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Influencia de la acidez y concentración de NaCl
sobre el crecimiento de Leuconostoc mesenteroides
Ingaramo, Eleonora A. - Cayré, María E. - Garro, Oscar A.
Facultad de Agroindustrias - UNNE.
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ANTECEDENTES
La elaboración y conservación de los alimentos con adecuada calidad es un requerimiento imprescindible para satisfacer
las demandas de los consumidores. En la calidad de los alimentos se incluyen propiedades sensoriales, nutricionales, de
seguridad biológica (desarrollo de microorganismos patógenos) y de vida útil (desarrollo de microorganismos
alteradores). Una de las principales causas de disminución de la calidad es el desarrollo de microorganismos.
En los últimos años se ha incrementado el interés en el desarrollo de modelos matemáticos que describen el crecimiento
de microorganismos como función de distintos factores de control (Giffel y Zwietering, 1999). Los modelos
matemáticos pueden ser usados para predecir los cambios en la calidad de los alimentos y para estimar la vida útil de los
mismos (Wijtzes y col., 1995). Un modelo matemático es una expresión matemática que describe el crecimiento, la
supervivencia, inactivación o actividad metabólica de bacterias patógenas como alteradoras de interés en los alimentos.
Las investigaciones en Microbiología Predictiva tienden al desarrollo de ecuaciones matemáticas que incorporen el
efecto de factores críticos para el crecimiento tanto intrínsecos, tales como pH, actividad acuosa, concentración de
cloruro de sodio y otras sales, como extrínsecos como temperatura y composición de la atmósfera gaseosa (Skinner y
Larkin, 1994)
Por niveles de actividad los modelos se clasifican en primarios, secundarios y terciarios. Los modelos primarios se usan
para describir como una población de bacterias cambia con el tiempo, en un ambiente determinado; esto es una
expresión matemática que describe la curva de crecimiento, (Neira, 1999). En la elaboración de modelos matemáticos,
el modelado primario corresponde a la primera etapa ya que permite obtener información acerca de los parámetros de
crecimiento bajo condiciones ambientales definidas y controladas. A partir del modelado primario se pueden deducir
qué factores deberían ser tenidos en cuenta y qué rangos afectan el crecimiento de uno o varios microorganismos en un
alimento en particular. Los modelos primarios permiten derivar parámetros primarios de crecimiento que se pueden
utilizar en la construcción de modelos secundarios.
En emulsiones cárnicas cocidas y curadas, envasadas al vacío y almacenadas en refrigeración la flora bacteriana está
dominada por especies de bacterias lácticas (Korkeala y col.1988; von Holy y col.1991) Este grupo de
microorganismos, si bien no representa riesgos para la salud del consumidor, cuando alcanza un determinado número
produce modificaciones en las características organolépticas del producto (acidificación, decoloración, formación de
exudado blanquecino, limo superficial) que alteran su calidad y por consiguiente su vida útil. Leuconostoc
mesenteroides ha sido reportado como integrante de la flora alterante de varios productos cárnicos (Koerkeala y col.,
1988, Korkeala y Mäkelä, 1989, von Holy y col., 1991, Ingaramo y col., 2002).
El objetivo de este trabajo fue evaluar la influencia de la acidez y concentración de NaCl sobre los parámetros de
crecimiento Leuconostoc mesenteroides usando modelado matemático.
MATERIALES Y METODOS
Microorganismo y Condiciones de Cultivo
Se trabajó con una cepa de Leuconostoc mesenteroides aislada a partir de embutidos cocidos alterados. El crecimiento
del microorganismo se realizó sobre caldo MRS (Biokar Diagnostics, Beauvais, France) suplementado con NaCl en
distintas concentraciones. El pH del se ajustó a cada uno de los valores ensayados con HCl 2 N o Na OH 2N. Las
lecturas de pH se realizaron con un medidor con electrodo de vidrio (Accumet, Fischer, USA).
El inóculo se obtuvo a partir de un cultivo activo del microorganismo y el tamaño del mismo fue el suficiente para
asegurar una concentración al inicio del crecimiento de 105 UFC/ml .
El crecimiento se monitoreo por el cambio en la densidad óptica (DO) a 580 nm en espectrofotómetro Beckman DU
640 B, usando medio de cultivo libre de células como blanco de lectura. La temperatura de incubación fue de 30°C.
Los valores de absorbancia obtenidos fueron corregidos por falta de linealidad mediante la siguiente función de
corrección:
ABS = ABSobs * (1 + (0,38*(ABSobs)2,06) (1)
Modelado Primario
Las curvas de crecimiento se generaron por ajuste de los datos experimentales expresados como log Absorbancia a la
ecuación de Gompertz modificada (Gibson y col., 1987) cuya expresión matemática es:
log ABS= A + C.exp (-exp(-B.(t – M))) (2)
donde log ABS es el logaritmo decimal de la absorbancia corregida al tiempo t,
A es el valor asintótico cuando el tiempo decrece indefinidamente; C es el incremento en el logaritmo de la absorbancia
corregida cuando el tiempo se incrementa indefinidamente (número de ciclos de crecimiento);
B es la velocidad de crecimiento máxima relativa al tiempo M [días]-1 y
M es el tiempo requerido para alcanzar la máxima velocidad de crecimiento [días].
A partir de los parámetros de la ecuación de Gompertz se calculó la velocidad específica de crecimiento (µmax = B.C/e
[horas-1], con e= 2,7182) y la duración de la fase de latencia (λ= M – (1/B) [horas]).
Las regresiones no lineales se realizaron utilizando el algoritmo de Marquart en STATGRAPHIC PLUS Versión 4.0.
Diseño Experimental
Para evaluar la influencia de la acidez y concentración de cloruro de sodio sobre los parámetros de crecimiento de
Leuconostoc mesenteroides se usaron diseños unifactoriales con tres niveles para pH (3,5; 5 y 7) y concentración de
NaCl (1%, 3% y 6% p/v).
Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
RESULTADOS Y DISCUSION
log (ABS)
En la Fig.1. se muestran las curvas de crecimiento de Leuconostoc mesenteroides en caldo MRS suplementado con
distintas concentraciones de NaCl, obtenidas por ajuste de los valores experimentales a la ecuación modificada de
Gompertz. En todos los casos el modelo fue adecuado para describir los datos experimentales lográndose coeficientes
de determinación mayores a 0,98.
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
0
2
4
6
8
10
Tiempo (horas)
Figura1. Crecimiento de Leuconostoc mesenteroides en caldo
MRS suplementado con 6% (), 3% ( ) y 1% ( ) de NaCl.
La Tabla 1 resume los valores de los parámetros cinéticos estimados a partir de los coeficientes de la ecuación de
Gompertz para cada una de las condiciones ensayadas. Puede observarse que un aumento en la concentración de NaCl
produce una disminución en la velocidad de crecimiento y un aumento en la fase de latencia, esto es, un retardo en el
crecimiento. Este retardo puede ser explicado por la influencia de la concentración de NaCl en fase acuosa sobre la
presión osmótica del medio y por consiguiente, sobre la actividad de agua del mismo (Girard, 1991; Wirth, 1992).
Tabla 1. Parámetros de Crecimiento estimados para Leuconostoc mesenteroides
para cada una de las condiciones ensayadas
µmax [horas-1]
Factor
[NaCl]
1
Estimación1
0
0,334
1,002
0,833
0,717
0,340
3,5
5
7
1%
3%
6%
pH
2
λ [horas]
Nivel
EE2
0,051
0,072
0,005
0,017
0,005
Estimación
1,122
0,564
0,529
0,670
2,239
EE
0,031
0,046
0,017
0,027
0,043
Media de los valores estimados
Error estándar
El análisis de ANOVA y test de Tukey, para ambos parámetros, mostraron que existen diferencias significativas entre
los valores de µmax y λ estimados a cada concentración de NaCl al 95 % de confianza.
La Figura 2 muestra las curvas de crecimiento obtenidas a cada uno de los valores de pH ensayados. El modelo de
Gompertz fue adecuado para ajustar los valores experimentales obtenidos a pH 7 y 5 (R2 = 0,98 y 0,99 respectivamente)
pero no los obtenidos a pH 3,5. En este último caso, los datos obtenidos hasta las 48 horas de ensayo (datos no
mostrados) fueron ajustados, mediante regresión lineal, a una recta. El análisis estadístico mostró que la pendiente de la
misma no difiere significativamente de cero (Pv = 0,4356) evidenciando inhibición total del crecimiento a este pH.
0,6
log (ABS)
0,4
0,2
0
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
0
2
4
6
8
10
Tiempo (horas)
Figura 2. Crecimiento de Leuconostoc mesenteroides a pH 3,5 (), 5 ( ) y 7 ( )
Se observa una disminución de la velocidad de crecimiento cuando el pH baja de 7 a 5 y un aumento del tiempo de
latencia (Tabla 1). Los valores fueron significativamente diferentes al 95% de confianza.
Si bien el pH normal de los embutidos cocidos es cercano a la neutralidad, el conocimiento de los parámetros cinéticos
a valores más bajos es útil puesto que la flora desarrollada sobre estos productos provoca acidificación del medio
modificando de esta manera el pH. Esto causaría variaciones en la velocidad de crecimiento de los microorganismos
que deberían ser tenidas en cuenta a fin de estimar la vida útil de los mismos.
CONCLUSIONES
Este trabajo permitió determinar que tanto la acidez del medio como la concentración de NaCl en el mismo influyen
significativamente sobre los parámetros de crecimiento de Leuconostoc mesenteroides. Se observó un retado en el
crecimiento para concentraciones crecientes de NaCl y valores decrecientes de pH. No se detectó crecimiento a pH 3,5.
La información obtenida permitió fijar rangos en las variables independientes a utilizar en próximos ensayos.
REFERENCIAS
-
Girard, J,P. (1991) Tecnología de la Carne y los Productos Cárnicos. Ed. Acribia. España.
-
Ingaramo, E.A., Cayré, M.E., Garro, O.A. (2002) Alteración Microbiológica de Embutidos Cocidos. Actas del
IX Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Agosto de 2002.
-
Korkeala, H., Suortti, T., Mäkelä, P, (1988) Ropy slime formation in vacuum-packed cooked meat products
caused by homofermentative lactobacilli an a Leuconostoc species. Int. J. Food Microbiol. 7: 339-347.
-
Korkeala, Hand Mäkelä, P, (1989) Characterization of lactic acid bacteria isolated from vacuum-packed ring
sausages. Int. J. Food Microbiol. 9:33-34.
-
Neira, M.S. y Rodríguez, H.R. (1999) Microbiología Predictiva. Énfasis Año 5, Nº 4:22-28.
-
Skinner, G.E. and Larkin, J.W. (1994) Mathematical modeling of microbial growth. Journal of Food Safety 14:
175-217.
-
Von Holy, A., Cloete, T.E. and Holzapfel, W.H. (1991) Quantification and characterization of microbial
populations associated whit spoiled, vacuum-packed Vienna sausages. Food Microbiol. 8:95-104.
-
Wijtzes, T., De Wit, J.C., Huis int Veld, J.H.J., Vant Riet, K. and Zwietering, M.H. (1995) Modelling Bacterial
Growth of Lactobacillus curvatus as a Function of Acidity and Temperature. Appl. Environ. Microbiol.
61:2533-2539.
-
Wirth, F (1992) Tecnología de los Embutidos Escaldados. Ed. Acribia. España