Download Lección 3. Los programas de mutagénesis - Mi portal

Drosophila como sistema
• Ventajas generales:
– Fácil y barato de mantener
– Tiempo de generación corto (10 dias)
– Produce mucha progenie
Drosophila como sistema
• Ventajas genéticas:
– Sin recombinación meiótica en machos
– Sólo cuatro cromosomas
– Cromosomas politénicos visibles al óptico
– Muchos caracteres externos variables (ojos,
nervios en las alas, quetas…)
– Un gran repertorio de técnicas y trucos
– Genoma completamente secuenciado
Drosophila como sistema
• Ventajas como modelo:
– Muchos procesos de desarrollo conservados
entre moscas y vertebrados
– Muchos genes claramente relacionados con
genes humanos (más que Caenorhabditis
elegans)
Drosophila como sistema
• Desventaja fundamental:
– Tiene que mantenerse viva en el laboratorio
(no hay posibilidad de conservar congelada)
EL SCREENING DE HEIDELBERG
• Primer intento de hacer una búsqueda global de
mutantes del desarrollo.
• ¿No sería inmanejable el número de genes que
intervienen en el proceso?
• ¿Servirían de algo esos mutantes, serían
informativos?
EL SCREENING DE HEIDELBERG
• Cosas importantes a tener en cuenta:
– ¿Qué tipo de mutantes quiero encontrar? No se puede tener
todo.
– Disponer de un sistema simple y eficaz para mutagenizar
– Planificar un esquema de cruzamientos para obtener
individuos con las mutaciones y poder conservarlas.
– Tener un sistema para distinguir los mutantes de interés.
• Se buscaron genes cigóticos que mataran al
embrión: no llegarían a salir larvas del huevo.
CICLO VITAL DE DROSOPHILA
EL SCREENING DE HEIDELBERG
• Cosas importantes a tener en cuenta:
– ¿Qué tipo de mutantes quiero encontrar? No se puede tener
todo.
– Disponer de un sistema simple y eficaz para mutagenizar
– Planificar un esquema de cruzamientos para obtener
individuos con las mutaciones y poder conservarlas.
– Tener un sistema para distinguir los mutantes de interés.
• Se buscaron genes cigóticos que mataran al
embrión: no llegarían a salir larvas del huevo.
• Esas mutaciones deberían causar alteraciones
morfológicas visibles en la cutícula
LA CUTÍCULA EMBRIONARIA
LA CUTÍCULA EMBRIONARIA
¿Cómo hacer mutagénesis?
Se hace mutagénesis de un buen número de machos de modo que un cierto
porcentaje de sus espermatozoides tengan mutaciones
¿Cómo hacer mutagénesis?
Los machos mutagenizados se cruzan “en masa” con hembras normales
x
F1
Todos los descendientes son heterozigotos. Por lo general, cada uno
para una mutación distinta.
¿Cómo hacer mutagénesis?
Para los mutantes recesivos es preciso obtener individuos homozigotos.
Pero, ¿cómo conseguirlos?
x
1/4
La autofecundación “en masa” de la F1 NO generará casi nunca
homozigotos para cada mutación sino dobles mutantes en heterozigosis
¿Cómo hacer mutagénesis?
Cruzando POR SEPARADO cada macho F1 con hembras wt se obtiene en
cada cruce (botella) 1/2 de heterozigotos para cada mutación.
x
F2
1/2
1/2
¿Cómo hacer mutagénesis?
Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas
aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga
1/2
x
1/4 de los cruces
Todos wt
1/2
¿Cómo hacer mutagénesis?
Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas
aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga
1/2
1/2
x
1/2 de los cruces
1/2
1/2
¿Cómo hacer mutagénesis?
Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas
aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga
1/2
1/2
x
1/4 de los cruces
1/4
Fenotipo visible
1/2
1/4
¿Cómo hacer mutagénesis?
Resumen de los resultados de la autofecundación en botellas
donde había un mutante
1/2
1/2
x
1/16
6/16
9/16
Entre los hermanos de los mutantes habrá portadores de la mutación,
pero también muchos wt
¿Cómo hacer mutagénesis?
El experimento se simplificaría si hubiera algún modo de eliminar
automáticamente los individuos “a” y “b”
F1
F2
x
1/2
x
1/2
a
F3
b
1/16
6/16
9/16
¿Cómo hacer mutagénesis?
Una posibilidad es usar letales recesivos (r) y letales dominantes
inducibles (D)
r
F1
x
r
D
r
r
D
F2
r
r
D
¿Cómo hacer mutagénesis?
Pero si hay recombinación en la hembra el sistema puede destruirse
r
D
Meiosis
r
D
x
r
…
r
…
¿Cómo hacer mutagénesis?
• Los recombinantes que se producen entre
cromosomas que difieren en una inversión dan
descendientes inviables. En Drosophila hay
sistemas de cromosomas con inversiones,
CROMOSOMAS BALANCEADORES, que pueden
emplearse para evitar este problema.
• El “screening” se hace por separado para cada
cromosoma
El “screening” de Heidelberg
EMS
w
w
x
B
r
D
w
F1
B
w
r
D
Se mutagenizan con EMS varios miles de machos que después se
cruzan con hembras vírgenes “en masa”
El “screening” de Heidelberg
w
B
r
r
B
x
w
D
D
29º 4 dias
18º o 25º
w
w
D
B
B
B
D
r
D
r
r
F2
B
r
D
El “screening” de Heidelberg
w
B
x
r
w
w
1/4
w
B
w
B
r
1/2
F3
r
B
B
r
r
1/4
Mueren como larvas
CRITERIOS DE SELECCIÓN:
-1)no hay moscas de ojos blancos;
-2)de 1/4 de los huevos no salen larvas;
-3)observación embriones
RESULTADOS DEL “SCREENING”
EN EL CROMOSOMA 2
• 1500 machos mutagenizados se cruzaron
con unas 2500 hembras vírgenes
EMS
w
w
x
B
r
D
RESULTADOS DEL “SCREENING”
EN EL CROMOSOMA 2
• 1500 machos mutagenizados se cruzaron
con unas 2500 hembras vírgenes
• 10.000 cruces individuales de F1, 5764
dieron suficiente descendencia
w
B
r
B
r
x
w
D
D
RESULTADOS DEL “SCREENING”
EN EL CROMOSOMA 2
w
w
1/4
w
B
r
1/2
B
B
r
r
1/4
Mueren como larvas
• 4217 de las F2 no dieron moscas de ojos
blancos (73% → 1.3 mut/crom) Poisson, no media
• 2843 daban 25% huevos de los que no
salían larvas
RESULTADOS DEL “SCREENING”
EN EL CROMOSOMA 2
• Examen a la lupa de los embriones de las
2843 líneas
• 1620 líneas son letales embrionarios
auténticos
• 321 muestran defectos claros cutícula
• Análisis de complementación: 61 genes
(13 con un alelo, 48 con más de uno)
ALGUNOS MUTANTES OBTENIDOS
MUCHOS MUTANTES CON
PROBLEMAS EN LOS SEGMENTOS
LOS MUTANTES SUGIEREN APARICIÓN
PROGRESIVA DE PATRONES
Zonas a lo largo del eje A/P
14 parasegmentos
Borde anterior y posterior de
cada parasegmento
Identidad de cada región
SATURACIÓN DEL “SCREENING”
¿Qué fracción de los genes que se podría encontrar con este
protocolo de trabajo se ha encontrado realmente?
¿Merece la pena seguir buscando con este protocolo?
Criterio 1: seguir la marcha del proceso
Constantemente aparecen
mutantes, pero …
El caso del cromosoma
2 de Drosophila:
Cada vez se encuentran
menos GENES nuevos
SATURACIÓN DEL “SCREENING”
Criterio 2: número de alelos por gen. Cuantos más haya, más
cerca de la saturación.
El caso del cromosoma
2 de Drosophila:
Aproximadamente
4,55 alelos/locus
(hay mejores
aproximaciones)
¿Podemos predecir cuántos genes quedan por encontrar?
Asunción clásica: la distribución de frecuencias de alelos sigue una Poisson
La fracción de genes sin mutar (0 alelos) será: P(0)= e-m
Caso del cromosoma 2: m=4,55, P(0)= 0,01. El 1% del total de genes que se podrían
encontrar no se ha mutado aún, quedarían menos de 1 (0,6)
SATURACIÓN DEL “SCREENING”
Problema: muchas veces la distribución no parece una Poisson.
Previsible si no todos los genes tienen la misma probabilidad de
recuperarse como mutantes.
14
Fuerte exceso de
loci con una
mutación
12
Observados
Poisson
El caso del cromosoma
2 de Drosophila:
Número de loci
10
Poisson para
m = 4,55 alelos/locus
8
6
4
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Número de alelos
Posteriormente se han encontrado 8 genes más en este cromosoma con el tipo de problema
buscado en el “screening” original. Esos 8 loci representan el 11,6% del total de 69 loci,
P(0)=0,116, mucho más que lo previsible según Poisson (P(0)=0,01)
SATURACIÓN DEL “SCREENING”
Criterio 3: análisis de deleciones. ¿Las hay que causen un fenotipo de
interés pero en las que no mapee uno de los loci identificados?
El caso del cromosoma 2 de Drosophila:
Crom. 2
Deleciones
(cubren 30% del cromosoma)
Deleciones dando
fenotipos cuticulares
Loci de mutantes
previamente identificados
En todas mapea alguno de los loci identificados
(compatible con saturación)
“SCREENING” DE MUTANTES
DE EFECTO MATERNO
• Mucho menos saturado
• La mayoría afectan a genes implicados en
momentos tempranos del desarrollo
• Algunos pueden agruparse por tipo de
problemas que causan en la aparición de
patrones en el desarrollo: zona anterior, zona
posterior, extremos de la larva o eje dorsoventral
EL PEZ CEBRA COMO SISTEMA
MODELO DE VERTEBRADOS
•
•
•
•
•
Pequeño tamaño (3-4 cm)
Tiempo de generación corto (3-4 meses)
Alta fecundidad (100-200 huevos/hembra)
Fácil de mutagenizar
Embrión transparente y de desarrollo
externo
• Se puede fecundar “in vitro”. Esperma
congelable
“SCREENINGS” EN EL PEZ
CEBRA
Se dejan transcurrir varias semanas
entre mutagénesis y cruzamiento
para reducir la aparición de mosaicos
“SCREENINGS” EN EL PEZ
CEBRA
Cruzamiento:
Macho wt/ENU x Hembra alb/alb
Individuo F1 mosaico para
mutación en el locus alb
“SCREENINGS” EN EL PEZ
CEBRA
1/4 de los cruzamientos entre los
F2 darán individuos homozigotos
para m: con fenotipo visible
Varias peceras, cada una
con cruces entre parejas
de hermanos F2
DESARROLLO DEL PEZ CEBRA
MUTANTES OBTENIDOS
“SCREENINGS” DEL PEZ CEBRA
“SCREENING” DE TÜBINGEN
•
•
•
49 MACHOS MUTAGENIZADOS
3075 FAMILIAS F2 INICIADAS
2746 FAMILIAS F2 ANALIZADAS
–
•
•
•
•
•
•
150 GENES CON MÁS DE 1 ALELO
222 GENES CON 1 ALELO
Nº alelos/gen: de 1 a 34. Nº medio:
2.4
Development 123:1-36 (1996)
266 MACHOS MUTAGENIZADOS
2799 FAMILIAS F2 INICIADAS
1808 FAMILIAS F2 ANALIZADAS
–
(14.357 cruces para dar F3)
4624 MUTANTES OBTENIDOS
1163 MUTANTES CONFIRMADOS
372 GENES IDENTIFICADOS
–
–
–
“SCREENING” DE BOSTON
•
•
•
(más de 30.000 cruces para dar F3)
2383 MUTANTES OBTENIDOS
695 MUTANTES CONFIRMADOS
220 GENES IDENTIFICADOS
–
–
–
56 GENES CON MÁS DE 1 ALELO
164 GENES CON 1 ALELO
Nº alelos/gen: de 1 a 11. Nº medio:
1.5
Development 123:37-46 (1996)
“SCREENING” DE HAPLOIDES
Ventaja:
Enseguida se detectan
mutaciones interesantes
Problemas:
-1)Los embriones haploides
acaban muriendo
-2)Los embriones haploides tienen
algunos problemas de desarrollo
MÉTODOS ALTERNATIVOS
Presión poco después
de la fertilización:
NO se completa la meiosis II y
embriones diploides
Problema: no son
completamente homocigotos
Choque térmico tras fertilización:
NO se completa 1ª mitosis tras
meiosis y embriones diploides y
completamente homocigotos
Problema: pobre viabilidad (10-20%)
“Screeining” de
haploides ya visto
“SCREENINGS” EN RATÓN
•
•
•
•
Es un mamífero (cercano al hombre)
Genoma secuenciado
Transformable y sistemas “knock out”
Corto tiempo de generación (2 meses)
• Desarrollo embrionario intrauterino
• Requerimientos de espacio en jaulas
• Pocos programas de mutagénesis a gran
escala: unos 300 mutantes dominantes
(visibles en G1) desde más de 40.000
ratones, pocos de desarrollo
DISEÑO DE UN CROMOSOMA
BALANCEADOR EN RATÓN
Sin Wnt3 el ratón muere
Ag da color amarillento al pelo
Puro y Neo dan resistencia
a antibióticos
Se obtiene un gen Hprt funcional,
Hprt permite crecer en medio HAT
ca. 1/3 del cromosoma con la inversión
UN BALANCEADOR PARA EL
CROMOSOMA 11
Color amarillento de partes del
cuerpo de los ratones portadores
de la inversión
ESQUEMA DEL “SCREENING”
Ratones macho
Marcador dominante
REX: pelo rizado
Mutación
Camadas de más de 24 ratones sin animales negros indican un mutante recesivo letal
ALGUNOS MUTANTES DEL
DESARROLLO OBTENIDOS
MUTAGÉNESIS EN ARABIDOPSIS
Meristemo apical del embrión
Sector
m/+
Nº células del meristemo que
contribuirán a las semillas
de la planta = 2 en Arabidopsis
Sector
+/+
Como cada individuo se autofecunda no hace falta una generación previa
de amplificación del número de individuos m/+
CAENORHABDITIS ELEGANS
XX
959 células somáticas
302 son neuronas
99% de la población
X0
1031células somáticas
381 son neuronas
1% de la población
“SCREENING” DE GENES DE
EFECTO MATERNO
Defecto en la vulva: los huevos
no pueden salir y se desarrollan
dentro del individuo
Sin mutación en el gen
de efecto materno
Larvas dentro del individuo
BOLSA DE LARVAS
“SCREENING” DE GENES DE
EFECTO MATERNO
Defecto en la vulva: los huevos
no pueden salir y se desarrollan
dentro del individuo
Sin mutación en el gen
de efecto materno
Mutación en el gen
de efecto materno: todos
sus huevos se desarrollan
Larvas dentro del individuo
¼ son homocigotos: sus
huevos no se desarrollan
BOLSA DE HUEVOS
“SCREENING” DE GENES DE
EFECTO MATERNO
Defecto en la vulva: los huevos
no pueden salir y se desarrollan
dentro del individuo
Sin mutación en el gen
de efecto materno
Mutación en el gen
de efecto materno: todos
sus huevos se desarrollan
Larvas dentro del individuo
Individuos para conservar
la mutación
¼ son homocigotos: sus
huevos no se desarrollan
LIMITACIONES DE LOS
“SCREENINGS” DE MUTANTES
• No todos los fenotipos son adecuados para hacer un
“screening” a saturación
• No siempre hay medios suficientes para llegar a
saturación
• Muchos genes implicados en un proceso no
aparecerán en el “screening” por:
• Pleitropía
• Redundancia (se ha estimado que cerca de 2/3 de los
genes no dan fenotipo en mutantes de pérdida de función, la
redundancia es una posible causa)
• Simplemente mala suerte (si no está muy saturado)
UN FENOTIPO MÁS VISIBLE
Sin GFP
Con GFP
Sistema traqueal de Drosophila visualizado con GFP y aspecto de algunos mutantes
UN FENOTIPO MÁS VISIBLE
RFP bajo promotor
células hepáticas
GFP bajo promotor
células endoteliales
Vasculogénesis visualizada en hígado de pez cebra con dos genes delatores
EL SISTEMA GAL4-UAS
DROSOPHILAS TRANSGÉNICAS
Gen marcador
Se perderá rápidamente
La transposasa sólo se produce
en la línea germinal y sólo allí se
integra el transposón P
Transposón sólo en la línea germinal
de algunas de las moscas
Moscas ya con el transposón
en la línea somática
“SCREENING” DE MODIFICADORES
Se mutagenizan individuos con un gen de
la ruta en estudio ya mutado
Supresores: suprimen el fenotipo mutante
Intensificadores: intensifican el fenotipo mutante
“SCREENING” DE MODIFICADORES
Se mutagenizan individuos con un gen de
la ruta en estudio ya mutado
Todavía mutante
Supresores: suprimen el fenotipo mutante
Intensificadores: intensifican el fenotipo mutante
Es impredecible el fenotipo que tendrá (caso de tenerlo) un modificador por si sólo
“SCREENING” DE SUPRESORES
wt
Señal
Sev
(RTK)
RTK activado
constitutivamente
1 célula R7
por omatidio
Sev
(RTK)
Mutante supresor
sobre RTK activada
Sev
(RTK)
Varias células
R7 por omatidio
1 célula R7
por omatidio
INTENSIFICADORES:
POLARIDAD DE LOS CARPELOS
CRC (Crabs claw): TF similares están
relacionados con diferenciación polar
Fenotipo normal, pero debe estar
afectado en la ruta: más sensible
Pérdida parcial de polaridad carpelos
(óvulos externos en línea medial)
Pérdida completa polaridad carpelos
y de simetría bilateral
“SCREENING” SENSIBILIZADO
Sev
(RTK)
Señal
Boss
(Señal)
1 célula R7
por omatidio
Sev
(RTK)
Sina
(TF)
Búsqueda de más componentes por mutagénesis convencional
1 célula R7
por omatidio
No se encuentran más: ¿quizás porque el resto
también funcionen en partes vitales del organismo?
Ruta sensibilizada (funciona, pero con dificultades): podemos
identificar mutantes sin tener que llegar a homocigosis
Sensibilizada sólo en el ojo (parte no vital del organismo): pueden
encontrarse sin problemas de letalidad
sevB4: alelo hipomorfo
22.7ºC: ojos wt
24.3ºC: ojos rugosos (sin R7)
Intensificadores: ojos rugosos a 22.7ºC con 1 copia del alelo mutante
Sev
(RTK)
A
1 célula R7
por omatidio
Sev*
(RTK)
A
1 célula R7
por omatidio
Sev*
(RTK)
A/A*
Sin célula R7
(Ojos rugosos)
RTK
A
Función vital
RTK
A
Función vital
RTK
A/A*
Función vital
wt
Individuo sensibilizado
Mutante de interés
La ruta está tan al borde de no funcionar que incluso alelos de baja pérdida de
actividad en otros genes pueden manifestarse como dominantes
“SCREENING” SENSIBILIZADO
sevB4: alelo hipomorfo
22.7ºC: ojos wt
24.3ºC: ojos rugosos (sin R7)
Ruta sensibilizada sólo en el ojo (parte no vital del organismo)
Intensificadores: ojos rugosos a 22.7ºC con 1 copia
Sev
(RTK)
A
1 célula R7
por omatidio
Sev*
(RTK)
A
1 célula R7
por omatidio
Sev*
(RTK)
A/A*
Sin célula R7
(Ojos rugosos)
RTK
A
Función vital
RTK
A
Función vital
RTK
A/A*
Función vital
wt
Sev
(RTK)
Individuo sensibilizado
A/A*
1 célula R7
por omatidio
Esos mismos mutantes NO se manifiestan
como dominantes en individuos wt para Sev
RTK
A*/A*
Mutante de interés
CONFIRMACIÓN
Sev
(RTK)
A*/A*
Sin célula R7
(Ojos rugosos)
RTK
A/A*
Función vital
Sin función vital
Pero son LETALES en homocigosis (no se habrían
encontrado con el método convencional)
Individuo mosaico (sólo homocigoto
mutante en el ojo)
RECOMBINACIÓN MITÓTICA
Células de interés no tienen el marcador (es dominante). No se puede
con este sistema conseguir que SÓLO las células de interés tengan marcador
basado en la actividad de un gen delator
EL SISTEMA Flp/FRT
Cerca del centrómero de cada brazo
-Más eficaz que irradiando
-Más controlable (Flp bajo
promotor inducible)
Procede del plásmido 2m
de levaduras
EJEMPLOS Flp/FRT
Mala adhesión compartimentos
dorsal y ventral del ala
Mutantes afectando el control del tamaño.
Efecto en cabeza, resto del cuerpo normal
EL SISTEMA DFS
La mutación se recupera desde
Sus hermanos machos
Inducción por calor en larvas.
También mueren larvas con
cromosoma balanceador
“SCREENING” EN F1 DE GENES
DE EFECTO MATERNO
Se induce recombinación
Distintos niveles de GFP
“SCREENING” EN F1 DE GENES
DE EFECTO MATERNO
Cámara de huevos en
hembra con GFP
Embrión con GFP
sólo materno
Embriones de zona sin GFP
(fluorescencia basal)
Son los a mirar en busca
de fenotipo
Embriones de
zona con GFP
“SCREENING” EN F1 DE GENES
DE EFECTO MATERNO
Puede haber recombinación
meióica
Ya no puede haber
recombinación meióica
Balanceador
NÚMEROS DEL “SCREENING”
•
•
•
•
•
•
Cruzamientos estudiados: 59.200
Hembras F1 miradas: 21.970
Mutantes potenciales: 726
Mutantes confirmados: 353
Genes mutados: 86 (41 nuevos)
Nº medio alelos/gen: 2.02
Genetics 167:325-342 (2004)
LA TÉCNICA Minute
M
M
A
Marcador
+
A
+
M
m
m
A
a
a
*
m
a
+
*
m
M
a
A
+
*
*
Gen de
interés
Genes Minute: intervienen en traducción
-M/M: mueren las células
-M/m: crecen lento
-m/m: crecen normal
**
Mosaico normal
M
m
m
M
M
M
m
m
A
a
a
A
A
A
a
a
+
*
*
+
+
+
*
*
**