia de las reacciones catalizadas por algunas enzimas
Enzima
Anhidrasa carbónica
Corismato mutasa
Triosafosfato isomerasa
Carboxipeptidasa A
AMP nucleosidasa
Nucleasa estafilococal
Velocidad en
ausencia de enzima
Velocidad de
reacción cat alizada
Rendimiento
1.3 X 10 –1
2.6 X 10 –5
4.3 X 10 –6
3.0 X 10 –9
1.0 X 10 –11
1.7 X 10 -13
1.0 X 10 6
50
4300
578
60
95
7.7 X 10 6
1.9 X 10 6
1.0 X 10 9
1.9X 10 11
6.0 X 10 12
5.6 X 10 14
3
1.2.8 NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS
A cada enzima se le asignan dos nombres. El primero es corto y es como se
conoce a la proteína de manera coloquial, es el nombre sugerido. El segundo es más
completo e infiere propiedades sobre la reacción que la enzima desarrolla, se le
conoce como nombre sistemático, este nombre permite reconocer a la enzima sin
ambigüedad y localizarla en el metabolismo.
a) Nombre sugerido
Muchas de las enzimas poseen en su nombre el sufijo “-asa” unido al nombre
del substrato de la reacción que cataliza, por ejemplo:
Ureasa: proteína cuyo sustrato es la urea
Lactasa: proteína cuyo sustrato es la lactosa
También suele utilizarse este sufijo a la descripción de la reacción que la
enzima cataliza:
Lactato deshidrogenada: deshidrogena (le quita Hidrógenos) al lactato
Adenilato ciclasa: hace un ciclo en la adenina.
Algunas enzimas poseen nombres que no representan su actividad o sustrato:
Lisozima
Tripsina
b) Nombre sistemático
La Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB), desarrolló
un sistema de nomenclatura en el cual las enzimas se dividen en seis clases
principales, cada una con numerosos subgrupos:
1.2.7
CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS
4
En función de su acción catalítica específica, los enzimas se clasifican en 6 grandes
grupos o clases:
1. Oxidorreductasas. Reacciones de transferencia de electrones.
2. Transferasas. Transferencia de grupos funcionales. Ej. UDP-glucosa-fructosaglucotransferasa.
3. Hidrolasas. Reacciones de hidrólisis. Ej. lipasa, proteasa, celulasa.
4. Liasas. Adición a dobles enlaces. Ej. carboxilasa, fenilalanina amonioliasa.
5. Isomerasas. Reacciones de isomerización.Ej. fosfoglucosa isomerasa.
6. Ligasas. Se conocían como sintetasas. Participan en la formación de enlaces
con hidrólisis de ATP.
Para todas las clasificaciones se muestran ejemplos representativos:
1.- OXIDOREDUCTASAS:
Catalizan reacciones de oxidación-reducción:
2e-
2.- TRANSFERASAS:
Catalizan la transferencia de grupos que contienen C, N, o P:
THF: tetrahidrofolato.
5
3.- HIDROLASAS :
Catalizan la ruptura de enlaces por la adición de una molécula de agua:
4.- LIASAS:
Catalizan la ruptura de enlaces C-C, C-S y algunos enlaces C-N:
5.- ISOMERASAS:
Catalizan la racemización de isómeros ópticos o geométricos:
6
6.- LIGASAS:
Catalizan la formación de enlaces entre C y O, S, N. Esta reacción sólo es posible
mediante la energía derivada de fosfatos ricos en energía como el del fosfato de la
molécula de ATP:
1.5 COFACTORES y COENZIMAS
Algunas enzimas se asocian con moléculas de carácter no proteíco que son
necesarias para el funcionamiento de la enzima, estas moléculas se denominan
cofactores (Figura 3). Comúnmente, los factores encontrados en las enzimas incluyen
iones metálicos como el Zn2+ o el Fe2+ ( Tabla 2) también pueden ser moléculas
orgánicas que se denomina coenzimas como el NAD +, FAD, la coenzima A,
Generalmente las coenzimas son derivados de las vitaminas. A la enzima en ausencia
de su cofactor (cuando lo tiene), se le denomina apoenzima, en presencia de su
cofactor (cuando lo tiene), se le denomina holoenzima. La apoenzima generalmente
carece de actividad biológica. La diferencia entre un cofactor y un grupo prostético,
como el grupo hemo, es que este último está unido de manera covalente a la
enzima, mientras que el cofactor puede ser removido de la misma con relativa
facilidad.
Se pueden señalar algunas características de las coenzimas como: generalmente son
estables al calor y a otros agentes desnaturalizantes de las proteínas, pueden ser
recicladas y algunas provienen de las vitaminas.
7
Figura 3. Cofactores y Coenzima
Tabla 2. Algunos enzimas que contienen iones metálicos o los necesitan como
cofactores.
Zn+2
Mg+2
Mn+2
Cu+2 (Cu+)
Alcohol- deshidrogenada
Anhidrasa-carbónica
Carboxipeptidasa
Tirosinasa
Citocromo-oxidasa
K+
Fosfohidrolasa
Fosfotransferasas
Arginasa
Fosfotransferasas
Piruvato- fosfoquinasa
Na+
ATPasa de la membrana plasmática
Fe +2 o Fe+3
8
Citocromos
Peroxidasa
Catalasa
Ferredoxina
Texto ------- (Tabla 3).
Tabla 3. Relación entre algunas coenzimas y las vitaminas a partir de las
cuales se producen. Enfermedades generadas por la deficiencia
Coenzima
Reacción
Biocitina
Fuente vitamínica
Carboxilación
Coenzima A
Biotina
Transferencia de acilos
Coenzimas de Cobalamima
Coenzimas de flavina
Acido lipóico
Enfermedad
Humana
por deficiencia
*
Alquilación
Pantotenato
Cobalamina (B 12)
Oxidación-reducción
Transferencia de acilos
Riboflavina (B 2)
-
anemia perniciosa
*
*
Coenzimas de nicotinamida
Oxidación-reducción
Nicotinamida (niacina)
Fosfato de piridoxal
Transferencia de grupo amino
Piridoxina (B 6)
Tetrahidrofolato
*
Transferencia de un grupo de 1 Carbono
Acido fólico
Pelagra
*
anemia
megaloblástica
Tiamina pirofosfato
Transferencia de aldehído
Tiamina (B 1)
beriberi
* no tiene un nombre específico, su aparición es muy rara.
Otras coenzimas:
NADP
Coenzima Q
Biotina
NAD y NADP
9
Coenzima Q (CoQ)
Esta coenzima es sintetizada a partir de farnesil pirofosfato. Al igual que el
FMN, la CoQ es capaz de aceptar y donar uno o dos electrones porque su forma
semiquinona es estable. A su forma oxidada se le conoce como ubiquinona (de
ubicuo, lat. ubique, en todas partes) o quinona. A su forma reducida se le conoce
como QH2, ubiquinol o hidroquinona. (Figura 2). A la coenzima solo parcialmente
reducida se le conoce como ubisemiquinona, semiquinona o QH (Figura 4).
Figura 4: Representación de la molécula de CoQ
La síntesis de la CoQ se lleva a cabo a través de unidades isoprenoides (Figura 5).
10
Figura 5. La CoQ se produce a partir de isoprenoides.
Biotina
La biotina consiste de un anillo imidazol que está unido en forma cis a la
cadena lateral tetrahidrotiofeno del valerato (Figura 6).
11
Figura 6. Estructura de la biotina
La enzima holocarboxilasa sintetasa (HCS) cataliza la activación, mediante
biotinilación, de cinco carboxilasas en células humanas. La deficiencia de HCS
produce el síndrome deficiencia múltiple de carboxilasas (DMC). Esta enfermedad es
potencialmente mortal y se caracteriza por la deficiencia de la actividad de todas las
carboxilasas. La deficiencia de biotina no solo disminuye la actividad de estas enzimas
sino que parece modificar la expresión genética.
1.2.6 PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS
Las propiedades de las enzimas derivan del hecho de ser proteínas y de actuar como
catalizadores. Como proteínas, poseen una conformación natural más estable que las
demás conformaciones posibles. Así, cambios en la conformación suelen ir asociados
en cambios en la actividad catalítica. Los factores que influyen de manera más directa
sobre la actividad de un enzima son:
pH
temperatura
cofactores
A) EFECTO DEL pH
Al comprobar experimentalmente la influencia del pH en la velocidad de las
reacciones enzimáticas se obtienen curvas que indican que los enzimas
presentan un pH óptimo de actividad. El pH puede afectar de varias maneras:
12
o
El centro activo puede contener aminoácidos con grupos ionizados
que pueden variar con el pH.
o
La ionización de aminoácidos que no están en el centro activo puede
provocar modificaciones en la conformación de la enzima.
o
El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH.
Algunos enzimas presentan variaciones peculiares. La pepsina del estómago,
presenta un óptimo a pH=2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la fosfatasa alcalina del
intestino un pH= 12
B) EFECTO DE LA TEMPERATURA
Influye en la actividad. El punto óptimo representa el máximo de actividad. A
temperaturas bajas, los enzimas se hallan “muy rígidos” y cuando se supera un
valor considerable (mayor de 50:) la actividad cae bruscamente porque, como
proteína, el enzima se desnaturaliza.
1.2.8
EFECTO DE LOS COFACTORES SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMATICA
A veces, un enzima requiere para su función la presencia de sustancias no proteicas
que colaboran en la catálisis: los cofactores. Casi un tercio de los enzimas conocidos
requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molécula orgánica se llama
coenzima. En la figura inferior podemos observar una molécula de hemoglobina
(proteína que transporta oxígeno) y su coenzima (el grupo hemo). Cuando los
cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman
13
grupos prostéticos. La forma catalíticamente activa del enzima, es decir, el enzima
unido a su grupo prostético, se llama holoenzima. La parte proteica de un
holoenzima (inactiva) se llama apoenzima, de forma que:
apoenzima + grupo prostético= holoenzima
1.2.9
MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS
En las reacciones espontáneas, los productos finales tienen menos energía libre de
Gibbs (∆G) que los reactantes (figura inferior izquierda). Por lo tanto las reacciones
espontáneas liberan energía de Gibbs ((∆G < 0). Sin embargo, el comienzo de la
reacción requiere un aporte inicial de energía. Esta energía inicial que hay que
suministrar a los reactantes para que la reacción transcurra se llama energía de
activación (E a). Cuanto menor es la Ea más fácilmente transcurre la reacción.
Perfil energético de una reacción espontánea
Perfil energético de una reacción catalizada
14
La acción de los catalizadores consiste, precisamente, en disminuir la E a (Figura superior derecha). Los enzimas
son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la Ea aún más que los catalizadores inorgánicos.
Por ejemplo, la descomposición del agua oxigenada (H2O2) para dar H2O y O2 puede ocurrir sin catalizador,
con un catalizador inorgánico (platino), o con un enzima específico (catalasa). Las respectivas E a para cada
proceso son 18, 12 y 6 Kcal/mol. Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción 20.000 veces, mientras
que la catalasa la acelera 370.000 veces.
Para que una reacción química tenga lugar, las moléculas de los reactantes deben chocar con una energía y
una orientación adecuadas. La actuación del enzima (1) permite que los rea ctantes (sustratos) se unan a su
centro activo con una orientación óptima para que la reacción se produzca y (2) modifica las propiedades
químicas del sustrato unido a su centro activo, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formación de
otros nuevos (Figuras inferiores):
1.2.10 REGULACIÓN DE SU ACTIVIDAD ENZIMATICA
15
Una molécula de enzima no tiene por que actuar siempre a la misma velocidad. Su
actividad puede estar modulada por:
 Cambios en el pH
 Cambios en la temperatura
 Presencia de cofactores
 Las concentraciones del sustrato y de los productos finales
 Presencia de inhibidores
 Modulación alostérica
 Modificación covalente
 Activación por proteolisis
 Isoenzimas
EFECTO DE LAS CONCENTRACIONES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
La velocidad de una reacción enzimática depende de la concentración de
sustrato. La Figura de la derecha muestra la velocidad de una reacción enzimática
a 6 concentraciones distintas de sustrato.
Además, la presencia de los productos finales puede hacer que la reacción sea
más lenta, o incluso invertir su sentido (Figura inferior).
EFECTO DE LOS INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de un enzima: son los inhibidores. Estos inhibidores bien
pueden ocupar temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el sustrato original (inhibidor
competitivo) o bien alteran la conformación espacial del enzima, impidiendo su unión al sustrato (inhibidor no
competitivo) (Figuras inferiores).
Inhibidor competitivo
Inhibidor no competitivo
16
MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa). R es la
forma más activa porque se une al sustrato con más afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R
<==> T (Figura inferior):
Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son los llamados moduladores positivos. El propio sustrato es a
menudo un modulador positivo. Las moléculas que favorecen la forma R pero que actúan sobre una región del
enzima distinta del centro activo son los activadores alostéricos (Figura inferior izquierda).
Activador alostérico: favorece la unión Inhibidor alostérico: impide la unión del
del sustrato
sustrato
Las sustancias que favorecen la forma T y disminuyen la actividad enzimática son los moduladores negativos. Si
estos moduladores actúan en lugares distintos del centro activo del enzima se llaman inhibidores alostéricos
17
(Figura superior derecha
EFECTO DE LA MODIFICACIÓN COVALENTE SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Otros enzimas pasan de una forma menos activa a otra más activa uniéndose covalentemente a un grupo
químico de pequeño tamaño como el P i o el AMP. También se da el caso inverso, en el que un enzima muy
activo se desactiva al liberar algún grupo químico. En las enzimas de las vías degradativas del metabolismo, la
forma fosforilada es más activa que la no fosforilada, mientras que en las vías biosintéticas ocurre lo contrario. En
las figuras inferiores se ilustra la activación de una proteína por fosforilación.
Elementos de la reacción El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Algunos enzimas no se sintetizan como tales,
sino como proteínas precursoras sin actividad
enzimática. Estas proteínas se llaman
proenzimas o zimógenos. Para activarse, los
zimógenos sufren un ataque hidrolítico que
origina la liberación de uno o varios péptidos.
El resto de la molécula proteica adopta la
conformación y las propiedades del enzima
activo. Muchos enzimas digestivos se secretan
en forma de zimógenos y en el tubo digestivo
se convierten en la forma activa. Es el caso de
la -quimotripsina, que se sintetiza en forma
de quimotripsinógeno (Figura superior). Si
estos enzimas se sintetizasen directamente en
forma activa destruirían la propia célula que las
produce. Así, la tripsina pancreática (una proteasa) se sintetiza como tripsinógeno (inactivo). Si por alguna razón
se activa en el propio páncreas, la glándula sufre un proceso de autodestrucción (pancreatitis aguda), a
menudo mortal.
18
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR MEDIO DE ISOENZIMAS
Algunos enzimas tienen distinta estructura molecular aunque su función biológica es similar. Se llaman isozimas
o isoenzimas. Estas diferencias de estructura se traducen en ligeros cambios en sus propiedades, de forma que
cada isozima se adapta perfectamente a la función que debe realizar. Así, podemos observar la existencia de
isoenzimas en función de:
el tipo de tejido: Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa presenta isozimas distintos en músculo y corazón.
el compartimento celular donde actúa: Por ejemplo, la malato deshidrogenasa del citoplasma es distinta
de la de la mitocondria.
el momento concreto del desarrollo del individuo: Por ejemplo, algunos enzimas de la glicolisis del feto
son diferentes de los mismos enzimas en el adulto.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Los principios generales de las reacciones químicas se aplican también a las
reacciones enzimáticas. Por este motivo, antes de empezar con la cinética química, se
van a repasar algunos conceptos básicos de cinética química.
A continuación, se describirán los siguientes conceptos:
Cinética enzimática
Modelo cinético de Michaelis-Menten
Cálculo de la KM y la Vmax de un enzima
Actividad enzimática
19
NOMENCLATURA DE LOS ENZIMAS
CATALISIS MOLECULAR
Un catalizador modifica la velocidad de una reacción química sin ser utilizado o aparec er como
uno de los productos de la reacción. Una reacción química en la que un substrato(S ) se
transforma en un producto(P): S
P, ocurre por que cierta fracción de moléculas de S,
posee mucho más energía que el resto de ellas, lo que es suficiente para que alcancen un
estado activado, en el que pueda formarse o romperse un enlace químico y se forme el
producto(P ).
La energía de activación es la cantidad de energía expresada en calorías, necesaria para
que todas las moléculas de un mol, a una temperatura dada alcancen el estado reactivo.
Mientras que, el estado de transición es el estado rico en energía de las moléculas que
interaccionan en la cima de la barrera de activación. La velocidad de una reacción química es
proporcional a la concentración del complejo en el estado de transición.
Una reacción química se puede acelerar de la siguiente forma: 1) Al aument ar la temperatura
se incrementa la energía cinética, por lo que es mayor el número de moléculas que alc anzan el
estado de transición. Generalmente el Q 10 =2, lo que indica que la velocidad de una reacción
0
química se duplica al aumentar la temperatura en 10 C. 2) Añadiendo un catalizador, que
disminuye la energía de activación y aumenta la velocidad de reacción.
La enzima (E), se combina con el substrat o (S) formando el complejo de transición, enzimasubstrato (E-S ), mediante una reacción reversible, cuya energía de activación es menor que la
de la reacción no catalizada. Cuando se forma el producto de la reacción (P), se regenera de
nuevo la enzima (E ) de forma libre, la que puede combinarse de nuevo con otra molécula de
substrato (S).
Una enzima reduce más eficientemente la energía de activación( Ea) de una reacción que un
catalizador inorgánico, lo que permite que una reacción se realice a menor temperatura.
El siguiente ejemplo ilustra mejor lo que hemos discutido:
Reacción
-1
Energía de activación (Kcal*mol )
20
a) el peróxido de hidrógeno se descompone en:
H2 O2
H2 O + O2
b) el hierro catalítico (Fe) realiza la reacción
H2 O2
12
H2 O + O2
d) la catalasa una enzima hepática la realiza
H2O2
13
H2 O + O2
c) el platino catalítico (Pt) realiza la reacción :
H2 O2
18
5
H2O + O2
Una enzima no modifica la energía libre, ni la constante de equilibrio, sino que disminuye
la energía de activación de la reacción.
Ir al principio
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUBSTRATO SOBRE LA
CATALISIS ENZIMATICA
La actividad de una enzima se puede estudiar in vitro, bajo condiciones controladas
añadiéndole una enzima a un substrat o. Sí se trabaja con la condición de que la concentración
del substrato sea saturante, variando entonces la concentración de enzima, se obs erva que
aumenta el producto de la reacción, a pH y temperatura constant es.
21
Si se mantiene la concentración de la enzima constante y variando la concentración de
substrato se obtiene una curva hiperbólica como la de la figura. Al principio un aument o de la
concentración de substrato produce un aumento rápi do de la velocidad de reacción, pero si se
sigue aument ando la concentración de substrato, la velocidad de reacción comienza a
disminuir y a muy altas concent raciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de
reacción, se dice que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad
de reacción que se obtiene a es a alta concent ración de substrato se define como la velocidad
máxima (V) de la reacción enzimática bajo las condiciones especificadas. La concentración de
substrato (S), a la semivelocidad máxima de reacción (V/2) se puede determinar de la figura y
representa la constante de Michaelis o Km, la cual es una característica para cada enzima. La
inversa de Km, o 1/Km, mide aproximadamente la afinidad de la enzima por el subs trato.
Mientras más pequeño sea el valor de Km, mayor será la afinidad de la enzima por el
substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo substrato, éste será
transformado preferentemente por la enzima con may or afinidad.
La ecuación de Michaelis describe la relación cuantitativa entre la velocidad de reacción y la
concentración de substrato [S], si se conoce Vmax o Km:
v=
En donde v= es la velocidad de reacción obs ervada a una concentración de substrato
determinada [S]
Km= constante de Michaelis en moles/lít ro
22
Vmax= velocidad máxima a concentración saturant e de substrato.
Si v= Vmax/2; entonces
=
Km+[S] = 2[S]
Km =[S]
De tal forma que podemos concluir que Km es igual a la concentración de substrato a la
semivelocidad máxima de reacción.
1. Concentraciones relativas de E y S: la concentración de substrato S , es
mucho mayor que la de E, de tal manera que la cantidad de substrato
unido a la enzima en cualquier momento es muy pequeña.
2. Se asume el estado estacionario: ES no cambia con el tiempo, esto
quiere decir que la velocidad de formación de ES es igual a aquella para
su desintegración. En general, un intermediario en una serie de
reacciones está en estado estacionario cuando su velocidad de síntesis
es igual a su velocidad de degradación.
3. Velocidad inicial: para el análisis de reacciones enzimáticas, sólo se
utiliza la velocidad inicial de la reacción, que es la velocidad ejercida por
la enzima, inmediatamente después de que se ha puesto en contacto
con el substrato y hasta antes de que se haya consumido el 10 % de la
concentración inicial del mismo. La razón de lo anterior es que en ese
momento, la concentración del producto de la reacción que se ha
acumulado, en muy pequeña y, por tanto, la reacción en el sentido
inverso, es decir, la transformación del producto en el substrato original,
puede ser ignorada.
23
Características de Km: la constante de Michaelis-Menten es
característica de una enzima y particular para un substrato. Refleja la afinidad
de la enzima por ese substrato. K m es numéricamente igual a la concentración
de substrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la Vmax (K m=
Vmax/2). Este parámetro, K m no varía con la concentración de enzima.
Significado de una Km pequeña: un valor numérico pequeño de K m
refleja una alta afinidad de la enzima por su substrato porque a una baja
concentración del mismo, la enzima a desarrollado ya la mitad de la velocidad
máxima.
Significado de una Km grande: el valor numérico grande de K m refleja
una baja afinidad de la enzima por su substrato porque a una concentración
elevada del mismo, la enzima desarrolla la mitad de la velocidad máxima.
Relación de la velocidad con la concentración de enzima: la
velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la
enzima a cualquier concentración de substrato. Por ejemplo, si la concentración
de enzima es disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reacción (v0) es
reducida también a la mitad de la original.
Orden de la reacción: cuando S es mas pequeña que la K m, la
velocidad de la reacción es aproximadamente igual a la concentraci ón de
substrato.
100
50
0
Substrato
Km
Figura: Localización de la constante de Michaelis (K m )
24
La velocidad de reacción se dice en estas condiciones es de primer
orden con respecto al substrato. Cuando S es mas grande que la K m, la
velocidad es constante e igual a la Vmax. La velocidad de la reacción es
independiente de la concentración de substrato y se dice que es de orden cero
con respecto a la concentración de substrato.
Las enzimas pueden ser aisladas de las células u organismos, para estudiar sus
propiedades in vitro es decir, en un tubo de ensayo. Las diferentes enzimas muestran
diferentes respuestas a los cambios en la concentración de substrato, temperatura y pH.
Concentración de substrato.
La forma hiperbólica de la curva de velocidad vs. Substrato .
Efecto de la temperatura en la actividad enzimática
Efecto de la variación del pH en la actividad enzimática.
Incre mento de la velocidad con la te mperatura : En general, la velocidad de la
reacción se incrementa con la temperatura hasta que un punto máximo es alcanzado.
Este incremento se debe a que aumenta el número de moléculas ricas en energía que
pueden pasar la barrera energética de estado de transición, para formar a los productos.
Decremento de la velocidad con la temperatura : la elevación excesiva de la
temperatura del medio que contiene a las enzimas, resulta en un decremento de la
velocidad como resultado de la desnaturalización, es decir, la pérdida de la estructura
tridimensional de las enzimas.
25
zona de reactivación
máximo de actividad
Zona de
inactivación
0
Temperatura
Figura: dependencia de la actividad enzimática con la temperatura
Velocidad máxima: la velocidad de una reacción (v) es el número de
moléculas de substrato convertidas en producto por unidad de tiempo y
usualmente se expresa en µmoles de producto formadas por minuto. La
velocidad de una reacción catalizada por una enzima, aumenta conforme se
incrementa la concentración de substrato hasta que se llega a una velocidad
máxima (Vmax), a partir de la cual la velocidad de la reacción, es
independiente de la cantidad de substrato. El que la velocidad no pueda
seguirse incrementando, refleja la saturación del sitio activo con el substrato.
Vmax
0
Substrato
Figura: representación de una cinética típicamente michaeliana.
Vmax = velocidad de saturación o máxima.
26
Cuando se grafica la velocidad de la reacción, v0, contra la
concentración de substrato, S , no siempre es posible determinar la condición
en que se ha llegado a la velocidad máxima, Vmax, debido al incremento de la
pendiente en la hipérbola a concentraciones de substrato elevadas.
Figura: experimento cinético para la actividad enzimática.
Se presentan los valores experimentales y los resultados del ajuste al
modelo de Michaelis.
Aún así, si se grafica una doble recíproca, es decir, el inverso de la
velocidad (1/v0) contra el inverso de la concentración de substrato (1/ S ), se
obtiene una línea recta. El regráfico de Lineweaver-Burke, también se
denomina de “dobles recíprocas” y se utiliza para calcular la Km y la Vmax así
como para determinar el mecanismo de acción de los diversos tipos de
inhibidores.
La ecuación que describe a la gráfca de Lineweaver-Burke es:
1
v0
Km
Vmax S
1
Vmax
(3)
que describe una recta en donde el intercepto con el eje de las abscisas es
igual a –1/Km y el intercepto con el eje de las ordenadas es igual a 1/Vmax.
27
Figura: experimento cinético para la actividad enzimática. Regráfico de
Lineweaver-Burke
Se presentan los valores experimentales y los resultados del ajuste al modelo.
REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LINEWEAVER Y BURK
Si se toma el inverso en ambos miembros de la ecuación de Michaelis tenemos:
=
+
28
que es la ecuación de una línea recta, cuya pendiente es
ordenadas en
y a la abcisa en el punto
, que interc epta al eje de las
Lo que es evident e al hacer
,
ya que se convierte en
Si se hace una gráfica con los dobles inversos, colocando los valores de
en el eje de las
ordenadas y
en el eje de las abcisas, se obtiene una línea recta a partir de la cual se puede
calcular fácilmente Km.
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Sabiendo que las enzimas son proteinas, cualquier cambio brusco de pH puede alterar el
carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie prot eica, afectando así las
propiedades catalíticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalización
de la enzima y en consecuencia su inactivación . La fosfatasa ácida es más activa a pH 5,0,
mientras que la fosfatasa alcalina lo es a pH 9,0. Muchas enzimas tienen máxima actividad
cerca de la neutralidad en un rango de pH de 6 a 8.
El pH per se no afecta la actividad enzimática, sino la concentración de prot ones. Los protones
además de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar también en la
reacción como substrato o producto. En esos casos, la concentración de protones afecta
directamente la velocidad de la reacción.
ENZIMA
pH OPTIMO
29
Pepsina
1,5
Tripsina
7,7
Catalasa
7,6
Arginasa
9,7
Fumarasa
7,8
Ribonucleasa
7,8
EFECTO DE ACTIVADORES
Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reacción hasta cierta
0
temperatura óptima, ya que después de aproximadamente 45 C se comienza a producir la
desnaturalización térmica. Las enzimas de muchos mamíferos tienen una temperatura óptima
0
de 37 C, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se destruyen Sin embargo
existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas termales y en el otro
0
extremo ciert as bacterias árticas tienen temperaturas óptimas cercanas a 0 C.
30
ESPECIFICIDAD ABSOLUTA
Cierta enzimas se encuentran como aproenzimas o zimogenos que son inactivos.
El tripsinógeno es convertido en tripsina por la misma acción de la tripsina, que remueve un
hexapéptido.
tripsina
Tripsinógeno
Tripsina + Val (Asp)4 lisina
Otra forma de activación consiste en mantener los grupos SH reducidos. Estos grupos pueden
formar parte de cent ros activos de ciertas enzimas. Si se oxidan estos grupos a -S -S- la enzima
se inactiva. Así tenemos que la enzima papaina, se inactiva después de exponerla al ox ígeno;
pero cuando se le añade un reductor apropiado la enzima se reactiva. Los grupos –S-S- se
convierten en –S H, activándose la enzima.
Otra forma de activación requiere la presencia de otra substancia que se enlaza al sitio
alostérico, el compuesto que se enlaza se denomina un ef ector alostéric o. El centro alostérico
es bien específico para el ef ector o modulador alostérico.
ESPECIFICIDAD RELATIVA
Oxígeno
L-aminoácido
a -cetoácido + NH3 + H 2 O 2 .
L-aminoácido oxidasa
Oxígeno
D-aminoácido
a -cetoácido + NH3 + H 2 O 2
D-aminoácido oxidasa
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En este ejemplo se muestra la estereo-es pecificidad. Una enzima puede tener una
especificidad óptica para isomeros D o L.
Hay enzimas que muestran especificidad absoluta como la aspartasa, que cataliza la adición
reversible de amoníaco al doble enlace del ácido fumárico, pero no al de ot ros ácidos
insaturados.
-
HOOC – CH = CH – COO + NH4
+
-
HOOC – CH2 - CHNH2 - COO + H
+
INHIBICIÓN ENZIMATICA
Mediante el uso de inhibidores enzimáticos se ha obtenido información muy valiosa sobre la
conformación del centro activo de algunas enzimas.
a. Inhibición irreversible: Este tipo de inhibidores forman un enlace covalente con las
enzimas cerca del centro activo. Un ejemplo son los gases nerviosos, como el
fluorofos fato de diisopropilo (DFP) que forma un complejo con la enzima
acetilcolinesterasa. Los animales envenenados con este gas quedan paralizados,
debido a la imposibilidad de transmitir adecuadament e los impulsos nerviosos.
Ester di-isopropil fos fórico de la enzima (inactivo)
b) Inhibición competitiva.
Es cuando el inhibidor compite con el substrat o por la unión con el cent ro activo de la
enzima. Este tipo de inhibición puede reducirs e si se aumenta la concentración de
substrato.
-
OOC - CH2 - CH2 - COO
Succinato
-
-
-
OOC - CH = CH - COO + 2H
Succinato
+
Fumarato
32
Deshidrogenasa
COO
-
I
CH2
Malonato (inhibidor competitivo)
I
-
COO
En la inhibición competitiva la enzima se combina con el inhibidor para formar un complejo
enzima-inhibidor:
E+ I
E I en competencia con la reacción normal E +S
ES
La sulfanilamida (bactericida) interfiere con la síntesis del ácido fólico compitiendo con
el ácido p-aminobenzoico, de una forma competitiva.
HOOC-§- NH2
ácido p- amino benz oico
NH2 –SO2 - §- NH2
sulfanilamida
§ = fenil
a. Inhibición no competitiva.
Esta inhibición se caracteriza por que no se puede revertir el efecto del inhibidor, aumentando
la concentración del substrato.
Por ejemplo la inhibición de la deshidrogenasa del gliceraldehido -3-fosfato por la yodoacetamida:
Enzima-SH + I-CH2 CONH2
Enzima-SCH2 CONH2 + IH
La deshidrogenasa del gliceraldehido-3 fosfato puede ser inhibida también por el ácido iodo acético:
Enzima-SH + ICH2 COOH
Enzima-SCH2 COOH + IH
c) Inhibición por met ales.
Ciert os metales como el plomo, mercurio y arsénico inhiben enzimas que tienen en su centro
activo grupos -SH libres.
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