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MODELAMIENTO MICROBIOLÓGICO PARA LA
LEVADURA Saccharomyces cerevisiae
JUAN CARLOS CÁCERES GARCÍA
ANDRES REYNA LOPEZ
Directora
BERNADETTE KLOTZ
Asesor
FRANCISCO ZIMMERMAN
UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE INGENIERÍA
INGENIERÍA DE PRODUCCIÓN AGROINDUSTRIAL
BOGOTÁ
2002
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
OBJETIVOS
INTRODUCCION
i
1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2
1. Microbiología de alimentos
2
1.1 Composición de los alimentos
2
1.2 Tipos nutricionales de microorganismos
2
1.2.1 Macronutrientes
2
1.2.2 Micronutrientes
3
1.2.3 Medios de cultivo
3
1.3 Clasificación de los microorganismos según su ruta metabólica
3
1.3.1 Tipos de metabolismo
3
1.3.2 Organismos asimiladores de carbono
4
1.3.3 Organismos asimiladores de nitrógeno
5
1.3.4 Organismos asimiladores de oxígeno
5
1.3.5 Organismos asimiladores de azufre
5
1.4 Clasificación de los microorganismos según los factores de crecimiento
5
1.5 Microorganismos y alimentos
6
1.6 Factores intrínsecos y extrínsecos de los alimentos que afectan el crecimiento
microbiano
9
1.6.1 Factores intrínsecos
9
1.6.1.1 Contenido de nutrientes
9
1.6.1.2 pH
9
1.6.1.3 Potencial redox
10
1.6.1.4 Barreras y constituyentes antimicrobianos
10
1.6.1.5 Actividad de agua
10
1.6.2 Factores extrínsecos
12
1.6.2.1 Humedad relativa
12
1.6.2.2 Temperatura
12
1.6.2.3 Atmósfera gaseosa
12
2. HONGOS Y LEVADURAS
13
2.1 Saccharomyces cerevisiae
14
Tabla de Contenido
2.1.1 Clasificación
14
2.1.2 Requerimientos nutricionales
14
2.1.2.1 Requerimientos de macroelementos
14
2.1.2.2 Requerimientos de microelementos
14
2.1.2 Inhibidores de crecimiento
15
2.1.3 Factores y condiciones de crecimiento
15
2.1.4 Macromoléculas básicas en la S. cerevisiae
15
2.1.5 Estructura celular
16
2.1.5.1 Envoltura celular
16
2.1.5.2 Membrana plasmática
16
2.1.5.3 Pared celular
17
2.1.6 Ciclo de vida
17
2.1.6.1 Apareamiento
18
2.1.6.2 Meiosis y esporulación
18
2.1.6.3 Crecimiento vegetativo
18
3. MICROBIOLOGIA PREDICTIVA
19
3.1 Planteamiento
19
3.2 Colección y análisis de datos
20
3.3 Descripción matemática
20
3.3.1 Modelos primarios
20
3.3.1.1 Modelo de Gompertz
21
3.3.1.2 Modelo Logístico
21
3.3.1.3 Modelo de Richards
22
3.3.1.4 Modelo de Standard
22
3.3.2 Modelos secundarios
22
3.3.3 Modelos terciarios
22
3.4 Validación de los modelos
23
2. MATERIALES Y MÉTODOS
25
1. Materiales y Equipos
25
1.1 Ensayos microbiológicos
25
1.2 Ensayos fisicoquímicos
25
2. Diseño Experimental
26
3. METODOLOGÍA
28
3.1 Ensayos preliminares
28
3.1.1 Determinación del sustrato deseado (medio líquido)
28
3.1.1.1 Preparación del medio de cultivo
29
Tabla de Contenido
3.1.2 Control de la flora no deseada
29
3.1.3 Elección de la longitud de onda
30
3.1.4 Determinación de la frecuencia de muestreo
30
3.1.5 Estandarización de los procesos de activación e inoculación
30
3.1.5.1 Activación de la levadura
30
3.1.5.2 Dilución del inóculo
30
3.1.5.3 Cuantificación de la cantidad inicial de células en la muestra de la levadura activa
30
3.1.5.4 Inoculación
31
3.1.6 Lectura de muestras
31
3.1.7 Destilación
31
3.2 Curva de calibración
31
3.2.1 Inoculación
31
3.2.2 Incubación
32
3.2.3 Lectura de muestras
32
3.3 Modelos primarios
32
3.3.1 Elección del pH
32
3.3.2 Ensayos de actividad de agua
32
3.3.3 Incubación
33
3.3.4 Experimentos factoriales
33
3.3.4.1 Experimentación factorial con factores independientes
33
3.3.4.2 Experimentación factorial con factores dependientes
33
3.3.4.3 Experimentos factoriales en repetición fraccionada
34
3.3.5 Lectura de muestras
35
3.4 Modelo secundario
35
3.5 Modelo terciario
35
3. ANÁLISIS Y RESULTADOS
36
1. Ensayos preliminares
36
2. Curva de calibración
39
2.1 Resultado con la técnica de N.M.P
39
2.2 Resultados de la cantidad de microorganismo por conteo en cámara
40
3. Modelos primarios
41
3.1 Modelo Logístico
41
3.2 Modelo de Gompertz
41
4. Modelos secundario
46
5. Modelos terciarios
52
Tabla de Contenido
CONCLUSIONES
54
RECOMENDACIONES
55
5. BIBLIOGRAFÍA
56
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1
Bacterias Gram- relacionadas con alimentos
6
Tabla 2
Bacterias Gram+ relacionadas con alimentos
7
Tabla 3.
Levaduras relacionadas con alimentos
8
Tabla 4.
Actividades de agua mínimas a las que puede haber crecimiento
11
Tabla 5.
Actividades de agua de productos alimenticios
11
Tabla 6.
Macomoléculas básicas para la S. Cerevisiae
15
Tabla 7.
Organelos de la S. cerevisiae
17
Tabla 8.
Porcentaje de carbohidratos para frutas
29
Tabla 9.
Porcentaje mínimo sólidos solubles totales a 20ºC para jugos de frutas
29
Tabla 10.
Normas técnicas para jugos de frutas
30
Tabla 11.
Cultivos y asignación de horas para toma de muestras
32
Tabla 12.
Diseño del modelo primario
34
Tabla 13.
Resultados de pH, índice de refracción y absorbancia para cultivos agitados y
en reposo
36
Tabla 14.
Análisis de varianza del pH para cultivos agitados y en reposo
37
Tabla 15.
Análisis de varianza del índice de refracción para cultivos agitados y en reposo
37
Tabla 16.
Análisis de varianza de la densidad óptica para cultivos agitados y en reposo
37
Tabla 17.
Ensayos de conteo en cámara para la dilución 10
Tabla 18.
N.M.P en función de la absorbancia a una longitud de onda de 600nm
39
Tabla 19.
Conteo directo (cámara de conteo) en función de la absorbancia a una longitud
de onda de 600nm
40
Tabla 20.
Parámetros de Gompertz y resultados de fase lag y tasa máxima de
crecimiento
42
Tabla 21.
Valores de t para comparación de pH con una confianza del 95%
43
Tabla 22.
Valores de t para comparación de a w con una confianza del 95%
44
Tabla 23.
Valores de t para comparación de pH con una confianza del 95%
44
Tabla 24.
Valores de t para comparación de temperatura con una confianza del 95%
46
Tabla 25.
Valores críticos para las funciones de fase lag
52
Tabla 26.
Actividades de agua para productos azucarados
57
Tabla 27.
Actividades de agua del medio de cultivo a distintas concentraciones de azúcar
57
-4
38
Lista de Tablas
Tabla 28.
Modelo primario pH = 5.6, aw = 0.995, T = 25º C
61
Tabla 29.
Modelo primario pH = 5.6, aw = 0.965, T = 25º C
61
Tabla 30.
Modelo primario pH = 5.6, aw = 0.952, T = 25º C
62
Tabla 31.
Modelo primario pH = 5.6, aw = 0.937, T = 25º C
62
Tabla 32.
Modelo primario pH = 3.0, aw = 0.957, T = 25º C
62
Tabla 33.
Modelo primario pH = 4.0, aw = 0.957, T = 25º C
63
Tabla 34.
Modelo primario pH = 5.0, aw = 0.957, T = 25º C
63
Tabla 35.
Modelo primario pH = 6.0, aw = 0.957, T = 25º C
64
Tabla 36.
Modelo primario pH = 6.0, aw = 0.957, T = 20º C
64
Tabla 37.
Modelo primario pH = 6.0, aw = 0.957, T = 30º C
65
Tabla 38.
Modelo primario pH = 6.0, aw = 0.957, T = 35º C
65
Tabla 39.
Modelo primario pH = 4.0, aw = 0.957, T = 20º C
66
Tabla 40.
Modelo primario pH = 4.0, aw = 0.937, T = 25º C
66
Tabla 41.
Modelo primario pH = 4.0, aw = 0.995, T = 30º C
67
Tabla 42.
Modelo primario pH = 4.0, aw = 0.965, T = 35º C
67
Tabla 43.
Modelo primario pH = 5.0, aw = 0.995, T = 25º C
68
Tabla 44.
Modelo primario pH = 5.0, aw = 0.965, T = 30º C
68
Tabla 45.
Modelo primario pH = 5.0, aw = 0.957, T = 35º C
69
Tabla 46.
Modelo primario pH = 5.6, aw = 0.995, T = 20º C
69
Tabla 47.
Modelo primario pH = 5.6, aw = 0.937, T = 35º C
70
Tabla 48.
Modelo primario pH = 6.0, aw = 0.995, T = 20º C
70
Tabla 49.
Modelo primario pH = 6.0, aw = 0.937, T = 30º C
71
Tabla 50.
Modelo primario pH = 5.6, aw = 0.995, T = 35º C
71
Tabla 51.
Modelo primario pH = 5.0, aw = 0.957, T = 20º C
72
Tabla 52.
Modelo primario pH = 4.0, aw = 0.995, T = 20º C
72
Tabla 53.
Modelo primario pH = 6.0, aw = 0.937, T = 20º C
73
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1.
Envoltura celular de la levadura
16
Figura 2.
Fases de crecimiento de los microorganismos
20
Figura 3.
Concentración de levaduras en la superficie del sustrato
45
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo A.
Ensayos Preliminares
57
Anexo B.
Resultados de los modelos primarios
61
LISTA DE GRÁFICAS
Pág.
Gráfica 1.
Absorbancia en función de la longitud de onda para el caldo inoculado y sin
inóculo
39
Gráfica 2.
Concentración de microorganismos (N.M.P) en función de la densidad óptica
a 600nm.
40
Gráfica 3.
Conteo directo (cámara de conteo) en función de la absorbancia a una
longitud de onda de 600nm
41
Gráfica 4.
Gráfica comparativa de pH de la función de Gompertz
43
Gráfica 5.
Gráfica comparativa de actividad de agua de la función de Gompertz
44
Gráfica 6.
Gráfica comparativa de temperaturas de la función de Gompertz
45
Gráfica 7.
Tasa máxima de crecimiento en función de la actividad de agua y pH a 20º C
47
Gráfica 8.
Tasa máxima de crecimiento en función de la actividad de agua y pH a 25º C
48
Gráfica 9.
Tasa máxima de crecimiento en función de la actividad de agua y pH a 30º C
48
Gráfica 10.
Tasa máxima de crecimiento en función de la actividad de agua y pH a 35º C
49
Gráfica 11.
Fase lag en función del pH y actividad de agua a 20º C
49
Gráfica 12.
Fase lag en función del pH y actividad de agua a 25º C
50
Grafica 13.
Fase lag en función del pH y actividad de agua a 30º C
50
Grafica 14
Fase lag en función del pH y actividad de agua a 35º C
51
Grafica 15
pH en función del tiempo para cultivo agitado
58
Grafica 16
pH en función del tiempo para cultivo sin agitación
58
Grafica 17
Indice de refracción en función del tiempo para cultivo agitado
59
Grafica 18
Indice de refracción en función del tiempo para cultivo sin agitación
59
Grafica 19
Absorbancia en función del tiempo para cultivo agitado
60
Grafica 20
Absorbancia en función del tiempo para cultivo no agitado
60
RESUMEN
En el presente proyecto se contemplan las siguientes tres etapas que involucran el desarrollo de un
modelo predictivo: primero el diseño experimental, segundo el modelamiento y por último su aceptación.
En este documento se ilustran los efectos de los tres principales factores de crecimiento de la
Saccharomyces cerevisiae tales como: temperatura (20, 25, 30, 35ºC), pH (4.0, 5.0, 5.6, 6.0), y aW (0.995,
0.965, 0.957, 0.937). El inóculo se estandarizó y se diseñó una curva de calibración que relaciona la
densidad óptica con conteo de microorganismos en microscopio. Las curvas de crecimiento generadas
por el conteo directo de microorganismos se ajustan a la ecuación de Gompertz (con coeficiente de
correlación > 0.97) y se calcularon los parámetros de la función. El efecto de combinación de los tres
factores es descrito y analizado. Los valores en los que no se observaron crecimiento se excluyeron
debido a que bajan la bondad de ajuste de las ecuaciones. La transformación de los parámetros de
Gompertz a logaritmo permite un mejor ajuste a una regresión múltiple cuyos coeficientes de
2
determinación ( R ) son: log (a) 0.9094, log (b) 0.8510 y log (c) 0.9457.
ABSTRACT
Three stages involved in developing a predictive model, experimental design, modeling, and acceptance,
are illustrated using data describing the effects of the main controlling factors influencing the growth of
Saccharomyces cerevisiae: temperature ( 20, 25, 30, 35ºC ), pH ( 4.0, 5.0, 5.6, 6.0 ) and aw ( 0.995,
0.965, 0.957, 0.937 ). The inoculum was standardized and a calibration curve correlating the optical
density and direct microscopy count was generated. Growth curves generated from direct total cell counts
were fitted using a Gompertz equation ( correlation coefficient > 0.97 ) and growth parameters were
calculated. The effects of various combinations of these controlling factors are described and analyzed.
No growth data were not included because they tend to bias the equations to poorer fit. The log
transformed Gompertz parameters were tested for goodness of fit by multiple regression and the
2
coefficients of determination ( R ) obtained were:
Log ( a ) 0.9094, log ( b ) 0.8510, log ( c ) 0.9457.
OBJETIVO GENERAL
Desarrollar un modelo que permita predecir el crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae bajo
condiciones de pH, temperatura y actividad de agua controladas.
Objetivo Específicos:
•
•
•
Ajustar un modelo primario de crecimiento para la levadura teniendo en cuenta las condiciones
de temperatura, pH y actividad de agua de forma independiente.
A partir del modelo primario, construir un modelo secundario que permita relacionar o combinar
las tres condiciones ya mencionadas.
Con base en un modelo terciario, elaborar un programa en computador que permita predecir el
comportamiento de la levadura en un sustrato definido.
INTRODUCCION
El objetivo de la microbiología predictiva en sistemas de alimentos consiste en describir
matemáticamente el crecimiento, sobrevivencia o muerte de microorganismos bajo condiciones
ambientales específicas.
El comportamiento microbiano se ve afectado por diversos factores intrínsecos y extrínsecos. Sin
embargo, generalmente los más importantes y los que controlan o definen el crecimiento o sobrevivencia
son: temperatura, pH, y actividad de agua.
La evaluación de la respuesta microbiana bajo la combinación de esos factores permite la descripción,
modelado y predicción de diferentes situaciones. Las expresiones matemáticas permiten predecir la
respuesta microbiana ante condiciones no evaluadas dentro del intervalo de los niveles de los factores o
variables estudiadas.
Los modelos microbianos son una herramienta de vital importancia ya que proveen de manera rápida,
información necesaria para la toma de decisiones, análisis de riesgos, aseguramiento de la calidad,
desarrollo de productos y procesos, análisis de datos, planeación de ensayos de laboratorio, entre otros
(la importancia de estos puntos se explica con detalle en la revisión bibliográfica).
El modelado microbiano tiene sus inicios hacia 1920 con el estudio cinético de los tratamientos térmicos.
Con la llegada de los computadores el interés por los modelos microbianos creció ya que se facilitó el
manejo de los modelos multifactoriales. La respuesta microbiana puede predecirse con base en la
respuesta que se obtiene a un solo factor presente. Actualmente los modelos predictivos se han venido
desarrollando con mayor intensidad para microorganismos patógenos (especialmente bacterias
causantes de infecciones e intoxicaciones de origen alimentario).
Con este proyecto se pretende ampliar algo más el conocimiento que se tiene de los modelos
microbianos respecto a la flora deteriorativa, y predecir el comportamiento de la levadura en productos
alimenticios como jugos, mermeladas, compotas y demás productos azucarados.
El aporte de éste proyecto, radica en que los modelos terciarios actuales se enfocan como es obvio, en
los microorganismos patógenos (Programa de micromodelado de alimentos de Reino Unido y Programa
de modelado de patógenos de USDA) y no contempla los microorganismos deteriorativos como se refleja
en este estudio. Lo conveniente sería modelar tanto los deteriorativos como los patógenos en el
procesamiento y almacenamiento, así como sus interacciones.
i
CAPÍTULO 1
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1 MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
1.1
Composición de los alimentos
Los alimentos están compuestos por diversas sustancias orgánicas. Entre lo principales tipos de
moléculas orgánicas que constituyen los alimentos en diferente proporción están los glúcidos, lípidos y
proteínas.
Los glúcidos sirven de materia prima para la obtención de energía en los seres vivos. Los glúcidos más
sencillos son los monosacáridos, como la glucosa y la fructosa. Estos pueden combinarse para formar los
disacáridos, como la sacarosa, y los polisacáridos. El almidón y el glucógeno son polisacáridos de
reserva mientras que la celulosa, otro polisacárido, es un importante material estructural en las plantas.
Los lípidos son moléculas orgánicas hidrofóbicas que, como en el caso de los glúcidos, juegan un papel
importante en la reserva de energía y en la función estructural. Este grupo abarca los sebos, mantecas y
aceites, los fosfolípidos, los glucolípidos, las ceras, así como el colesterol y otros esteroides. Los
fosfolípidos y los glucolípidos son los componentes principales de las membranas celulares.
Las proteínas son macromoléculas compuestas de aminoácidos; estas cadenas se denominan
polipéptidos. Algunas proteínas son fibrosas y tienen un papel estructural importante. Otras proteínas son
globulares y tiene funciones reguladoras y defensivas. La exacta estructura de una molécula de proteína
es de vital importancia para llevar a cabo fielmente una determinada función biológica.
Para poder entender cuáles son los principales microorganismos que influyen en los alimentos es
necesario definir los tipos de microorganismos y el metabolismo de los mismos.
1.2
Tipos nutricionales de microorganismos
Los microorganismos se pueden agrupar dependiendo de la fuente de energía que utilicen en:
•
•
1.2.1
Fotótrofos: Utilizan la luz como fuente de energía.
Quimiótrofos: Utilizan compuestos químicos como fuente energética. Entre los quimiótrofos se
derivan los quimiorganotrofos (utilizan compuestos orgánicos) y quimiolitótrofos (organismos
capaces de utilizar compuestos inorgánicos).
Macronutrientes
Son elementos requeridos en grandes cantidades. Los macronutrientes mayoritarios son el carbono y el
nitrógeno. La mayoría de los procariotas requieren un compuesto orgánico de algún tipo como fuente de
2
Revisión Bibliográfica
3
carbono. En peso seco, una célula típica consta de aproximadamente 50% de carbono y a su vez este
es el elemento mayoritario de las macromoléculas.
Después del carbono, el siguiente elemento más abundante en la célula es el nitrógeno. El nitrógeno se
encuentra en la naturaleza tanto en forma orgánica como inorgánica, Sin embargo, la globalidad del
nitrógeno utilizable está en forma inorgánica, bien como amoniaco, nitrato o nitrógeno gaseoso.
Otros macronutrientes en menor proporción son el fósforo, que es utilizado por la célula para la síntesis
de ácidos nucleicos y fosfolípidos, el azufre que es fundamental por ser un elemento estructural en los
aminoácidos cisteína y metionina; el potasio, magnesio, calcio y sodio.
1.2.2
Micronutrientes
Los micronutrientes clásicamente considerados como compuestos esenciales, comprenden 13 vitaminas
y unos 16 minerales, muchos de los cuales son responsables de acciones beneficiosas para el
organismo.
Aunque los micronutrientes son requeridos en muy pequeñas cantidades, son importantes para la función
celular; entre ellos están el cromo, cobalto, cobre, manganeso, molibdeno, níquel, selenio, tungsteno,
vanadio y zinc.
1.2.3
Medios de cultivo
Se puede resumir la nutrición microbiana examinando la composición química de diversos medios de
cultivo diseñados para desarrollar microoganimos en laboratorios. En microbiología se usan dos grandes
grupos de medios de cultivo: los químicamente definidos y los indefinidos (complejos). Los medios
químicamente definidos se preparan añadiendo al agua destilada cantidades precisas de compuestos
orgánicos o inorgánicos. Los medios complejos emplean lisados de caseína (proteína de leche), de
carne, de soja, de levadura o cualquier otra sustancia altamente nutritiva. Tales lisados están disponibles
comercialmente en forma de polvo y pueden ser pesados rápidamente y disueltos en agua destilada para
dar lugar al caldo nutritivo.
1.3 Clasificación de los microorganismos según su ruta metabólica
1.3.1
Tipos de metabolismo
Se define metabolismo como el conjunto de las reacciones químicas que se llevan a cabo en la célula.
Comprende procesos de construcción o biosintéticos, llamados anabolismo, y los procesos de
degradación (llamados catabolismo), que dan como resultado una liberación de energía.
En el proceso catabólico, algunos compuestos son utilizados por los microorganismos como fuente de
energía aún en ausencia de un aceptor de electrones adicionado externamente mediante un proceso
llamado fermentación. Una fermentación es una reacción de oxidación-reducción balanceada
internamente, en la cual algunos átomos de la fuente de energía se quedan más reducidos mientras que
otros se quedan más oxidados. Solamente una pequeña cantidad de energía se libera durante la
fermentación ya que la mayor parte de la misma permanece en el producto de la fermentación reducido.
Contrario a la fermentación se encuentra el proceso de respiración el cual también es un proceso de
oxidación-reducción en el cual el oxígeno molecular (en el caso de respiración aerobia) se utiliza como
aceptor externo de electrones. Debido al elevado potencial de reducción del oxígeno, la cantidad máxima
de energía disponible se libera a partir de una fuente de energía cuando el oxígeno es el aceptor de
Revisión Bibliográfica
4
electrones. Esto último implica la oxidación completa de una fuente orgánica de energía a bióxido de
carbono y agua.
Una forma alterna de generación de energía es una variable de la respiración, en el cual se utilizan
aceptores de electrones, diferentes al oxígeno, que por su analogía con el oxígeno, se clasifican con el
nombre de respiración anaerobia. Los aceptores de electrones utilizados en la respiración anaerobia son
el nitrato, sulfato, carbonato, y otros compuestos orgánicos.
Los organismos litótrofos utilizan fuentes inorgánicas de energía como el sulfuro de hidrógeno, hidrógeno
gaseoso, y el amoniaco. La mayor parte de estos organismos utilizan bióxido de carbono como fuente de
carbono, por lo cual son autótrofos.
Después del anterior análisis de los procesos catabólicos, es necesario hablar de los procesos
bioquímicos por los cuales los microorganismos construyen a través de nutrientes la gran variedad de
sustancias químicas que los componen, o de otra manera dicha, anabolismo. Llamado también
biosíntesis, el anabolismo es el proceso por el cual la célula construye la amplia gama de sustancias
químicas que son necesarias para su crecimiento. El ATP producido en el catabolismo se consume en el
anabolismo y otros procesos dependientes de energía (el ATP es la energía liberada en las reacciones
de oxidación-reducción que actúa como acarreador primario de energía en la célula).
Aunque los azúcares son una fuente de energía importante, también son necesarios en la biosíntesis de
las paredes celulares, ácidos nucleicos, entre otros. Los azúcares más importantes en la biosínteis celular
son las pentosas (cinco carbonos) y las hexosas (seis carbonos).
Los 20 aminoácidos que existen en las proteínas se sintetizan en una serie de reacciones biosintéticas
complejas, a partir de intermediarios clave. Los aminoácidos pueden agruparse en familias con base en
el precursor usado para la síntesis del esqueleto de carbono.
La biosíntesis de las purinas se realiza a partir del fosfato de ribosa, un compuesto al cual se le va
añadiendo átomo por átomo utilizando carbonos y nitrógenos derivados de aminoácidos.
Las pirimidinas, contrario a las purinas, se construyen antes de adicionar el azúcar para formar un
nucleósido.
1.3.2
Organismos asimiladores de carbono
Los organismos quimiorganotrofos utilizan el carbono como fuente de energía. Este elemento puede
aportarse a los microorganismos en forma muy diversa dependiendo del tipo de metabolismo que
posean. El carbono es utilizado por los microorganismos para sintetizar los compuestos orgánicos
requeridos para las estructuras y funciones de la célula.
Se pueden establecer cuatro categorías principales de organismos:
•
•
•
•
Fotoautótrofos: Dependen de la luz como fuente de energía y utilizan CO2 como principal fuente
de carbono. Vegetales superiores, bacterias fotosintéticas, algas eucarióticas, etc.
Fotoheterótrofos: Utilizan luz como fuente de energía y emplean compuestos orgánicos como
fuente de carbono. Algunas bacterias fotosintéticas y algas eucarióticas.
Quimioautótrofos: Utilizan CO2 como fuente de carbono y emplean fuentes de energía química
2+
proveniente generalmente de compuestos inorgánicos reducidos (H2, S , NH4 , etc).
Quimioheterótrofos: Utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía. Los
compuestos orgánicos también se comportan como fuente de electrones. Este grupo está
integrado por animales superiores, hongos, protozoos y la mayoría de las bacterias.
Revisión Bibliográfica
1.3.3
5
Organismos asimiladores de nitrógeno
El nitrógeno es utilizado por las bacterias para formar aminoácidos, pirimidinas, purinas, etc, y puede
provenir de rutas diferentes.
•
•
•
•
1.3.4
Asimilación de NH3 y sales de amonio: el nitrógeno es transferido con este estado de
oxidación a los aminoácidos por la vía de la glutamato/glutamina.
+
Fijación de nitrógeno: el N2 es reducido dentro de la célula a NH4 y metabolizado.
Reducción asimiladora de nitratos: los nitratos son reducidos dentro de la célula por la vía
de los nitritos a NH3 y metabolizado.
Asimilación de compuestos nitrogenados orgánicos: los microorganismos incapaces de
asimilar el nitrógeno de sales inorgánicas, lo obtienen a través de compuestos orgánicos
nitrogenados como los hidrolizados proteicos. Estos compuestos proteicos son a su vez
hidrolizados por enzimas bacterianas, fuera de la célula, a aminoácidos, los que después son
metabolizados dentro de la célula.
Organismos asimiladores de oxígeno
Basados en los requerimientos de oxígeno molecular las bacterias se pueden dividir en 5 grupos:
•
•
•
•
•
Aerobios Obligados: requieren oxígeno para el crecimiento pues dependen de este elemento
para cubrir sus necesidades energéticas. El oxígeno es el aceptor final de electrones en la
cadena respiratoria.
Anaerobios obligados: crecen en ausencia total de oxígeno porque necesitan un medio muy
reductor. Utilizan respiración anaerobia donde los aceptores finales de electrones pueden ser
222generalmente SO4 , Fumarato o CO3 .
Anaerobios facultativos: pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno. Utilizan al oxígeno
como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria cuando está disponible, y en ausencia
de oxígeno la energía la obtienen por fermentación o respiración anaerobia (generalmente el
NO3 es un aceptor final de electrones en las enterobacterias).
Anaerobios aerotolerantes: pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno, pero la energía
la obtienen por fermentación.
Microaerófilos: sólo pueden crecer con bajas tensiones de oxígeno porque las altas tensiones
son tóxicas para este tipo de microorganismos (1 a 12% de O2 en la fase gaseosa). La energía la
obtienen por respiración aeróbica, cuando no hay aceptores electrónicos terminales alternativos,
o anaeróbica.
1.3.5 Organismos asimiladores de azufre
El azufre en el microorganismos puede ingresar en la célula reducido (grupos sulfhidrilos), como sulfato
(debe ser reducido dentro de la célula para metabolizarse) o como aminoácidos azufrados.
El azufre es utilizado para la síntesis de aminoácidos azufrados como la cisteína o metionina, que tienen
un papel muy importante en la estructura terciaria de las proteínas (formación de puentes S-S) y en el
sitio catalítico de enzimas.
1.4
Clasificación de los microorganismos según los factores de crecimiento
En relación al requerimiento de factores de crecimiento los microorganismos se pueden dividir en:
•
Protótrofos: Microorganismos que sintetizan sus propios factores de crecimiento.
Revisión Bibliográfica
•
6
Auxótrofos: Microorganismos que requieren una fuente exógena de factores de crecimiento
debido a que son incapaces de sintetizarlos.
1.5 Microorganismos y alimentos
A continuación se presentan las tablas en las que se relaciona el tipo de microorganismo con los rangos
de pH, temperatura, actividad de agua en los que crecen, nutrientes necesarios, y consideraciones en
cuanto a los alimentos que alteran y lo que representan.
Tabla 1. Bacterias Gram- relacionadas con alimentos
Género
pH Temp
aW
O.R
4.5Acetobacter
5-42 0.95-0.99
9.0
5.5Acinetobacter
4-40 0.95-0.99
9.0
Aeromonas
Alcalígenes
Alteromonas
Campylobacter
Chromobacterium
Edwardstella
4,010.0
6.49.7
6.08.0
4.98.0
5.09.0
4.09.0
1-42
0.95-0.99
+/-
5-40
0.95-0.99
+
Glucosa, proteína
4-40
0.95-0.99
+
25-47 0.95-0.99
+/-
2-41
0.95-0.99
+/-
7-45
0.95-0.99
+/-
4.58.5
4-45
0.95-0.99
+/-
Erwinia
4.09.3
1-40
0.95-0.99
+/-
Escherichia
4.59.0
4-45
0.95-0.99
+/-
4-35
0.95-0.99
+
15-35 0.95-0.99
+
Gluconobacter
Hafnia
Haloccocus
Halobacterium
Moraxella
Plesiomonas
Proteus
5.09.0
3.67.0
4.09.0
5.58.0
5.58.0
5.59.0
4.08.0
4.09.0
Glucosa, proteína
Glu, gal, fru, suc,rib.
Malta, almidón,
proteína, lípidos,
pectina
Enterobacter
Flavobacterium
Nutrientes
Glucosa, oxida
etanol
7-45
0.95-0.99
+/-
20-40 0.75-0.91
+/-
30-50 0.75-0.91
+
4-40
0.95-0.99
+
8-55
0.95-0.99
+/-
7-45
0.95-0.99
+/-
Glucosa, almidón,
proteína
No usa azúcares,
usa aminoácidos
Glu, fru, malt,
proteína, lípidos
Glucosa, sucrosa
Glu, fru, lac, suc,
xyl, arab, proteína,
pectina
Glu, gal, fru, suc,
xyl, arab, pectina
Glu, fru, lac, malt,
xyl, arab, proteína
Glu, fru, malt,
proteína, lípidos
Glucosa, oxida
etanol
Glu, fru, malt, syl,
arab
Necesita 15% de
sal, proteína
Necesita 15% de
sal, Na, Mg, Cl;
proteína
Proteína, no usa
azúcares
Glu, fru, necesita 35% de sal
Glu, fru, proteína,
lípidos
Alimentos afectados
Vinagre, frutas,
vegetales
Leche, carne,
pescado
Carne, pescado,
huevos
Carne, pescado,
lácteos
Pescado
Patógeno de la leche
y carnes
Decolora el pescado,
carnes
Patógeno de
importancia
Vegetales, carnes,
leche
Vegetales
Indicador fecal,
algunas cepas son
patógenas
Carne, pescado,
lácteos
Vinagre, vegetales,
frutas
Carnes vacunas
Pescado salteado
Agua salada, pescado
Carnes, pescado,
leche
Patógeno oportunista,
pescado
Carne, lácteos,
comida de mar
Revisión Bibliográfica
Pseudomonas
Salmonella
Serratia
7
5.38.0
4.09.0
4.09.0
Shigella
4.09.0
Vibrio
6.09.0
Xanthomonas
Yersinia
5.010.0
4.69.0
4-43
0.95-0.99
+
Glu, fru, suc,rib,
proteína, lípidos,
pectina
7-47
0.93-0.99
+/-
Glu, fru, malt, xyl
10-45 0.93-0.99
+/-
Glu, fru, suc, malt,
proteína, lípidos
Patógeno, carne,
huevos
Carnes, decoloración
en pescado
0.95-0.99
+/-
Glu, fru
Disentería
10-44 0.93-0.99
+/-
Glu, fru, gal, malt,
rib, Almidón,
proteína, lípidos, sal
Pescado, patógeno
7-46
7-30
0.95-0.99
+
Glu, suc, pectina
Vegetales,
0-44
0.95-0.99
+
Flu, fru, suc, malt,
xyl, arab, proteína
Patógeno, carnes,
comida de mar, leche
(W.C Frazier, D.C Westhoff, 1978),
(O.R: Requerimiento de oxígeno)
Tabla 2. Bacterias Gram+ relacionadas con alimentos
4.0Aerococcus
10-40 0.91-0.99 +/9.6
Arthrobacterium
Bacillus
Bifidobacterium
Clostridium
Corynebacterium
Desulfotomaculum
Kurthia
Lactobacillus
Lactococcus
Leuconostoc
Listeria
Microbacterium
5.08.0
2.09.3
5.58.0
3.08.5
5.07.5
6.014.0
5.07.5
3.09.6
4.09.6
3.09.6
5.59.6
5.08.0
Carne, pescado,
leche
0-37
0.91-0.99
-
-5-75 0.90-0.99
+/-
25-45 0.91-0.99
-
0-70
0.90-0.99
-
0-40
0.91-0.99
+/-
30-70 0.91-0.99
Glu, gal, fru, suc,
malt
Glu, gal, fruc, suc,
malt, xyl, almidón,
proteína
Glu, fru, lac, suc,
malt.
Glu, gal, fru, lac,
suc, malt, xyl, rib,
Glu, fru, almidón,
proteína, lípidos,
Glu, gal, fru, suc,
malt, algunas
proteínas
Vegetales, salmueras
Vegetales, carnes
Alimentos enlatados
Tracto intestinal
Alimentos enlatados
Plantas, carnes,
comida de mar
-
Glucosa
Alimentos enlatados
Proteína
Carnes
5-37
0.91-0.99
-
5-53
0.90-0.99
+/-
4-45
0.91-0.99
+/-
10-40 0.95-0.99
+/-
2.5-38 0.91-0.99
+/-
15-35 0.94-0.99
+
Micrococcus
5.08.5
0-45
0.90-0.99
+
Pediococcus
4.0-
7-45
0.91-0.99
+/-
Glu, fru, gal, lac,
suc, malt, rib,
nutrientes complejos
Glu, gal, fru, lac,
suc, malt, xyl
Glu, gal, fru, lac,
suc, malt, xyl
Glu, gal, fru, lac, tre,
sal
Glu, gal, fru, lac,
suc, malt, almidón
Glu, gal, fru, suc
malt, proteína,
lípidos, sal
Glu, fru, suc
Queso, productos
lácteos
Frutas, leche,
vegetales, vino
Frutas, leche,
vegetales, vino
Vegetales, leche,
carne
Carne, pescado,
leche
Queso
Vegetales, salsas,
Revisión Bibliográfica
8
9.6
cerveza
Sarcina
1.09.8
15-40 0.91-0.99
-
Staphylococcus
4.29.3
6.5-46 0.83-0.99
+/-
Vitaminas,
aminoácidos, glu,
gal, fru, suc, malt
Glu, gal, fru, lac,
suc, malt, proteína,
lípidos,aminoácidos,
sal, b-vitaminas
Pescado y jamones
salteados
Carne roja y blanca
(W.C Frazier, D.C Westhoff, 1978)
Tabla 3. Levaduras relacionadas con alimentos
Brettanomyces
28.5
Mycoderma y
torulopsis
1.38.5
0-48
0.70-0.99
+/-
Cryptococcus
28.5
0-40
0.87-0.99
+
Debaryomyces
28.5
Hanseniaspora
28.5
Hansenula
28.5
Kloeckera
28.5
8-40
Kluyveromyces
1.58.5
Pichia
1.58.5
Rhodotorula
28.5
Saccharomyces
1.511
Saccharomycopsis
28.5
Schizasaccharomyces
Trichosporon
28.5
2-
mesóf
0.87-0.99
.
+/-
Glu, gal, suc, fruc,
malt, vitaminas
Glu, gal, fru, suc,
malt, xyl, rib, arab,
proteína, lípidos
Glu, gal, fru, suc, lac
malt, xyl, rib, lípidos
Cerveza, bebidas
alcohólicas, tragos
suaves
Alimentos
fermentados, vinos,
vegetales y frutas
Produce lipasas,
alteran pescado
+
Glu, gal, fru, suc,
malt, lac, xyl, rib,
arab
Toleran 18-24% de
sal, alteran
salmueras, carnes
curadas y salteadas,
+/-
Glu, fru, suc, malt,
vitaminas
Alteran frutas y jugos
+/-
Glu, fru, suc, malt,
xyl, lípidos, pectina
Fermentación
osmofílica (soluciones
de 68 ° brix), alteran
salmueras
0.87-0.99
+/-
Glu, fru, malt,
vitaminas
Frutas, vinos,
fermentan granos de
cacao
5-46
0.87-0.99
+/-
Glu, gal, fru, suc,
malt, lac, rib,
vitaminas
Altera productos
diarios
5-37
0.87-0.99
+/-
Glu, gal, fru, suc,
malt, xyl, rib, arab
+
Glu, gal, fru, suc,
malt, xyl, rib, arab,
proteína, lípidos,
pectina
+/-
Glu, gal, fru, suc,
malt
0-40
0.87-0.99
20-40 0.87-0.99
10-50 0.75-0.99
2.5-35 0.89-0.99
0-40
0.62-0.99
Glu, gal, fru, suc,
malt, lípidos
30-40 0.88-0.99
10-40 0.70-0.99
0-40
0.87-0.99
+/+
Glu, suc, malt,
pectina
Glu, gal, fru, suc,
Salmueras vegetales,
frutas y cerveza
Decoloran carne y
pescado, producen
pectinasas
Frutas, jugos,
mermeladas,
compotas
Almidón, grasas. No
fermentan azúcares
con facilidad
Alimentos con alto
contenido de azúcar
Crecen en carnes y
Revisión Bibliográfica
9
8.5
Zygosaccharomyces
1.88.5
malt, almidón,
lípidos
Mesó0.65-0.99
filos
+/-
Glu, gal, fru, malt,
suc
pescado, queso
Alteran alimentos con
alto contenido de
azúcar, de sal, o de
ácido acético
(W.C Frazier, D.C Westhoff, 1978)
1.6
Factores intrínsecos y extrínsecos de los alimentos que afectan el crecimiento microbiano.
1.6.1
Factores intrínsecos
Estos factores son atribuidos a las posibles limitaciones que presente el sustrato en cuanto al contenido
de nutrientes, pH y capacidad tampón, potencial redox, barreras y constituyentes antimicrobianos y por
último la actividad de agua.
1.6.1.1
Contenido de nutrientes
Los microorganismos quimiorganotrofos heterótrofos son capaces de utilizar los alimentos como fuente
de nutrientes y energía. De los alimentos obtienen los elementos químicos que constituyen la biomasa
microbiana, aquellas moléculas que son indispensables para su crecimiento y que el organismo es
incapaz de sintetizar. Es por esto que de los alimentos obtienen un sustrato que puede ser utilizado como
fuente de energía.
La incapacidad de un organismo para utilizar un componente mayoritario de un material alimenticio
limitará su crecimiento y lo situará en desventaja competitiva comparado con aquellos que son capaces
de utilizarlo.
1.6.1.2
pH
La acidez o la alcalinidad que un medio tiene influencia en la estabilidad de las macromoléculas tales
como las enzimas, por lo que no resulta sorprendente que tanto el crecimiento como el metabolismo de
los microorganismos estén influidos por el pH.
En general, las bacterias crecen con mayor rapidez en la escala de pH comprendida entre los valores 6,0
y 8,0, las levaduras entre los valores 4,5 y 6,0 y los hongos filamentosos entre los valores 3,5 y 4,0. Lo
mismo que sucede en todas las generalizaciones, existen excepciones, de modo especial en aquellas
bacterias que producen gran cantidad de ácido consecuencia de su metabolismo productor de energía.
La mayoría de los alimentos son, cuando menos, ligeramente ácidos, ya que los materiales cuyo pH es
alcalino generalmente tienen un sabor bastante desagradable. La clara de huevo, cuyo pH aumenta
hasta cerca de 9,2 a medida que el CO2 es eliminado del huevo, constituye una excepción común a lo
expuesto.
La acidez de un producto puede tener implicaciones tanto en su ecología microbiana como en la rapidez
y naturaleza de su alteración. Por ejemplo, los productos vegetales clasificados como hortalizas
generalmente tienen un pH ligeramente ácido en donde las bacterias productoras de putrefacción blanda
causan su alteración. En las frutas, sin embargo, un pH más bajo impide el crecimiento bacteriano y de
aquí que su alteración sea dominada por levaduras y mohos.
1.6.1.3
Potencial redox
Revisión Bibliográfica
10
A la tendencia de un medio para aceptar o ceder electrones, para oxidar o para reducir, se le denomina
potencial redox. Este potencial ejerce un importante efecto electivo en la microflora del alimento. Si bien
el crecimiento microbiano puede tener lugar dentro de un amplio intervalo de potencial redox, los
microorganismos son encuadrados convenientemente en uno solo, de diversos grupos fisiológicos con
base en el intervalo de potencial redox dentro del cual son capaces de crecer teniendo en cuenta su
respuesta al oxígeno.
Los microorganismos aerobios obligados o estrictos son aquellos que son respiratorios, generando la
mayor parte de su energía por fosforilación oxidativa utilizando el oxígeno como aceptor final de
electrones en el proceso respiratorio. Consiguientemente, tienen necesidad de oxígeno y de un alto
potencial redox por lo que predominarán en la superficie de los alimentos expuestos al aire o en aquellas
zonas de los mismos en las que el aire pueda ser utilizado fácilmente.
Los microorganismos anaerobios obligados sólo tienden a crecer a potenciales redox bajos o negativos y
con frecuencia necesitan oxígeno para estar ausentes. Los clostridios por ejemplo tienen la posibilidad de
crecer dondequiera que las condiciones sean anaerobias, como por ejemplo en la profundidad de los
tejidos y en los estofados de carne, en los alimentos envasados y enlatados al vacío causando alteración.
Los microorganismos facultativos son aquellos que pueden crecer bajo las dos condiciones explicadas
anteriormente dependiendo del lugar en que se encuentren.
1.6.1.4
Barreras y constituyentes antimicrobianos
Los alimentos a lo largo de la evolución han sido dotados de medios con los cuales las infecciones
microbianas potencialmente perjudiciales pueden ser evitadas o, por lo menos, limitadas.
El primero de estos medios es el tegumento: se trata de una barrera frente a la infección como por
ejemplo la piel, la cáscara, la vaina o la corteza de un producto. El tegumento suele estar formado por
macromoléculas resistentes en medida a la degradación y proporciona un medio inadecuado de
existencia para los microorganismos por tener una baja actividad de agua, una falta de nutrientes
fácilmente asequibles y, con frecuencia, por contener componentes antimicrobianos tales como ácidos
grasos de cadena corta (en la piel de los animales) o aceites esenciales (en la superficie de las plantas).
Como segunda línea de defensa, los tejidos de los productos pueden contener componentes
antimicrobianos cuya concentración local con frecuencia aumenta como consecuencia del daño físico. En
las plantas, es posible que la lesión rompa células de depósito que contienen aceites esenciales o pueda
unir una enzima y un sustrato que en el tejido intacto estaban separados (como sucede en plantas de
mostaza, rábano picante, el berro, la col, entre otros).
Algunos constituyentes propios de los tejidos vegetales tales como pigmentos, alcaloides y las resinas
tienen propiedades antimicrobianas.
Los productos de origen animal también contienen una serie de constituyentes antimicrobianos
inespecíficos. Por ejemplo la clara de huevo de gallina y la leche, contienen una batería completa de
componentes inhibidores como la enzima lizosima que interfiere en la formación de la pared celular
bacteriana.
1.6.1.5
Actividad de agua
Es un parámetro útil para comprender el desplazamiento del agua desde el medio al citoplasma de una
célula o desde el citoplasma al medio. La actividad de agua de un sustrato se define de modo más
adecuado como el cociente entre la presión parcial del agua existente en la atmósfera en equilibrio con el
sustrato, P, y la presión parcial de la atmósfera en equilibrio con el agua pura a la misma temperatura, Po.
Revisión Bibliográfica
11
Este cociente es numéricamente equivalente a la humedad relativa de equilibrio (HRE) expresada como
fracción en lugar de expresarla como porcentaje:
aW =
P
1
=
HRE
P0 100
La humedad relativa en equilibrio tiene importantes repercusiones en el almacenamiento de alimentos de
baja actividad de agua.
A medida que la actividad de agua disminuye, o a medida que aumenta la presión osmótica, es esencial
que la actividad del agua del citoplasma sea aún más baja, o que su presión osmótica sea aún más
elevada. Esto se consigue mediante la producción de concentraciones crecientes de solutos que no
deben obstaculizar la función del citoplasma.
Con la reducción de la actividad de agua en su medio, disminuye el número de grupos de
microorganismos capaces de crecer activamente como se muestra a continuación:
Tabla 4. Actividades de agua mínimas a las que puede haber crecimiento
Grupo de microorganismos
Actividad de agua mínima
Mayoría de bacterias Gram-negativas
0.97
Mayoría de bacterias Gram-positivas
0.90
Mayoría de levaduras
0.88
Mayoría de hongos filamentosos
0.80
Bacterias halófilas
0.75
Hongos Xerófilos
0.61
(Westhoff, 1985)
Para definir los microorganismos asociados a alimentos se usan tres términos:
•
•
•
Halotolerantes: capaces de crecer en presencia de elevadas concentraciones de sal.
Osmotolerantes: capaces de crecer en presencia de elevadas concentraciones de compuestos
orgánicos no ionizados como los azúcares.
Xerotolerantes: capaces de crecer en alimentos secos.
El valor limitante de la actividad de agua para el crecimiento de cualquier microorganismo es de
aproximadamente 0,6, de modo que por debajo de este valor la alteración de los alimentos no es
microbiológica sino que es posible que sea debida al daño causado por insectos o a reacciones químicas,
como por ejemplo la oxidación.
A continuación se muestran los valores de actividad de agua de varios productos alimenticios
Tabla 5. Actividad de agua de productos alimenticios
Producto
aw
Hortalizas, carne, leche, pescado
1.0
Carnes curadas, jamón, salami
0.95
Quesos secos
0.9
Harinas, tortas, cereales
0.8 – 0.9
Avena en copos
0.7
Frutas desecadas, caramelos
0.6 - 0.7
Alimentos deshidratados
< 0.6
(Food Protection, 1991)
Los alimentos de humedad intermedia son aquellos que comprenden actividades de agua entre 0.85 y
0.6. Esta escala, que corresponde a un 15% y 50% de humedad impide el crecimiento de las bacterias
Revisión Bibliográfica
12
Gram-negativas así como de un gran número de Gram-positivas, levaduras y mohos, confiriendo al
producto una prolongada vida comercial a temperatura ambiente.
La actividad de agua de un producto se puede reducir mediante la eliminación física del agua líquida,
bien en forma de vapor en la desecación, bien en forma sólida durante la congelación. También se
reduce mediante la adición de solutos tales como la sal y el azúcar.
1.6.2
Factores extrínsecos
Estos factores se refieren a las limitaciones ambientales como la humedad relativa, temperatura, y
atmósfera gaseosa.
1.6.2.1
Humedad relativa
Cuando se almacenan alimentos que tienen una actividad de agua baja en una atmósfera de humedad
relativa elevada, el agua pasará de la fase gaseosa al alimento. Esto origina una condensación en zonas
localizadas con elevada actividad de agua lo que aumenta la posibilidad de desarrollo de
microorganismos los cuales habitualmente producen agua al final de la respiración. Así aumentan la
actividad de agua de su propio medio ambiente creciendo más la posibilidad de más microorganismos.
El almacenamiento de fruta y hortalizas frescas requiere de sumo cuidado en cuanto a la humedad
relativa. Si ésta es excesivamente baja, en algunas hortalizas disminuirá el contenido de agua y se
mustiarán. Si es excesivamente elevada, puede haber condensación y es posible que se de inicio a la
alteración microbiana.
1.6.2.2
Temperatura
A presión atmosférica, puede haber crecimiento microbiano dentro de un intervalo de temperatura
comprendido desde los -8°C hasta los 100°C. La exigencia más importante es que el agua se halle en
estado líquido y por lo tanto disponible para mantener el crecimiento.
Los microorganismos se pueden clasificar según su resistencia a la temperatura en mesófilos, psicrótofos
y termófilos. Los mesófilos, con óptimos de temperatura en torno a 37°C, con frecuencia son de origen
humano o animal e incluyen patógenos bien conocidos como por ejemplo, Salmonella y Staphylococcus.
Entre los organismos capaces de crecer a temperaturas bajas se pueden distinguir dos grupos: los
psicrófilos verdaderos o estrictos que no crecen por encima de 20°C. Los psicrófilos facultativos crecerán
a las mismas temperaturas como los estrictos pero su temperatura de crecimiento óptima y máxima son
más elevadas.
Los termófilos son de poca importancia en la microbiología de alimentos, aunque termófilos esporógenos
como algunos Bacillus y determinadas especies de Clostridium causan problema en un número de casos
limitado.
1.6.2.3
Atmósfera gaseosa
Como ya se explicó, el oxígeno es de vital importancia en el crecimiento de microorganismos ya que
ocupa el 21% de la atmósfera terrestre y es el de más importancia al contacto con los alimentos. Otros
gases como el dióxido de carbono actúa como inhibidor del crecimiento microbiano por lo que se utiliza
en envasado de productos en atmósferas controladas.
Revisión Bibliográfica
13
2 HONGOS Y LEVADURAS
Los hongos conforman el reino Fungi. Aquellos hongos que producen enfermedades en el hombre son
hongos verdaderos o Eumycetes, Todos los hongos que poseen reproducción sexual (estado telemorfo)
se denominan hongos perfectos mientras que los hongos imperfectos son los que no poseen
reproducción sexual o bien se desconoce (estado amorfo).
Los hongos pueden crecer como células aisladas (levaduras) o como filamentos multinucleares (hongos
filamentosos). Algunos hongos patógenos para el hombre son dimórficos, es decir, pueden crecer como
levaduras (habitualmente forma parasitaria) y como hongos filamentosos (forma vegetativa).
Las levaduras son microorganismos cuyas células contienen un núcleo diferenciado (eucariotas), a
diferencia de las bacterias (procariotas). Para producir sus elementos estructurales dependen de fuentes
externas de carbono (heterótrofos), y por tanto no son capaces de realizar la fotosíntesis ni la
quimiosíntesis. Pueden vivir sobre materia orgánica muerta (saprófitos) o como parásitos de vegetales y
animales, entre ellos el hombre.
Dado su carácter eucariota, las células fúngicas se asemejan estructuralmente a las células animales y
vegetales. Poseen varios cromosomas rodeados por una membrana celular que, a diferencia de la
membrana bacteriana, contiene esteroles. La pared celular de los hongos está formada por polisacáridos
cristalinos (quitina) que le dan rigidez y son responsables de su morfología, y también polisacáridos
amorfos (mananos, glucanos)
Una levadura es un hongo unicelular con un único núcleo que se reproduce de forma asexual por
gemación y fisión transversal o por reproducción sexual a través de la formación de esporas. Cada yema
que se separa puede crecer y convertirse en una nueva levadura, y algunas se agrupan para formar
colonias. En general, las levaduras tienen un mayor tamaño al de las bacterias, varían mucho de tamaño,
y suelen ser esféricas u ovoides (de 3 a 10µm de longitud). No tienen flagelos pero poseen la mayoría de
los restantes organelos de los eucariotas.
Muchas levaduras, en determinadas circunstancias y dependiendo de la especie, pueden producir hifas y
seudohifas. Las hifas son unidades estructurales que poseen un diámetro de 3-12 µm y pueden tener
varios centímetros de longitud. Un conjunto de hifas entrelazadas constituyen el micelio, que se hace
macroscópicamente visible como una colonia fúngica. En el micelio se distinguen dos partes: una que
penetra en el medio de cultivo y se extiende por su superficie y es responsable de la nutrición (micelio
vegetativo) y otra que se proyecta siempre vertical a la superficie y contiene las esporas (micelio aéreo o
reproductor).
Las seudohifas se diferencian de las hifas verdaderas porque no tienen septos verdaderos, sino
estrechamientos o constricciones. Las seudohifas son una prolongación de la blastoconidia.
Los hongos se reproducen por esporas, que son estructuras unicelulares de resistencia que contienen
toda la información genética necesaria para el desarrollo completo de un nuevo hongo. Los tipos de
esporas, su tamaño y el modo de esporulación son las características principales para clasificar e
identificar a los hongos. Las esporas pueden reproducirse de forma asexual (por simple diferenciación del
micelio) o de forma sexual (por fusión de dos núcleos haploides con formación de un zigoto sexual).
La forma de reproducción sexual mediante zigosporas, ascosporas, y basidiosporas es la base de la
clasificación de los hongos perfectos en Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes. Los
Deuteronomycetes incluyen todos los hongos en los que se desconoce la reproducción sexual, así como
los estados anamorfos de todos los hongos.
La forma de reproducción asexual se caracteriza por la formación de esporangiosporas en los
Zygomycetes y de esporas externas o conidias en las otras tres clases. Las esporangiosporas se
producen en el interior de una estructura llamada esporangio, por división consecutiva; al llegar la
Revisión Bibliográfica
14
madurez, el esporangio se rompe liberándose las esporas. Las conidias son formas de propagación de
reproducción asexual que nacen de una célula especializada (célula conidiógena), que, a su vez, puede
nacer directamente de una hifa vegetativa o de estructuras diferenciadas (conidióforo).
A continuación se hablará de la levadura en cuestión: su clasificación, requerimientos nutricionales,
macromoléculas básicas, estructura celular, ciclo de vida, entre otros.
2.1
Saccharomyces cerevisiae
2.1.1
Clasificación
La levadura S. cerevisiae se clasifica (según Kreger-van Rij 1987) como sigue:
REINO
Fungi
DIVISIÓN
Eumycota
SUBDIVISIÓN
Ascomycotina
CLASE
Hemiascomycetes
ORDEN
Endomycetales
FAMILIA
Saccharomycetaceae
SUBFAMILIA
Saccharomycetoideae
2.1.2
2.1.2.1
•
Requerimientos nutricionales
Requerimientos de macroelementos
Requerimientos de Carbono
Los azúcares son la principal fuente de carbono y energía donde la levadura es capaz de fermentar la
sacarosa (glucosa y fructuosa), galactosa, manosa y en general hexosas. Por el contrario, no fermenta la
maltosa, lactosa y pentosas.
•
Requerimientos de Nitrógeno
Este elemento constituye el 10% de la materia seca. Las principales fuentes son las sales de amonio
inorgánicas, el acetato de amonio, carbonato, bicarbonato, lactato, sulfato y tartrato de amonio.
Los aminoácidos necesarios para un óptimo crecimiento son la anilina, arginina, asparagina, ácido
aspártico, ácido glutánico, leucina y valina. Aquellos aminoácidos para un crecimiento moderado son la
isoleucina, metionina, fenilalanina, serina y triptófano.
•
Requerimientos de Fósforo
El dihidrógeno potásico de fosfato suministra las necesidades de fósforo en la levadura a partir del anión
monovalente H2PO4-.
•
Requerimientos de Azufre
En cuanto a estas necesidades, el sulfato de amonio, el sulfito y el tiosulfito suple dichos requerimientos.
2.1.2.2
Requerimientos de microelementos
Se encuentran el potasio, magnesio, calcio, zinc, manganeso y el cloro.
Además de los mencionados anteriormente también se incluyen el cobalto, boro, cadmio, cromo, cobre,
yodo, molibdeno, níquel y vanadio como microelementos
Revisión Bibliográfica
2.1.2
15
Inhibidores de crecimiento
Entre los elementos inhibidores se tienen la plata, arsénico, bario, litio, níquel, osmio, plomo, selenio y
telurio.
2.1.3
Factores y condiciones de crecimiento
Entre los principales factores para el desarrollo de la levadura se tienen:
•
•
•
•
•
•
2.1.4
Vitaminas: biotina, pantotenato, tiamina, piridoxina, acido p-aminobenzoico, niacina, ácido fólico,
riboflavina.
Inositol: Esta sustancia es esencial para la división celular.
pH: pH interno debe estar entre 5.8 y 6.3
pH externo entre 3 y 7.
Temperatura: Entre 0ºC y 40°C con un valor óptimo entre los 28ºC y 35°C.
Actividad de Agua: Debe ser mayor a 0.6
Macromoléculas básicas en la S.cerevisiae
En la siguiente tabla se encuentran las principales macromoléculas básicas en la S. cerevisiae , clase y
su función en la misma.
Tabla 6. Macromoléculas esenciales para la S. cerevisiae
MACROMOLÉCULA
CLASE
FUNCIÓN
Compone la mayor parte de las proteínas
Tubulina
proteína
microtubulares citoplasmáticas
Filamentos de actina toman parte en la localización de
Actina
proteína
vesículas en el proceso de gemación
Proteínas ribosomales
r-proteína
Conforman los ribosomas citoplasmáticos
Invertasa
glicoproteína
Constituyente de la membrana celular
Glucógeno
polisacárido
Depósito de sustancias de reserva en la pared celular
Se encuentra en vacuolas y exterior a la membrana
poli y
Polifosfato
celular. Además de su función de reserva ayuda a la
pirofosfato
adición de aminoácidos básicos en la vacuola
Se encuentra en las cicatrices gemales de la pared
Quitina
polisacárido
celular
Manoproteína
proteína
Componente de la pared celular
Ergosterol
lípido
Principal constituyente de las partículas lipídicas
Triglicéridos, fosfolípidos,
Sirven como bloques de construcción de los lípidos de
lípidos
ácidos grasos libres
la membrana
Se sintetiza primero como molécula precursora que se
ácido
MRNA
procesa posttranscripcionalmente para que, finalmente
ribonucléico
se produzcan mRNA traducibles
Cada ribosoma contiene cuatro moléculas de rRNA. La
ácido
RRNA
maduración y síntesis del rRNA es similar al de los
ribunocléico
eucariotas
ácido
Existen aproximadamente 400 genes tRNA y están
TRNA
ribunocléico
distribuidos a lo largo del genoma de la levadura
(Brock, Thomas 1991)
Revisión Bibliográfica
2.1.5
16
Estructura celular
Las levaduras contienen un juego se compartimentos subcelulares típicos de las células eucariotas.
Morfológicamente, (o por lo menos funcionalmente), se definen organelos que incluyen el núcleo,
mitocondria, retículo endoplasmático, aparato de Golgi, vesículas secretorias, y vacuolas. La envoltura
celular consiste de una pared celular rígida separada de la membrana celular por el espacio periplásmico.
No todos los organelos subcelulares son completamente independientes de cada uno, pero si lo son
ciertas estructuras especializadas derivadas de un extenso sistema intramembranoso.
2.1.5.1
Envoltura celular
El arreglo de las estructuras celulares contenidas en la envoltura celular de la levadura se muestra en la
figura 1. La membrana plasmática forma una barrera de difusión para la mayor cantidad de sustancias de
peso molecular bajo entre el citoplasma y el medio de cultivo (o ambiente). Algunas enzimas secretadas
por las levaduras, generalmente glicoproteínas activas en hidrolasa, no alcanzan a penetrar la pared
celular sino que quedan atrapadas entre la membrana plasmática y la pared misma en el llamado espacio
periplásmico. La pared celular está mayormente compuesta de glucano y manoproteína.
Figura 1. Envoltura celular de la levadura
(Zlotnik 1984, Shekman y Novick 1982)
Esquema de la superficie celular de las levaduras. CP, citoplasma; IB, OB, mitades interior y exterior
respectivamente de la membrana plasmática de dos capas; PMP, membrana proteínica periférica; IMP,
membrana proteínica integral; PPE, enzima periplásmica; PP, espacio periplásmico; G, glucano; M,
manoproteína; WOS, superficie fuera de la pared; (=) S-S enlace tioéster; (-) enlace covalente.
2.1.5.2 Membrana plasmática
La membrana plasmática es presentada en la figura 1 de acuerdo al modelo de membrana vigente
(Zlotnik et al. (1984) y Scheman y Novic (1982). Las proteínas intrínsecas a la membrana están
insertadas en una bicapa lipídica que consiste principalmente de fosfolípidos y esteroles. Las proteínas
Revisión Bibliográfica
17
extrínsecas (las cuales interactúan con los lípidos de la membrana y proteínas por fuerzas polares)
cubren parte de la superficie de la bicapa. Las partes carbohidratadas de las glicoproteínas están
orientadas hacia la superficie externa de la membrana.
La composición fosfolipídica de la membrana plasmática es similar al patrón fosfolipídico de un extracto
completo de una levadura en si mientras que el contenido de esteroles parece ser mayor que en las
membranas intracelulares.
2.1.5.3
Pared celular
El glucano y la manoproteína, los constituyentes principales de la pared celular de la S. cerevisiae, son
encontrados en igual cantidad. La quitina se encuentra restringida a la cicatriz gemal y constituye el 4%
de la composición total de la pared celular. El contenido de lípidos varía entre 3% y 9% (ver Rattray et al.,
1975, en resumen y referencias). Se estima que el glucano es el compuesto determinante en la
estructura principal de la pared.
El arreglo preciso de los componentes de la pared celular en la Saccharomyces es desconocido pero se
sabe que la parte externa de la pared consiste de manoproteínas ligadas entre si.
La degradación selectiva con proteasas ha demostrado que las manoproteínas en el lado externo de la
pared determinan la porosidad de la misma.
En la tabla a continuación se relacionan los principales organelos contenidos en el espacio citoplásmico
de la S. cerevisiae.
Tabla 7. Organelos de la S. cerevisiae
ORGANELO
FUNCIONES
Vacuolas
Sistema intermembranoso que incluye el retículo endoplasmático y sirve para
almacenar metabolitos.
Retículo
Su función principal es secretoria (invertasa, fosfatasa acídica) y se
endoplasmático
encuentra en la región de crecimiento de la célula.
Mitocondria
Da la facultad respiratoria a la levadura (crecimiento aeróbico en un recurso
de carbono no fermentable)
Núcleo
Rodeado por una membrana nuclear, mantiene el material genético aislado
de los demás organelos celulares.
(Tuite, Oliver 1991)
2.1.6
Ciclo de vida
La levadura Saccharomyces tiene la capacidad de crecer vegetativamente tanto de forma haploide (n=17
cromosomas) como diploide (2n=34 cromosomas) y muchas cepas industriales poseen constituciones
cromosomales de tipo poliploide. En un ciclo sexual normal las células diploides resultan de la fusión de
dos células haploides de apareamiento opuesto (alfa y a). Las células de tipo alfa se aparean solamente
con células del tipo a y que una célula sea del tipo alfa o a se determina asimismo genéticamente. Sin
embargo, aunque una línea de célula de levaduras permanece ya sea como alfa o a, las células
haploides de la levadura son capaces periódicamente de conmutar su tipo de apareamiento del uno al
otro.
Esta célula diploide ( alfa/a-célula) pierde la capacidad de aparearse y tampoco puede secretar factores
de reproducción o responder a ellos. Pero, en el momento de ocurrencia de la meiosis, cuando las
células son expuestas a condiciones de inanición (por ejemplo déficit en nitrógeno) se forma un
ascomiceto (o célula reproductora de esporas) el cual normalmente contiene cuatro esporas haploides,
dos de las cuales son de apareamiento. Al transferir las esporas a un medio nutritivo se lleva a cabo la
germinación y una rápida fusión dentro del ascomiceto para formar dos células diploides del tipo alfa/a.
Revisión Bibliográfica
18
Los eventos sucedidos en el ciclo celular y los mencionados anteriormente son acompañados por
cambios en la estructura celular los cuales son descritos a continuación.
2.1.6.1 Apareamiento
En este estado, las células haploides han sido acondicionadas por factores de apareamiento. En
respuesta a estos factores, un aumento de la aglutinación de células puede ser observado por
microscopio, normalmente 30-60 minutos después de mezclar células de apareamiento opuesto.
Este aumento en la aglutinación de células, como resultado de la inducción de feromona, requiere de la
presencia de un recurso de carbono y otro de nitrógeno y depende del RNA y la síntesis de proteínas. En
respuesta a un factor de apareamiento, la síntesis de carbohidratos en la pared celular cambia de tal
forma que la rrelación del glucano/manano aumenta. Además, cadenas pequeñas de oligosacáridos se
encuentran más frecuentemente en la pared celular.
Células tratadas con factores de apareamiento se vuelven alargadas y forman una especie de bastones
en donde se acumula quitina, un componente menor de la pared celular
La regulación del proceso de identificación no está bien reconocida. Se ha propuesto que los sitios de
apareamiento, que a su vez parecen ser determinados por los microtúbulos citoplasmáticos, deben
encontrarse en una orientación adecuada entre si. Esto disminuiría notablemente el número de patrones
de apareamiento con agregados y explicaría el porqué el apareamiento entre más de dos células de
4
apareamiento opuesto raramente ocurre (aproximadamente uno por 10 zigoto formados).
2.1.6.2
Meiosis y esporulación
Cuando las alfa/a-células son expuestas a un medio de acetato libre de nitrógeno (medio esporulante),
éstas entran en una etapa de meiosis para formar ascosporas. La citología y el proceso metabólico que
ocurre durante la meiosis (Revisado por Byers, Esposito y Klapholz 1981), es cuando las células son
sometidas a un medio esporulante y completan su ciclo celular para luego entrar a un ciclo meiótico.
En general, los primeros eventos de la meiosis en levaduras son muy similares a los eventos ocurrentes
en otros eucariotas. Antes que las células entren a la profase meiótica, el DNA es replicado en un lapso
de 4 a 10 horas después del cambio de medio.
2.1.6.3 Crecimiento Vegetativo
En un caldo nutritivo, la Saccharomyces crece por gemación. La aparición de un brote en la célula indica
el inicio de un nuevo ciclo de división. Durante el ciclo celular, se da lugar a un incremento en los
componentes celulares, incluyendo la duplicación del material genético. El aumento en la masa y
volumen celular es propio del crecimiento por gemación. La segregación de cromosomas ocurre
mitóticamente dentro de la membrana nuclear la cual permanece intacta. Terminada la etapa de
citoquinesis y con la formación de la barrera de membrana, la separación celular da origen a una célula
joven con todos los componentes y funciones necesarias para la vida vegetativa.
La gemación ocurre sólo en algunas levaduras, pero no en otros eucariotas. La gemación es formada por
un crecimiento o brote localizado en alguna parte de la pared celular.
Revisión Bibliográfica
3.
19
MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA
El modelamiento en la microbiología de alimentos empezó en 1920 con el desarrollo de métodos para
calcular los valores D (tiempo de reducción decimal), z (grados necesario para que la curva atraviese un
ciclo log) que predicen el tiempo de muerte térmica de un microorganismo y c (concentración de
microorganismos) con el fin de asegurar que los alimentos estuvieran libres del riesgo de
envenenamiento por el microorganismo.
Antes del advenimiento de las computadoras personales, los modelos simples eran los más
desarrollados, pero, al ver la importancia de encontrar modelos más avanzados estos equipos fueron
muy utilizados. Para explicar lo anterior, en la investigación clásica, la recolección de datos
representaban gráficos de crecimiento o inactivación para uno o máximo dos factores. Esto se volvió un
problema creciente cuando tres o más factores estaban envueltos y éstos a la vez variaban, situación en
la cual los programas desarrollados por computador facilitaron y facilitan la interrelación de múltiples
factores. Con la ayuda de la estadística se puede estimar los rangos de error lo cual puede informar al
usuario sobre la precisión de la estimación.
El objetivo de la Microbiología Predictiva de alimentos es describir matemáticamente el crecimiento o
inactivación de un microorganismo capaz de deteriorar un alimento (entiéndase por deterioro a los daños
en las características organolépticas, sanitarias y demás que influyan en la inocuidad del mismo) bajo
condiciones específicas del medio ambiente. Estas condiciones del medio incluyen factores intrínsecos
(como por ejemplo pH, actividad de agua) y factores extrínsecos (temperatura, presión atmosférica, entre
otros). Una numerosa lista de factores indudablemente afectan el crecimiento de un microorganismo,
pero, en la mayoría de los alimentos sólo unos pocos ejercen gran parte del control en la inactivación o
crecimiento del mismo. A saber, temperatura, pH, actividad de agua o sal, nitrito de sodio, ácido orgánico
y atmósferas aerobias o anaerobias.
Un modelo matemático es, por consiguiente, un conjunto de suposiciones (posiblemente no explícitas)
algunas de las cuales pueden ser formuladas por ecuaciones (diferenciales). Biológicamente hablando, el
sistema real es extremadamente complejo, por lo que es inevitable incluir simplificaciones en el modelo.
Los modelos utilizados en varias disciplinas como la biotecnología o microbiología de alimentos deben
diferir entre si sólo en las simplificaciones utilizadas para cada uno de ellos.
En síntesis, la microbiología predictiva en alimentos es un campo de estudio que combina elementos de
microbiología, matemáticas y estadística para desarrollar modelos que describan y predigan el
crecimiento o muerte de microorganismos bajo condiciones específicas.
El proceso de modelado consiste en las siguientes etapas:
3.1 Planteamiento
La especificación del problema es la fase previa mas importante en el diseño experimental para la
generación del modelo. El tipo de modelado requerido va a estar determinado por el microorganismo en
cuestión y la clase de problema que causa.
Los factores a considerar en el planeamiento son:
•
•
•
•
Variables independientes y su rango de valores.
Preparación del inóculo: Deben ser inóculos estandarizados
Variables de respuesta: Velocidad de crecimiento o muerte, probabilidad. La variable de
respuesta usualmente se transforma matemáticamente a fin de obtener un mejor ajuste del
modelo a los datos.
Sistema experimental: Los sistemas experimentales utilizados son usualmente líquidos, ya sea
un medio de laboratorio o un sistema modelo de aliemento.
Revisión Bibliográfica
20
3.2 Colección y análisis de datos
Para la cantidad de datos, debe haber más puntos experimentales que parámetros a estimar.
cantidad de datos debe distinguir las fases de crecimiento que están sujetas a estudio.
La
En un cultivo batch, se distinguen las siguientes fases de crecimiento:
•
•
•
Fase exponencial: la célula muestra su mayor velocidad de crecimiento posible.
Fase estacionaria: A medida que la población crece se acumulan metabolitos tóxicos. Cuando la
concentración de estos es suficientemente alta, se produce también muerte y lísis celular. En
esta fase, la velocidad de crecimiento es similar a la de la muerte teniendo en cuenta que se
siguen acumulando toxinas.
Fase de muerte: Es cuando la velocidad de lísis y muerte supera la de crecimiento.
Figura 2. Fases de crecimiento de los microorganismos
fase estacionaria
fase de muerte
fase exponencial
tiempo
fase lag
(Whiting, R.C 1995)
3.3 Descripción matemática
Los modelos pueden ser:
3.3.1
Modelos primarios
Estos modelos describen los cambios ocurridos en el número de microorganismos u otra respuesta
celular a través del tiempo. El modelo puede cuantificar unidades formadoras de colonias por mililitro
(UFC/ml), formación de toxinas, niveles de sustrato, productos metabólicos, o absorbancia o impedancia.
Una ecuación matemática o una función describe el cambio ocurrido a través del tiempo bajo un set de
factores predeterminados. Ejemplos de estos modelos primarios son la tasa de crecimiento exponencial,
la función de Gompertz, la inactivación térmica de primer orden, etc.
Revisión Bibliográfica
3.3.1.1
21
Modelo de Gompertz
El modelo describe el comportamiento de la cantidad de microorganismos bajo diferentes condiciones
físicas o químicas tales como temperatura, pH, actividad de agua,etc. Este modelo permite la predicción
de la vida útil de un producto alimenticio y la detección de las partes críticas de la cadena de producción
y distribución.
En el crecimiento bacteriano por lo general se distingue una fase en donde la tasa de crecimiento
empieza desde cero y luego se acelera hasta alcanzar un valor máximo (µm ) dentro de cierto periodo de
tiempo, dando como resultado la fasa lag (λ). En adición, la curva de crecimiento tiene una fase final en
donde tasa de crecimiento decrece y se hace nuevamente cero.
Como los microorganismos crecen exponencialmente, es usual graficar el logaritmo de la población en
función del tiempo; en donde se distinguen 3 fases de crecimiento descritas por tres parámetros: primero
la tasa máxima de crecimiento, la cual esta dada por la pendiente de la línea tangente al punto de
inflexión de la curva en su fase exponencial, segundo la fase lag que corresponde al punto de corte en el
eje del tiempo de esta recta tangente y como tercero la fase asintótica que es el mayor valor alcanzado
por la curva.
Reparametrización del modelo de Gompertz:
La mayoría de ecuaciones que describen el crecimiento contienen parámetros matemáticos (a,b,c,…) y
no parámetros biológicos (µm , λ, A). Es difícil estimar los valores iniciales de los parámetros si no se tiene
una interpretación biológica. Por tanto, los modelos de crecimiento se reescriben sustituyendo los
parámetros matemáticos por biológicos.
Para la ecuación de Gompertz se tiene que:
y = a * exp [− exp( b − ct ]
Igualando la segunda derivada de la ecuación a cero y despejando, se halla el punto de inflexión ti que
corresponde a:
ti =
b
c
luego la tasa de crecimiento máxima se obtiene mediante la primera derivada de la función de Gompertz
en el punto de inflexión dada por la siguiente ecuación:
µm =
ac
e
A partir de esta última ecuación, se obtiene la ecuación de la recta tangente a la curva y se despeja el
punto de intersección (fase lag) dando como resultado:
λ=
b −1
c
3.3.1.2
Modelo logístico
Al igual que el modelo de Gompertz, el modelo logístico como otros modelos describe el crecimiento
microbiano a través de la ecuación:
Revisión Bibliográfica
y=
22
a
1 + exp( b − ct )
3.3.1.3 Modelo de Richards
y = a[1 + v * exp( k (τ − x)) ]( −1 / v )
3.3.1.4 Modelo Stannard

 l + kx 
y = a 1 + exp  −

p 


3.3.2
(− p )
Modelos secundarios
Dichos modelos son los que describen el comportamiento de los parámetros cinéticos en las diferentes
condiciones de temperatura, pH y actividad de agua, entre otros. Como ejemplo, se tiene la relación de
Arrhenius y el modelo de la raíz cuadrada.
Los modelos primarios y secundarios que se basan en las técnicas de regresión que debe cumplir con los
criterios estándar de:
•
•
•
•
•
•
•
•
Distribuciones normales y varianzas homogéneas
Exactitud de ajuste
Habilidad para predecir combinaciones de factores no testadas
Incorporación de todos los factores relevantes
Poseer un número mínimo de parámetros para que sea fácilmente usable
Especificación del término de error
Parámetros con significado biológico y valores realísticos
Reparametrización para mejorar las propiedades estadísticas.
Mediante los modelos secundarios, se obtiene la relación de las variables de un experimento.
3.3.3
Los modelos terciarios
Son rutinas creadas en un software para computador que reúnen los modelos primarios y secundarios en
un programa amigable para el usuario; dichas aplicaciones permiten calcular los cambios microbiológicos
debidos a una alteración a las condiciones de crecimiento. Entre estos programas se encuentran:
•
Programas de micromodelado de alimentos del Reino Unido: Este software predice el
comportamiento microbiano en medios de laboratorio (crecimiento, supervivencia y muerte) con
un ajuste de Gompertz modificado a diversas condiciones de pH, aw y T. Entre los principales
microorganimos estan la Salmonella, L. monocytogenes, S aureus, Y. enterocolitica, E. coli,
Bacillus cereus, B. subtilis, C. botulinum, Campylobacter jejuni, C. perfringens y a. hydrophila.
•
Programa de modelado de patógenos de USDA: El programa modela el crecimiento de
Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, E. coli, Listeria manocytogenes, Salmonella, Shigella
flexneri, Staphylococcus aureus y Yersinia enterocolitica, la producción de toxinas para C.
botulinum y la inactivación térmica para E. coli.
Revisión Bibliográfica
23
3.4 Validación de los modelos
El verdadero valor de un modelo radica en cuán bien pueda predecir la respuesta microbiana en
situaciones distintas a las que fueron testadas para su planteo.
Después de una colección de un número apropiado de curvas y plantear los modelos primarios y/o
secundarios trabajados, se puede validar el modelo en medios de cultivo o en alimentos, con el objeto de
contrastar la predicción del modelo con los resultados y evaluar su “bondad del ajuste”.
Con la validación se puede comparar la conducta microbiana predictiva en los medios de cultivo con el
comportamiento en alimentos mediante ensayos de inoculación. Dicha etapa indicará las limitaciones del
modelo y, si las predicciones son pobres, y la necesidad de considerar factores adicionales o una
reparametrización del modelo.
Con dichos modelos, se pretende una minimización o inhibición del crecimiento y no una optimización
como sucede en el área biotecnológica.
En general, los modelos utilizados en microbiología predictiva son empíricos y semi-empíricos y se
basan en regresiones lineales o no lineales. Se utilizan algoritmos de mínimos cuadrados y deben
verificarse, al igual que para cualquier aplicación estadística de la regresión.
El tipo de modelado requerido va a estar determinado por el microorganismo en consideración y la clase
de problema que causa. Principalmente los factores a considerar son las variables independientes y su
rango de valores, en donde el rango de valores debe abarcar todo el intervalo esperado a encontrar en el
producto.
En microbiología de alimentos, interesa predecir la fase lag y la exponencial. La estacionaria no es de
interés ya que el grado de deterioro del alimento es generalmente alto.
A continuación se presentan diferentes causas por las cuales estos modelos son de suma importancia y
que a la vez marcan la diferencia con los modelos utilizados en la biotecnología e ingeniería química:
•
•
•
•
Se pretende una minimización o inhibición del crecimiento del microorganismo en cuestión (que
para el caso es la levadura Saccharomyces cerevisiae) y no una optimización o reproducción del
mismo como en biotecnología.
Las concentraciones microbianas de interés son mucho más bajas que las consideradas en
biotecnología (alrededor de 10^6 – 10^7 células/ml.). Este es un factor de suma importancia ya
que se debe resaltar que algunos métodos validados a altas concentraciones (turbidimetría,
conductimetría, etc.) no pueden aplicarse sin establecer una curva de calibración.
La cinética de la fase lag es importante, mientras que en un bioreactor no es tan importante (tanto
la fase lag como las demás están descritas en la revisión bibliográfica). Los modelos en cuestión
van encaminados a predecir la fase lag y la exponencial más no la estacionaria ya que en esta
fase el grado de deterioro del alimento es generalmente alto.
La transición de la fase exponencial a la estacionaria, no interesa en este caso ya que
generalmente no hay limitación de sustrato a menos que el alimento ya se encuentre deteriorado.
Se debe resaltar las aplicaciones de estos modelos como una herramienta útil para obtener una
estimación inicial del comportamiento de los microorganismos:
•
•
En cuanto a la predicción de la seguridad microbiana, permiten estimar el riesgo de crecimiento o
supervivencia del microorganismo después de un periodo de almacenamiento normal o en
condiciones de abuso. Ayudan a establecer fechas de vencimiento del producto.
En el control de calidad colaboran en la implementación del sistema HACCP, mostrando
condiciones ambientales que permiten el crecimiento o supervivencia y el rango aceptable de los
mismos, sugiriendo además valores límites críticos. Permiten evaluar las consecuencias cuando
un punto crítico se sale de control y los nuevos peligros potenciales.
Revisión Bibliográfica
•
•
•
•
24
Para el desarrollo de un nuevo producto dan la posibilidad de evaluar las consecuencias
microbiológicas de cambios en la composición de los productos y procesos y comparar
formulaciones nuevas y anteriores.
En el área de la educación ayudan a explicar la conducta microbiológica tanto a personal técnico
como estudiantes universitarios encaminado hacia la importancia del control de los procesos
críticos del proceso.
En el análisis de datos y tareas de laboratorio permiten planear tiempos de muestreo de
productos y la necesidad o no de la realización de ensayos extensivos de laboratorio.
Para la evaluación de riesgos, estos modelos permiten evaluar la probabilidad de que un
alimento cause enfermedad (por patogenicidad o por deterioro).
CAPÍTULO 2
MATERIALES Y MÉTODOS
1 MATERIALES Y EQUIPOS
En este capítulo se consideraran todos los materiales y equipos utilizados en las pruebas experimentales
microbiológicas y fisicoquímicas concernientes al proyecto, las cuales fueron realizadas en su totalidad en
los laboratorios de Investigación y Microbiología de la Facultad de Ingeniería de la Universidad de la
Sabana.
1.1
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
1.2
•
•
•
Ensayos microbiológicos
Autoclave Electric Pressure Steam (25X)
Balanza Digital Mettler PM4800 (+/- 0.001g)
Cabina de Flujo Laminar. Mod:Cae.et 30” x 36” x 6”
Cámara de conteo Improvet Neubauer (Deep 1/10 mm). Boeco
Estufa Cerna Schott
Incubadora Binder WTB (0-90ºC)
Microscopio de luz con contraste de fase Zeiss 450711. Objetivos (10x, 20x, 40x, 100x)
Nevera Whirpool E.T18MRXDWOG
Potenciómetro Schott Duran, precisión (+/- 0.01)
Refractómetro Polskie No. 96534. Precisión (+/- 0.001) entre (1.3 – 1.7)
Mecheros Bunsen de gas y de alcohol
Canastas de destilación plásticas Nalgene
Erlenmeyers Schott Duran de 250, 500 y 1000ml
Probeta graduada de plástico Kartell ISO6706 de 1000ml
Probeta graduada de vidrio Silber Brand de 25ml
Pipetas Brand 1, 5, 10ml
Termómetro Silber Brand (10-50ºC). Precisión (+/- 1ºC)
Tubos de ensayo de tapa rosca 10x150 Pyrex
Tubos de ensayo 20x180 Pyrex
Vaso de Precipitado Plástico de 2000ml. Kartell ISO7056
Ensayos fisicoquímicos
Espectrofotómetro Varian; mod: Cary100 con celdas de 10mm (rect open Sil). Precisión (+/- 0.0001)
Novasina. Acitividad de agua; mod:TH200. Precisión (+/- 0.001)
Equipo de destilación fraccionada. Columna de rectificación; matraz de fondo plano con boca
esmerilada de 250ml, trampa, destilador y agarradera.
25
Materiales y Métodos
2.
26
DISEÑO EXPERIMENTAL
ENSAYOS PRELIMINARES
Preparación caldo
nutritivo
Estandarización activación
de la levadura
Mezclar 10g/l de extracto de levadura
con 150g/l de azúcar en agua destilada
Activar 10% (p/v) de levadura
en una solución azucarada al 5% a 30ºC
Acidular hasta obtener pH=5.6 con ácido
tartarico y cítrico al 30% y 70% respectivamente
Diluir levadura activa
Conteo de microorganismos en cámara
de conteo previo ajuste de la dilución
Elección longitud de onda con el
espectrofotómetro para determinar el O.D.
Inoculación
Medio agitado
Medio sin agitación
Registro del índice de refracción y densidad óptica con
una frecuencia igual a una hora a partir de la hora 23 hasta la 51
7 veces
Materiales y Métodos
27
Curva de calibración
Preparacion del inóculo
Preparación caldo nutritivo
Inocular
Incubar a 25ºC durante 96 horas
2 veces
Registrar conteo por cámara, N.M.P y densidad óptica
para 3 cultivos por duplicado desde la hora 30 hasta la 95
MODELO PRIMARIO
2 veces
Ensayos actividad de agua
Adicionar azúcar
al 60% (p/v)
Adicionar azúcar
al 15% (p/v)
aw=0.937
aw=0.957
Adicionar azúcar
al 9% (p/v)
Adicionar azúcar
al 5% (p/v)
aw=0.965
aw=0.995
Acidificar a pH=3.0, 4.0, 5.0, 5.6 y 6.0
2 veces
Incubar a T=7ºC, 20ºC, 25ºC, 30ºC y 35ºC
Ajustar mediante regresión los valores de O.D y tiempo de
cada una de las condiciones a la función de Gompertz
Hallar los parámetros cinéticos para cada
una de las condiciones experimentadas
Diseño Factorial
4
fraccionado 4
Activación e
inoculación de
la levadura
Materiales y Métodos
28
MODELO SECUNDARIO
Mediante la técnica Backwards hallar
la ecuación que relacione pH, T, y a w con los
parámetros de Gompertz con un nivel de significancia del 10%
MODELO TERCIARIO
Simular dentro de los
intervalos experimentados
3. METODOLOGÍA
3.1
Ensayos preliminares
Los ensayos preliminares tienen como objeto:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
3.1.1
Determinar el sustrato (medio líquido) para el crecimiento de la levadura Saccharomyces
cerevisiae que permita la elaboración de los modelos primarios y secundarios.
Establecer el tratamiento para el control de la flora no deseada.
Elegir la longitud de onda adecuada para la determinación a la densidad óptica de medición.
Evaluar el crecimiento de S. cerevisiae y determinar la frecuencia del muestreo.
Estandarizar el proceso de activación e inoculación de la levadura.
Mediante ensayos de varios cultivos en paralelo, determinar el efecto de la agitación en el
crecimiento del microorganismo.
Ejecutar diversos ensayos para elegir los valores de actividad agua a los cuales se trabajará
tanto en los modelos primarios como en los secundarios.
Definir si la toma de datos se debe hacer por duplicado o triplicado en el proceso experimental.
Obtener una curva de calibración que relacione la densidad óptica con la concentración de
microorganismos.
Determinación del sustrato deseado (medio líquido)
La selección del sustrato, la actividad de agua y el pH se basa esencialmente en la composición de
productos alimenticios que son de preferencia de la levadura; tales como jugos, mermeladas, compotas y
también de acuerdo con los requerimientos nutricionales de la S. cerevisiae.
Según las normas técnicas, la cantidad de azúcares presentes en un jugo se debe encontrar no menor a
un 9% en promedio para diferentes jugos (piña, toronja, mandarina, naranja, entre otros). Para la
formulación del caldo se tendrá en cuenta los porcentajes de azúcares para jugos y frutas.
Materiales y Métodos
29
Tabla 8. Porcentaje de carbohidratos para frutas
Fruta
%Carbohidratos
Uva
8.1
Mora
13.5
Fresa
6.9
Curuba
6.3
Guanábana
13
Naranja
9
Mandarina
9.5
(Ospina, 1996)
Tabla 9. Porcentaje mínimo sólidos solubles totales a 20ºC para jugos de frutas
Jugo
Sólidos solubles totales
Naranja
9.0
Limón
6.0
Mandarina
9.0
Toronja
10
Piña
10.5
(Icontec No. 404 (segunda revisión))
Para los demás requerimientos, se suministra extracto de levadura el cual cumple con las necesidades de
nitrógeno, vitaminas y aminoácidos para promover el crecimiento de la S. cerevisiae, entre otros.
Por tanto, el caldo a utilizar esta compuesto por:
150 g/l de sacarosa
10 g/l de extracto de levadura granulado. Merck. KGaA. I.03753
Agua destilada
3.1.1.1
Preparación del medio de cultivo
Para la preparación del medio, se pesan los sustratos (sacarosa y extracto de levadura) de acuerdo con
la formulación previamente mencionada y se adicionan a una probeta de un litro, para luego completar
con agua destilada hasta 1000ml en volumen. Una vez hecho esto, se agita la mezcla hasta obtener una
solución homogénea la cual se acidifica con ácido cítrico y ácido tartárico al 30% y 70% respectivamente
hasta obtener un pH de 5.6. La solución debe luego ser esterilizada en el autoclave durante 15 minutos a
una presión entre 15 y 20psi.
3.1.2
Control de flora no deseada
El medio esta limitado bajo unas condiciones de pH de 5,6 que permiten el crecimiento de las levaduras e
inhiben la mayor parte del crecimiento de bacterias no fermentadoras. De igual forma, éste valor de pH
así como la concentración de sacarosa a incluir en el sustrato, permiten realizar un proceso de
esterilización del mismo (calor húmedo en el autoclave) sin que se presenten reacciones de
pardeamiento enzimático (Maillard) que impidan utilizar el método basado en la turbidimetría o inhiban el
crecimiento bacteriano.
La máxima cantidad de microorganismos permitida para los jugos de frutas (sustrato de mayor interés)
esta dado por la siguiente tabla:
Materiales y Métodos
Tabla 10. Normas técnicas para jugos de fruta
Recuento bacterias aerobias/g
Coliformes N.M.P/g
E. coli/g
Hongos y Levaduras/g
Bacterias termófilas/g
30
3
máx. 10
23
Ausente
máx. 10
5
(Icontec No. 404 (segunda revisión))
3.1.3
Elección de la longitud de onda
Con ayuda del espectrofotómetro se debe hacer un barrido espectral al medio de cultivo para determinar
la longitud de onda a utilizar. Esta debe ser la adecuada, es decir, una que permita obtener un mayor
intervalo de muestras en un rango de absorbancia tolerable por el equipo, o sea, verdaderas.
3.1.4
Determinación de la frecuencia de muestreo
Con la técnica de conteo por cámara y densidad óptica, se recopilan los datos de crecimiento de la
levadura para obtener un pronóstico de la replicación de la célula y estimar la frecuencia a la cual se
deben tomar las muestras.
3.1.5
Estandarización de los procesos de activación e inoculación
Mediante numerosas repeticiones del proceso de activación e inoculación de la levadura, se busca
estandarizar dichos procesos para obtener muestras reproducibles en las diversas replicas del
experimento. Con la técnica de Conteo en Cámara se ejecutan diversos ensayos para obtener una
-4
cantidad de microorganismos presentes en la dilución de 10 lev/ml (dilución apropiada de conteo en
cámara) de la muestra original de levadura.
3.1.5.1
Activación de la levadura
La levadura a utilizar es levadura seca y semiactiva (S. cerevisiae) producida por Levapan. Para su
activación se debe preparar una solución esterilizada de azúcar al 5% y levadura al 10% y calentar a
30ºC durante 20 minutos.
Ficha Técnica levadura
Levadura Activa Seca (Saccharomyces cerevisiae)
Peso Neto 130g
Reg. Sanitario RSIAV09M14687-LSFIV90M00285
Producido por Compañía Nacional de levadura Levapan S.A.
3.1.5.2
Dilución del inóculo
Se debe diluir la muestra con una solución salina al 1% y esterilizada y reducir la concentración original
mediante la técnica de dilución seriada
3.1.5.3
Cuantificación de la cantidad inicial de células en la muestra de levadura activa
Para determinar la cantidad de microorganismos presentes en la muestra de levadura activa se debe,
mediante la técnica de dilución seriada, buscar la dilución que permita una concentración adecuada para
una mayor facilidad del conteo en cámara.
Materiales y Métodos
31
-4
Una vez elegida la dilución que corresponde a 10 de la muestra original, se hacen diversos ensayos de
activación, dilución y conteo y así obtener un valor acertado de la cantidad de células por mililitro
presentes en la muestra original; que es igual a:
#Células/ml = (Concentración de células en la dilución)x(Factor de Dilución)
Donde:
4
•
Factor de Dilución = 10
•
2.07 x105 1000 mm3 1
Concentración _ células =
x
x
≈ 4lev / ml
0.1mm3
500ml 10 6
La cámara tiene una profundidad de 0.1mm y esta compuesta de 400 cuadros de 0.05mm de lado
organizados en grupos de 16. Luego el volumen total de la cámara es:
2
Volumen Cámara = (400 cuadros)(0.05mm) x(0.1mm) = 0.1mm
3.1.5.4
3
Inoculación
El proceso se realiza con la mayor inocuidad posible en donde se extrae la levadura de la dilución y se
vierte sobre el medio de cultivo esterilizado.
3.1.6
Lectura de muestras
Las muestras se someten a análisis de índice de refracción (corregida a una temperatura de 20ºC),
conteo en cámara y densidad óptica.
3.1.7
Destilación
Se somete el medio de cultivo a destilación para extraer el etanol producido por la levadura debido a la
conversión de azucares en etanol y dióxido de de carbono; cuya cantidad se procede a medir con el
alcoholímetro.
3.2 Curva de calibración
Para agilizar la técnica de conteo de microorganismos; con base a los métodos de N.M.P y conteo en
cámara se requiere diseñar una curva de calibración que busca lo siguiente:
•
•
•
3.2.1
Una relación entre la densidad óptica y el número de microorganismos presentes en el medio de
cultivo.
Agilizar el conteo de microorganismos para los ensayos primarios y secundarios.
Determinar si el método es reproducible.
Inoculación
Se inocula la dilución de la levadura activa (que ya se ha estandarizado) en los medios de cultivo
ejecutando la prueba por duplicado para probar la reproducibilidad del experimento.
En la pareja de cultivos (cultivo a y b) se deben evaluar los siguientes intervalos de tiempo después de la
hora cero (hora de inoculación):
Materiales y Métodos
32
Tabla 11. Cultivos y asignación de horas para toma de muestras
Cultivos
Rango en Horas
Rango en Horas
Rango en Horas
a
b
1 y1
30 – 38
54 – 62
78 – 86
b
2ª y 2
24 – 32
48 – 56
72 – 80
b
3ª y 3
39 – 47
63 – 71
87 – 95
Dichos intervalos cubren la mayor densidad de puntos en la fase exponencial para la curva de
calibración.
3.2.2
Incubación
Los medios de cultivo después de inoculados se dejan en una incubadora a 25ºC hasta alcanzar la fase
estacionaria.
3.2.3
Lectura de muestras
Una vez el medio es inoculado e incubado, se debe hacer un seguimiento y extraer en los intervalos de
tiempo establecidos las muestras y someterlas a medición de absorbancia y a las técnicas de N.M.P y
conteo por cámara
3.3
Modelos primarios
Los modelos primarios se desarrollan combinando las tres variables (pH, T y aw) que se están
experimentando dentro de los rangos tolerables por la levadura con el objeto de obtener los parámetros
cinéticos de cada condición trabajada.
Con los modelos primarios se busca:
•
•
•
•
•
3.3.1
Encontrar una ecuación de crecimiento para cada una de las condiciones, que se ajuste a los
valores experimentales.
Elegir los valores de pH, aw y temperatura a experimentar.
Observar los efectos en el crecimiento de la S. cerivisiae al cambiar una de las tres variables que
se están trabajando.
Hallar los parámetros cinéticos de cada curva de crecimiento.
Determinar la variable que más incide en el crecimiento de la levadura.
Elección del pH
La literatura considera que la levadura crece a un rango de pH entre 3 y 7; por tanto se escoge un pH
inicial de 3 ya que es un valor al que se encuentran las frutas consideradas cítricas; 4 y 5 son valores de
pH para la mayoría de las frutas, 5.6 es el valor óptimo y 6 corresponde al valor límite en donde son muy
pocos los productos que sobrepasen este valor.
3.3.2
Ensayos de actividad de agua
La actividad de agua es una variable importante para el crecimiento de la levadura; por tanto se deben
preparar varios medios de cultivo a distintas cantidades de azúcar con el propósito de evaluar la cantidad
de agua disponible por el microorganismo.
Estableciendo como referencia productos tales como jugos, mermeladas y salsa de tomate se
seleccionan los siguientes valores de actividad de agua: 0.937 por ser el menor valor obtenido a causa
Materiales y Métodos
33
de la saturación del medio, 0.957 y 0.965 por ser valores intermedios y 0.995 que correspondiente a la
mayoría de jugos
3.3.3
Incubación
Para la incubación, se escogen 4 temperaturas: la primera es 7°C que representa la temperatura
promedio a la que se refrigeran los alimentos; como segundo y tercero los valores de 15ºC y 25°C que
representan las temperaturas ambiente promedio y la última es 35°C que evalúa la situación más cálida.
Los intervalos de 15ºC a 35ºC son regulares, mientras que de 7ºC a 15ºC queda un vacío debido a la
limitación instrumental, esto se debe básicamente a que no se cuenta con un equipo que permita
mantener constante la temperatura cuando aumenta o disminuye la temperatura ambiente.
3.3.4
Experimentos factoriales
En un experimento factorial se investigan simultáneamente los efectos de cierto número de diferentes
factores. Los tratamientos constan de todas las combinaciones que puedan formarse de los distintos
factores. Un experimento factorial proporciona por sí mismo una prueba para la suposición de
independencia; si esta resulta significativa, la suposición de independencia es rechazada por los datos.
La experimentación factorial puede darse cuando los factores son dependientes o independientes.
3.3.4.1 Experimentación factorial con factores independientes
Las ventajas de esta experimentación depende naturalmente de la finalidad del experimento. El objeto es
obtener un cuadro amplio del efecto de los factores, más bien que encontrar por ejemplo la combinación
de los factores que dan una respuesta máxima. Cuando los factores son independientes todos los efectos
simples de un factor son iguales a su efecto principal; en un experimento factorial cada efecto principal se
estima con la misma precisión que si todo el experimento se hubiese dedicado a ese solo factor.
3.3.4.2 Experimentación factorial con factores dependientes
Cuando los factores no son independientes, los efectos simples de un factor varían de acuerdo con la
combinación particular de los otros factores con los cuales estos se producen.
La experimentación factorial es adecuada en los siguientes casos:
•
•
•
En trabajos de exploración donde el objeto es determinar rápidamente los efectos de cada uno de
cierto número de factores dentro de un intervalo específico.
En investigaciones de las interacciones entre los efectos de varios factores. Por su naturaleza,
las interacciones no se pueden estudiar sin probar algunas de las combinaciones que se forman
de los diferentes factores. Frecuentemente la información se obtiene mejor probando todas las
combinaciones.
En experimentos diseñados para poder llegar a recomendaciones que deben aplicarse a una
gran variedad de condiciones. Se pueden introducir factores auxiliares en un experimento para
probar los factores principales bajo una variedad de condiciones similares a las encontradas en la
población a la cual se van aplicar dichas recomendaciones.
Cuando los factores que se van a investigar son numerosos, la principal desventaja del experimento
factorial estriba en su tamaño y complejidad. La magnitud de la tarea puede reducirse teniendo
únicamente una sola repetición; hasta es posible obtener casi toda la información deseada probando una
fracción (por ejemplo, la mitad o un cuarto) del número total de combinaciones de tratamientos, aún
cuando esto se haga con ciertos riesgos. Las dificultades que surgen de los experimentos grandes no
Materiales y Métodos
34
deben ser consideradas como una crítica del método factorial, cuya eficiencia es mayor cuando los
factores son numerosos.
3.3.4.3
Experimentos factoriales en repetición fraccionada
Frecuentemente aun una sola repetición de un experimento factorial va más allá de los recursos del
investigador, o da más precisión de la necesaria en las estimaciones de los efectos principales. En una
6
sola repetición de un experimento factorial 2 , cada efecto principal es el promedio de 32 combinaciones
de los otros factores, y por lo tanto su efecto se repite 32 veces. Posiblemente, una repetición de 4 a 8
veces sería suficiente. En situaciones como esta vale la pena considerar un experimento que consista en
sólo una parte de una repetición completa.
El principal atractivo del diseño experimental fraccionado estriba en que permite incluir simultáneamente
5 o más factores en un experimento de tamaño práctico, de tal manera que el investigador puede
determinar rápidamente cuales factores tienen un efecto importante sobre el resultado. En especial se
desarrollo el siguiente diseño factorial:
•
¼ de un factorial de 3 factores a 4 niveles
La elaboración del modelo primario implica el uso de 3 factores (pH, aw y T) a 4 niveles cada uno, lo cual
daría 64 diferentes combinaciones de crecimiento; de los cuales se ha decidido tomar un cuarto
(suficiente para obtener una superficie de respuesta) de estas combinaciones y 12 cultivos adicionales
desarrollándolo de la siguiente manera:
Tabla 12. Diseño del modelo primario
Cultivo
pH
Actividad de Agua
1
4.0
0.957
2
4.0
0.957
3
4.0
0.937
4
4.0
0.995
5
4.0
0.965
6
5.0
0.957
7
5.0
0.937
8
5.0
0.995
9
5.0
0.965
10
5.0
0.957
11
5.0
0.957
12
5.6
0.995
13
5.6
0.965
14
5.6
0.937
15
5.6
0.957
16
5.6
0.957
17
5.6
0.957
18
5.6
0.957
19
5.6
0.995
20
5.6
0.937
21
6.0
0.957
22
6.0
0.965
23
6.0
0.937
24
6.0
0.995
25
3.0
0.957
26
4.0
0.995
27
6.0
0.937
28
5.6
0.952
Temperatura (ºC)
20
25
25
30
35
25
20
25
30
35
20
25
25
25
7
20
30
35
20
35
25
20
30
35
25
20
20
25
Materiales y Métodos
3.3.5
35
Lectura de muestras
La mayor toma de muestras se realiza durante la fase exponencial de crecimiento para cada uno de los
cultivos y se evalúa el cambio de la densidad óptica durante el tiempo.
3.4
Modelo secundario
El modelo secundario busca:
•
•
•
•
•
Obtener una función que relacionen las tres variables de T, aw y pH con cada uno de los
parámetros a, b y c de la ecuación de Gompertz.
Observar como incide el crecimiento de la levadura con la interacción de las tres variables
seleccionadas.
Una vez obtenida las ecuaciones del modelo secundario, hacer simulaciones del crecimiento de
la levadura entre valores intermedios, que pertenezcan a los rangos de pH, aw y T
experimentados.
Obtener una función que relacione los parámetros de cinéticos con la T, aw y pH.
Hallar las condiciones críticas a las cuales se reproduce la levadura.
Después de haber obtenido las curvas de crecimiento para las distintas combinaciones de pH,
temperatura y actividad de agua se halla una ecuación ya sea de segundo o tercer orden que relacione
las variables trabajadas y permita obtener los parámetros de la curva de crecimiento para la S. cerevisiae.
Para el ajuste de las ecuaciones, se decide utilizar el tratamiento secuencial de ajuste Backwards con un
nivel de significancia del 10%.
3.5 Modelo Terciario
El modelo terciario pretende:
•
•
Evaluar condiciones no experimentadas.
Modelar el crecimiento de la levadura dentro de los intervalos de las condiciones experimentadas.
Con la hoja de cálculo Excel se pretende mostrar tubularmente y gráficamente los valores de la
concentración de levaduras en función del tiempo a las condiciones digitas por el usuario dentro de los
rangos experimentados en este proyecto.
CAPÍTULO 3
ANÁLISIS Y RESULTADOS
1. ENSAYOS PRELIMINARES
Los ensayos preliminares determinaron, que el efecto de la agitación no tuvo mayor significancia en el
crecimiento de la levadura de acuerdo con los cambios de pH, índice de refracción y absorbancia
registrados.
Tabla 13. Resultados de pH, índice de refracción (corregido a 20ºC) y absorbancia para cultivos agitados
y en reposo
pH
Tiempo
(Horas)
0,0
1,0
3,0
4,5
23,0
24,0
25,0
27,0
28,0
29,0
45,5
46,5
47,5
48,5
51,0
Agitado
5,67
5,59
5,45
5,31
4,57
4,55
4,53
4,48
4,45
4,44
4,45
4,43
4,43
4,44
4,46
Sin Agitación
5,60
5,60
5,44
5,33
4,55
4,55
4,52
4,45
4,43
4,43
4,44
4,43
4,42
4,43
4,43
Indice de Refracción
Agitado
1,358
1,359
1,359
1,359
1,355
1,353
1,352
1,348
1,347
1,348
1,345
1,343
1,343
1,341
1,342
Sin Agitación
1,357
1,358
1,359
1,359
1,353
1,352
1,348
1,349
1,349
1,349
1,344
1,343
1,343
1,340
1,342
O.D (600 n.m)
Agitado
2,716
2,727
2,756
2,794
3,652
3,745
3,876
3,876
3,888
3,902
4,373
4,413
4,412
4,458
4,464
Sin Agitación
2,797
2,742
2,743
2,791
3,700
3,683
3,816
3,875
3,889
3,889
4,414
4,371
4,458
4,458
4,399
(Ver gráficas 15 – 20, Anexo A)
Los valores el pH en función del tiempo disminuye hasta estabilizarse a partir de la hora 28 en 4.43 y
4.45 para ambos cultivos. Es importante notar que el tiempo en que logra estabilizarse el pH depende de
la cantidad de inóculo que se este trabajando, cuya cantidad es inversamente proporcional al tiempo.
El índice de refracción y sus valores fluctúan pero al igual que el pH, su valor disminuye a medida que
aumenta el tiempo. El consumo de azucares por la levadura es lo que conlleva a una disminución del
índice de refracción en el medio.
Realizando la prueba F (con un 95% de confianza) para el análisis de varianza de las dos muestras se
obtiene:
36
Análisis y Resultados
37
Tabla 14. Análisis de varianza del pH para cultivos agitados y en reposo
Origen de
Suma de
Grados
Promedio de
F
Probabilidad Valor crítico
las variaciones
cuadrados de libertad los cuadrados
para F
Tiempo
Tratamiento
Error
6.402166667
0.001333333
0.002966667
14
1
14
Total
6.406466667
29
0.457297619 2158.034 7.8279E-21
0.001333333
6.292
0.02505596
0.000211905
2.484
4.600
El valor de F para los dos tratamientos es mayor al valor crítico, y por tanto estadísticamente la variación
entre agitación y el estado en reposo es significativa. Sin embargo considerando el aspecto biológico,
una variación del pH entre los dos tratamientos de (+/-) 0.03 con un error de exactitud de (+/-) 0.01 no
representa una diferencia para determinar el efecto de agitación en los cultivos de levaduras.
Tabla 15. Análisis de varianza del índice de refracción para cultivos agitados y en reposo
Origen de
Suma de
Grados
Promedio de
F
Probabilidad Valor crítico
las variaciones cuadrados
de libertad
los cuadrados
para F
Tiempo
0.0012072
14
8.62286E-05
87.058 3.93672E-11
2.484
Tratamiento
1.63333E-06
1
1.63333E-06
1.649 0.219934745
4.600
Error
1.38667E-05
14
9.90476E-07
Total
0.0012227
29
En análisis de la varianza reporta que en el índice de refracción no es significativo entre cultivos agitados
y sin agitación.
Tabla 16. Análisis
Origen de
las variaciones
Tiempo
Tratamiento
Error
de varianza de la densidad óptica para cultivos agitados y en reposo
Suma de
Grados
Promedio de
F
Probabilidad Valor crítico
cuadrados de libertad los cuadrados
para F
12.5327702
14
0.89519787 941.591 2.5813E-18
2.484
2.43E-05
1
2.43E-05
0.026 0.87526489
4.600
0.0133102
14
0.00095073
Total
12.5461047
29
No hay diferencia en la densidad óptica que es el factor más importante entre los dos tratamientos, al ser
el valor de F menor al crítico.
Para todos los tratamientos se observa claramente en el análisis de varianza como cambia respecto al
tiempo el pH, índice de refracción y la densidad óptica.
La densidad óptica aumenta a medida que la cantidad de microorganismos incrementa; el medio resulta
cada vez más turbio haciendo por ende aumentar la absorbancia del medio, hasta obtener un valor
máximo de 4.464
En los ensayos de densidad óptica, se percato que la absorbancia inicial corresponde un valor de 2.7
para una longitud de onda de 600nm lo que indica que la cantidad de microorganismos inoculada en los
ensayos es sumamente elevada, obteniendo grandes valores en el conteo y por consecuencia se debe
someter el inóculo a una dilución para obtener una menor turbiedad en el medio. Además se debe tener
claridad que en microbiología predictiva, lo que interesa modelas es la fase de latencia, aceleración y
logarítmica a partir de muy bajas concentraciones microbianas iniciales.
Análisis y Resultados
38
Luego la cantidad adecuada a inocular se determina y se estandariza con base a los siguientes
resultados:
Tabla 17. Ensayos de Conteo en cámara de la dilución 10
5
Ensayo
Numero de Células (10 )
1
2.50
2
1.66
3
2.33
4
1.66
5
4.00
6
3.12
7
1.80
-4
La media de los valores es igual a:
x = 2.43 x10 5
Su desviación estándar es:
s = 0.86
Para un intervalo de confianza del 90% se tiene que:
1 − α = 0.9
luego
α = 0.05
2
Luego t = 1.943 (Función de distribución t de Student) con 6 grados de libertad
Límite Inferior
 0.86 
Li = 2.43 − 1.943

 7 
Li = 1.80 x10 5
Limite Superior
 0.86 
Li = 2.43 + 1.943

 7 
Li = 3.06 x10 5
-4
5
5
Por tanto la cantidad de células presentes en la dilución 10 esta entre (1.80x10 , 3.06x10 ) células por
mililitro con un intervalo de confianza del 90%
-6
A partir de estos ensayos se escoge diluir el inóculo 10 veces, que al ser inoculada en un medio de
500ml proporciona una concentración no mayor a 7 levaduras por mililitro. Esta baja concentración de
inoculo permite llevar un seguimiento al crecimiento de la levadura en el caldo nutritivo.
Análisis y Resultados
39
Grafica 1. Absorbancia en función de la longitud de onda para el caldo inoculado y sin inóculo
Barrido Espectral
12,00000
Absorbancia
10,00000
8,00000
6,00000
4,00000
2,00000
0,00000
200
300
400
500
600
700
800
900
Longitud de onda
medio
medio inoculado
Las gráficas no poseen ningún valor crítico (máximo o mínimo). La gráfica del medio sin inóculo se
comporta asintóticamente con la ordenada mientras que la del medio inoculado tiende a 2 a medida que
aumenta la longitud de onda. Luego la diferencia de absorbancia entre las dos gráficas corresponde a
las células presentes en el sustrato. Si se elige una longitud de onda de 600nm y una concentración de
células no mayor a 7 lev/ml para el sustrato trabajado, la transmitancia del medio es prácticamente del
100% y los cambios de absorbancia se deben sólo al aumento de la masa celular.
2. CURVA DE CALIBRACIÓN
2.1
Resultado con la técnica de N.M.P
Tabla 18. N.M.P. en función de la absorbancia a una longitud de onda de 600nm
O.D.
N.M.P
O.D.
N.M.P
4,60E+06
0,0145
3,6
0,3277
4,60E+06
0,0145
910
0,3805
0,0166
43
0,4189
1,50E+06
0,0192
93
0,5028
4,30E+06
0,0413
2,40E+04
0,5185
1,20E+06
0,0563
2,70E+04
0,6537
9,30E+06
0,0635
9,30E+04
1,4055
3,60E+06
0,0979
4,30E+05
1,8292
9,30E+07
0,0990
4,30E+05
1,8736
9,30E+07
0,1139
7,50E+05
1,9699
3,60E+07
0,1445
9,30E+05
2,0938
4,30E+07
0,1576
4,60E+06
2,2392
9,10E+07
0,2464
1,50E+06
2,4039
9,10E+07
Análisis y Resultados
40
Gráfica 2. Conteo de microorganismos (N.M.P) en función de la densidad óptica a 600nm
1,2E+08
1,0E+08
N.M.P
8,0E+07
6,0E+07
4,0E+07
2,0E+07
0,0E+00
0
0,5
1
1,5
2
2,5
O.D (600nm)
No se encontró una relación entre la técnica del N.M.P con la densidad óptica, en especial los valores
fluctúan en mayor proporción cuando la absorbancia es mayor a uno.
Se observa que la técnica no es sensible para altas concentraciones de microorganismos, es decir que
para un aumento de la densidad óptica no se observa cambio en el N.M.P a pesar de que la cantidad de
células aumentó considerablemente. Cabe notar que el intervalo de confianza para el N.M.P (De Man
JC 1983 MPN tables, corrected) aumenta medida que se incrementa el número de microorganismos
(inicia en 0.00 - 0.94 y termina en 20 – 400 multiplicado por el factor de dilución) haciéndose esta técnica
4
imprecisa para altas concentraciones. Por el contrario, para concentraciones menores a 10 el equipo no
registró cambios en la absorbancia a pesar de que la levadura se replicaba.
2.2
Resultados de la cantidad de microorganismo por conteo en cámara
Tabla 19. Conteo directo (cámara de conteo)
600nm
O.D
Conteo
O.D
0,0177
5,500E+04
0,2659
0,0235
9,800E+04
0,3805
0,0233
1,730E+05
0,3808
0,0563
4,375E+05
0,4189
0,0839
3,875E+05
0,5028
0,0979
6,375E+05
0,5185
0,0990
3,300E+05
0,8857
0,1445
6,750E+05
1,0482
0,2134
1,140E+06
1,4055
0,2464
1,585E+06
1,9699
en función de la absorbancia a una longitud de onda de
Conteo
1,536E+06
1,945E+06
3,213E+06
2,085E+06
3,195E+06
3,675E+06
5,188E+06
6,975E+06
1,113E+07
1,238E+07
Gráfica 3. Conteo directo (cámara de conteo) en función de la absorbancia a una longitud de onda de
600nm
Análisis y Resultados
41
Concentración (lev/ml)
1,400E+07
1,200E+07
1,000E+07
8,000E+06
6,000E+06
4,000E+06
2,000E+06
0,000E+00
0
0,5
1
1,5
2
O.D.
Mediante una regresión lineal, la ecuación que relaciona la cantidad de levaduras por mililitro de sustrato
en función de la densidad óptica es:
Conteo(lev/ml) = -140360 + 6791580(O.D.)
La correlación es de 0.988, lo que indica un buen ajuste de los datos mediante la técnica de conteo por
cámara, en donde existe una relación directa entre la densidad óptica y la cantidad de células por mililitro.
En base a esta ecuación, se cuantificará la cantidad de microorganismos para los modelos primarios y
secundarios.
3. MODELOS PRIMARIOS
Para los modelos primarios se ensayaron las ecuaciones de Gompertz y Logístico para el ajuste de los
valores experimentales.
Gráficamente con los valores experimentales se calcularon los valores iniciales de a, b y c con el punto
de inflexión de la curva y el corte de la recta con el eje de las x (tiempo); y con el proceso Marquardt se
obtienen las ecuaciones para pH = 5.6, T = 35ºC y aw = 0.957 de las siguientes funciones:
3.1
Modelo Logístico
Conteo( lev / ml ) =
1.32438 x10 7
1 + exp(16.7311 − 0.416671* Tiempo)
2
con un valor de R = 0,966
3.2
Modelo de Gompertz
Conteo( lev / ml ) = 1.40694 x10 7 * exp( − exp( 9.24349 − 0.236963 * Tiempo))
2
con un valor de R = 0,9801
Análisis y Resultados
42
luego:
µ=
(1.40694 x107 )( 0.236963)
= 1.2265 x106 lev / ml * hora
2. 718281
λ=
9.24349 − 1
= 34.78horas
0.236963
En las dos ecuaciones el valor del tiempo esta dado en horas y la correlación es mayor a 0.9 Ambas
ecuaciones reflejan adecuadamente el esquema de crecimiento de la levadura y se escoge la ecuación
de Gompertz como modelo primario.
Por tanto, los parámetros de la función de Gompertz para los 25 cultivos en los que se observaron
crecimiento son:
Tabla 20. Parametros de Gompertz y resultados de fase lag y tasa de máxima de crecimiento
pH
4,0
4,0
4,0
4,0
5,0
5,0
5,0
5,6
5,6
5,6
5,6
6,0
6,0
6,0
6,0
4,0
5,0
5,6
5,6
5,6
5,6
5,0
4,0
6,0
3,0
aw
0,957
0,937
0,995
0,965
0,995
0,965
0,957
0,995
0,965
0,957
0,937
0,965
0,957
0,937
0,995
0,957
0,957
0,957
0,957
0,995
0,937
0,957
0,995
0,937
0,937
Temp
20
25
30
35
25
30
35
20
25
30
35
20
25
30
35
25
25
20
35
25
25
20
20
20
25
a (10E7)
10,13290
1,43975
1,72643
1,28412
1,36269
1,29212
1,53333
2,04449
1,43214
1,45599
0,55610
2,77290
1,54137
0,56866
1,31173
1,78903
1,56211
1,54427
1,40694
1,48359
1,25652
2,41698
3,24708
0,92162
20,52320
b
3,25075
3,74181
13,15980
22,49670
14,65260
16,71410
16,52220
11,15720
14,21700
14,11230
3,138950
7,54567
6,58822
3,58988
27,76250
7,87684
7,56548
9,46409
9,24349
6,21731
3,34035
9,59695
8,44260
11,06660
9,57868
c
0,02115111
0,01635730
0,27662500
0,55872000
0,35538100
0,38960100
0,40051200
0,11525400
0,31838100
0,32790500
0,01815380
0,08446370
0,13646200
0,01243390
0,68042600
0,15574200
0,14510100
0,11096800
0,23696300
0,11573700
0,01817440
0,10901000
0,09360510
0,02324370
0,09422290
µ (lev/ml*hora)
7,8845E+05
8,6637E+04
1,7569E+06
2,6394E+06
1,7815E+06
1,8519E+06
2,2592E+06
8,6686E+05
1,6774E+06
1,7564E+06
3,7139E+04
8,6161E+05
7,7379E+05
2,6012E+04
3,2835E+06
1,0250E+06
8,3385E+05
6,3041E+05
1,2265E+06
6,3167E+05
8,4011E+04
9,6927E+05
1,1181E+06
7,8807E+04
7,2320E+08
lambda (h)
106,41285490
167,61996170
43,95770447
38,47490693
38,41679775
40,33382871
38,75589246
88,12882850
41,51315562
39,98810631
117,82381650
77,49684184
40,95074087
208,2918473
39,33197732
44,15533382
45,24765508
76,27505227
34,78808928
45,07901535
128,77178890
78,86386570
79,51062496
433,08939630
91,04665639
Los parámetros de Gompertz se comportan muy similares a excepción del último valor que corresponde
al pH más ácido del medio. Debido a la turbiedad del medio, la cuantificación de microorganismos se
elaboró mediante la técnica de N.M.P y por ello la gran diferencia de los valores a y c en comparación
con los demás datos. Esto índica que dichas condiciones son o demasiado significativas o que el valor
realmente no es confiable.
Análisis y Resultados
43
A una temperatura de 7ºC (refrigeración) no se especifican parámetros debido a que la levadura no se
reprodujo en dichas condiciones, siendo esta una condición de no crecimiento.
Los valores de a que corresponden a la mayor concentración de células generadas, se encuentran a
6
7
unas concentraciones de 10 y 10 células por mililitro
Gráfica 4. Gráfica comparativa de pH de la función de Gompertz
pH4
pH5
pH6
Concentración (lev/ml)
2,0E+07
1,8E+07
1,6E+07
1,4E+07
1,2E+07
1,0E+07
8,0E+06
6,0E+06
4,0E+06
2,0E+06
0,0E+00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tiempo(Horas)
La gráfica de pH=3 no se incluyó en la experimentación como se tenía presupuestado debido a que el
medio presentó turbiedad al ser acidificado, lo cual variaba la absorbancia inicial del medio. Este
fenómeno se observa para pH menores a 4 en donde la ecuación de la curva de calibración solo resulta
efectiva para las mismas condiciones de absorbancia.
En las gráficas se observan como la tendencia de los tres valores de pH son la misma; la fase de
adaptación del microorganismo es bastante semejante, al igual que su fase exponencial y el tiempo en el
que alcanza la parte estacionaria. Realizando una comparación entre los parámetros a , b y c de las
curvas de pH con base a la prueba t de Student (cociente entres la diferencia de los parámetros y la
diferencia de su varianza) se obtienen los siguientes valores:
Tabla 21. Valores de t para comparación de pH con una confianza del 95%
Parámetro
pH=4.0 con pH=5.0 pH=5.0 con pH=6.0
pH=4.0 con pH=6.0
a
2,38868069
0,23713683
2,43785147
b
0,16420855
0,57078441
0,64345517
c
0,2772385
0,24249013
0,46111057
Grados de libertad
51
57
46
t crítico
2,009
2,003
2,015
(R.A: Fisher y Frank Yates, Stastistical Tables)
Analizando los valores de t con el valor crítico las curvas de pH=5.0 y pH=6.0 son los únicos cultivos que
no tienen diferencia significativa, por tanto se puede ajustar una única curva de estos dos valores y
concluir que el crecimiento de la levadura entre pH 5.0 y 6.0 no tiene una notable incidencia.
Gráfica 5. Grafica comparativa de actividad de agua de la función de Gompertz
Análisis y Resultados
44
Aw 0,995
Aw 0,965
Aw 0,952
Aw 0,937
Concentración (lev/ml)
1,6E+07
1,4E+07
1,2E+07
1,0E+07
8,0E+06
6,0E+06
4,0E+06
2,0E+06
0,0E+00
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo(Horas)
El crecimiento de la levadura se comporta de manera similar para los valores de actividad de agua de
0.995, 0.965 y 0.952. Se observa como en estas tres curvas, a medida que disminuye la actividad de
agua, disminuye gradualmente el valor máximo que alcanza en la fase estacionaria.
En cuanto al valor de 0.937 es significativo al observarse como en estas condiciones se retarda la fase de
adaptación de la levadura al sustrato y se disminuye considerablemente la tasa de crecimiento de la
levadura. De la misma manera, el parámetro a de Gompertz que define la cantidad máxima de
microorganismos es el menor de todos los valores observados. Realizando de igual manera la prueba t
se obtiene:
Tabla 22. Valores de t para comparación de a w con una confianza del 95%
aw =0.937
aw =0.952
aw =0.965
Parámetro
con aw = 0.952
con aw = 0.965
con aw = 0.995
a
0,027202765
3,051069364
0,503189445
b
7,466864718
0,713107693
4,808290202
c
11,56300542
0,973661253
5,821116259
Grados de libertad
32
32
40
t crítico
2,039
2,039
2,021
(R.A: Fisher y Frank Yates, Stastistical Tables)
Tabla 23. Valores de t para comparación de a w con una confianza del 95%
aw =0.937
aw =0.952
aw =0.937
Parámetro
con aw = 0.965
con aw = 0.995
con aw = 0.995
a
0,027202765
3,051069364
0,503189445
b
7,466864718
0,713107693
4,808290202
c
11,56300542
0,973661253
5,821116259
Grados de libertad
32
32
40
t crítico
2,039
2,039
2,021
(R.A: Fisher y Frank Yates, Stastistical Tables)
De acuerdo con estos valores, existen diferencias significativas entre las diversas actividades de agua,
luego este factor esta afectando el crecimiento de la levadura al variar entre los rangos elaborados.
Análisis y Resultados
45
Para valores de actividad de agua bajos, se observó el fenómeno ilustrado en la figura, en donde la
levadura se ubica en la superficie del sustrato debido a la alta densidad del medio. Se cree que la
actividad de agua baja genera en el microorganismo una condición de estrés lo que se ve reflejado en
una mayor producción de CO2 y por tanto un mayor consumo energético por parte de la S. cerevisiae a
causa de la desfavorable condición a la que se encuentra.
Figura 3. Concentración de levaduras en la superficie del sustrato
Gráfica 6. Gráfica comparativa de temperaturas de la función de Gompertz
T 20ºC
T 30ºC
T 35ºC
Concentración (lev/ml)
1,80E+07
1,60E+07
1,40E+07
1,20E+07
1,00E+07
8,00E+06
6,00E+06
4,00E+06
2,00E+06
0,00E+00
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Tiempo(Horas)
La curva de crecimiento para los valores de temperatura de 30ºC y 35ºC tienen esencialmente la misma
fase lag, mientras que la tasa de crecimiento es relativamente un poco mayor a 30ºC y por ende alcanza
mas rápidamente el tiempo estacionario. En cuanto a la curva de 20ºC, se observa como se extiende la
fase de adaptación hasta la hora 70 en donde empieza su fase exponencial.
Para la temperatura de refrigeración como se mencionó anteriormente, la levadura no se multiplicó y
entro en un estado de latencia; hecho que se observó al replicarse las células al extraer el cultivo de la
nevera a temperatura ambiente después de dos meses de refrigeración Nuevamente la prueba t para
temperatura es la siguiente:
Análisis y Resultados
46
Tabla 24. Valores de t para comparación de temperatura con una confianza del 95%
T =20º C
T =25º C
T =20º C
Parámetro
con T = 25º C
con T = 35º C
con T = 35º C
a
2,72812844
0,95944847
3,32581969
b
4,11712196
2,1463525
0,11803909
c
9,91144332
1,59598726
2,29012706
Grados de libertad
69
71
62
t crítico
1,997
1,996
1,999
Los valores de t de los parámetros sobrepasa el valor crítico, luego la temperatura es también un factor
importante en el crecimiento, donde se notan las diferencias entre los valores evaluados.
Básicamente con los modelos primarios, se puede establecer que la levadura emplea por lo menos de 24
a 30 horas para adaptarse al medio en las condiciones más benéficas para su crecimiento, de igual
manera, entre mayor sea la tasa de crecimiento, más rápidamente alcanzará su fase estacionaria.
En los modelos primarios se verificó la reproducibilidad del microorganismo, mediante ensayos por
duplicado de los cultivos y detallando los valores de absorbancia obtenidos para los mismos intervalos de
tiempo. De igual manera, se presentaron diferencias poco significativas en la cantidad inicial de
microorganismos ya que se estandarizó el inóculo.
4. MODELOS SECUNDARIOS
Con el proceso Backwards incluyendo todas las variables y combinaciones de estas hasta grado 3, se
obtuvieron las siguientes ecuaciones que relacionan pH, T y aw con los parámetros de la función de
Gompertz con un grado de significancia del 90%:
log( a ) = 583.00768 − 1402.23816aW − 17.63068T − 8.78625 pH 2 + 836.28010aW + 87.66888 pHa W
2
+ 36.51626aW T + 9.15258 pH 2 aW − 91.33269 pHa W 2 − 18.92003aW 2 T
log( b) = −281.64986 − 45.60058 pH + 816.62986aW + 9.57514 pH 2 − 543.07348aW 2 − 0.02176T 2
− 0.18473aW T − 10.04561 pH 2 aW + 50.17328 pHa W + 0.02620aW T 2
2
log( c) = −694.75177 + 1435.22935aW − 745.55679 aW 2 − 0.01766T 2 − 0.13754 pH 2 aW + 1.38124 pHa W 2
+ 0.01892 aW T 2
2
con unos valores de R de 0.9094, 0.8510 y 0.9457 respectivamente.
En los modelos secundarios se conjugaron las variables de temperatura, aw y pH y se encontraron las
ecuaciones para los parámetros de Gompertz con el objeto de simular condiciones de crecimiento en
valores intermedios a los trabajados, es decir, que el modelo encontrado sólo es aplicable para pH entre
4 y 6, aw entre 0.995 y 0.957 y Temperatura entre 20ºC y 35ºC.
Con el proceso estadístico Backwards se determina las ecuaciones de orden tres, observando que la
transformación a logaritmo en base diez resulta con un mejor ajuste que tomando los valores de su forma
original. En el proceso se incluyen todas las variables y las que no son significativas en un 10% son
descartadas hasta obtener las ecuaciones mencionadas.
Análisis y Resultados
47
En los modelos se ensayaron 28 cultivos de 64 posibilidades. De estos 28, se descartó uno por excesiva
turbiedad generada por el ácido, dos debido a que no se presentó crecimiento (uno de ellos es la
condición de refrigeración) y el último valor que corresponde a la aw=0.952 para efectuar el diseño del
factorial fraccionado. En el modelo secundario no se incluye la condición de no crecimiento teniendo por
tanto 24 posibilidades para modelar
El primer valor de los modelos secundarios no se descartó, aunque difiere notablemente con respecto a
los demás parámetros, influye de forma importante en el ajuste del modelo.
Se tienen en conclusión 23 grados de libertad en total, donde 9 son para los parámetros y 14 son de error
para los variables log(a) y log(b). En cuanto al log(c) 6 corresponden a los parámetros y 17 al error
experimental.
El modelo secundario muestra como la S. cerevisiae se reproduce sin ninguna dificultad entre los valores
de pH trabajados, esto quiere decir que las condiciones de pH impuestas al microorganismo no tienen
mayor significancia en su reproducción. Por el contrario, se encontró que la actividad de agua es la
variable que más significancia tiene en el crecimiento de la levadura así las otras dos condiciones sean
las más óptimas.
De todos los cultivos que se ensayaron en el proyecto, el espectrofotómetro no reportaba ningún cambio
en la densidad óptica antes de las 24 horas de haber inoculado. Este método de conteo indirecto al igual
4
que la cámara, resulta útil para concentraciones mayores a 10 celulas/ml. Es decir, la célula se toma por
lo menos un día para adaptarse a un medio con óptimas condiciones y luego empieza a reproducirse a
una tasa que depende de la actividad de agua, pH y temperatura a la que este sometida.
Esencialmente los productos alimenticios se someten a diversas condiciones ambientales, por ello se
establece la temperatura como criterio para graficar las siguientes superficies:
Gráfica 7. Tasa máxima de crecimiento en función de la actividad de agua y pH a una temperatura de
20ºC
2
µ = − 1095440005 + 2267087028 a w − 3098899 pH − 1172625979 a w + 3698597 pHa w − 52377 pH 2
Análisis y Resultados
48
Gráfica 8. Tasa máxima de crecimiento en función de la actividad de agua y pH a una temperatura de
25ºC
µ = −1314852250 + 2713361852a w − 3461984 pH − 1398639512a w + 3866788 pHa w − 32098 pH 2
2
Gráfica 9. Tasa máxima de crecimiento en función de la actividad de agua y pH a una temperatura de
30ºC
µ = −1606777185 + 3304074969 a w − 4425134 pH − 1695755633a w + 4475385 pHa w + 5620.1525 pH 2
2
Análisis y Resultados
49
Gráfica 10. Tasa máxima de crecimiento en función de la actividad de agua y pH a una temperatura de
35ºC
µ = −1936453562 + 3960225261a w − 6606003 pH − 2018546822 aw + 5888393 pHa w + 87668 pH 2
2
Gráfica 11. Fase lag en función de la actividad de agua y pH para una temperatura de 20º C
λ = 99478 − 210438a w + 1246.158959 pH + 111709 aw − 1453.701605 pHa w + 16.334540 pH 2
2
Análisis y Resultados
50
Gráfica 12. Fase lag en función de la actividad de agua y pH para una temperatura de 25º C
λ = 47992 − 102129 a w + 698.310531 pH + 54528a w − 802.375157 pHa w + 7.902031 pH 2
2
Gráfica 13. Fase lag en función de la actividad de agua y pH para una temperatura de 30º C
λ = 34337 − 73492a w + 556.694797 pH + 39452a w − 631.707744 pHa w + 5.481909 pH 2
2
Análisis y Resultados
51
Gráfica 14. Fase lag en función de la actividad de agua y pH para una temperatura de 35º C
λ = 40413 − 86585a w + 643.096349 pH + 46504 a w − 721.996519 pHa w + 5.539940 pH 2
2
Para los gráficos 7 a 14, se utilizan las ecuaciones del modelo secundario y se calcula los valores de a, b
y c para cada una de las 4 temperaturas variando en 0.05 la aw y 0.1 el pH dentro de los rangos
experimentados. Con dichos valores se evalúa la tasa de crecimiento y la fase lag para la levadura
obteniendo que para la grafica de temperatura de 20ºC la tasa de crecimiento presenta su valor máximo
para las condiciones de 0.974266 de actividad de agua y 4.816216 de pH. En cuanto a la de 25ºC,
también la superficie posee un valor crítico que es máximo para una actividad de agua de 0.976484 y pH
de 4.907341.
Para las condiciones de 30ºC y 35ºC no se presentan valores máximos y los puntos críticos son donde la
superficie cambia su concavidad, es decir puntos de silla.
Reemplazando en las respectivas ecuaciones de tasa de crecimiento se obtiene que para 20º C
6
6
µ =1.470*10 y para 25ºC µ =1.837*10 levaduras por hora por cada mililitro de sustrato.
Mas aún, si se reemplazan las condiciones máximas de 20ºC en la ecuación de tasa de crecimiento de
6
25ºC el valor es de 1.829*10 dando por entendido que el incremento en 5ºC de temperatura promueve la
tasa de multiplicación en la levadura. Esto quiere decir que reemplazando en la curva de calibración, la
mayor tasa de crecimiento se presenta en una densidad óptica de 0.2381 y 0.2921 para 20ºC y 25ºC
respectivamente. Luego es conveniente hacer el mayor registro de datos cuando se presentan dichos
valores de absorbancia.
Las cuatros gráficas son semejantes en su forma, se observa como la actividad de agua es el factor que
más repercute y este hecho se detalla en como el valor de la tasa de crecimiento disminuye a media que
se baja el valor de actividad de agua. Por el contrario el pH no tiene una mayor influencia, básicamente
a que la superficie disminuye de manera homogénea a medida que baja la disponibilidad de agua para la
levadura.
2
Los valores de R para dichas funciones son de 0.950, 0.941, 0.933 y 0.928 para 20ºC, 25ºC, 30ºC y
35ºC respectivamente.
Análisis y Resultados
52
En los gráficos de fase lag, todas las superficies de respuestas presentaron un valor mínimo que
reemplazando en cada una de las respectivas ecuaciones sus valores críticos, se obtiene la siguiente
tabla de valores:
Tabla 25. Valores críticos para las funciones fase lag
aw
pH
T (ºC)
Fase lag (horas)
0,976407
5,303061
20
45,58
0,975939
5,363114
25
28,61
0,974345
5,363691
30
26,41
0,972124
5,304520
35
33,21
Como se observa las condiciones de aw y pH para las 4 condiciones de temperatura son semejantes, y se
nota claramente como en la combinación (0.974345, 5.363391, 30) se logra la mejor condición de
acoplamiento de la levadura en el sustrato.
Nuevamente si se hace el mismo ejercicio como en la tasa de crecimiento y se toman las mejores
condiciones de aw y pH para cualquier temperatura, se llega a la conclusión que la temperatura de 30ºC
es la mejor condición de fase lag entre las cuatro.
Las cuatro superficies tienen el mismo comportamiento y a diferencia de las de tasa de crecimiento, el pH
tiene un aporte en la fase lag en particular para actividades de agua baja.
2
Los valores de R para dichas funciones son de 0.907, 0.887, 0.864 y 0.861 para 20ºC, 25ºC, 30ºC y
35ºC respectivamente.
Observando la escala vertical (tasa de crecimiento y fase lag) en todas las gráficas y en especial para la
actividad de agua más alta, los valores disminuyen a medida que se baja la temperatura; luego si se
están tratando productos tales como jugos la refrigeración vendría a ser el método más conveniente para
su conservación.
En cuanto a los productos de baja actividad de agua, estos no tienen mayor inconveniente retardando por
su misma condición la reproducción de la levadura.
5.
MODELO TERCIARIO
Este modelo explica mediante un programa de computador elaborado en excel el comportamiento de la
levadura en condiciones no experimentadas dentro de los rangos de pH, actividad de agua y
temperatura experimentado, es decir (4 < pH < 6), (20ºC < T < 35ºC) y (0.937 < aw < 0.995). Si por algún
motivo los valores digitados no pertenecen a los intervalos mencionados, el programa generará un
mensaje de error y los valores calculados no son representativos.
Para la ejecución de la hoja de cálculo se debe proceder de la siguiente manera:
1.
2.
3.
4.
Abril con el explorador el archivo 3er Modelo,
Hacer clic sobre el botón “habilitar macros” al percibir el mensaje de excel. Si su programa no
permite la ejecución de macros, entre al menú Herramientas y escoja la opción Macros y luego
Seguridad. Cambie el nivel de seguridad a medio el cual permite ejecutar macros con
autorización del usuario.
Click con el mouse sobre el mensaje “Realizar Predicción” para ejecutar la macro
Introducir los valores de pH, aw y Temperatura en las ventanas y pulsar enter.
Después de ejecutar los pasos anteriores, el programa calcula la tasa máxima de crecimiento, la fase lag,
una tabla de datos con los valores más representativos y la gráfica de la función de Gompertz para las
condiciones elegidas.
Análisis y Resultados
53
En primera instancia, el modelo terciario calcula los parámetros de Gompertz para las condiciones
insertadas por el usuario con las ecuaciones obtenidas en el modelo secundario. Luego procede a
obtener una extensa tabla de datos de la concentración de microorganismos en función del tiempo
reemplazando los parámetros en la función Gompertz. El comportamiento de estos valores se analiza e
identifica la fase lag, exponencial y estacionaria de la función. A partir de este análisis se obtiene el
rango de la gráfica que corresponde a la diferencia de el valor en tiempo de la fase estacionaria con la
fase lag divido entre 15 (cantidad de puntos necesaria para graficar la curva).
Debido a la alta tasa de crecimiento de la levadura y a obtener valores de concentración en un amplio
7
rango (de 5 lev/ml hasta 10 lev/ml), el modelo terciario presenta dificultades a nivel de escala en la
función de Gompertz. Por ello, se ha diseñado una macro de la siguiente manera:
Private Sub CommandButton1_Click()
ph = InputBox("Introduzca el pH (valor entre 4 y 6)")
temp = InputBox("Introduzca la temperatura (valor entre 20 y 35 ºC)")
act = InputBox("Introduzca la actividad de agua (valor entre 0,937 y 0,995) ")
Range("i2").Select
Selection.FormulaR1C1 = ph
Range("i3").Select
Selection.FormulaR1C1 = temp
Range("i4").Select
Selection.FormulaR1C1 = act
Set minimo = Range("E10")
Set maximo = Range("H34")
Set intervalo = Range("G10")
ActiveSheet.ChartObjects("gráfico 30").Chart.Axes(xlCategory).MinimumScale = minimo
ActiveSheet.ChartObjects("gráfico 30").Chart.Axes(xlCategory).MaximumScale = maximo
ActiveSheet.ChartObjects("gráfico 30").Chart.Axes(xlCategory).MajorUnit = intervalo
ActiveSheet.ChartObjects("gráfico 30").Chart.Axes(xlValue).MaximumScaleIsAuto = True
End Sub
El primer grupo de líneas de Visual crea el botón “Realizar predicción” e introduce los valores del usuario
en las celdas de la hoja de cálculo para luego ser utilizado por el programa y calcular los tiempos y
concentraciones de la levadura.
El segundo grupo permite reescalar la gráfica tomando valores mínimos y máximos de tal manera que la
mayor densidad de puntos se ubiquen en la fase exponencial, cuya fase es la que presenta mayores
cambios de concentración de microorganismos a través del tiempo.
El modelo terciario no contempla la cantidad del inóculo inicial, luego es solo aplicable para condiciones
extremas y concentraciones iniciales de 5 lev/ml. Dicho valor es importante, ya que como se mencionó
en los ensayos preliminares, el tiempo de generación se disminuye al inocular una mayor cantidad de
microorganismos alcanzando en menor tiempo una elevada cantidad de células por mililitro.
CONCLUSIONES
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Las funciones Logistica y de Gompertz se ajustan al fenómeno de crecimiento de la S.
cerevisiae, distinguiendo claramente las fases: lag, exponencial y estacionaria con correlaciones
mayores a 0.9.
El modelo secundario para evaluar los parámetros de Gompertz tiene un coeficiente de
determinación de 0.9094, 0.8510 y 0.9457 para a, b y c respectivamente.
La actividad de agua y temperatura en su orden, son los factores de mayor influencia sobre el
crecimiento de las levaduras
Las levaduras no presentan gran sensibilidad a los cambios de pH contemplados en el modelo.
El efecto de la agitación no repercute de manera sustancial el crecimiento de la levadura.
No se encontró relación alguna entre la absorbancia del medio y la técnica de conteo del N.M.P.
La densidad óptica es una técnica indirecta de medición de microorganismos que se ajusta
linealmente al conteo por cámara con un r de 0.988.
Actividades de agua menores a 0.937 retardar el crecimiento de la levadura.
Las temperaturas de refrigeración inhiben el crecimiento dejando la levadura en un estado de
latencia y es el método más adecuado para conservar aquellos productos cuya actividad de
agua resulta ser mayor a 0.957.
Se encontraron valores críticos para la tasa máxima de crecimiento solo para temperaturas de
20ºC y 25ºC.
54
RECOMENDACIONES
•
•
•
•
•
Para concluir el proceso de modelamiento debe validarse el modelo elaborado en diferentes
productos alimenticios.
Se recomienda antes de validar, determinar si existe un efecto de inóculo sobre el modelo.
Se recomienda aumentar el rango de cada una de las condiciones de temperatura, actividad de
agua y pH experimentados. Se demostró que para valores menores a 7ºC la levadura no crece,
luego es conveniente ensayar entre 7ºC y 20ºC que es un intervalo amplio en donde no se sabe
el comportamiento de la S. cerevisiae.
Debido a las limitaciones metodológicas de conteo cuando se tienen concentraciones de
4
levaduras por debajo de 10 lev/ml se recomienda utilizar otro método de conteo más sensible,
como es el conteo en placa con la ayuda del SpiralTech. Este método además es el más
empleado por casi todos los grupos de investigación que se encuentran trabajando en el tema de
microbiología predictiva.
Se sugiere encontrar una relación entre la técnica del N.M.P y el conteo en cámara. Los valores
obtenidos de la cantidad de células por cámara son el total de células presentes mientras que el
N.M.P evalúa las células viables.
55
BIBLIOGRAFÍA
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BROCK Madigan. Microbiologia Predictiva. 6ta. Edición.
COCHRAN William, COX Gertrude M. Diseños Experimentales. Ed. Trilla Mexico 1980.
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Matemáticas para las ciencias naturales.
Sociedad
KUEHL Robert. Diseño de Experimentos. Ed Mc Graw Hill
LOPEZ Malo A., GUERRERO S. Probabilistic Modeling of Saccharomyces cerevisiae Inhibition under the
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91-95.
M.R Adams, M.O Moss. Microbiología de los Alimentos. Ed Acribia S.A.
OSPINA Machado Ernesto, ALDANA Hector Alfonso, Enciclopedia Agropecuaria Terranova. Terranova
Editores. 1996.
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PHILIPS. J.D and GRIFFITHS M.W. The relation between temperature and growth of bacteria in diary
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PRUITT K.M and KAMAU D.N. Mathematical models of bacterial growth, inhibition and death under
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WHITING Richard C, BUCHANAN Robert L. Predictive Modeling. 1994 pag 728-737.
WHITING Richard C. Microbial Modeling in Foods. Ciritical Reviwes in Food Science and Nutrition. 1995.
Pag 467-494
TERRY A. Roberts, BARNYI Jozsef. Mathematics of predictive food microbiology. International Journal
of Food Microbiology. pag 199-209. August 1994.
TUITE Michale F, OLIVER Stephen G. Saccharomyces. Biotechnology Handbooks. Pag 5-45 y 249278.
W.C Frazier, D.C Westhoff. Microbiología de Alimentos. Ed. Acriba S.A. 3ra Edición.
ZWIETERING M.H, JONGENBURGER I. Modeling of Bacterial Gowth Curve. Applied And Environmental
Microbiology, June1990 pag 1875-1881.
56
ANEXO A
ENSAYOS PRELIMINARES
Ensayos de actividad de agua
Se tomaron tres productos comerciales y varios medios de cultivo a distintas concentraciones de azúcar y
se les sometió a análisis en la Novasina observando los siguientes resultados:
Tabla 26. Actividades de agua de productos azucarados
Producto
Actividad de Agua (Aw)
Jugo
0.999
Mermelada
0.870
Salsa de Tomate
0.905
Tabla 27. Actividades de agua del medio de cultivo a distintas concentraciones de azúcar
Actividad de
Gramos de azúcar para
Porcentaje (p/p)
agua (a w)
250 ml de sustrato
0.995
12.5
5%
0.965
22.5
9%
0.957
37.5
15%
0.952
50.0
20%
0.937
150.0
60%
El factor de corrección de la novasina para actividades de agua mayor a 0.9 es de 0.02, el cual se le
aplica a todos los valores ilustrados en la tabla 2 y 3 que excedían el valor mencionado.
57
Anexo A
58
Cantidad de alcohol producido por los dos cultivos:
Medio Agitado: 9.5 ºG.L
Medio sin Agitación: 9.5 ºG.L
Grafica 15. pH en función del tiempo para cultivo agitado
Cambio de pH en cultivo Agitado
6
5,5
pH
5
4,5
4
3,5
3
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
45
50
55
Tiempo (horas)
Grafica 16. pH en función del tiempo para cultivo sin agitación
Cambio de pH en Cultivo sin Agitación
6,00
5,50
pH
5,00
4,50
4,00
3,50
3,00
0
5
10
15
20
25
30
Tiempo (horas)
35
40
Anexo A
59
Grafica 17. Indice de refracción en función del tiempo para cultivo agitado
Cambio del índice de refracción para cultivo agitado
1,36
1,358
1,356
1,354
I.R.
1,352
1,35
1,348
1,346
1,344
1,342
1,34
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tiempo (horas)
Grafica 18. Indice de refracción en función del tiempo para cultivo sin agitación
Cambio del índice de refracción para cultivo sin agitación
1,36
1,355
I.R.
1,35
1,345
1,34
1,335
0
5
10
15
20
25
30
Tiempo (horas)
35
40
45
50
55
Anexo A
60
Grafica 19. Absorbancia en función del tiempo para cultivo agitado
Cambio de la densidad óptica para cultivo agitado
5,0
O.D (600 n.m).
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tiempo (horas)
Grafica 20. Absorbancia en función del tiempo para cultivo no agitado
Cambio de densidad óptica para cultivo sin agitación
5,0
O.D. (600 n.m)
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
0
5
10
15
20
25
30
Tiempo (horas)
35
40
45
50
55
ANEXO B
RESULTADOS DE LOS MODELOS PRIMARIOS
Tabla 28. Modelo primario pH
Tiempo (Horas)
O.D
0
0.0145
42
0,0264
42
0,0299
44
0,0370
44
0,0472
57
1,2305
57,5
1,2407
58
1,3488
63
1,4739
63
1,4885
63,5
1,4918
64
1,5888
64
1,6585
65
1,6511
= 5.6, aw=0.995, T = 25º C
Conteo
Tiempo (Horas)
3,6
65
3,894E+04
65,25
6,271E+04
67
1,109E+05
67
1,802E+05
67,75
8,217E+06
67,75
8,286E+06
68
9,020E+06
68
9,870E+06
69
9,969E+06
69
9,991E+06
70
1,065E+07
71
1,112E+07
71
1,107E+07
Tabla 29. Modelo primario pH = 5.6, aw =0.965, T = 25ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
Tiempo (Horas)
0
0.0145
3.6
42
40
0,2183
1,342E+06
43
40
0,1814
1,092E+06
43
40,5
0,2303
1,424E+06
44
40,5
0,2153
1,322E+06
44
41
0,2406
1,494E+06
45
41
0,2756
1,731E+06
45
41,5
0,2592
1,620E+06
46
41,5
0,2756
1,731E+06
46
42
0,3104
1,968E+06
O.D
1,6728
1,6698
1,7447
1,7417
1,7988
1,7794
1,8035
1,8195
1,8837
1,8702
1,9264
2,0457
2,0424
O.D
0,3691
0,4244
0,4934
0,5504
0,6147
0,7052
0,7801
0,8789
0,9412
Conteo
1,122E+07
1,120E+07
1,171E+07
1,169E+07
1,208E+07
1,194E+07
1,211E+07
1,222E+07
1,265E+07
1,256E+07
1,294E+07
1,375E+07
1,373E+07
Conteo
2,366E+06
2,742E+06
3,211E+06
3,598E+06
4,034E+06
4,649E+06
5,158E+06
5,829E+06
6,252E+06
61
Anexo B
62
Tabla 30. Modelo primario pH = 5.6, aw =0.952, T = 25ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
Tiempo (Horas)
0
0.0145
3,6
58
44
0,0207
2,257E+02
59
53
0,5240
3,418E+06
60
53,5
0,5466
3,572E+06
60,5
54
0,6092
3,997E+06
65
55
0,7530
4,974E+06
67
56
0,9433
6,266E+06
68
56,5
1,0832
7,216E+06
69
57
1,0820
7,208E+06
71
57,5
1,0992
7,325E+06
O.D
1,2641
1,3113
1,3907
1,4950
1,6610
1,8018
1,8501
1,8983
1,9866
Conteo
8,445E+06
8,765E+06
9,305E+06
1,001E+07
1,114E+07
1,210E+07
1,242E+07
1,275E+07
1,335E+07
Tabla 31. Modelo primario pH = 5.6, aw =0.937, T = 25ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
Tiempo (Horas)
0
0.0145
3,6
162,5
139
0,1432
8,322E+05
164,5
139
0,1601
9,470E+05
164,5
140
0,1605
9,497E+05
186
140
0,1657
9,850E+05
186
142,5
0,2043
1,247E+06
209
142,5
0,1886
1,141E+06
209
144
0,4201
2,713E+06
215
144
0,4055
2,614E+06
215
162,5
0,4714
3,061E+06
O.D
0,4618
0,4581
0,4937
0,6942
0,6834
0,9446
1,075
1,005
1,1479
Conteo
2,996E+06
2,971E+06
3,213E+06
4,574E+06
4,501E+06
6,275E+06
7,161E+06
6,685E+06
7,656E+06
Tabla 32. Modelo primario pH=3.0, aw =0.957, T = 25º C
Tiempo (Horas)
N.M.P
22
26
41,5
46
52
66,5
74
90
94
114
3,6
9,1
9,10E+02
1,50E+03
4,30E+03
7,50E+04
9,40E+05
3,60E+06
3,00E+07
1,50E+08
Anexo B
Tabla 33. Modelo primario pH=4.0, aw =0.957, T = 25º C
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
Tiempo (Horas)
0
0.0145
3,6
48
22
0,0920
4,845E+05
50
22
0,0501
1,999E+05
50
41,5
0,1404
8,132E+05
52
41,5
0,0985
5,286E+05
52
43
0,1853
1,118E+06
64
43
0,1376
7,942E+05
64
45
0,3168
2,011E+06
65
45
0,2265
1,398E+06
65
46
0,4027
2,595E+06
67
46
0,3133
1,987E+06
67
48
0,6083
3,991E+06
Tabla 34. Modelo primario pH=5.0, aw =0.957, T = 25º C
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
Tiempo (Horas)
0
0.0145
3,6
50
22
0,028
4,980E+04
51
24,5
0,0276
4,709E+04
51
24,5
0,0355
1,007E+05
52
41,5
0,0484
1,884E+05
52
41,5
0,0501
1,999E+05
56
43
0,0682
3,228E+05
56
43
0,0688
3,269E+05
64
45
0,1466
8,553E+05
64
45
0,1498
8,770E+05
65
46
0,204
1,245E+06
65
46
0,1529
8,981E+05
67
47
0,2121
1,300E+06
67
47
0,2252
1,389E+06
69
48
0,3244
2,063E+06
69
48
0,3408
2,174E+06
70
50
0,5908
3,872E+06
70
63
O.D
0,5301
0,9425
0,8455
1,3232
1,1324
2,3812
2,3345
2,3958
2,3789
2,4401
2,4635
Conteo
3,460E+06
6,261E+06
5,602E+06
8,846E+06
7,550E+06
1,603E+07
1,571E+07
1,613E+07
1,602E+07
1,643E+07
1,659E+07
O.D
0,6153
0,7777
0,7978
0,9814
0,9901
1,2401
1,3028
1,9282
1,9351
1,9278
1,9399
2,0734
2,0551
2,1683
2,1415
2,3001
2,0673
Conteo
4,038E+06
5,141E+06
5,278E+06
6,525E+06
6,584E+06
8,282E+06
8,708E+06
1,296E+07
1,300E+07
1,295E+07
1,303E+07
1,394E+07
1,382E+07
1,459E+07
1,440E+07
1,548E+07
1,390E+07
Anexo B
64
Tabla 35. Modelo primario pH=6.0, aw =0.957, T = 25º C
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
Tiempo (Horas)
0
0.0145
3,6
48
24,5
0,0234
1,856E+04
50
24,5
0,0222
1,041E+04
50
41,5
0,104
5,660E+05
56
41,5
0,0978
5,239E+05
56
43
0,1753
1,050E+06
64
43
0,2357
1,460E+06
64
45
0,4482
2,904E+06
65
45
0,3301
2,102E+06
65
46
0,59
3,867E+06
67
46
0,4582
2,972E+06
67
47
0,8384
5,554E+06
69
47
0,7973
5,275E+06
69
48
1,0129
6,739E+06
70
70
O.D
0,9853
1,1702
1,1646
1,4874
1,5012
1,9861
1,9879
1,9953
1,9902
2,0962
2,066
2,167
2,155
2,3183
2,3654
Conteo
6,551E+06
7,807E+06
7,769E+06
9,961E+06
1,006E+07
1,335E+07
1,336E+07
1,341E+07
1,338E+07
1,410E+07
1,389E+07
1,458E+07
1,450E+07
1,560E+07
1,592E+07
Tabla 36. Modelo primario pH=5.6, aw =0.957, T=20ºC
Tiempo (Horas)
0
70
70
71
71
72
72
74
74
75,5
75,5
76,5
76,5
78
78
88
88
O.D
0.0145
0,0378
0,0287
0,0354
0,0474
0,045
0,055
0,069
0,1061
0,0998
0,1462
0,2044
0,1403
0,2733
0,3364
1,0485
1,1211
Conteo
3,6
1,164E+05
5,456E+04
1,001E+05
1,816E+05
1,653E+05
2,332E+05
3,283E+05
5,802E+05
5,374E+05
8,526E+05
1,248E+06
8,125E+05
1,716E+06
2,144E+06
6,981E+06
7,474E+06
Tiempo (Horas)
96
96
97
97
98,5
98,5
99,5
99,5
100,5
100,5
118,5
118,5
120,5
120,5
123,5
123,5
O.D
1,6688
1,7489
1,6778
1,747
1,804
1,8462
1,8641
1,8919
1,9455
1,9567
2,1861
2,2128
2,2588
2,2795
2,2865
2,2516
Conteo
1,119E+07
1,174E+07
1,125E+07
1,172E+07
1,211E+07
1,240E+07
1,252E+07
1,271E+07
1,307E+07
1,315E+07
1,471E+07
1,489E+07
1,520E+07
1,534E+07
1,539E+07
1,515E+07
Anexo B
65
Tabla 37. Modelo primario pH=5.6, aw =0.957, T=30ºC
Tiempo (Horas)
0
31
32
33
34
35
36
36
36,5
37
37
37,5
38
39
39,5
40
40,5
41
44
44
45
O.D
0.0145
0,0222
0,0293
0,0338
0,0411
0,0272
0,1019
0,0296
0,1218
0,1780
0,0351
0,2191
0,2648
0,0795
0,0909
0,1364
0,1633
0,1890
1,4072
1,1259
1,4113
Conteo
3,6
1,041E+04
5,863E+04
8,920E+04
1,388E+05
4,437E+04
5,517E+05
6,067E+04
6,869E+05
1,069E+06
9,802E+04
1,348E+06
1,658E+06
3,996E+05
4,770E+05
7,860E+05
9,687E+05
1,143E+06
9,417E+06
7,506E+06
9,445E+06
Tiempo (Horas)
45
45,5
45,5
46
46
46,5
46,5
47
47
47,5
47,5
48
48
48,5
48,5
49,5
49,5
57
60
60
63
O.D
1,1311
1,4301
1,1259
1,5155
1,3125
1,6442
1,4368
1,7220
1,5421
1,7994
1,6812
1,8426
1,7784
1,9146
1,8997
1,9685
1,9204
2,1419
2,1354
2,1369
2,1410
Tabla 38. Modelo primario pH=5.6, aw =0.957, T=35ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
Tiempo (Horas)
0
0.0145
3,6
38,5
28
0,0475
1,822E+05
39
31
0,0243
2,468E+04
39,75
32
0,0449
1,646E+05
40,25
32,5
0,0439
1,578E+05
40,75
34
0,0688
3,269E+05
45
34
0,0792
3,975E+05
45
35
0,1298
7,412E+05
46,5
35
0,1118
6,189E+05
46,5
35,5
0,1414
8,200E+05
47,5
36
0,1968
1,196E+06
47,5
36
0,2451
1,524E+06
51
36,75
0,3598
2,303E+06
51
37
0,3289
2,093E+06
57
37,25
0,463
3,004E+06
60
37,5
0,423
2,732E+06
60
37,75
0,625
4,104E+06
63
38
0,537
3,507E+06
O.D
0,6992
0,8641
1,0713
1,2237
1,4013
1,5545
1,5357
1,5681
1,5938
1,7242
1,7604
1,9798
2,0143
2,0465
2,2497
2,0703
2,2621
Conteo
7,542E+06
9,572E+06
7,506E+06
1,015E+07
8,774E+06
1,103E+07
9,618E+06
1,155E+07
1,033E+07
1,208E+07
1,128E+07
1,237E+07
1,194E+07
1,286E+07
1,276E+07
1,323E+07
1,290E+07
1,441E+07
1,436E+07
1,437E+07
1,440E+07
Conteo
4,608E+06
5,728E+06
7,135E+06
8,170E+06
9,377E+06
1,042E+07
1,029E+07
1,051E+07
1,068E+07
1,157E+07
1,182E+07
1,331E+07
1,354E+07
1,376E+07
1,514E+07
1,392E+07
1,522E+07
Anexo B
Tabla 39. Modelo primario pH=4, aw =0.957, T=20ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
71,50
0,0321
7,765E+04
95,00
0,2692
1,688E+06
100,50
0,7385
4,875E+06
101,25
0,8223
5,444E+06
101,50
0,8443
5,594E+06
101,75
0,8894
5,900E+06
102,00
0,9135
6,064E+06
102,50
0,9848
6,548E+06
103,00
1,0440
6,950E+06
117,50
1,9395
1,303E+07
118,50
1,9385
1,303E+07
Tabla 40. Modelo primario pH=4, aw =0.937, T=25ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
41,50
0,0476
1,829E+05
188,00
0,3646
2,336E+06
189,00
0,3139
1,992E+06
208,00
0,5310
3,466E+06
211,00
0,5600
3,663E+06
214,00
0,6142
4,031E+06
214,50
0,6200
4,070E+06
232,50
0,8355
5,534E+06
237,00
0,9177
6,092E+06
257,50
1,1091
7,392E+06
260,50
1,2649
8,450E+06
281,50
1,3916
9,311E+06
66
Anexo B
Tabla 41. Modelo primario pH=4, aw =0.995, T=30ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
46,50
0,7282
4,805E+06
47,50
0,9046
6,003E+06
48,00
1,0417
6,934E+06
48,50
1,1759
7,846E+06
49,00
1,3038
8,715E+06
50,00
1,5794
1,059E+07
50,50
1,6695
1,120E+07
51,00
1,7711
1,189E+07
51,50
1,8224
1,224E+07
52,00
1,9123
1,285E+07
52,50
1,9667
1,322E+07
Tabla 42. Modelo primario pH=4, aw =0.965, T=35ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
38,50
0,3427
2,187E+06
39,00
0,4131
2,665E+06
39,50
0,4749
3,085E+06
40,00
0,6252
4,106E+06
40,50
0,7778
5,142E+06
41,00
0,9091
6,034E+06
41,50
1,0637
7,084E+06
42,00
1,2587
8,408E+06
42,50
1,3948
9,333E+06
43,00
1,5179
1,017E+07
44,00
1,7419
1,169E+07
45,00
1,8301
1,229E+07
46,00
1,9027
1,278E+07
67
Anexo B
Tabla 43. Modelo primario pH=5, aw =0.995, T=25ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
28,50
0,0511
2,067E+05
30,50
0,0962
5,130E+05
39,50
0,5073
3,305E+06
40,00
0,5332
3,481E+06
40,50
0,5991
3,928E+06
41,00
0,6919
4,559E+06
41,50
0,7945
5,256E+06
42,00
0,8971
5,952E+06
43,00
1,1487
7,661E+06
43,50
1,2333
8,236E+06
44,00
1,3392
8,955E+06
44,50
1,4423
9,655E+06
45,00
1,5113
1,012E+07
46,00
1,7268
1,159E+07
47,00
1,8575
1,247E+07
48,00
1,9420
1,305E+07
Tabla 44. Modelo primario pH=5, aw =0.965, T=30ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
38,50
0,0999
5,381E+05
39,50
0,1366
7,874E+05
40,50
0,2295
1,418E+06
41,00
0,2800
1,761E+06
41,50
0,3792
2,435E+06
42,00
0,4158
2,684E+06
42,50
0,5774
3,781E+06
43,00
0,7134
4,705E+06
44,25
1,0960
7,303E+06
44,75
1,1962
7,984E+06
45,00
1,2615
8,427E+06
47,50
1,6689
1,119E+07
48,50
1,6860
1,131E+07
50,50
1,9185
1,289E+07
68
Anexo B
Tabla 45. Modelo primario pH=5, aw =0.957, T=35ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
38,50
0,2483
1,546E+06
39,00
0,2876
1,813E+06
39,50
0,3515
2,247E+06
40,00
0,4397
2,846E+06
40,50
0,5982
3,922E+06
41,00
0,7143
4,711E+06
41,50
0,8324
5,513E+06
42,00
0,9933
6,606E+06
42,50
1,2156
8,115E+06
43,00
1,3824
9,248E+06
44,25
1,7131
1,149E+07
44,75
1,7911
1,202E+07
45,00
1,8243
1,225E+07
Tabla 46. Modelo primario pH=5.6, aw =0.995, T=20ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
85,25
0,1383
7,989E+05
86,50
0,1557
9,171E+05
87,50
0,1862
1,124E+06
89,00
0,2607
1,630E+06
93,75
0,7618
5,033E+06
94,25
0,8246
5,460E+06
94,50
0,8541
5,660E+06
95,50
0,9346
6,207E+06
96,50
1,0478
6,976E+06
97,50
1,1917
7,953E+06
99,00
1,4411
9,647E+06
100,00
1,5455
1,036E+07
100,50
1,5697
1,052E+07
101,25
1,6615
1,114E+07
102,00
1,7591
1,181E+07
103,00
1,8797
1,263E+07
69
Anexo B
Tabla 47. Modelo primario pH=5.6, a w =0.937, T=35ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
99,00
0,0852
4,383E+05
115,50
0,0739
3,615E+05
113,50
0,0801
4,036E+05
119,50
0,0878
4,559E+05
134,50
0,1233
6,970E+05
159,00
0,2171
1,334E+06
233,00
0,5989
3,927E+06
254,00
0,6944
4,576E+06
283,00
0,7478
4,938E+06
305,00
0,7705
5,093E+06
380,50
0,8102
5,362E+06
404,50
0,8183
5,417E+06
Tabla 48. Modelo primario pH=6, aw =0.995, T=20ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
66,50
0,0496
1,041E+04
68,50
0,0665
3,113E+05
70,00
0,0930
4,913E+05
71,00
0,1223
6,903E+05
73,50
0,0845
4,335E+05
75,50
0,1480
8,648E+05
76,50
0,1931
1,171E+06
77,00
0,2265
1,398E+06
78,00
0,2543
1,587E+06
79,00
0,2943
1,858E+06
88,00
1,5472
1,037E+07
89,50
1,6267
1,091E+07
91,00
1,6952
1,137E+07
93,50
1,9203
1,290E+07
70
Anexo B
Tabla 49. Modelo primario pH=6, aw =0.937, T=30ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
239,00
0,1555
9,157E+05
241,00
0,1620
9,599E+05
245,75
0,1984
1,207E+06
262,50
0,2236
1,378E+06
264,50
0,2450
1,524E+06
270,50
0,2756
1,731E+06
285,50
0,2818
1,774E+06
307,00
0,3721
2,387E+06
381,00
0,6206
4,074E+06
402,00
0,7059
4,654E+06
431,00
0,7276
4,801E+06
453,00
0,7857
5,196E+06
528,50
0,8054
5,330E+06
552,50
0,8075
5,344E+06
Tabla 50. Modelo primario pH=6, aw =0.995, T=35ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
38,50
0,2713
1,702E+06
39,00
0,3084
1,954E+06
39,50
0,3771
2,421E+06
40,00
0,5057
3,294E+06
40,50
0,6295
4,135E+06
41,00
0,7654
5,058E+06
41,50
0,9351
6,210E+06
42,00
1,1415
7,612E+06
42,50
1,3143
8,786E+06
43,00
1,4935
1,000E+07
44,00
1,7746
1,191E+07
45,00
1,9005
1,277E+07
46,00
2,0473
1,376E+07
71
Anexo B
Tabla 51. Modelo primario pH=5, aw =0.957, T=20ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
64,50
0,0336
8,784E+04
66,00
0,0522
2,142E+05
67,00
0,0606
2,712E+05
68,50
0,0849
4,362E+05
70,00
0,1243
7,038E+05
71,00
0,1682
1,002E+06
73,50
0,0210
2,263E+03
76,50
0,0291
5,727E+04
77,00
0,0308
6,882E+04
78,00
0,0514
2,087E+05
79,00
0,0903
4,729E+05
88,00
1,5854
1,063E+07
89,50
1,7035
1,143E+07
91,00
1,6890
1,133E+07
93,50
1,8792
1,262E+07
Tabla 52. Modelo primario pH=4, aw =0.995, T=20ºC
Tiempo (Horas)
O.D
Conteo
0,00
0,0145
3,600E+00
41,50
0,0439
1,578E+05
64,50
0,0682
3,228E+05
66,50
0,0853
4,390E+05
73,50
0,0791
3,969E+05
75,50
0,1073
5,884E+05
76,50
0,1251
7,093E+05
77,00
0,1302
7,439E+05
78,00
0,1654
9,830E+05
79,00
0,2008
1,223E+06
88,00
1,6499
1,107E+07
91,00
1,7708
1,189E+07
72
Anexo B
Tabla 53. Modelo primario pH=6,
Tiempo (Horas)
O.D
0,00
0,0145
376,50
0,1197
380,00
0,1934
399,00
0,3203
495,50
0,7547
501,50
0,7974
521,00
0,9708
527,50
1,0309
544,00
1,1089
551,50
1,1373
567,00
1,1908
688,50
1,4073
695,50
1,3637
712,00
1,3866
73
aw =0.937, T=20ºC
Conteo
3,600E+00
6,726E+05
1,173E+06
2,035E+06
4,985E+06
5,275E+06
6,453E+06
6,861E+06
7,391E+06
7,584E+06
7,947E+06
9,417E+06
9,121E+06
9,277E+06