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Genética Molecular de los Receptores
Estudios directos e indirectos para el diagnóstico patologías.
Prof. Dra. Carina M. Rivolta
Cátedra de Genética y Biología Molecular
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Universidad de Buenos Aires
Esquema simplificado de la síntesis de hormonas tiroideas
Lumen folicular
TG
Mit
Dit
T3
T4
TG
IPendrina
I+
Mit
Dit
H2O2
Duox
TPO
al
pic
a
na
ra
b
m
me
Ial
as
b
na
ra
b
m
me
Na+
NIS
H
TS
R
H
TS
Circulación sanguínea
hAIT: transportador de yodo apical
TSH
Fisiología molecular
I-
receptor de TSH
Membrana basolateral
NIS
GS
proteína G
GDP
TTF-1, TTF-2, PAX8
Gen de la TG
Gen de la TPO
Transcripción
ARNm
Traducción
Membrana apical
ThOX
Pendrina
TPO
TG
I-
H 2O2
I
I
NH2
CH2
O
HO
OH
COOH
T3
I
RXR
TR
Co-activador
Zn
Zn
TBP
TF IIB
RNA pol
TRE
TATA
Gen Blanco
Transcripción
Objetivos
Determinación de la organización
estructural de los genes tiroideos
Identificación y caracterización de mutaciones
que causan hipotiroidismo congénito y
resistencia a hormonas tiroideas.
Desarrollo de nuevas herramientas
moleculares (directas e indirectas) con el
objetivo de mejorar el diagnóstico de las
enfermedades tiroideas
Expresión normal y patológica de los genes
tiroideos
Hipotiroidismo Congénito
Incidencia: 1/3000 - 1/4000 recién nacidos.
Origen del defecto:
Existencia de bocio:
terciario
eje hipotalámico
secundario
eje pituitario
primario
tiroides
Hipotiroidismo no bocioso (80 %)
 Causas: agenesia, disgenesia o hipoplasia
 Genes alterados: TSH-, TTF1, TTF2, PAX 8, RTSH
Hipotiroidismo con bocio (20 %)
 Causa: defectos en la síntesis de hormonas tiroideas
 Genes alterados: TG, TPO, Pendrina, NIS, DUOX2
Hipotiroidismo Congénito con Bocio
Mutaciones en el Gen de
Tiroglobulina
Representación esquemática del
gen de la Tiroglobulina
Cromosoma 8
8q24.2-8q24.3
Gen: 270 Kb
3’
5’
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12 13 14 15
16
17 18 19 20
21
22 23 24 25 26 27 28 29
30
31 32 33 34 35 36 37
5’
3’
Tipo 1
Unidades repetitivas 1-1 1-2 1-3
Tipo 2
1-4
1-5 1-6
1-7
1-8
1-9 1-10
2-1 -2 -3 1-11
Tipo 3
3a-1
3b-1
3a-2
3b-2 3a-3
Dominio de homología
a la ACHE
NH 2
COOH
Y
Y
Y
Y
Y
YY
Y
38
39 40
41
42 43
44 45 46
47
mRNA: 8,5 Kb
Proteina: 2749 aa
48
Thyroglobulin mutations identified in patients with congenital goiter and
hypothyroidism.
Individuals
TD
LD
BA
FM
GD
RS
MIO
RM
JNA
RA
HSN
TI
Reference values
Serum TG
(µg/L)
0.8
0.9
0.4
0.77
0.9
3.3
0.9
1.8
2.1
<1
5.1
2-30
TG mutations
p.G362fsX382/p.R2223H
p.R277X /p.R1511X
p.R277X /?
p.R277X /?
p.L234fsX236/p.C164Y
p.R277X / p.A2215D
p.R277X/p.R277X
p.R277X/p.R277X
p.R277X /p.R1511X
p.R277X/g.IVS34-1G>C
g.IVS30+1G>T/g.IVS30+1G>T
g.IVS3-3C>G/g.IVS3-3C>G
Toulouse/France
Buenos Aires/Argentina
Buenos Aires/Argentina
Buenos Aires/Argentina
Buenos Aires/Argentina
Buenos Aires/Argentina
Buenos Aires/Argentina
Mendoza/Argentina
São Paulo/Brasil
São Paulo/Brasil
São Paulo/Brasil
Japan
Desaminación
CGA →TGA
R → Stop
p.R277X
p.R1511X
Splicing alternativo asociado a “nonsense mutations” en
el gen de la TG humana
NH 2
COOH
Y
Y
Y
Y
Y
3’
c.4588C>T (p.R1511X)
Alternative Splicing of exon 22
NH 2
COOH
Y
Y
Y
Type 1
Repetitive units
Wild Type
1-1 1-2 1-3
Y
Y
Y
Type 2
1-4
1-5 1-6
1-7
1-8
1-9 1-10
Type 3
2-1 -2 -3 1-11
3a-1
3b-1
3a-2
Y
ACHE-like domain
3b-2 3a-3
NH 2
COOH
1 2 3
Y
Y
Y
exons
4
5
6
7
8
9
10
Y
Y
11
12 13 14 15 16
17
18
19
Y
20
21
22 23 24 25
26
27 28 29 30 31 32 33 34 35 39
36 40
37 38
41
42
43
44
Y
45 46 47
48
“Genotipificación y caracterización de dos nuevos
marcadores microsatélites en el gen de la TG humana.”
TSH
I-
r e c e p to r d e T S H
N IS
M e m b r a n a b a s o la t e r a l
G S
p r o te ín a G
GDP
T T F -1 , T T F -2 , P A X 8
T r a n s c r ip c ión
G e n d e la T G
G e n d e la T P O
ARNm
T r a d u c c ió n
M e m b ra n a a p ic a l
ThO X
P e n d r in a
TPO
TG
H 2O
I-
2
I
I
NH2
CH2
O
HO
OH
COO H
T3
I
RXR
TR
C o -a c tiv a d o r
Zn
Zn
TBP
T F I IB
R N A pol
TRE
TATA
G e n B la n c o
T r a n s c r ip c ión
Secuenciación del exón 30 y de sus
intrones flanqueantes
TGrI30
TGrI29
cagagtctaagattttgccatcccataatttttaggacttcctggggccttctgaactattcctgtctgacccaactc
ccagctctactgacttcaatcctgctctggtttcacacagcataaaaatgtctctgtctctatctctgacactttctc
tctctgtctctctctgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtttctttcttgtgtttttctcatattcactagagttaaaggtgc
aggaagttgactccctgcttctttttcag GTTTGACAACAGAACTTTTCTCCCCTGTGGACCTCAACCAGGTCATTG
Exon 30
L T T E L F S P V D L N Q V I V
TCAATGGAAATCAATCACTATCCAGCCAGAAGCACTGGCTTTTCAAGCACCTGTTTTCAGCCCAGCAGGCAAACCTAT
N G N Q S L S S Q K H W L F K H L F S A Q Q A N L W
GGTGCCTTTCTC gtaagtatccttagaactcattcttcttcttccagacactgtagtcaggcatcacaggccaagtc
tggcaactcctgagacacagataaggccaaattttgtgtcataactcatggatcactgtggatgatataaaagaaaga
tagcacataacccatatcttcaagaaggttacagtgtagttaatctctactctgcttccataacctatcttcatccac
ctgtctctccatctatccgtccattcacccatccatccatccatccatctacccatccatcccattcatccatccatc
tacccatttatccatcccatccatccttccatcccatccacccatccatccatccatccatccatccatcccattcat
ccgtccatctttgcatcccatccatccatccattcgatccatccatccatccatccatccatccatccatccatccat
ccacccatccaaccatccatccatccatgtatccatgtatccatcccatccaaccatccatccatccatccatccatc
catccatccatccatccatctatccatccatccatttggcagttattaagtatgcattatgttcaaagctttgtgttt
gattttggagaagaaagagaacacccaaaatgaatcaaatcaaccatgttccttgcccttggggagctcatatatacc
aggggcacaggctgacttgggcacaggtgcagggagaccattcacaaagttcacagtttttacagtcctgtgacctct
Objetivos
Genotipificar los nuevos marcadores.
Determinar mediante análisis estadísticos
su posible empleo para análisis de
ligamiento.
Caracterizarlos por clonado y
secuenciación.
Estudiar su asociación con el hipotiroidismo
congénito con bocio.
Genotipificación de los marcadores microsatélites
Exón 29

Exón 30


Exón 31
PCR radiactiva
ADN genómico de individuos
no relacionados

TGrI29
AtSN HSN AcSN C1
29.4:
29.3:
29.2:
29.1:
203
201
199
197
C2
TGrI30
C3
C4
N1
30.8:
30.7:
30.6:
30.5:
30.4:
pb
pb
pb
pb
542
538
534
530
522
N2
N3
N4
N5
pb
pb
pb
pb
pb
30.3: 510 pb
30.2: 506 pb
30.1: 502 pb
140 cromosomas analizados
304 cromosomas analizados
Mediciones de variación
STR
Localización
TGrI29
Intrón 29
TGrI30
Intrón 30
HET: Indice de Heterocigosidad
Alelo
Tamaño
del
producto
de PCR
(bp)
Frecuencias
alélicas
29.1
197
0.336
29.2
199
0.200
29.3
201
0.450
29.4
203
0.014
30.1
502
0.099
30.2
506
0.115
30.3
510
0.013
30.4
522
0.007
30.5
530
0.003
30.6
534
0.036
30.7
538
0.720
30.8
542
0.007
HET
PIC
0.859
0.471
0.522
0.434
PIC: Indice de contenido polimórfico
Frecuencias genotípicas de TGrI30
Frecuencias genotípicas de TGrI29
Genotipo
Observado(n)
Esperado (n)
1/1
1/2
1/3
1/4
1/5
1/6
1/7
1/8
2/2
2/3
2/4
2/5
2/6
2/7
2/8
3/3
3/4
3/5
3/6
3/7
3/8
4/4
4/5
4/6
4/7
4/8
5/5
5/6
5/7
5/8
6/6
6/7
6/8
7/7
7/8
8/8
0
3
0
1
0
2
24
0
1
1
0
0
1
27
1
0
0
0
0
3
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
7
0
78
1
0
1.489
3.461
0.391
0.210
0.090
1.083
21.669
0.210
2.010
0.454
0.244
0.104
1.258
25.171
0.244
0.025
0.027
0.011
0.142
2.845
0.027
0.007
0.006
0.076
1.532
0.014
0.001
0.032
0.656
0.006
0.196
7.879
0.076
78.796
1.532
0.007
2
X = 40.5170
P > 0.05
(no significativo)
df = 28
n = 152
Genotipo
Observado (n)
Esperado (n)
1/1
1/2
1/3
1/4
2/2
2/3
2/4
3/3
3/4
4/4
7
9
22
2
4
11
0
15
0
0
7.902
9.408
21.168
0.658
2.800
12.600
0.392
14.175
0.882
0.013
2
X = 4.9391
P >0.50 (no significativo)
df = 6
Frecuencias haplotípicas
Haplotipo
29.1/29.1 - 30.1/30.2
29.1/29.1 - 30.1/30.4
29.1/29.1 - 30.2/30.3
29.1/29.1 - 30.7/30.7
29.1/29.2 - 30.1/30.6
29.1/29.2 - 30.1/30.7
29.1/29.2 - 30.2/30.2
29.1/29.2 - 30.2/30.7
29.1/29.3 - 30.1/30.7
29.1/29.3 - 30.2/30.7
29.1/29.3 - 30.2/30.8
29.1/29.3 - 30.6/30.7
29.1/29.3 - 30.7/30.7
29.1/29.4 - 30.1/30.7
29.1/29.4 - 30.2/30.7
29.2/29.2 - 30.5/30.6
29.2/29.3 - 30.6/30.7
29.2/29.3 - 30.7/30.7
29.3/29.3 - 30.6/30.7
29.3/29.3 - 30.7/30.7
Otros
Frecuencia
0.06
0.02
0.02
0.02
0.02
0.02
0.02
0.04
0.14
0.10
0.02
0.02
0.06
0.02
0.02
0.02
0.04
0.16
0.02
0.16
0.00
n = 50
n = 70
Clonado y secuenciación de los distintos alelos
PCR
Exón 29
Exón 30
Vector pGEM-T
T
T

Exón 31
ADN genómico de individuos
conteniendo los distintos
alelos
Producto de PCR purificado a partir de gel y con
columna
JM 109
JM 109
Preparación del ADN plasmídico
Identificación del plásmido
recombinante con EcoRI.
Secuenciación del alelo
Comparación de la secuencia nucleotídica
de los alelos de TGrI29
29.
4
3b
3a
2
1b
1a
tg
tg
tg
tg
tg
tg
(tc)2
(tc)2
(tc)2
(tc)2
(tc)2
(tc)2
tg
tg
tg
tg
tg
tg
(tc)2
(tc)2
(tc)2
(tc)2
(tc)2
(tc)2
ta
ta
ta
ta
ta
ta
(tc)2
(tc)2
(tc)2
(tc)2
(tc)2
(tc)2
tg
tg
tg
tg
tg
tg
acactt
acactt
acactt
acactt
acactt
acactt
(tc)4
(tc)4
(tc)4
(tc)4
(tc)4
(tc)4
tg
tg
tg
tg
tg
tg
(tc)4
(tc)4
(tc)6
(tc)5
(tc)3
(tc)4
(tg)13
(tg)12
(tg)10
(tg)10
(tg)11
(tg)10
Comparación de la secuencia nucleotídica de los alelos de TGrI30
30.
8
7
6
5
4
3
2B
2A
1
atccgtccattcaccc(atcc)4
................(atcc)4
................(atcc)4
................(atcc)4
................(atcc)4
................(atcc)4
................(atcc)4
................(atcc)4
................(atcc)4
8
7
6
5
4
3
2B
2A
1
(atcc)2ttcc(atcc)1
(atcc)2....(atcc)1
(atcc)2....(atcc)1
(atcc)2....(atcc)1
(atcc)2....(atcc)1
(atcc)2....(atcc)1
(atcc)2....(atcc)1
(atcc)2....(atcc)1
(atcc)2....(atcc)1
8
7
6
5
4
3
2B
2A
1
(atcc)3
(atcc)3
(atcc)3
(atcc)3
(atcc)3
(atcc)3
(atcc)3
(atcc)3
(atcc)3
attcg
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
.....
cattc(atcc)2
.....(atcc)2
.....(atcc)2
.....(atcc)2
.....(atcc)2
.....(atcc)2
.....(atcc)2
.....(atcc)2
.....(atcc)2
atctacccattt(atcc)2 c
............(atcc)2 .
............(atcc)2 .
............(atcc)2 .
............(atcc)2 .
............(atcc)2 .
............(atcc)2 .
............(atcc)2 .
............(atcc)2 .
c(atcc)1 accc (atcc)7 cattc(atcc)1
.(atcc)1 accc (atcc)7 .....(atcc)1
.(atcc)1 accc (atcc)7 .....(atcc)1
.(atcc)1(atcc)1(atcc)5.....(atcc)1
.(atcc)1 accc (atcc)8 .....(atcc)1
.(atcc)1 accc (atcc)6 .....(atcc)1
.(atcc)1 accc (atcc)6 .....(atcc)1
.(atcc)1 accc (atcc)6 .....(atcc)1
.(atcc)1 accc (atcc)6 .....(atcc)1
gtccatctttgc(atcc)1 c
............(atcc)1 .
............(atcc)1 .
............(atcc)1 .
............(atcc)1 .
............(atcc)1 .
............(atcc)1 .
............(atcc)1 .
............(atcc)1 .
8
7
6
5
4
3
2B
2A
1
(atcc)2
(atcc)2
(atcc)2
(atcc)2
(atcc)2
(atcc)2
(atcc)2
(atcc)2
(atcc)2
c(atcc)1
.(atcc)1
.(atcc)1
.(atcc)1
.(atcc)1
.(atcc)1
.(atcc)1
.(atcc)1
.(atcc)1
(atcc)12
(atcc)11
(atcc)10
(atcc)11
(atcc)11
(atcc)10
(atcc)10
(atcc)9
(atcc)9
atctaccc(atcc)2
........(atcc)2
........(atcc)2
........(atcc)2
........(atcc)2
........(atcc)2
........(atcc)2
........(atcc)2
........(atcc)2
accc(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
aacc(atcc)10
....(atcc)10
....(atcc)10
....(atcc)10
....(atcc)6
....(atcc)7
....(atcc)6
....(atcc)7
....(atcc)6
aacc(atcc)1(atcc)1(atcc)1
....(atcc)1(atcc)1(atcc)1
....(atcc)1(atcc)1(atcc)1
....(atcc)1(atcc)1(atcc)1
....(atcc)1 aacc (atcc)3
....(atcc)1 aacc (atcc)3
....(atcc)1 aacc (atcc)3
....(atcc)1 aacc (atcc)3
....(atcc)1 aacc (atcc)3
atgt(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
....(atcc)1
atgt
....
....
....
....
....
....
....
....
(atct)1(atcc)3 atttggcagttattaagtatgcattatgtt
(atct)1(atcc)3 ..............................
(atct)2(atcc)2 ..............................
(atct)1(atcc)3 ..............................
accc-------- ..............................
------------ ..............................
------------ ..............................
------------ ..............................
------------ ..............................
Asociación de los marcadores con el bocio congénito
GT
Exón 29
Exón 30
Exón 31
+1
AtSN HSN AcSN C1 C2 C3 C4
AtSN HSN
AcSN
30.8: 542 pb
30.7: 538 pb
29.4:
29.3:
29.2:
29.1:
203
201
199
197
pb
pb
pb
pb
30.1: 502 pb
TGrI29
TGrI30
C1
Conclusiones STRs
TGrI29 y TGrI30 pueden emplearse para estudios de
ligamiento familiar.
 Hipotiroidismo congénito con bocio
 Hipotiroidismo congénito sin bocio
Es un polimorfismo informativo, sin problemas de
genotipificación. Puede ser amplificado rápidamente
por PCR.
TGrI29 y TGrI30 podrían modular el splicing
contribuyendo al mecanismo molecular responsable de la
enfermedad.
Identificación y caracterización de un polimorfismo de
inserción/deleción de 1464 bp en el intrón 18 del gen de TG
D/D I/I
I/D D/D I/I
5.0 Kb
3.5 Kb
TCAG TCAG
G
G
T
C
G
G
A
G
A
C
A
C
A
A
T
T
A
C
A
C
T
C
G
T
T
T
G
G
G
A
G
T
C
C
A
A
T
T
A
C
A
C
T
C
Análisis de Haplotipos
LD
c.229G>A (p.G58S)
c.2200T>G (p.S715A)
c.2334T>C (p.P759P)
c.2488C>G (p.Q811E)
Tgms1
c.3082A>G (p.M1009V)
c.3474T>C (p.S1139S)
c.3935G>A (p.G1293D)
IndelIVSTG18
c.4506C>T (p.A1483A)
Tgms2
c.5512A>G (p.N1819D)
TGrI29
TGrI30
c.5995C>T (p.R1980W)
c.6695C>T (p.P2213L)
c.7408C>T (p.L2451L)
c.7501T>C (p.W2482R)
c.7589G>A (p.R2511Q)
G
G
C
C
307
G
C
G
541
C
340
A
201
538
T
C
C
T
G
II-1
G
G
C
C
307
G
C
G
541
C
338
A
201
538
C
C
C
C
G
G
T
T
C
305
A
C
G
541
C
338
A
201
538
T
C
C
C
G
G
G
C
C
307
G
C
G
541
C
338
A
201
538
T
C
C
T
G
Polymorphic TG Markers
p.R277X
p.R1511Xp.R277X
p.R1511X
“Resistencia a Hormonas Tiroideas”
TSH
I-
r e c e p to r d e T S H
N IS
M e m b r a n a b a s o la t e r a l
G S
p r o te ín a G
GDP
T T F -1 , T T F -2 , P A X 8
T r a n s c r ip c ión
G e n d e la T G
G e n d e la T P O
ARNm
T r a d u c c ió n
M e m b ra n a a p ic a l
ThO X
P e n d r in a
TPO
TG
H 2O
I-
2
I
I
NH2
CH2
O
HO
OH
COO H
T3
I
RXR
TR
C o -a c tiv a d o r
Zn
Zn
TBP
T F I IB
R N A pol
TRE
TATA
G e n B la n c o
T r a n s c r ip c ión
Resistencia a Hormonas Tiroideas (RTH)
Incidencia: 1/50000 nacidos vivos
Diagnóstico:
 Elevados niveles de T3 y de T4 séricas
 Niveles de TSH normales o levemente elevados
Síntomas y signos:
Indicativos de hipotiroidismo e hipertiroidismo
Manifestaciones de RTH
BOCIO
TAQUICARDIA
DEFICIT DE ATENCIÓN
HIPERACTIVAD/TRANSTORNOS EN EL
APRENDIZAJE
BAJO IQ
BAJA ESTATURA
RETRASO EN EL DESARROLLO ÓSEO
PÉRDIDA DE AUDICIÓN
Superfamilia de receptores intracelulares
C
N
Receptor de cortisol
C
N
Receptor de estrógenos
C
N
Receptor de progesterona
C
N
Receptor de vitamina D
N
C
Receptor de hormona tiroidea
C
N
Receptor de ácido retinoico
Dominio de
unión al ADN
Dominio de unión
al ligando
Respuesta primaria a
hormonas esteroideas
Hormona
esteroidea
Respuesta secundaria a
hormonas esteroideas
Receptor de
Hormona esteroidea
Proteínas de respuesta
secundaria
H-C activa genes de
respuesta primaria
ADN
Síntesis inducida de unas pocas
proteínas diferentes en la
respuesta primaria
ADN
Una respuesta primaria
enciende genes de respuesta
secundaria
Modelo molecular para la represión basal por corepresores en la ausencia de T3
Complejo co-represor
HDACs
Deacetilación de histonas
sin 3
Co -represores
RXR
TR
TAFs
Zn
Zn
TF IIB
TBP
RNApol
TRE
Co-represores: NCoR, SMRT
TATA
X
Gen Blanco
Transcripción
Activación transcripcional por co-activadores en la
presencia de T3
Complejo SRC/p 160
Acetilación
de histonas
Complejo DRIP/TRAP
TRAP 220/
DRIP205
P/CAF
CBP/P300
Co
-re
pr
eso
r
Co -activador
I
HO
RXR
I
NH2
CH2 OH
O
COOH
TR
T3
I
TAFs
Zn
Zn
TF IIB
TBP
RNApol
TRE
TATA
Gen Blanco
Transcripción
Genes que codifican a los Receptores de
Hormonas Tiroideas (TRs)
Gen
TR 
TR 
Cromosoma
Ch.17
Ch.3
Isoformas
Localización del TR
TR 1
Generalizada
TR 2
Generalizada
TR 1
Generalizada
TR 2
Pituitaria/SNC
Mutaciones en el gen TR se asocian a RTH.
Estructura y funciones de las isoformas del receptor
de hormonas tiroideas
DNA binding T3-binding Transactivación
1
514
TR-2
DBD
LBD
1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
461
TR-1
100
100
1
TR-1
410
86
82
492
1
c-erbA -2
+
86
82
Representación esquemática del gen TR y su proteína TR 1
Cromosoma 3
3p22-24
171
72
64
261
101 148 206
147
259
269
5’
pb
3’
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Gen: 372 Kb
5’
3’
NH2
COOH
DBD
LBD
ARNm: 1.698 b
Proteína: 461 aa
Localización de mutaciones en el gen TR
Hinge
1
461 aa
-COOH
NH2-
AF-2
Cluster 3
DBD
Cluster 2
Cluster 1
LBD
12 hélices
Interacción con co-represores y
co-activadores
Unión a T3
Heterodimerización
con RXR
Mutaciones identificadas en el gen TR
Mutación
K306A
M310T
M313T
R316H
A317T
R320C
R320H
R320L
Y321C
D322N
D322H
L328F
L330F
G322R
E333Q
M334R
T337I
T337A
T337H
R338W
R338L
Exón
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
Mutación
Q340H
K342I
G344E
G345R
G345V
G345D
G345S
G347E
V348E
V349M
V349M
R383H
T426I
L428R
R429Q
I431T
C434X
H435L
H435Q
R438C
R438H
Exón
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
Mutación
M442V
K443E
K443N
C446R
C446X
L450H
F451I
F451X
P453T
P453S
P453A
P453H
L454A
L454V
L454S
E457R
E457A
V458A
F459C
E460K
Características:
Tipo de mutación: Germinal
Presencia alélica: Heterocigota
Tipo de herencia: Autosómica dominante
Exón
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
Herencia autosómica
recesiva
Herencia autosómica
dominante
Evidencias genéticas y clínicas para la actividad
dominante negativa ejercida por los TR mutados
TR heterocigota
TR
TR 
RTH
Mutación puntual
TR heterocigota
Fenotipo Normal
X
Deleción
Tests de función tiroidea
normales
TR homocigota
X
X
RTH
Doble deleción
Dicha actividad disminuye introduciendo mutaciones en el dominio DBD
Objetivos
Identificar nuevas mutaciones en el gen TR en 17
familias argentinas con cuadro clínico compatible con RTH.
Metodología
Purificación de ADN genómico a partir de sangre periférica.
PCR de los exones 7, 8, 9 y 10
Secuenciación
SSCP para validar nuevas mutaciones
3’
T
G
T
T
T
C
1357: C/A
C
C
C
C
T
T
C
T
C
5’
Alelo Normal
CCT
Pro (453)
Familia 1
Mutación en el exón 10
p.P453T
F.B. Ve.B. Vi.B. Padre Madre
TCAG TCAG TCAG TCAG TCAG
N1 N2
N8
N3 Vi.B. M.A. N4
N5
N6
Alelo Mutado
ACT
Thr (453)
SSCP : Gel de poliacrilamida al 10 %.
N7
Nueva deleción en el exón 10 : c.1297-1304delGCCTGCCA
Alelo
Paciente CB
N M
3’ 3’
G C
A C
C T
C T
G C
T G
A C
C C
C G
G A
T C
C C
C G
G T
A A
G G
G G
A A
T T
A A
G G
5’ 5’
Hna 1 Padre Madre
C.B.
Normal
1145
Exon
.................................................ATCGCCCGGGG
R
P
G
Hna 2
TCAG TCAG TCAG TCAG TCAG
10
CTTGCCTGTGTTGAGAGAATAGAAAAGTACCAAGATAGTTTCCTGCTGGCCTTTGAACAC
L
A
C
V
E
R
I
E
K
Y
Q
D
S
F
L
L
A
F
E
H
TATATCAATTACCGAAAACACCACGTGACACACTTTTGGCCAAAACTCCTGATGAAGGTG
Y
I
N
Y
R
K
H
H
V
T
H
F
W
P
K
L
L
M
K
V
1297
1304
ACAGATCTGCGGATGATAGGAGCCTGCCATGCCAGCCGCTTCCTGCACATGAAGGTGGAA
T
D
L
R
M
I
G
A
C
H
A
S
R
F
L
H
M
K
V
E
TGCCCCACAGAACTCTTCCCCCCTTTGTTCCTGGAAGTGTTCGAGGATTAGACTGACTGA
C
P
T
E
L
F
P
P
L
F
L
E
V
F
E
D
*
1413
ATTCATTCTCATAATTCC..........................................
Alelo
Mutado
1145
Exon
.................................................ATCGCCCGGGG
R
P
G
CTTGCCTGTGTTGAGAGAATAGAAAAGTACCAAGATAGTTTCCTGCTGGCCTTTGAACAC
L
A
C
V
E
R
I
E
K
Y
Q
D
S
F
L
L
A
F
E
H
TATATCAATTACCGAAAACACCACGTGACACACTTTTGGCCAAAACTCCTGATGAAGGTG
Y
I
N
Y
R
K
H
H
V
T
H
F
W
P
K
L
L
M
K
V
1297-1304delGCCTGCCA
ACAGATCTGCGGATGATAGGA
TGCCAGCCGCTTCCTGCACATGAAGGTGGAA
T
D
L
R
M
I
G
C
Q
P
L
P
A
H
E
G
G
M
TGCCCCACAGAACTCTTCCCCCCTTTGTTCCTGGAAGTGTTCGAGGATTAGACTGACTGA
P
H
R
T
L
P
P
F
V
P
G
S
V
R
G
L
N
*
1413
ATTCATTCTCATAATTCC..........................................
Análisis de microsatélites
Madre Padre
C.B.
Hna1 Hna2 Control
Madre Padre C.B. Hna1 Hna2 Control
538 pb
203 pb
201 pb
199 pb
197 pb
502 pb
TGrI29
TGrI30
10
Paciente CB
Wild Type
Hinge
1
461 aa
-COOH
NH2Cluster 3
DBD
Cluster 2
AF-2
Cluster 1
LBD
1297-1304delGCCTGCCA
Hinge
1
460 aa
NH2-
-COOH
Cluster 3
DBD
Cluster 2
LBD
AF-2
Cluster 1
Mutaciones identificadas en el gen TR
Exón
Pacientes
9
MA
c.1012C>T
(CGG>TGG)
p.R338W
10
GC
c.1357C>A
(CCT>ACT)
p.P453T
10
VB
c.1357C>A
(CCT>ACT)
p.P453T
10
NL
c.1357C>A
(CCT>ACT)
p.P453T
Mutaciones conocidas
Análisis predictivo de la estructura secundaria del receptor
THR-WT
QIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSDAIFDLGMSL
ESP
HHEE-----HHHHHHHH----------E-H---HHHHH--------EEEE--EHHH----
Exón 9
THR-R338W QIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTWGQLKNGGLGVVSDAIFDLGMSL
ESP
HHEE-----HHHHHHHH----------E-H---HHHHH--------EEEE--EHHH----
E: lámina 
H:  hélice
-: aa conectores
Análisis evolutivo del receptor
Homo sapiens
Macaca mulatta
Macaca fascicularis
Mus musculus
Rattus norvegicus
Equus caballus
Canis familiaris
Conger myriaster
Danio rerio
Gallus gallus
Xenopus laevis
296
296
296
296
296
296
302
232
230
204
208
p.R338W
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 351
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 351
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 351
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPDSETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 351
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPDSETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 351
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 351
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 357
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 287
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESDTLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 285
LPCEDQIILLKVCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 259
LPCEDQIILLKGCCMEIMSLRAAVRYDPESETLTLNGEMAVTRGQLKNGGLGVVSD 263
Conclusiones
El análisis poblacional indica que la mutaciones
identificadas no se tratan de polimorfismos
frecuentes.
El análisis de la estructura secundaria de las
proteínas mutadas y los estudios evolutivos proteicos
permiten inferir que las mutaciones identificadas son
de tipo inactivante.
En el 90 % de casos de RTH no existen síntomas ni
signos patognomónicos por lo cual la identificación de
nuevas mutaciones en el gen TR aumentará la
precisión en el diagnóstico y tratamiento de RTH.
Perspectivas
1) Búsqueda de mutaciones en los exones 7 y
8 del gen TR en aquellos pacientes en los
cuales no se han identificado alteraciones.
2) Expresión in vitro de los alelos TR
conteniendo las mutaciones identificadas.
Binding a co-activadores
Binding a co-represores
Determinación de la afinidad de las hormonas
tiroideas por los receptores mutados.