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PathoDx
Respiratory Virus Panel
ES
R62400
1. USO PREVISTO
El kit PathoDxTM Respiratory Virus Panel (RVP) es un ensayo de
inmunofluorescencia directa para la detección cualitativa de 7
virus respiratorios comunes (virus sincitial respiratorio, virus de la
gripe A, virus de la gripe B, virus paragripales 1, 2 y 3 y adenovirus)
en muestras de pacientes preparadas después de su crecimiento
en cultivo celular. Categoría de complejidad CLIA: Alta.
2. RESUMEN Y EXPLICACIÓN del ensayo
Las enfermedades respiratorias virales en los niños y adultos causan
una morbilidad y mortalidad considerables, especialmente en los
niños pequeños y adultos mayores. Aproximadamente el 75%
de las enfermedades respiratorias agudas es causado por virus.
Con la disponibilidad de terapias anti-virales para algunos virus,
es importante la determinación de una etiología viral para las
infecciones respiratorias.19 El uso temprano y adecuado de una
terapia antiviral eficaz puede reducir la morbilidad y mortalidad
asociadas con las infecciones virales del tracto respiratorio
inferior.
El diagnóstico de laboratorio de las infecciones virales suele
lograrse mediante serología y aislamiento/confirmación en
cultivo. La desventaja del diagnóstico serológico es la demora
y dificultad para obtener sueros de fase aguda y convaleciente.
El aislamiento/confirmación en cultivo es el método tradicional
utilizado en la mayoría de los laboratorios de virología clínica.
Aunque no es tan rápido como la detección de muestras de
pacientes directas, el aislamiento/confirmación en cultivo
sigue siendo el método más sensible para detectar patógenos
respiratorios virales.
Las muestras respiratorias (aspirados o frotis nasofaríngeos) se
analizan para detectar la presencia de antígeno viral. Los análisis
de antígeno viral con el método de centrifugación-cultivo en
vial sellado y cultivo convencional en tubo permiten obtener un
diagnóstico exacto de etiologías virales comunes de infecciones
del tracto respiratorio.
Virus sincitial respiratorio (RSV)
El virus sincitial respiratorio (RSV) es la principal causa de
enfermedad respiratoria viral aguda en lactantes y niños
pequeños. La enfermedad se produce en aproximadamente el
10–40% de los niños infectados por primera vez.1 Es responsable
del 50% de los casos de bronquiolitis y del 25% de los casos de
neumonía durante los primeros meses de vida.2,3 Por lo general,
la infección por RSV en los niños mayores y adultos presenta los
síntomas de un resfriado común pero también puede causar
infección significativa del tracto respiratorio inferior en los
adultos, especialmente en los mayores.1
El RSV se encuentra difundido por todo el mundo y causa
brotes anuales de enfermedad respiratoria en el invierno,
particularmente en los climas templados.3 El virus es muy
contagioso y los niños infectados lo liberan durante 1 a 2 semanas
después de su hospitalización y durante 2 a 3 semanas en total.4
La alta capacidad infecciosa del RSV y la ocurrencia de reinfección
a pesar de la presencia de anticuerpos circulantes5,6 ha hecho que
este virus sea la causa más frecuente de infección nosocomial en
las salas pediátricas.7
La ribavirina en aerosol controla la bronquiolitis y la neumonía
por RSV.8,9 Es fundamental un diagnóstico temprano y rápido
de las infecciones por RSV para iniciar la terapia y controlar
las infecciones nosocomiales. Se ha comprobado que la
inmunofluorescencia es sensible y específica para la detección
de antígenos de RSV en secreciones nasofaríngeas.10–13 Estos
estudios demuestran que pueden utilizarse anticuerpos muy
específicos contra el RSV para la detección de antígenos en una
muestra de paciente en cultivo celular.
El aislamiento de RSV en cultivo celular puede lograrse con
diferentes líneas celulares, como células HEp-2, HeLa, A549 y
Vero. El efecto citopático (EC) del RSV puede observarse ya 2 días
después la inoculación, aunque en algunos aislados puede tardar
hasta 10 días.
Virus de la gripe
Los virus de la gripe son virus ARN de hebra negativa de la familia
Orthomyxoviridae. Los virus de la gripe A y B pertenecen al mismo
género, mientras que el virus de la gripe C pertenece a un género
separado.
El virus de la gripe A, y en menor grado el de la gripe B,
muestran variación antigénica en las proteínas hemaglutinina
y neuraminidasa. Los subtipos de Gripe A se identifican por los
antígenos hemaglutinina y neuraminidasa, H1-H13 y N1-N9,
respectivamente.15 Cada año se producen cambios menores en
estos antígenos, llamados deriva antigénica. Los cambios mayores
debidos al reordenamiento de segmentos genéticos se conocen
como variaciones antigénicas. Estas variaciones pueden causar
pandemias cada 10 a 30 años. Las cepas H1N1, H3N2 se han
asociado con pandemias en humanos.15
Las infecciones gripales se asocian con brotes estacionales
de enfermedad respiratoria como faringitis, crup, bronquitis
y neumonía.17 La “temporada de gripe” se extiende desde
noviembre a abril en el hemisferio septentrional y desde mayo
a octubre en el hemisferio meridional. En los climas tropicales, la
gripe puede ser endémica y las epidemias pueden tener lugar más
de una vez al año.15 Por lo general, predomina un tipo, el A o el B,
durante cada epidemia.18
El aislamiento e identificación del virus es el método de laboratorio
habitual para su diagnóstico.15–17 La inoculación en cultivo tisular,
en lugar de la inoculación en huevos, es el método más común
de aislamiento. El uso del método de ensayo de centrifugacióncultivo en vial sellado junto con el método de cultivo tisular
puede permitir obtener un diagnóstico en el término de un día
aproximadamente. Los virus Gripe A y B pueden aislarse en
cultivos en tubo o en viales sellados de MRC-5, RD, A549, HL y
MDCK con o sin la presencia de tripsina.15,17 Por lo general, el
virus Gripe B produce un EC antes que el A, generalmente 5–10
días después de la infección. La hemaglutinación o hemadsorción
pueden realizarse antes de observar el EC y confirmarse la
identificación viral final con anticuerpos monoclonales marcados
con fluoresceína.
Virus paragripales
Los virus paragripales (PIV) pertenecen al género Paramyxoviridae,
al igual que el RSV. Al igual que los virus de la gripe, los virus
paragripales también presentan actividad de hemaglutinina,
neuraminidasa y fusión celular. Se han identificado cuatro
serotipos de virus paragripales humanos (tipos 1, 2, 3 y 4). Los
virus del tipo 1, 2 y 3 pueden aislarse fácilmente mediante cultivo
celular mientras que el virus tipo 4 es más difícil de cultivar.20,21
Los virus paragripales y el RSV son los patógenos respiratorios
virales más importantes en los lactantes y los niños pequeños.
Las enfermedades clínicas causadas por los virus paragripales
son: rinorrea, tos, crup (laringotraqueobronquitis), bronquiolitis
y neumonía.22,23 Los virus del tipo 1 y 2 son una de las causas
más comunes de crup. Si bien la infección por el tipo 3 puede
producir crup, el tipo 3 de este virus es la segunda causa más
común de bronquiolitis y neumonía después del RSV en lactantes
de menos de 6 meses de vida.21 En los niños mayores y adultos, las
infecciones por los virus paragripales pueden ser asintomáticas
o manifestarse como un resfriado común. El virus de tipo 4
se ha asociado únicamente con infecciones leves en las vías
respiratorias superiores en niños y adultos.21
células fijadas con acetona, se lavan para eliminar los anticuerpos
no unidos, se montan con glicerol tamponado y se observan al
microscopio de fluorescencia. Los virus responsables emiten una
fluorescencia de color verde claro característica y las células no
infectadas se contratiñen de color rojo.
4. REACTIVOS
CONTENIDO DEL KIT
Respiratory Virus Panel
1.
Reactivo de detección de panel
de virus respiratorio (R62416)
2.
Reagente di controllo negativo per
virus respiratori (RVP) (R62412)
3.
Portaobjetos de control de panel
de virus respiratorio (R62414)
4.
Reactivo RSV (R62411)
Por lo general, el aislamiento en cultivo celular de los virus
paragripales se realiza con células de riñón de mono Rhesus
primario o líneas celulares de riñón humano. Las líneas celulares
que se han utilizado con éxito para propagar virus paragripales
son RMK, HEK, LLC-MK2, Vero, A549 y HEp-2.21 El EC paragripal,
cuando está presente, por lo general puede detectarse 5–10
días después de la inoculación. Puede obtenerse una presunta
de la infección por este virus analizando la confirmación
hemadsorción de eritrocitos de cobayos y confirmando
la identificación final del virus con anticuerpos monoclonales
marcados con fluoresceína.21,22,24
5.
Reactivo Gripe A (R62405)
6.
Reactivo Gripe B (R62406)
7.
Reactivo Paragripe 1 (R62408)
8.
Reactivo Paragripe 2 (R62409)
9.
Reactivo Paragripe 3 (R62410)
10.
Reactivo Adenovirus (R62407)
11.
Adenovirus
Los adenovirus humanos son virus de ADN de doble hebra sin
envuelta que pertenecen a la familia Adenoviridae. Se han
identificado 47 serotipos humanos y la mayoría se asocia con
infecciones respiratorias u oculares.25 La enfermedad en el
tracto respiratorio superior es leve. En cambio, la enfermedad
en el tracto respiratorio inferior causada por los tipos 3, 4, 7 y
21 puede provocar bronquitis, crup, bronquiolitis y neumonía.26
Las infecciones por adenovirus en adultos no son significativas,
a excepción de infecciones en los huéspedes inmunocomprometidos y brotes ocasionales en las poblaciones de
reclutas militares.27,28
12.
Líquido de montaje
respiratorio (R62413)
Instrucciones de uso
3. PRINCIPIOs biológicos del Procedimiento
El kit PathoDx Respiratory Virus Panel consta de un reactivo de
detección que contiene anticuerpos monoclonales contra cada
virus respiratorio y siete reactivos de anticuerpos monoclonales
específicos para cada virus. Todos los reactivos contienen
anticuerpo monoclonal marcado con fluoresceína. Las células
fijadas con acetona de cultivos celulares positivos o cultivos en
vial sellado se tiñen con el reactivo de detección de RVP y el
reactivo de control negativo. El reactivo de detección contiene
anticuerpos monoclonales marcados con fluoresceína contra el
RSV, el virus gripal A, el virus gripal B, los virus paragripales 1, 2 y
3 y el adenovirus. Reaccionan específicamente contra cualquiera
de los antígenos virales anteriores, si están presentes en la célula.
El reactivo de control negativo contiene anticuerpos murinos
marcados con fluoresceína que no reaccionan con los agentes
virales. El anticuerpo no unido y la contratinción de azul de Evans
se lavan con solución salina tamponada y el portaobjetos se monta
con glicerol tamponado. Bajo microscopia de fluorescencia, los
antígenos virales detectados por los anticuerpos monoclonales
emiten una fluorescencia de color verde claro característica.
Las células no infectadas se contratiñen de color rojo con azul
de Evans. Para identificar cuáles de los siete virus respiratorios
reaccionan con el reactivo de detección, se tiñen preparados de
200 ensayos (R62400)
1 frasco cuentagotas
(cappuccio bianco)
1 frasco cuentagotas
(tapón rojo)
1 paquete de portaobjetos
de control
1 frasco cuentagotas
(tapón gris)
1 frasco cuentagotas
(tapón azul)
1 frasco cuentagotas
(tapón morado)
1 frasco cuentagotas
(tapón verde)
1 frasco cuentagotas
(tapón naranja)
1 frasco cuentagotas
(tapón blanco)
1 frasco cuentagotas
(tapón amarillo)
1 frasco cuentagotas
(tapón azul)
1
5. Descripción, preparación para el uso y
almacenamiento
Si desea más información, consulte el apartado Advertencias
y precauciones en este folleto.
Este producto se suministra listo para usar y no requiere
preparación adicional. Guardar a 2–8°C, protegido de la luz.
Utilizar hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Deje
que el producto se estabilice a temperatura ambiente (15–28°C)
antes de usarlo.
Los componentes se venden por separado.
Reactivo RSV
Un frasco cuentagotas contiene 2,0 ml (aproximadamente 40 ensayos) de anticuerpos
monoclonales murinos purificados marcados
con fluoresceína y contratinción de azul de
Evans en una solución tampón estabilizada
con proteína, con 0,098% de azida sódica
como conservante.
Reactivo Gripe A
Un frasco cuentagotas contiene 2,0 ml
(aproximadamente 40 ensayos) de anticuerpos
monoclonales murinos purificados marcados
con fluoresceína y contratinción de azul de
Evans en una solución tampón estabilizada
con proteína, con 0,098% de azida sódica
como conservante.
Un frasco cuentagotas contiene 2,0 ml
(aproximadamente 40 ensayos) de anticuerpos
monoclonales murinos purificados marcados
con fluoresceína y contratinción de azul de
Evans en una solución tampón estabilizada
con proteína, con 0,098% de azida sódica
como conservante.
Reactivo Adenovirus
Un frasco cuentagotas contiene 2,0 ml
(aproximadamente 40 ensayos) de anticuerpos
monoclonales murinos purificados marcados
con fluoresceína y contratinción de azul de
Evans en una solución tampón estabilizada
con proteína, con 0,098% de azida sódica
como conservante.
Reactivo de control negativo
Un frasco cuentagotas con 10,0 ml de anticuerpos IgG murinos purificados marcados
con fluoresceína, no reactivos con ningún
virus respiratorio y contratinción de azul de
Evans en una solución tampón estabilizada
Portaobjetos de control de panel de virus
respiratorio
Cinco portaobjetos en envases individuales
de papel de aluminio sellados con desecante.
Cada portaobjetos de control tiene ocho
pocillos. Cada pocillo está claramente
marcado con el tipo de célula infectada por
virus que se encuentra en el portaobjetos.
Uno de los pocillos contiene células LLC-MK2
no infectadas. El portaobjetos se encuentra
fijado con acetona. Antes de utilizarlo,
deje que el portaobjetos se estabilice a
temperatura ambiente (15–28°C) en el envase
de papel de aluminio. Retire el portaobjetos
sujetándolo sólo por los bordes. Las células
infectadas por virus son las siguientes:
RSV
Gripe A­
Gripe B­
Paragripe 1­
Paragripe 2­
Paragripe 3­
Adenovirus 5­
Cepa de Long, ­ATCC® VR-26/HEp-2­
Cepa A/Port Chalmers/1/73, ATCC® VR-810/MDCK­
Cepa B/Maryland/1/59,­ATCC® VR-296/MDCK­
Cepa C-35, ­ATCC® VR-94/LLC-MK2­
Cepa Greer, ­ATCC® VR-92/LLC-MK2­
Cepa C 243, ­ATCC® VR-93/LLC-MK2­
Cepa adenoide 75, ­ATCC® VR-5/A-549­
6. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES.
Reactivos sólo para uso en diagnósticos in vitro.
Sólo para uso profesional.
Si desea más información sobre los componentes potencialmente
peligrosos, consulte la hoja de datos de seguridad del fabricante y
el etiquetado del producto.
PRECAUCIONES DE SEGURIDAD
1.
Reactivo de detección de panel de virus
respiratorio
Un frasco cuentagotas con 10,0 ml (aproximadamente 200 ensayos) de anticuerpos
monoclonales murinos purificados marcados
con fluoresceína específicos para el RSV, los
virus gripales A y B, los virus paragripales 1,
2 y 3, y adenovirus y contratinción de azul de
Evans en una solución tampón estabilizada
con proteína, con 0,098% de azida sódica
como conservante.
Reactivo Paragripe 3
Un frasco cuentagotas contiene 2,0 ml
(aproximadamente 40 ensayos) de anticuerpos
monoclonales murinos purificados marcados
con fluoresceína y contratinción de azul de
Evans en una solución tampón estabilizada
con proteína, con 0,098% de azida sódica
como conservante.
Líquido de montaje respiratorio
Un frasco cuentagotas con 15 ml de
líquido de montaje, consistente en glicerol
tamponado con 0,098% de azida sódica como
conservante.
Reactivo Paragripe 2
Un frasco cuentagotas contiene 2,0 ml
(aproximadamente 40 ensayos) de anticuerpos
monoclonales murinos purificados marcados
con fluoresceína y contratinción de azul de
Evans en una solución tampón estabilizada
con proteína, con 0,098% de azida sódica
como conservante.
Reactivo Paragripe 1
Un frasco cuentagotas contiene 2,0 ml
(aproximadamente 40 ensayos) de anticuerpos
monoclonales murinos purificados marcados
con fluoresceína y contratinción de azul de
Evans en una solución tampón estabilizada
con proteína, con 0,098% de azida sódica
como conservante.
con proteína, con 0,098% de azida sódica
como conservante.
Reactivo Gripe B
2.
3.
4.
Se ha añadido a los reactivos azida sódica en concentraciones
del 0,098% como agente antibacteriano. Para evitar la
acumulación de azidas metálicas explosivas en las tuberías
de plomo y cobre, los reactivos deben diluirse e irrigarse con
grandes cantidades de agua antes de desecharlos. Utilice
sistemas de drenaje que no contengan cobre ni plomo
siempre que sea posible.
Muestras clínicas: Deben tomarse las precauciones
de seguridad adecuadas durante la manipulación y
procesamiento de todas las muestras clínicas ya que puede
haber microorganismos vivos patógenos. Deben seguirse las
buenas prácticas de laboratorio durante la manipulación de
los cultivos sospechados de contener virus infecciosos.
Material de desecho: Esterilice todo el material de desecho
antes de eliminarlo, según los procedimientos de laboratorio
habituales y las reglamentaciones locales.
El reactivo contiene el tinte azul de Evans. Aunque su
concentración es tan baja que el producto no se puede
clasificar como cancerígeno, debe evitarse el contacto con
la piel.
5.
La acetona (no suministrada) es un disolvente orgánico
inflamable. Utilizar en un lugar bien ventilado y lejos de
cualquier fuente de ignición potencial.
PRECAUCIONES DE MANIPULACIÓN
Este producto no se debe usar si (1) ha pasado la fecha de
caducidad o (2) pueden observarse otros signos de deterioro.
7. OBTENCIÓN, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE DE
MUESTRAS
Todas las muestras deben colocarse en un medio de transporte
viral y transportarse lo antes posible al laboratorio en hielo.
Debe evitarse congelar las muestras. Si la muestra no puede
inocularse en dos días, debe congelarse a –70°C. Utilice medio de
transporte viral (MTV) que no inhiba el crecimiento de ninguno
de los virus respiratorios o células en cultivo. Los medios de
transporte viral recomendados son M4®, M4RT® y M5® de Remel
Inc. Los laboratorios deben establecer los procedimientos para
la recogida y transporte de muestras adecuados a sus propias
necesidades. Pueden encontrarse pautas y recomendaciones en
varios manuales de laboratorio.30-35
8. Procedimiento
MATERIALES SUMINISTRADOS
El kit Respiratory Virus Panel (62400) contiene materiales
suficientes para realizar 200 ensayos; consulte el apartado
Contenido del kit en este folleto.
MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
1.
Portaobjetos para microscopio (de 2 pocillos y 8 pocillos)
con pocillos de 5–8 mm de diámetro con recubrimiento
hidrófobo resistente a la acetona. Los pocillos deben estar
separados a una distancia suficiente para evitar que las
muestras o reactivos pasen de un pocillo a otro. Utilice
portaobjetos limpiados con acetona.
2.
Acetona — grado de reactivo o superior, almacenada en
vidrio.
3.
Tubos de cultivo de 16×125 mm o viales sellados de un dram y un
diámetro de 12 mm, cubreobjetos n° 1, con células adecuadas
para aislar los virus respiratorios. Para ello se recomienda
utilizar células primarias de riñón de mono, MDCK, LLC-MK2,
HEp-2 u otras células que sean sensibles a los diferentes
virus respiratorios.
4.
Centrífuga con capacidad de al menos 600–700×g para el
procesamiento de las muestras de los pacientes.
5.
Cepas de virus respiratorios conocidos como controles, como
por ejemplo cepas American Type Culture Collection (ATCC®)
o aislados de laboratorio previamente identificados:
Virus
RSV
Gripe A­
Gripe B­
Paragripe 1­
Paragripe 2­
Paragripe 3­
Adenovirus 5­
6.
7.
8.
Línea celular
Cepa de Long, ­ATCC® VR-26/HEp-2­
Cepa A/Port Chalmers/1/73, ATCC® VR-810/MDCK­
Cepa B/Maryland/1/59,­ATCC® VR-296/MDCK­
Cepa C-35, ­ATCC® VR-94/LLC-MK2­
Cepa Greer, A
­ TCC® VR-92/LLC-MK2­
Cepa C 243, A
­ TCC® VR-93/LLC-MK2­
Cepa adenoide 75, ­ATCC® VR-5/A-549­
Medio de mantenimiento de cultivo tisular [Medio esencial
mínimo de Eagle con suero bovino fetal al 2%, HEPES 15 mM,
0,8 g/l de bicarbonato de sodio y antibióticos (100–250 U/
ml de penicilina G y 100 µg/ml de estreptomicina o de 5 a
10 µg/ml de gentamicina, o equivalente)].
Medio de mantenimiento de cultivo tisular sin suero.
Pipetas graduadas estériles de 10, 5 y 1 ml.
9.
10.
11.
Pipetas Pasteur estériles.
Pinzas de punta fina.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS: fosfato de sodio
0,01 M, cloruro de sodio 0,15 M, pH 7,2–7,4, sin calcio ni iones
de magnesio). Puede añadirse 0,05 g/dl de timerosal o 0,01 g/dl
de azida sódica como agente bacteriostático.
12. Cubreobjetos n° 1 de 22×50 mm.
13. Vaso de precipitado, jarra de Coplin o botella para lavado
para lavar los portaobjetos.
14. Papel absorbente para secar los portaobjetos.
15. Cámara húmeda oscura adecuada para incubar portaobjetos.
16. Incubadora de 30–36°C, con un aparato de tambor de rodillo,
si se utilizan tubos de cultivo.
17. Microscopio de fluorescencia con filtros para fluorescencia
(excitación máxima – 490 nm; emisión máxima – 520 nm)
con objetivos con una capacidad de aumento de 160–250X
y 400–630X.
18. Centrífuga con soporte para viales de 1 dram. (Opcional
– para método de centrifugación-cultivo en vial sellado
únicamente.)
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Inoculación de los cultivos celulares
Si deben utilizarse viales sellados de un dram, se recomienda
inocular cultivos en tubo para tener más probabilidades de
aislar los virus respiratorios y recuperar otros virus. Los cultivos
de células sensibles deben inocularse según los procedimientos
habituales.2,10,11 Deben inocularse cultivos de control positivo
o negativo consistentes en cepas o aislados conocidos de virus
respiratorios en viales sellados o cultivos convencionales junto
con cada grupo de muestras de los pacientes para asegurarse
de que se han seguido los procedimientos de cultivo y
detección. Precaución: Utilice técnica aséptica durante todo el
procedimiento de ensayo.
NOTA: Se ha informado que el uso del método de ensayo de
centrifugación-cultivo en vial sellado [(600–700xg) durante
1 hora a temperatura ambiente (15–28°C)] facilita el aislamiento
de algunos virus.14,16,22,26
Frotis nasofaríngeos en medio de transporte viral
La torunda con la muestra del frotis debe agitarse con varias
cuentas de vidrio durante 20–30 segundos para eliminar los virus
y células. Retire la torunda del medio y presiónela con fuerza
contra la parte interior del tubo para exprimir todas las células,
virus y líquido recogidos.
Secreciones nasofaríngeas
Agite las muestras con varias cuentas de vidrio para liberar
cualquier virus asociado a las células.
1.
Paso a
Paso b
Preparación de la muestra
Centrifugue el eluido del frotis o la secreción
nasofaríngea procesada a 600×g durante 5 minutos
para obtener un sedimento celular.
Elimine el sobrenadante aspirando con una pipeta
estéril y guárdelo para inocular los viales sellados y/o
el cultivo en tubo. Vuelva a suspender el sedimento
celular con 5 ml de solución salina tamponada con
fosfato estéril (PBS), pH 7,0–7,6.
Paso c
Paso d
2.
Paso a
Paso b
Paso c
Paso d
Paso e
3.
Paso a
Paso b
Paso c
Paso d
Paso e
Paso f
Paso g
Centrifugue las células a 600×g durante 5 minutos y
repita el lavado con PBS una vez más, si es necesario,
para eliminar cualquier mucosidad residual que pudiera
dar como resultado una fluorescencia inespecífica.
Después del último lavado, elimine todo el sobrenadante
dejando únicamente de 100 a 200 µl. Vuelva a
suspender el sedimento celular en el líquido restante
pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para
obtener una suspensión uniforme.
Procedimiento de cultivo en tubo
Extraiga el medio de cultivo de una línea celular
adecuada cultivada en tubos de cultivo de vidrio
(16×125 mm). Aclare la monocapa celular con medio de
mantenimiento de cultivo tisular sin suero y aspirado.
Inocule 0,2–0,5 ml de muestra procesada en cada
cultivo en tubo. Se recomienda inocular todas las
muestras clínicas por duplicado para aumentar la
sensibilidad.
Incube los tubos durante una hora a 33–36°C.
Extraiga el inóculo y añada 2 ml de medio de
mantenimiento de cultivo tisular fresco sin suero
precalentado.
Incube los tubos a 33–36°C con o sin agitación y examine
la monocapa de cultivo periódicamente para detectar
el efecto citopático (EC). Algunos virus muestran un
EC característico que facilita su identificación. Puede
realizarse la hemadsorción con eritrocitos de cobayo
frescos pero las células deben lavarse antes de proceder
a su tinción.
Procesamiento y tinción de cultivo en tubo
Cuando la monocapa de cultivo presenta un EC o
después de un período de incubación adecuado, retire
el medio de cultivo del tubo y colóquelo en un tubo
estéril para su ulterior pasaje, en caso de ser necesario.
Aclare la monocapa con PBS estéril y aspire. Añada 0,5
ml de PBS estéril.
Raspe y remueva las células de la superficie del tubo
utilizando una pipeta Pasteur. (Utilice una pipeta nueva
para cada aislado).
Utilizando la misma pipeta, aspire la suspensión celular
suavemente para obtener una suspensión monocelular.
Debe haber suficientes células para que la suspensión
tenga un aspecto turbio notorio.
Coloque 5–10 µl de la muestra procesada sobre un pocillo de
5–8 mm de un portaobjetos para microscopio de 2 pocillos y
8 pocillos. Repita este procedimiento para cada cultivo
celular que desea analizar. Deje que el portaobjetos se
seque al aire completamente.
Fije los portaobjetos con acetona durante 10 minutos
a temperatura ambiente (15–28°C). Elimine la acetona
de los portaobjetos y deje que se sequen al aire. Si los
portaobjetos no se pueden teñir de inmediato, pueden
almacenarse desecados a 2–8°C hasta una semana
antes de proceder a su tinción o a –20°C hasta un año.
Coloque una gota de reactivo de detección de RVP
sobre un pocillo de un portaobjetos de 2 pocillos
que contenga la muestra, asegurándose de cubrirlo
en su totalidad. Repita este procedimiento para cada
portaobjetos de muestras de 2 pocillos.
Paso h
Coloque una gota de reactivo de control negativo sobre
el pocillo restante de un portaobjetos de 2 pocillos que
contenga muestra. Repita este procedimiento para cada
portaobjetos de 2 pocillos.
Paso i
Coloque el portaobjetos en una cámara húmeda a
35–37°C durante 15–30 minutos.
Paso j
Coloque el portaobjetos en una jarra de Coplin
o vaso de precipitado que contenga PBS. Lave
el portaobjetos agitándolo suavemente durante
2–4 minutos, incluyendo un cambio de PBS.
Paso k Golpee suavemente el portaobjetos o páselo sobre
papel secante para eliminar la PBS sobrante y móntelo
con líquido de montaje y un cubreobjetos. Elimine las
burbujas de aire y el líquido de montaje sobrante con
papel absorbente.
Paso l
Examine mediante microscopia de fluorescencia con
un aumento de 100X a 400X. Examine primero los
controles positivos y negativos para asegurarse de la
eficacia del reactivo de detección de RVP. Las células
infectadas por virus emiten una fluorescencia de color
verde claro. La ausencia de fluorescencia de color verde
claro significa que las células no están infectadas por
un virus. No se observa ninguna fluorescencia con
los portaobjetos teñidos con el reactivo de control
negativo.
Paso m Si las muestras de 2 pocillos no presentan fluorescencia,
los resultados se informan como que no se ha detectado
ningún virus respiratorio.
Paso n Si los portaobjetos de 2 pocillos presentan fluorescencia
con el reactivo de detección de RVP y ninguna
fluorescencia con el reactivo de control del virus
negativo, continúe con el paso siguiente (o). (Deben
evaluarse los grupos de células con precaución ya que
es posible que haya conjugado atrapado. El reactivo de
control negativo puede indicar hasta qué punto.)
Paso o Analice el portaobjetos de 8 pocillos restante para todas
las muestras y controles que presentan fluorescencia
en el portaobjetos de 2 pocillos. Si los portaobjetos
se han almacenado a 2–8°C, deje que se estabilicen a
temperatura ambiente (15–28°C).
Paso p Añada una gota de cada uno de los reactivos de
identificación de anticuerpos monoclonales específicos
al virus a un pocillo separado del portaobjetos de
muestras de 8 pocillos. Repita este procedimiento para
cada portaobjetos de muestras.
Paso q Coloque el portaobjetos en una cámara húmeda a
35–37°C durante 15–30 minutos.
Paso r Coloque el portaobjetos en una jarra de Coplin
o vaso de precipitados que contenga PBS. Lave
el portaobjetos agitándolo suavemente durante
2–4 minutos, cambiando la PBS una vez.
Paso s Golpee suavemente el portaobjetos o páselo sobre
papel secante para eliminar la PBS sobrante y móntelo
con líquido de montaje y un cubreobjetos. Elimine las
burbujas de aire y el líquido de montaje sobrante con
papel absorbente.
Paso t
4.
Paso a
Paso b
Paso c
Paso d
Paso e
5.
Paso a
Paso b
Paso c
Paso d
Paso e
Paso f
Paso g
Paso h
Examine mediante microscopia de fluorescencia con un
aumento de 100X a 400X. Examine el portaobjetos de
control de panel de virus respiratorio para observar el
patrón característico de inmunofluorescencia de cada
una de las células infectadas por virus con su respectivo
reactivo de anticuerpo monoclonal específico. No debe
haber fluorescencia con el control celular LLC-MK2 no
infectado.
Procedimiento de cultivo en vial sellado
El número de viales sellados y líneas celulares debe
ser determinado por el laboratorio de virología que
realizará el ensayo. Se recomienda también establecer
el número y tipos de tubos de cultivo celular adecuados
para la incubación simultánea con los viales sellados.
U t i l i za n d o t é c n i c a a s é p t i c a d u ra n t e t o d o
el procedimiento, aspire y deseche el medio de
mantenimiento de los viales sellados que desea
inocular. No deje que la monocapa celular se seque.
Inocule cada vial sellado con 0,2 ml de material de
muestra y vuelva a taparlos.
Centrifugue los viales a 600–700×g durante 45 minutos a
18–35°C.
Después del centrifugado, aspire el inóculo y lave
la monocapa con 2 ml de PBS estéril o medio
de mantenimiento (precalentado a 35–37°C).
Aspire el líquido restante. Añada 2 ml de medio de
mantenimiento de cultivo tisular fresco antes de
incubar.
Incube los viales sellados a 33–36°C durante 2–4 días.
Procesamiento y tinción en vial sellado
Aspire el medio de mantenimiento de forma tal que no
se rompa la monocapa celular sobre el cubreobjetos
dentro del vial.
Aclare la monocapa dos veces con 1 ml de PBS, añadido
por el interior del vial para evitar romper la monocapa
celular.
Después de aspirar el aclarado final, añada de inmediato
1 ml de acetona.
Aspire la acetona y añada 1 ml de acetona fresca. Deje
que los viales se fijen durante 10 minutos a temperatura
ambiente (15–28°C).
Elimine la acetona y deje que la monocapa celular
se seque. (Si el cubreobjetos no debe teñirse de
inmediato, vuelva a tapar el vial y guárdelo a –20°C
o a una temperatura inferior. Cuando el cubreobjetos
esté listo para teñirse, deje que el vial se estabilice a
temperatura ambiente antes de retirar la tapa.)
Aclare el vial con 1 ml de PBS para aumentar la cohesión
de la superficie. Elimine la PBS antes de añadir el
reactivo de detección de RVP.
Añada 2–3 gotas (aproximadamente 150 µl) del reactivo
de detección de RVP al vial, asegurándose de cubrir la
totalidad del cubreobjetos. Vuelva a tapar el vial sellado
e incube a 35–37°C durante 15–30 minutos.
Aspire el reactivo de detección de RVP y lave dos veces
con 1 ml de PBS.
Paso i
Paso j
Paso k
Retire el cubreobjetos con una aguja doblada o unas
pinzas y golpee suavemente el borde del cubreobjetos
o páselo sobre papel secante para eliminar la PBS
sobrante.
Monte cada cubreobjetos sobre un portaobjetos
de vidrio colocando el lado que contiene las células
hacia abajo sobre una gota de líquido de montaje
respiratorio.
Elimine las burbujas de aire y el líquido de montaje
sobrante del cubreobjetos con papel absorbente.
Examine mediante microscopia de fluorescencia con
un aumento de 100X a 400X.
9. CONTROL DE CALIDAD
Los portaobjetos de control de virus respiratorio deben teñirse
con reactivo de detección de RVP y reactivo de control negativo
con cada lote de muestras.
Los controles positivos para los cultivos celulares deben
prepararse con aislados de virus respiratorios de laboratorio
conocidos (p. ej. de American Type Culture Collection, Rockville,
MD) o con aislados clínicos previamente identificados.
Los controles negativos para cultivos celulares deben pseudoinfectarse con medio de mantenimiento, incubarse y procesarse
de la misma manera que las muestras clínicas.
Los controles de cultivo celular demuestran la eficacia del
procedimiento de cultivo celular y la intensidad y patrón de
fluorescencia de los reactivos de detección de panel de virus
respiratorio.
Los portaobjetos de control y los portaobjetos de aislados virales
conocidos deben leerse antes de leer los aislados del paciente
para determinar la intensidad de la tinción de fluorescencia y el
grado de tinción no específica, si la hubiera.
10. INTERPRETACIÓN DEL ENSAYO
Examine los controles antes que los aislados del paciente. Véanse
más detalles en la sección Control de calidad.
NOTA: Los resultados deben ser interpretados por un técnico
especializado en el uso de un microscopio de fluorescencia.
Preparaciones de cultivo convencional en tubo
Resultado positivo: Las manchas celulares de los tubos
sospechados positivos que muestran una o más células con
un patrón característico de fluorescencia verde claro brillante
contra el fondo rojo de las células no infectadas contrateñidas
se consideran positivas para virus respiratorios, según el reactivo
utilizado.
Resultado negativo: Las manchas celulares que muestran
únicamente contratinción de color rojo oscuro de las células y
ninguna fluorescencia verde claro deben considerarse negativas
para los virus respiratorios incluidos en el proceso de tinción.
Debe haber una fluorescencia inespecífica mínima.
Preparaciones de cubreobjetos de vial sellado teñido
Resultado positivo: Los cubreobjetos que muestran una o más
células con un patrón citoplásmico granular de fluorescencia de
color verde claro brillante contra el fondo rojo de las células no
infectadas contrateñidas se consideran positivos para uno de los
7 virus respiratorios incluidos en este kit. Las células teñidas
pueden aparecer como células aisladas o multinucleadas, según
el tiempo que lleva la infección y la etapa en la que se encuentra.
Resultado negativo: Los cubreobjetos en los que las células
sólo muestran contratinción de color rojo oscuro se consideran
negativos. Los negativos deben informarse de la siguiente manera:
“Supuestamente negativos para RSV, Gripe A o B, Paragripe 1, 2
o 3 y Adenovirus por ensayo en vial sellado; se proporcionarán
posteriormente los resultados de cultivo en tubo”. Debe haber
una fluorescencia no específica mínima.
Patrón de tinción fluorescente de las células infectadas con virus
El patrón de inmunofluorescencia depende del virus causante
y su crecimiento y maduración dentro de la célula infectada.
A continuación se describen los patrones de tinción típicos
observados con los virus respiratorios.
Virus sincitial respiratorio: la fluorescencia es citoplásmica,
punteada con pequeñas inclusiones.
Gripe A y B: la fluorescencia es nuclear, citoplásmica o ambas.
La tinción nuclear es uniformemente brillante y la tinción
citoplásmica suele ser punteada con grandes inclusiones.
Paragripe 1, 2, 3: la fluorescencia es citoplásmica, punteada con
inclusiones irregulares.
Adenovirus: la fluorescencia es nuclear, citoplásmica o ambas.
La tinción nuclear es uniformemente brillante y la tinción
citoplásmica suele ser punteada.
Células negativas: las células no infectadas se tiñen de color rojo
debido a la contratinción de azul de Evans en cada reactivo de
tinción.
11. LIMITACIONES
1.
La acetona absorbe la humedad si no se guarda de forma
adecuada. Esta humedad provocará una turbidez no
específica después de la fijación. En este caso, utilice un
frasco nuevo de acetona y repita el ensayo.
2.
No congele las muestras antes de inocularlas en el cultivo
celular a menos que sea absolutamente necesario. Algunos
virus pueden no sobrevivir a la congelación.
3.
No deje que los reactivos de tinción de anticuerpo monoclonal
marcados con fluoresceína se sequen sobre el portaobjetos ya
que producirán tinción no específica alrededor de los pocillos.
Asegúrese de que hay suficiente colorante para cubrir todo el
pocillo.
4.
La fluorescencia de fondo no asociada con la tinción de la
superficie puede ser resultado de un lavado insuficiente e
impedir la total eliminación del conjugado de fluoresceína.
En estos casos, retire el cubreobjetos, lávelo bien con PBS
y vuelva a montarlo.
5.
Puede producirse una fluorescencia de color verde amarillento
opaco debido al conjugado atrapado por células agregadas
que dificultaron la fijación y el lavado. Evite la observación
de esta área del pocillo.
6.
Deben eliminarse las mucosidades de la muestra el máximo
posible para evitar la ocurrencia de reacciones falsopositivas y falso-negativas con los anticuerpos fluorescentes.
Deben tomarse las máximas precauciones al interpretar las
muestras de frotis directo en presencia de mucosidades.
7.
Los portaobjetos teñidos deben lavarse bien para evitar
que los reactivos pasen a los pocillos adyacentes. Si se
produce o sospecha una infección doble, se recomienda
utilizar portaobjetos separados fijados para cada uno de
los reactivos específicos al virus sospechado para confirmar
esta posibilidad.
8.
La detección de virus respiratorios en las muestras cultivadas
depende de la adecuada obtención y transporte de las
muestras, así como de la correcta técnica de cultivo tisular
y preparación del portaobjetos.
9.
Puede producirse tinción inespecífica debido a la unión entre
las regiones Fc del anticuerpo y las proteínas A y G que se
encuentran en algunas cepas de Staphylococcus aureus. La
unión inespecífica podría dar resultados con un valor de
predicción positivo menor.
10. Un resultado negativo con el ensayo PathoDx Respiratory
Virus Panel no excluye la posibilidad de una infección por
virus respiratorio en el paciente. La interpretación de los
resultados debe incluir la evaluación clínica del paciente y
otros procedimientos de diagnóstico. Debe analizarse otra
muestra si se sospecha fuertemente de la presencia de un
patógeno viral respiratorio.
11. Se desconocen los efectos de la terapia antiviral sobre los
resultados de este kit de ensayo.
12. Los anticuerpos monoclonales en este kit para RSV y
adenovirus son específicos a cada grupo y, en consecuencia,
no pueden utilizarse para determinar la especificidad de
tipo.
13. La exposición prolongada del portaobjetos teñido a la luz
puede reducir la intensidad de la fluorescencia.
14. Los reactivos (todos marcados con fluoresceína) vienen
listos para usar y optimizados para detectar sus respectivos
antígenos virales. La dilución u otra alteración del reactivo
de trabajo puede reducir su sensibilidad.
15. La intensidad de la fluorescencia observada depende de
las propiedades del microscopio de fluorescencia que se
utiliza. El tipo de microscopio y lente, la antigüedad y el tipo
de fuente luminosa y el conjunto del filtro y su espesor, etc.
pueden afectar al rendimiento del ensayo. El uso del control
positivo ayuda a monitorizar el funcionamiento adecuado
del microscopio de fluorescencia.
16. El uso de medio de mantenimiento de cultivo tisular sin
suero puede requerir la adición o cambio frecuentes del
medio para mantener los cultivos celulares.
12. VALORES ESPERADOS
Los resultados varían según la ubicación geográfica, la edad de
la población, el estado socioeconómico, la época del año, el
tipo de laboratorio (hospital, referencia, investigación, etc.) y la
manipulación de las muestras.36–40
13. CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO
Para demostrar la especificidad del kit PathoDx Respiratory Virus
Panel, se realizaron estudios de detección viral y bacteriana
con cada reactivo de anticuerpo monoclonal específico. A
continuación se indican los resultados obtenidos con la tinción
de portaobjetos de antígenos fijados. Todos los microorganismos
son American Type Culture Collection (ATCC®), a menos que se
indique lo contrario.
MICROORGANISMO
ANALIZADO
Adenovirus:
Tipo 3 ATCC® VR 3­
Tipo 5 ATCC® VR 5
Tipo 7 ATCC® VR 7­
Tipo 10 ATCC® VR 11­
Tipo 14 ATCC® VR 15­
Gripe A:
A2 ATCC® VR-1OO­
A2 ATCC® VR-544­
A1 ATCC® VR-546
A ATCC® VR-810­
Gripe B:
ATCC® VR-103
ATCC® VR-295­
ATCC® VR-296­
ATCC® VR-523­
RSV:
Long ATCC® VR-26­
9320 ATCC® VR-955­
Paragripe 1:
C-35 ATCC® VR-94­
Paragripe 2:
Greer ATCC® VR-92­
Paragripe 3:
C 243 ATCC® VR-93­
Coxsackievirus:
A9 ATCC® VR-186­
B4 ATCC® VR-184­
Citomegalovirus:
AD-169 ATCC® VR-538­
Ecovirus:
Tipo 4 ATCC® VR-34­
Tipo 20 ATCC® VR-50­
Tipo 22 ATCC® VR-52­
Herpes simple:
Tipo 1 ATCC® VR-539­
Tipo 2 ATCC® VR-540­
Sarampión
Aislado clínico
Paperas
Aislado clínico
Rinovirus:
tipo 39 ATCC® VR-340­
Varicela-zóster
Aislado clínico
RSV­
–­
Anticuerpos monoclonales específicos
Inf A Inf B PIV 1­ PIV 2­ PIV 3­ Adeno
–­
–­
–­
–­
–­
+­
–­
+­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
+­
–­
–­
–­
–­
+­
–­
–­
–­
–­
–­
–
–­
–­
–­
+­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
+­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
+­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
–­
Ninguno de los anticuerpos monoclonales específicos mostró
fluorescencia en el análisis con las siguientes bacterias:
Bordetella pertussis­
Branhamella catarrhalis­
Chlamydia trachomatis­
Corynebacterium diphtheriae­
Haemophilus influenzae­
Klebsiella pneumoniae­
Legionella pneumophila­
Mycoplasma hominis­
Mycoplasma pneumoniae­
Mycoplasma salivarium­
Pseudomonas aeruginosa­
Staphylococcus aureus­
Staphylococcus aureus­
Streptococcus pneumoniae­
Streptococcus pyogenes­
ATCC® 10380­
ATCC® 8176­
ATCC® VR348B­
ATCC® 19409­
ATCC® 9006­
ATCC® 33495­
ATCC® 33152­
ATCC® 23114­
ATCC® 15531­
ATCC® 23064­
ATCC® 9027­
ATCC® 25178­
ATCC® 12598­
ATCC® 10813­
ATCC® 10389­
Ninguno de los anticuerpos monoclonales específicos mostró
fluorescencia en el análisis con las siguientes líneas celulares:
Riñón de mono verde de Buffalo
Riñón de mono Cinomolgus primario
Riñón de mono Rhesus primario
Riñón de mono Rhesus
Prepucio humano
Riñón canino Madin-Darby
A-549­
Vero­
HEp-2­
LLC-MK2­
WI-38­
MRC-5­
14. RENDIMIENTO CLÍNICO
El PathoDx Respiratory Virus Panel se evaluó en dos centros
clínicos en la región oeste central de los Estados Unidos para
determinar el rendimiento clínico del panel y sus constituyentes
individuales en la detección de la presencia de los siete virus
respiratorios.
El primer centro clínico realizó dos estudios. El primer estudio
incluyó 150 muestras frescas y 50 muestras retrospectivas
seleccionadas al azar. Las muestras eran de pacientes de sexo
masculino y femenino con edades que oscilaban entre los 8
días de vida a los 91 años. Las muestras fueron principalmente
nasofaríngeas. Las muestras frescas y las muestras retrospectivas
(total n = 200) se analizaron con el procedimiento de cultivo en
vial sellado utilizando ensayos PathoDx RVP y el Kit A, un ensayo
comercial para la detección de los mismos siete virus respiratorios.
Las muestras también se analizaron según el procedimiento de
cultivo celular definitivo y pruebas de virus individuales con el
Kit A. Los resultados de estas pruebas se incluyen en la siguiente
tabla.
La comparación entre el ensayo de cultivo en vial sellado PathoDx
Respiratory Virus Panel y el ensayo de virus individual del Kit A
mostró que el ensayo de cultivo en vial sellado PathoDx detectó
todas las muestras que dieron positivas según la prueba de virus
individual del Kit A, a excepción de una muestra de RSV.
Positivo: Vial
sellado PathoDx
17­
42­
12­
12­
11­
10­
12­
Tipo de muestra
RSV
Gripe A­
Gripe B­
Paragripe 1­
Paragripe 2­
Paragripe 3­
Adenovirus
Vial sellado Kit A
Positivo
Negativo
Pos
Neg
129­
1­
0­
70­
Positivo: Kit
A individual
18­
42­
12­
12­
11­
10­
12­
Vial sellado PathoDx
Sensibilidad
relativa
100%­
Coincidencia
94%­
100%­
100%­
100%­
100%­
100%­
100%­
Especificidad
relativa
98,6%­
Coincidencia: 99,5%
Límites de confianza del 95% para sensibilidad y especificidad
relativas, respectivamente. 97,2%–100% y 92,4%–100%.
El segundo estudio realizado en este centro incluyó 168 aislados
de cultivo celular congelados retrospectivos consistentes en 29
muestras negativas para los siete virus y 139 muestras positivas
para uno o más de los siete virus. Todas las muestras se detectaron
según los procedimientos de cultivo celular de los ensayos de
virus respiratorio PathoDx y Kit A.
Cultivo celular Kit A
Positivo
Negativo
Coincidencia: 99,4 %
Cultivo celular PathoDx
Positivo
Negativo
138­
1­
0­
29­
Las muestras positivas del segundo estudio se confirmaron según
los procedimientos de virus de cultivo celular de los ensayos de
virus respiratorio PathoDx y Kit A.
Tipo de muestra
RSV
Gripe A­
Gripe B­
Paragripe 1­
Paragripe 2­
Paragripe 3­
Adenovirus
Positivo: Cultivo
celular PathoDx
30­
30­
21­
7­
13­
7­
30­
Positivo: Cultivo
celular Kit A
30­
30­
21­
7­
14­
7­
30­
Positivo
Negativo
Virus paragripales:
21. Vainionpaa, R. and T. Hypia. 1994. Clin. Microbiol. Rev. 7:265-275.
Coincidencia
100%­
100%­
100%­
100%­
93%­
100%­
100%­
El segundo centro clínico, también en la región oeste central de
los Estados Unidos, incorporó a 185 pacientes de sexo masculino
y femenino seleccionados al azar, con edades que oscilaban entre
1 día de vida y 91 años. Se proporcionaron muestras frescas,
principalmente nasofaríngeas. Se analizaron las 185 muestras
mediante el procedimiento de cultivo en vial sellado con el
ensayo PathoDx y el ensayo de inmunofluorescencia indirecta
de detección de virus respiratorio del Kit B, con los siguientes
resultados.
Vial sellado Kit B
20. Johnston, S.L.G. and C.S. Siegel. 1991. Diagn. Microbiol. Infect. Dis.
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Vial sellado PathoDx
Positivo
Negativo
43
2
4
136
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16. ENVASE
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