Download (Microsoft PowerPoint - Criopreservaci\363n Hemocentro092012)

Crioprotectores
Dimetilsulfóxido (DMSO)
• Crioprotectores coligativos
previenen la deshidratación y
disminuyendo la cantidad de
agua absorbida por los cristales
de hielo.
• El DMSO es ligeramente tóxico.
• Atraviesa rápidamente las
membranas celulares
Crioprotectores.
Proteínas
• Aumentan la supervivencia de las
células cuando se agregan a la solución
crioprotectora.
• Modifican la viscosidad y la
temperatura de la transición de la
solución crioprotectora.
• La fuente puede ser autóloga.
Soluciones crioprotectoras
Hidroxietilalmidón (HES)
• Sustancia polimérica con cadenas de
diferentes pesos moleculares que no
penetra la célula de forma libre.
• Protege a la célula formando una capa
viscosa y hialina que retarda el
movimiento de agua.
Almacenamiento
• Congeladores mecánicos.
– -120°C a -86°C.
• Congelador de nitrógeno líquido.
– -196°C a -142°C.
Velocidad de congelación
controlada.
•
•
•
•
•
DMSO al 10 %.
Concentración celular 50x106/ml.
Velocidad inicial de -1°C/min.
En -40°C incrementar a -10°C/min.
En -80°C colocar en la fase gaseosa de
nitrógeno líquido hasta -146°C.
Velocidad de congelación no
controlada
• DMSO al 5 % con HES al 6 %.
• Concentración celular menor a 300000 mm3.
• Colocar en bolsas de almacenamiento en un
congelador mecánico a -80°C.
• En los -80°C incrementar a 10-16°C/min la
velocidad hasta -146°C.
• Almacenar en la fase gaseosa de nitrógeno
líquido.
Ventajas de la congelación no
controlada
• Menor costo.
• Menor tiempo técnico.
• El HES previene la lisis de granulocitos durante
el descongelamiento.
• Usando DMSO al 5% disminuyen las
reacciones tóxicas durante la infusión.
• Sencillo.
• Menos espacio en el congelador.
Protocolo B = –1°C/min
Protocolo D = –1.8°C/min
Congelación
Congelación
Congelación
Descongelación
Descongelación
Control de calidad de la
criopreservación.
Valoración in vitro.
• Conteo (citometría) (tasas de recuperación de células
mononucleares, CD34+, eritrocitos y PMN).
• Prueba de viabilidad por exclusión de tinción
(con azul de trípano o yoduro de propidio).
• Cultivo de CFU-GM.
Citometría de Flujo
Citometría de flujo (CF)
Es una técnica multiparamétrica que permite
estudiar propiedades físicas y biológicas de las
células vivas en una suspensión fluida.
El citómetro es un aparato capaz de medir
varios parámetros celulares a partir de
una suspensión celular por medio de la
interacción de las células con un haz de
luz láser guiadas mediante un flujo
contínuo.
Parámetros celulares que pueden
estudiarse
Tamaño
Contenido de
ADN
Complejidad
citoplasmática
Parámetros
nucleares
Parámetros
estructurales
Proteinas
intracelulares
Actividad enzimática
Parámetros
citoplasmáticos
Parámetros
superficiales
Proteinas de
superficie
Parámetros
extracelulares
Proteinas secretadas
Interacción con
otras cél.
Esquema del citómetro
Fluídos
Detectores
FL3 PerCP, Cy5
FL2 PE
FL1 FITC
SSC
Láser
488nm
FSC
Sistema óptico
Sistema electrónico
Tipos de señales
Señales de dispersión
Señales de fluorescencia
Tipos de señales
Señales de dispersión
Detector de
SSC
Detector de
FSC
L
A
S
E
R
Detector de
FSC
Detector de
SSC
Inmunomarcación
Anticuerpos
monoclonales
conjugados con
fluorocromo
Tipos de señales
Señales de fluorescencia
Detector de
SSC
Detector
de FL2
Detector
de FL3
Detector de
FSC
L
A
S
E
R
Detector de
FSC
Detector de
SSC
Detector de FL1
Bioq. Andrea Novoa - Laboratorio de Citometría de Flujo - Servicio de Hematología
Características de la CF
• Técnica sencilla y rápida
• Alta especificidad
• Multiparamétrica
FSC y SSC
FL1, FL2 y FL3 (un láser)
ó FL1, FL2, FL3 y FL4 (dos láseres)
Fluorocromos
Son moléculas químicas que absorben luz a una
determinada longitud de onda y emiten a otra
diferente.
•
•
•
•
FITC en FL1 (Isotiocianato de fluoresceina)
PE en FL2 ( Ficoeritrina)
PerCP en FL3 (piridin clorofil proteina)
APC en FL4 (aloficocianina)
Espectros de emisión
Procesamiento de la muestra
Marcación de superficie
Células en suspensión + Acs.
Monoclonales*
Incubar 20’ en oscuridad
Lisis con Cloruro de amonio
Centrifugar 5’ a 1800rpm
Resuspender
Adquisición de la muestra
Distribución de las células de una muestra de sangre
normal
Complejidad
citoplasmática
Tamaño celular
Distribución de las células de una
muestra de médula ósea normal
SSC
Eosinófilos
Granulocitos
Monocitos
Linfocitos
10 0
10 1
10 2
10 3
10 4
CD45 PERCPCY5,5 ->
10277.008
Céls. Rojas
nucleadas
CD45 PerCP
Precursores CD34+
GB
430.000mm3
CD 45 99.86 %
CD 34 0.02 %
GB
247.000mm3
CD 45 99.42 %
CD 34 1.05 %
Stem cell
GB
170.000mm3
CD 45 97.42 %
CD 34 0.25 %
GB
220.000mm3
CD 45 98.43 %
CD 34 1.05 %
Stem cell
• El recuento de células CD34+
es necesario para determinar
las dosis requeridas en los
transplantes de células
progenitoras
• La Citometría de Flujo provee
una metodología cuantitativa
rápida y reproducible para la
identificación y enumeración
de células CD34+
Trypan Blue
• El método de exclusión Trypan Blue es
ampliamente utilizado en laboratorios para la
determinación de viabilidad; solamente
penetra en células cuyas membranas
plasmáticas estén dañadas. Las membranas
de células viables no se tiñen con el colorante
pues son impermeables al mismo, y las células
teñidas y las no teñidas se visualizan con un
microscopio.
Trypan Blue
CULTIVO CELULAR
-Método Funcional
IMDM
Recolección
+ IMDM
FICOLL
STEM
+ STEM
FICOLL
GRD+Neutrof
400 G 30`
AGAR
STEM
IMDM
+ IMDM
X2
Resuspensión
Recuento
1x
2 LAVADOS
STEM + Mononucleares
106
Suero
Bovino
Fetal
Células
Medio
Cultivo
Mezcla + FEC-G
Mezcla + FEC-G
Mezcla sin FEC-G
Estufa 37º C Humidificada, CO2 al 5% durante 10
dias
Leer microscopio invertido
Microcolonias + 4 C / Colonias entre 40-50 C
Efectos asociados a la infusión
Efectos asociados a la infusión de
CPH.
• Los efectos colaterales de la infusión de CPH
se minimizan reduciendo el volumen total y
las células rojas infundidas.
• Los métodos al seleccionar mejor las celulas
disminuyen los efectos colaterales y mejoran
la velocidad de respuesta del injerto.
ehheh….
¿Qué hay de nuevo, viejo?
Gracias