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EFECTO DEL GEN fadH1 EN LA PRODUCCION DE PHA CONTENIENDO MONOMEROS INSATURADOS POR Pseudomonas putida DIEGO ARMANDO CASTILLO FRANCO PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL São Paulo, SP, Brasil Noviembre de 2008 EFECTO DEL GEN fadH1 EN LA PRODUCCION DE PHA CONTENIENDO MONOMEROS INSATURADOS POR Pseudomonas putida DIEGO ARMANDO CASTILLO FRANCO TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al título de MICROBIOLOGO INDUSTRIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL São Paulo, SP, Brasil Noviembre de 2008 NOTA DE ADVERTENCIA “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 EFECTO DEL GEN fadH1 EN LA PRODUCCION DE PHA CONTENIENDO MONOMEROS INSATURADOS POR Pseudomonas putida DIEGO ARMANDO CASTILLO FRANCO Prof. Dr. José Gregorio Cabrera Gómez Biólogo , Ph.D. Director Dr. Rafael Costa Santos Rocha Dra Sonia Regina Silva Queiroz Biólogo, Ph.D. Ing. Química, Ph.D. Jurado Jurado EFECTO DEL GEN fadH1 EN LA PRODUCCION DE PHA CONTENIENDO MONOMEROS INSATURADOS POR Pseudomonas putida DIEGO ARMANDO CASTILLO FRANCO APROBADO Dra. INGRID SCHULER, Ph.D JANETH ARIAS Decana académica Bacterióloga, M.Sc Facultad de Ciencias Directora de Carrera A mi Mamá, a mi Hermana y a Lina AGRADECIMIENTOS A mi mamá sencillamente por todo. Sin ella nada de esto hubiera sido posible Al profesor Dr. José Gregorio Cabrera Gómez por permitirme trabajar en su laboratorio y desarrollar este trabajo. A la Dra. Sonia Regina Silva Queiroz por todas sus enseñanzas, consejos y orientaciones durante este trabajo A la profesora Dra. Luiziana Ferreira da Silva por haberme permitido usar las instalaciones de su laboratorio para desarrollar parte de este trabajo. A Nuri Merchán por su apoyo, enseñanza y sobre todo, su amistad. A todos los compañeros y amigos de laboratorio: Marco, Rafael, Rogerio, Daniela, Sayuri, Thatiane, Karen, Renata, los cuales siempre estaban dispuestos a ayudar y dar una mano. Al personal del laboratorio de genética de microorganismos: Juan, Eric, Fabiana, Karen y Marcia por la ayuda prestada. A todas las personas que de una u otra manera hicieron parte colaborando con este trabajo vii TABLA DE CONTENIDO LISTA DE TABLAS ....................................................................................................x LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ xi LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................. xiii RESUMEN .................................................................................................................xv 1. INTRODUCCION ..................................................................................................16 2. REVISION BIBLIOGRÁFICA..............................................................................18 2.1. Biopolímeros ............................................................................................................... 18 2.2 Polihidroxialcanoatos ................................................................................................... 19 2.2.1 Historia y Producción ............................................................................................ 20 2.2.2. Características químicas y físicas ......................................................................... 22 2.2.3. Aplicaciones ......................................................................................................... 24 2.3 Síntesis de PHA ............................................................................................................ 25 2.3.1 Síntesis de PHASCL ................................................................................................ 26 2.4 Detección y cuantificación de PHA ............................................................................ 28 2.5. Metabolismo de Ácidos Grasos ................................................................................... 29 2.5.1. β-Oxidación de ácidos grasos ............................................................................... 30 2.5.2. Ácidos grasos insaturados .................................................................................... 32 2.6. Pseudomonas spp. ....................................................................................................... 33 3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION .................................35 4. OBJETIVOS ...........................................................................................................37 4.1. Objetivo General ......................................................................................................... 37 4.2 Objetivos específicos.................................................................................................... 37 5. MATERIALES Y MÉTODOS...............................................................................38 5.1 Microorganismos y Plásmidos ..................................................................................... 38 5.2 Medios de cultivo ......................................................................................................... 38 5.3.1Medio LB (Luria-Bertani) ...................................................................................... 39 Las siguientes denominaciones fueron dadas a los diferentes medios LB con diferentes antibióticos: .................................................................................................................... 39 5.2.2 Medio Mineral ....................................................................................................... 39 viii 5.3. Condiciones de cultivo ................................................................................................ 40 5.4 Manipulación de ADN ................................................................................................. 41 5.4.1 Extracción de ADN plasmídico ............................................................................. 41 5.4.2 Digestión de ADN con enzimas de restricción...................................................... 42 5.4.3 Ligación de ADN .................................................................................................. 42 5.4.4 Preparación de células competentes ...................................................................... 42 5.4.5 Transformación Bacteriana ................................................................................... 42 5.4.6 Electroforesis en gel de agarosa ............................................................................ 43 5.4.7 Purificacion de ADN a partir del gel de agarosa ................................................... 43 5.5 Construcción del plásmido por inserción del fragmento purificado a partir del gel de agarosa................................................................................................................................ 43 5.6 Complementación......................................................................................................... 43 5.7 Ensayos de acumulación de polímero a partir de ácido linoléico................................. 44 5.7.1 Determinación de Masa seca celular (MSC) ......................................................... 44 5.7.2 pH .......................................................................................................................... 45 5.7.3 Cantidad y composición de PHA .......................................................................... 45 6. RESULTADOS Y DISCUSION ............................................................................47 6.1 Evaluación en la producción de PHA por mutantes deficientes en la utilización de ácidos grasos insaturados ................................................................................................... 47 6.2 Clonación del gen fadH1 en pBBR1MCS-5 ................................................................ 48 6.3 Complementación de Pseudomonas putida IPT 046 y los mutantes deficientes en crecimiento en ácido 4-pentenoico con el gen fadH1. ....................................................... 53 7. CONCLUSIONES ..................................................................................................60 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................61 9. ANEXOS ................................................................................................................70 ix LISTA DE TABLAS Tabla 1. Compañías involucradas en la investigación y producción de PHA en el mundo 21 Tabla 2. Propiedades Físicas de PHA y PP 24 Tabla 3. Principales Características metabólicas de Pseudomonas sp. 30 Tabla 4. Microorganismos Utilizados 39 Tabla 5. Plásmidos utilizados 40 Tabla 6. Antibióticos y concentraciones utilizadas 41 Tabla 7. Composición monomérica de PHA acumulados por P. putida IPT046, AG46, BJ5, CF12, CN25 Y DU54, cultivadas en ácido linoléico Tabla 8. 48 Perfil de crecimiento de IPT 046 y los mutantes frente a las cepas complementadas con pBBR::fadH1 en MMGGm, MMV y MM4P 52 x LISTA DE FIGURAS Figura 1. Microfotografía electrónica de P. putida con gránulos de PHA 11 Figura 2. Estructura General de los Polihidroxialcanoatos 14 Figura 3. Síntesis de PHB. 17 Figura 4. Vías metabólicas propuestas a partir de diferentes sustratos 19 Figura 5. Ruta metabólica de Biosíntesis de PHA a partir de Ácidos Grasos 20 Figura 6. Hidrolisis de Triglicéridos 21 Figura 7. Modelo de β-Oxidación de Ácidos Grasos 22 Figura 8. Regiones del genoma de diferentes subespecies Pseudomonas putida donde se encuetra el gen fadH1 Figura 9 Secuencia de la región del amplicón conteniendo el gen fadH1. Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa. 1. 1Kb ladder; 2. pGEM; 3. pBBR1MCS-5::fadH1 digerido con ApaI; 4. pGEM:fadH1; 5. pGEM::fadH1 digerido con ApaI 51 Figura 11. Cajas con LBGm, IPTG y X-Gal mostrando colonias transformadas posiblemente con pBBR1MCS-5::fadH1 51 Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa. 1. 1Kb ladder; 2-11. ADN plasmidial digerido con ApaI 52 Figura 13. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “1” 53 Figura 14. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “2” 54 Figura 15. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “3” 55 Figura 16. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “4” 56 xi Figura 17. Evaluación de crecimiento de los mutantes complementados en MM4PGm 56 Figura 18. Evaluación de crecimiento entre IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1 y mutantes complementados. 57 Figura 19. Evaluación de crecimiento entre IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1 y mutantes complementados 58 xii LISTA DE ABREVIATURAS µL microlitro 3HD 3- Hidroxidecanoato 3HDd 3-Hidroxidodecanoato 3HDd∆6 3-Hidroxidodecanoato con insaturación en C6 3HHx 3-Hidroxihexanoato 3HO 3-Hidroxioctanoato ADN Ácido desoxirribonucleico (DNA) CoA Coenzima A fad fatty acid degradation IPTG (isopropil-tio-β-D-galactósido) Gm Gentamicina Kb Kilopares de bases kDa kilodalton LB Luria-Bertani LBA Luria-Bertani con Ampicilina LBGm Luria-Bertani con Gentamicina LBK Luria-Bertani con Kanamicina mM milimolar Min minutos mL mililitro xiii MM medio mineral MM4P medio mineral con ácido 4-pentenóico MM4PGm medio mineral con ácido 4-pentenóico y gentamicina MMG medio mineral con glucosa MMGGm medio mineral con glucosa y gentamicina MML medio mineral con ácido linoléico MMV medio mineral con ácido valérico MSC masa seca celular NADH Nicotinamida adenina dinucleotido- Forma reducida P3HB Poli-3-Hidroxibutirato (PHB) P3HV Poli-3-Hidroxivalerato P3HB-co-3HV Poli-3-Hidroxibutirato-co-hidroxivalerato PHA Polihidroxialcanoatos PHPE Polihidroxipentanoato PHASCL Polihidroxialcanoatos de cadena corta PHAMCL Polihidroxialcanoatos de cadena media PP polipropileno Rpm revoluciones por minuto SS solución salina 0.085% (m/v) X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido) xiv RESUMEN La producción de polihidroxialcanoatos conteniendo monómeros insaturados fue evaluada en Pseudomonas putida IPT 046 y en mutantes mini-Tn5 deficientes en crecimiento en ácido 4-Pentenóico. El mutante BJ5 presento un porcentaje mayor de incorporación del monómero insaturado HHd∆6 en comparación a la cepa salvaje. Mediante la inserción del gen fadH1 (codificador de 2,4-dienoil CoA reductasa) en el plásmido pBBR1MCS-5 fue posible complementar a los mutantes con este gen el cual probablemente esta afectados. 5 mutantes que estaban afectados parcialmente en el crecimiento en ácido 4-pentenóico, restablecieron este fenotipo después de haber sido complementados con el gen fadH1. Los mutantes que presentaron mayor incorporación de HHd∆6, no restablecieron el fenotipo de crecimiento en ácido 4pentenóico después de la conjugación con el plásmido cargando el gen fadH1, lo que sugiere la existencia de más genes involucrados en el metabolismo de ácidos grasos con insaturaciones que se extienden de carbono par hacia impar. Palabras clave: Polihidroxialcanoatos, Pseudomonas, ácidos grasos insaturados, fadH1 xv 1. INTRODUCCION Los plásticos de origen petroquímico son ampliamente utilizados debido a su fácil moldeamiento y alta resistencia química, pero son un problema ambiental, debido a su alto peso y conformación molecular, la acción de los microorganismos en los procesos degradadores es mínima, por lo cual permanecen en el ambiente durante amplios periodos de tiempo. Las medidas que se han adoptado para solucionar el problema de acumulación de basuras plásticas engloba desde el reciclaje hasta la incineración de las mismas, las cuales no son soluciones muy viables debido a que los procesos son costosos, no abarcan todos los desechos y generan emanaciones gaseosas nocivas para el ambiente, las cuales en los últimos años están siendo mas restringidas por las nuevas legislaciones medioambientales. La sobrepoblación humana, combinado con el actual estilo de vida exige el uso racional, eficiente y auto sostenible de fuentes naturales para producir sustancias amigables para el medio ambiente como los Polihidroxialcanoatos (PHA). Los polihidroxialcanoatos (PHA) constituyen una familia de poliésteres acumulados intracelularmente, en forma de gránulos, los cuales representan una alternativa biotecnología para la producción de plásticos biodegradables y biocompatibles. Los PHA poseen una amplia gama de propiedades que permiten su aplicación en diversas áreas. Son termoplásticos, insolubles en agua, no tóxicos, biocompatibles y biodegradables. Estos poliésteres son una alternativa ecológica a los plásticos derivados del petróleo. Estos polímeros son clasificados en dos grandes grupos dependiendo de su conformación: PHASCL (short chain length), los cuales están constituidos por monómeros de 3 a 5 carbonos; y PHAMCL (médium chain length) que de 6 hasta 16 carbonos. 16 La posibilidad de usar diferentes sustratos renovables para la producción de PHA hace más atractivo el proceso, ya que dentro de las grandes posibilidades se encuentran el uso de carbohidratos, pasando por alcoholes, hasta aceites vegetales, los cuales están constituidos por triglicéridos y radicales con cadenas de ácidos grasos saturados e insaturados. Dentro de los diferentes PHA producidos, el primero en ser descubierto y caracterizado fue el poli-3hidroxibutirato (P3HB), siendo objeto de varios estudios los cuales revelaron, entre otros resultados, una gran diversidad de microorganismos producen este polímero de características cristalinas y pertenecientes al grupo de PHASCL.. Los PHAMCL son poliésteres que presentan propiedades elastioméricas. Son producidos por diferentes especies de Pseudomonas y presentan características diferentes al P3HB y a sus copolímeros, los cuales son cristalinos. Es por esto que los PHAMCL son necesarios para cubrir las necesidades que el P3HB y sus copolímeros no abarcan. Para la producción sostenible de PHAMCL se buscan sustratos que cumplan con las condiciones para la obtención del polímero, por lo cual, entre las mejores opciones, está el uso de ácidos grasos derivados a partir de aceites vegetales, debido a que son de bajo costo, son renovables y además, su constitución presenta insaturaciones, las cuales sirven como precursores de monómeros insaturados para la incorporación al polímero, modificando sus propiedades químicas y así proporcionarle características propias que amplían su aplicación industrial. Además de eso, las insaturaciones sirven como blanco para modificaciones químicas posteriores. Este trabajo tiene como propósito evaluar la producción de PHAMCL conteniendo monómeros insaturados por mutantes de P. putida IPT046 afectados en el crecimiento en ácido 4-pentenóico. 17 2. REVISION BIBLIOGRÁFICA 2.1. Biopolímeros Una amplia variedad de polímeros son sintetizados a partir de materia viva, productos agrícolas y de procesos biotecnológicos Dependiendo de su estructura química, estos polímeros se clasifican en: ácidos nucléicos, poliamidas, polisacáridos, poliésteres, politioésteres, polianhídridos, poli-isoprenoides y polifenoles (STEINBÜCHEL, 2001). Los bioplásticos son poliésteres producidos por una amplia variedad de microorganismos, cultivados bajo unas condiciones específicas (MADISON & HUISMAN, 1999). Las propiedades físico-químicas de estos materiales dependen del microorganismo productor y del sustrato suministrado (HA & CHO, 2002). Además de su obtención natural, los bioplásticos son de gran importancia gracias a su biodegradabilidad, la cual es debida al metabolismo de organismos presentes en la naturaleza, que transforman los materiales poliméricos en compuestos de bajo peso molecular como CO2 y H2O. Los plásticos biodegradables son clasificados en 3 grandes grupos: Polímeros químicamente sintetizados: son susceptibles a la acción de microorganismos y no pueden ser usados con fines comerciales debido a su alta tasa biodegradativa y propiedades físicas. Ej.: Ácido poliglicólico, poli (e-caprolactona), alcohol polivinílico, etc. (KHANNA & SIVRASTAVA, 2004). Plásticos biodegradables a base de almidón: en este tipo de plástico, el almidón actúa como complemento y a la vez sirve como relleno y agente adherente para crear una mezcla entre almidón y plástico (almidónpolietileno). Las bacterias del suelo degradan el almidón y también alteran la matriz del plástico, aumentando la biodegradabilidad pero generando nuevos 18 compuestos recalcitrantes que quedarán en el ambiente durante largos periodos de tiempo (KHANNA & SIVRASTAVA, 2004). Polihidroxialcanoatos: Son los únicos polímeros 100% biodegradables (KHANNA & SIVRASTAVA, 2004). 2.2 Polihidroxialcanoatos Los Polihidroxialcanoatos (PHA) son una familia de poliésteres compuestos principalmente de ácidos R-3 hidroxialcanoicos acumulados en forma de gránulos intracelulares, que pueden representar hasta el 80% de la masa seca celular (Fig. 1), los cuales sirven como fuente de carbono, energía y equivalentes reductores. (MADISON & HUISMAN, 1999) Son producidos bajo condiciones desbalanceadas de cultivo, es decir, con exceso en la fuente de carbono y limitación en los elementos esenciales (N, S, O, P, Mg) (ANDERSON & DAWES, 1990). 1µm Figura 1. Microfotografía electrónica de P. putida con gránulos de PHA (Luengo et al. 2003) La acumulación de este polímero se puede considerar una estrategia desarrollada por las bacterias para su supervivencia en ambientes cambiantes. Además de servirle a la célula como fuente de carbono, los PHA también sirven como fuente de energía para 19 el proceso de enquistamiento (Azotobacter sp.) y de esporulación (Bacillus sp.), para la protección de complejo nitrogenasa en las bacterias fijadoras de nitrógeno, ya que el PHA actúa como compuesto oxidable y también es constituyente de la membrana citoplasmática de bacterias (ALMEIDA et al., 2004; ANDERSON & DAWES, 1990, FILIPOV, 2000). Los PHA pueden ser clasificados en dos grandes grupos: (i) de cadena corta (HASCL“HydroxyAcids of Short-Chain-Length”), teniendo de 3 a 5 átomos de carbono en la cadena principal, y (ii) de cadena media (HAMCL-“HydroxyAcids of Medium-ChainLength”) teniendo de 6 a 16 átomos de carbono en la cadena principal (STEINBÜCHEL & VALENTIN, 1995). 2.2.1 Historia y Producción El primer hidroxialcanoato en ser estudiado fue el poli 3-hidroxibutirato (P3HB), el cual fue descubierto por Lemoigne en 1926 (LEMOIGNE, 1926). En 1964 se identifico El ácido 3-hidroxi-2-butenóico producido por una bactéria del género Nocardia (ANDERSON & DAWES, 1990). En 1972, a partir de estudios en aguas residuales, se confirmó la presencia de otras sustancias como los ácidos 3hidroxivalérico (3HV), 3-hidroxihexanóico (3HHx) y 3-hidroxiheptanóico (3HHep) mediante la extracción con cloroformo (WALLEN y ROHDWEDDER, 1974). En 1976, la empresa inglesa Imperial Chemical industries (ICI) empezó estudios para producir polihidroxibutirato (P3HB) a partir de Ralstonia eutropha, depositando en 1981, una patente para la producción del copolímero P (3HB-co-3HV). Este copolímero es conocido como BIOPOL® y es obtenido a partir de glucosa y ácido propiónico (BYROM, 1990). Cargill Dow Polymers comercializa sus resinas “EcoPla” in Japón. Algunas de las marcas que están en el mercado actualmente son NODAXTM (Copolímero de hidroxibutirato e hidroxihexanoato) y BIOCYCLETM (homopolímero de hidroxibutirato, copolímero de hidroxibutirato e hidroxivalerato) producido por la empresa brasilera PHB Industrial S.A. desde el año 2000, con una capacidad inicial de producción de 50 toneladas por año, la cual se encuentra en fase de ampliación (NONATO et. al., 2001) (LEMOS et. al., 2006). 20 La empresa estadounidense Procter & Gamble desarrolló y comercializó en 2004, un copolímero de P3HB y 3HA con radicales laterales con más de 3 carbonos utilizando microorganismos genéticamente modificados (NODA et al. 2004). Debido a su crecimiento económico y demográfico en la segunda mitad del siglo XX, China se ha convertido en una de los países que más produce y a su vez, consume plásticos en el mundo (Tabla 1). En este país asiático se están desarrollando varias investigaciones para la obtención de PHA, contando con el 50% de las empresas a nivel mundial que producen este biopolímero (CHEN, 2008). Tabla 1. Compañias involucradas en la investigación y producción de PHA en el mundo (CHEN, 2008) Compañia Clases de PHA Escala (ton/año) Periodo ICI, UK PHBV 300 1980 hasta 1990 Chemie Linz, Austria PHB 20-100 1980s BTF, Austria PHB 20-100 1990s Biomers, Alemania PHB Desconocido 1990s - presente BASF, Alemania PHB, PHBV Escala piloto 1980s - presente Metabolix, USA Desconocido Desconocido 1980s - presente Tepha, USA Desconocido PHA como BioImplantes 1990s - presente ADM, USA (con Metabolix) Desconocido 50,000 2005 - presente P&G, USA PHBHHx Hecho por encargo 1980s - presente Monsanto, USA PHB, PHBV Planta de producción de PHA 1990s Kaneka, Japón (with P&G) PHBHHx Desconocido 1990s - presente Mitsubishi, Japón PHB 10 1990s Biocycles, Brasil PHB 100 1990s - presente 21 DSM, Holanda Desconocido Desconocido 2006-Presente Zhejiang TianAn, China PHBV 1000 1990s - presente Beijing TianZhu Biomaterials, China PHBHHx PHA como BioImplantes 2003 - presente Jiangmen Biotech Ctr, China PHBHHx Desconocido 1990s Tianjin Northern Food, China PHB Escala piloto 1990s Shantou Lianyi Biotech, China PHB Escala piloto 1990s to 2005 Jiangsu Nan Tian Group, China PHB Escala piloto 1990s - presente Shenzhen O’Bioer, China P(3HB-co-4HB) Desconocido 2004 - presente Tianjin Guo Yun, China P(3HB-co-4HB) Escala piloto 2004 - presente Shandong Lukang, China PHAMCL Escala piloto 2005 - presente Shijiazhuang Pharma Group, China Desconocido Desconocido 2006-Presente 2.2.2. Características químicas y físicas Como se mencionó anteriormente, los PHA son poliésteres compuestos por monómeros de (R)-3-hidroxiácidos, generalmente lineales, en los cuales, el grupo carboxilo forma un enlace éster con el grupo hidroxilo con del monómero siguiente. (MADISON & HUISMAN, 1999) (Fig. 2). Hasta el momento se han identificado más de 150 ácidos hidroxialcanoicos, saturados, insaturados, halógenos, aromáticos, etc. (STEINBUCHEL & VALENTIN, 1995) los cuales son incorporados a la cadena lateral del PHA y a su vez cambian sus propiedades físicas, llevándolas a ser usadas en nuevas aplicaciones tecnológicas. Esta variabilidad depende del tipo de sustrato que se suministra, especificidad en la polimerización y las diferentes rutas metabólicas que conllevan la formación de los monómeros (MADISON & HUISMAN, 1999) (SILVA-QUEIROZ, 2007). 22 Figura 2 Estructura General de los Polihidroxialcanoatos (LEE, 1996) La masa molecular de los PHA es del orden de 50kDa hasta 100kDa, esto depende de la naturaleza del polímero (MADISON & HUISMAN, 1999). Intracelularmente, el P3HB, existe en unos estados líquidos y amorfos, mientras que, después de su extracción mediante el uso de solventes orgánicos, éste pasa a un estado cristalino, confiriéndole características rígidas, pero a su vez quebradizo. Su punto de fusión es relativamente alto (180° C), pero cerca del punto de degradación térmica (200° C) (KIM & LENZ, 2001). Debido a su conformación estructural, los PHASCL y PHAMCL, difieren en sus características termoplásticas y elastioméricas. Los PHASCL son catalogados como termoplásticos, mientras que los PHAMCL, por tener menor cristalinidad y puntos de fusión menores son reconocidos como elastómeros (POIRIER et al., 2001). Los 23 PHAMCL tienen un alongamiento para ruptura mayor que 100%, mientras que los PHASCL poseen un alongamiento para ruptura menor que 5%; la incorporación de unidades de 3HV al P3HB permite aumentar la maleabilidad y resistencia, alcanzándose valores de alongamiento para ruptura cerca de 50% (SUDESH et al., 2000). Tabla 2 Propiedades físicas de PHA y PP. Modificado de REHM, 2007. Tg(Temperatura de transición vítrea) Tm( Temperatura de cristalización) Propiedades PHAMCL PHASCL PP Tm (°C) 177 61 176 Tg (°C) 2 -36 -10 Cristalinidad (%) 70 30 60 Elongación (%) 5 300 400 Las características del medio ambiente también repercuten en la producción de los biopolímeros. Varios estudios han demostrado la influencia que tienen los campos magnéticos en el rendimiento productivo de los microorganismos (ZHI-YONG et al., 2007; TAKEHIRO et al., 2003). CHEN & LI (2008) determinaron que definitivamente existe una influencia de los campos magnéticos estáticos en la producción de PHB. 2.2.3. Aplicaciones El mercado de los PHA se puede clasificar en dos grandes grupos: (i) Envases desechables biodegradables, con un mayor volumen de demanda, debido a que son producidos bajo formas predeterminadas, pero en donde los productos petroquímicos tienen ventaja debido a su excelente procesabilidad y bajo costo de producción. En este grupo, el objetivo fundamental es crear un mercado “ecológico” donde su biodegradabilidad le confiera un valor agregado al producto terminado, ya que según Nonato y colaboradores (2001), el PHB puede ser vendido a US$5.83 por Kilo, siendo mucho más barato que el polímero producido por Biomol® cuyos precios 24 oscilan entre US$10-20 por kilo, dependiendo de la naturaleza de este. Algunos productos comerciales fabricados a partir de PHA son botellas, recipientes para cosméticos, bolígrafos, palos de golf, entre otros. (ii) Área farmacéutica, ya que desde 1990, los PHA están siendo estudiados como posibles microencapsulados para liberación controlada de medicamentos. Algunas sustancias de origen natural como el colágeno ya fueron utilizadas para tratamiento de tejidos cardiacos afectados, pero se observó una baja eficiencia en la reparación debido a que durante el procedimiento quirúrgico, las partículas pueden migrar de lugar del implante antes del crecimiento del nuevo tejido (GALEGO et al., 2000). En el campo de la oncología, los PHA también están siendo evaluados en diferentes tratamientos, como por ejemplo, el P3HB y el PHPE son utilizados como microesferas portadores de NzPC, un colorante fotosensibilizador el cual es usado en terapia fotodinámica. (RÉ et al., 2005). Diversas pruebas han sido realizadas y han mostrado que el P3HB es biocompatible, debido a que R-3-Hidroxibutirato es un constituyente normal de la sangre en concentraciones entre 0.3 y 1.3 mM, así mismo, estudios demuestran que no existe alteración en los parámetros funcionales, bioquímicos y fisiológicos en los pacientes, además de presentar propiedades mecánicas iguales o mejores que los termoplásticos convencionales. Los PHAMCL, gracias a sus características elastioméricas, poseen aplicaciones potenciales como precursores de moléculas con propiedades anti-reumáticas, analgésicas, radiopotenciadores, anti-tumorales, además en biopelículas médicas y dispositivos especiales como soporte de fármacos, nuevos tipos de suturas, soporte regenerativo de tejidos vasculares, etc. (POUTON & AKHTAR. 1996; ZINN et al. 2001; SANCHEZ et al. 2003; SHISHATSKAYA et al. 2001; LUENGO et al. 2003). 2.3 Síntesis de PHA En diversos grupos de bacterias ha sido estudiada profundamente la biosíntesis de PHA. Algunas rutas metabólicas han sido descritas especialmente para 4 microorganismos: Cupriavidus necator, Rhodospirillum rubrum, Pseudomonas 25 oleovorans y Pseudomonas aeruginosa. (STEINBÜCHEL, 1996; STEINBÜCHEL & LÜTKE-EVERSLOH, 2003). 2.3.1 Síntesis de PHASCL En Cupriavidus necator la formación de PHASCL, polímero con cadenas de hasta 5 carbonos, ocurre por la acción de 3 diferentes enzimas producidas a partir de genes organizados en un operón conocido como phaCBA. Dos moléculas de Acetil-CoA producidas a partir de la degradación de la fuente de carbono suministrada son condensadas a acetoacil-CoA por la acción de la β-tiolasa (phaA). La molécula de acetoacil-CoA es reducida en la posición 3 por la acetoacil-CoA reductasa NADH dependiente (phaB), produciendo (R)-3-hidroxibutiril CoA. La reacción final involucra la polimerización de dos moléculas de (R)-3- hidroxibutiril CoA mediante la formación de un enlace éster gracias a la enzima PHB polimerasa (phaC) (Figura 3). Esta enzima es muy activa en monómeros que contienen menos de 5 átomos de carbono. (STEINBÜCHEL, 1991; ZINN et al., 2001; SUDESH et al., 2000). Figura 3. Síntesis de PHB. (1) β-Cetotiolasa (2) acetoacil CoA reductasa (3)PHB polimerasa 2.3.2. Síntesis de PHAMCL Uno de los factores clave en la síntesis de PHAMCL es la enzima pha sintasa del grupo II, producida por Pseudomonas, la cual es diferente a la pha sintasa producida por C. necator en cuanto a la afinidad que tiene por sustratos que poseen de 6 a 16 átomos de carbono (AMARA & REHM, 2003). 26 Distintas vías metabólicas han sido propuestas para la biosíntesis de PHAMCL a partir de diferentes tipos de sustrato (Figura 4). A partir del metabolismo de carbohidratos, son producidas moléculas de acetil-CoA, las cuales, vía malonil-CoA, son incorporadas a la biosíntesis de novo de ácidos grasos, donde es generado el 3-hidroxiacil, el cual es transportado de la ACP (Acyl carrier Protein) para la coenzima A (CoA) y ahí, es polimerizado por la acción de la pha sintasa (REHM et al. 1999). Figura 4. Vías metabólicas propuestas a partir de diferentes sustratos (http://mbel.kaist.ac.kr/lab/index_en.html) El metabolismo de los ácidos grasos (β-oxidación) es una de las vías más comunes para producir PHA de cadena media. La composición de estos polímeros está directamente relacionada con la estructura de la fuente de carbono. Cuando el sustrato posee de 6 a 12 átomos de carbono, los monómeros de PHA poseen la 27 misma longitud, o tienen 2, 4 o 6 carbonos menos. Cuando se suministran ácidos grasos de 13 a 18 carbonos, la composición del PHA no es relacionada con la longitud del sustrato, debido a que el monómero más largo que es incorporado posee 12 o 14 carbonos, aunque en su estructura puede presentar insaturaciones (ÁVILA-LEÓN, 2007). Aun no está claro si una epimerasa, 3-cetoacil reductasa o enoil-CoA hidratasa (Figura 5) es la encargada de realizar el transporte de intermediarios de la β-oxidación para la síntesis de PHAMCL (GOMEZ, 2000). Figura 5. Ruta metabólica de Biosintesis de PHA a partir de Ácidos Grasos (http://mbel.kaist.ac.kr/lab/index_en.html) 2.4 Detección y cuantificación de PHA Diferentes técnicas han sido empleadas para la detección de gránulos de polímero intracelular. Los colorantes lipofílicos negro de Sudán (SCHLEGEL et al. 1970) azul de Nilo A, y rojo de Nilo (KRANZ et al. 1997) son utilizados ampliamente. Este último produce una fuerte fluorescencia naranja a una longitud de onda de 28 543nm han sido utilizados para distinguir colonias acumuladores de PHA de las colonias que no acumulan el polímero. (SPIEKERMAN et al. 1999). El método cuantitativo para detección de polihidroxialcanoatos es mediante cromatografía de gases, utilizando como patrón interno ácido benzóico, el cual establece tiempos de retención determinados para cada uno de los tipos de estructuras y cantidad de carbonos presentes en ellas. Para realizar esta cuantificación es necesario extraer los PHA de las células previamente y despolimerizarlos mediante métodos como metánolisis para formar metil-ésteres (BRAUNEGG et al., 1978) o propanólisis para formar propil-ésteres (RIIS & MAI, 1988) La cuantificación de los Polihidroxialcanoatos también se realiza mediante en análisis espectroscópico de Resonancia Magnética Nuclear con C13 (C13-NMR). Esta técnica es muy útil para PHASCL, pero presenta complicaciones con PHAMCL saturados e insaturados debido a la equivalencia de los cambios químicos en los átomos de carbono y los patrones protónicos del espectro de NMR. 2.5. Metabolismo de Ácidos Grasos Los triglicéridos son lípidos formados por la unión de tres moléculas de ácidos grasos con una molécula de glicerol mediante un enlace éster. Los ácidos grasos constituyentes de la estructura del glicerol difieren generalmente en su estructura. Los aceites están compuestos de triglicéridos, los cuales por acción de lipasas, son hidrolizados a ácidos grasos. (Figura 6) El glicerol es fosforilado y oxidado a dihidroxiacetona fosfato, el cual es un intermediario de la glicólisis, para convertirse finalmente en acetil-CoA, molécula precursora de diferentes vías metabólicas, entre ellas, ciclo de Krebs y Biosíntesis de novo de ácidos grasos. (ROMERO, 2006). 29 Figura 6. Hidrolisis de Triglicéridos (http://www2.ufp.pt/~pedros/bq/fatty.htm) 2.5.1. β-Oxidación de ácidos grasos Un amplio grupo de bacterias pueden crecer y dividirse en ácidos grasos de cadena larga que son oxidados a Acetil-CoA por una vía metabólica denominada βoxidación (WHITE, 2OOO). Esta ruta consiste en una serie de 4 reacciones, al final de las cuales, el acil-CoA será reducido a dos carbonos, liberados en forma de Acetil-CoA. (Figura 7). En el modelo propuesto para E. coli por DiRUSSO y colaboradores (1999) los ácidos grasos entran a la célula mediante un mecanismo de translocación que involucra a dos enzimas: FadL, que sirve como receptor de los ácidos grasos y ayuda a su paso a través de la membrana externa; y fadD (Acil-CoA Sintetasa), proteína encargada de la activación del ácido graso internalizado. La oxidación de esta molécula activada se da mediante la acción de las proteínas fadF y fadG (Acil-CoA deshidrogenasa), las cuales tienen afinidad por sustratos de cadena media-larga y cadena corta respectivamente. El producto generado es un enoil-CoA (Acil-CoA con insaturación en la posición 2). El producto del gen fadE es una flavoproteína encargada del transporte de electrones necesarios en la acción de las Acil-CoA deshidrogenasas. 30 Figura 7. Modelo de β-Oxidación de Ácidos Grasos Modificado de DiRusso, 1999 Las enzimas que continúan con el proceso oxidativo de los ácidos grasos están agrupados en un complejo multienzimático conocido como el operón fadBA, en el cual son producidas las siguientes enzimas: 2-enoil-CoA hidratasa, 3-hidroxiacilCoA deshidrogenasa, 3-oxoacil-CoA tiolasa, 3-hidroxiacil-CoA epimerasa y 3-cis2-trans-enoil-CoA isomerasa. Este complejo está compuesto por una subunidad alfa 31 de 78 kDa y una subunidad beta de 42 kDa. (PRAMANIK et al., 1979; KUNAU et al. 1995). 2.5.2. Ácidos grasos insaturados Los principales ácidos grasos presentes en los aceites vegetales son el ácido oleico el cual presenta una instauración en el carbono 9 (C18:1∆9) y el ácido linoléico, el cual posee dos insaturaciones (C18:2∆9,12). Estos dos ácidos grasos representan más del 70% de la composición general de estas sustancias de origen natural. (VANZIN, 2008). La oxidación de estos ácidos grasos requiere de dos enzimas más, enoil-CoA isomerasa y 2,4 dienoil-CoA reductasa para que el proceso de degradación continúe. La enzima enoil-CoA isomerasa es la responsable por la conversión de compuestos cis-3-enoil-CoA para trans-2-enoil-CoA, debido a que la acil-CoA deshidrogenasa no reconoce moléculas con conformación cis. Esta enzima actúa en las insaturaciones que se extienden de un carbono impar hacia un carbono par. Después de esta isomerización el ciclo de oxidación continúa normalmente. (KUNAU, 1987). La enzima 2,4 dienoil-CoA reductasa dependiente de NADH es especifica cuando el doble enlace se extiende de un carbono par hacia uno impar. Partiendo de esta premisa, el ácido linoleico, que posee dos insaturaciones (C18:2∆9,12) es oxidado hasta 3-cis-dodecenoil-CoA. Luego una enoil-CoA isomerasa actúa, generando 2trans-6-cis-dodecadienoil-CoA, el cual entra de nuevo al ciclo de β-oxidación y se produce 2-trans-4-cis-decadienoil-CoA. Es aquí cuando es necesaria la reducción de este compuesto mediante la 2,4 dienoil-CoA producida a partir del gen fadH, para generar 3-trans-decenoil-CoA, molécula la cual es intermediaria del ciclo de βoxidación. Es así como las insaturaciones (dobles enlaces) son manipulados por isomerasas cuando se extienden de carbonos impares a pares, por isomerasas y reductasas cuando las insaturaciones se extienden de carbonos pares a impares (STRYER, 1998; SCHULZ & KUNAU, 1987), 32 2.6. Pseudomonas spp. Pseudomonas spp., es un género de bacterias aeróbicas, Gram-negativas, quimioheterótrofas, móviles y de forma bacilar (MERCADO-BLANCO, 2007) adaptadas a un gran variedad de ambientes debido a sus simples requerimientos nutricionales y por la misma razón ampliamente distribuido en el suelo formando asociaciones con plantas. Crecen a pH casi neutro y en temperaturas mesofílicas, hasta 43° C. Se ha reportado que muchas especies de eficientemente en medios químicamente definidos Pseudomonas crecen conteniendo diferentes compuestos alifáticos (carbohidratos, ácidos grasos, ácidos dicarboxílicos y tricarboxílicos, alcoholes) y aromáticos como fuente de carbono (MARTÍNEZBLANCO et al., 1990; MIÑAMBRES et al., 1996). Metabólicamente, las especies pertenecientes a este género bacteriano presentan características muy similares entre sí, las principales pruebas bioquímicas se encuentran resumidas en la Tabla 2. Muchas especies de Pseudomonas pertenecientes al grupo I de homología rRNA producen PHA con diversos grupos funcionales tales como halógenos, alquilos ramificados, fenilos, fenoxilos, olefinas y ésteres, cuando son cultivados con las correspondientes sustancias químicas (KIM et al. 2000). Tabla 3. Principales Caracteristicas metabólicas de Pseudomonas (BERGEY, 2005) Prueba Bioquimica Resultado Oxidasa (+) Indol (-) Rojo de Metilo (-) Voges Proskauer (-) Citrato (+) Catalasa (+) 33 Clasificación científica de Pseudomonas sp (BERGEY, 2005). Dominio: Eubacteria Phylum: Proteobacteria Clase: Gamma Proteobacteria Orden: Pseudomonadales Familia: Pseudomonadaceae Género: Pseudomonas Las Pseudomonas poseen una amplia variedad de enzimas lipolíticas, las cuales son de vital importancia para su metabolismo. P. fluorescens y P. aeruginosa presentan enzimas hidrolíticas de tipo éster enantioselectivas, las cuales las hacen participes de los procesos de biotransformación y esterificación. Los primeros reportes de la producción de PHAMCL por Pseudomonas fueron en la especie P. oleovorans, describiendo la producción de polímero conteniendo 3hidroxioctanoato por la metabolización de ácidos grasos de cadena media, larga y también en alcanos (KESSLER Y PALLERONI, 2000). Hoy en dia se tiene conocimiento de la capacidad productora de todas las Pseudomonas fluorescentes (BALLISTRERI et al. 2001). El efecto de la temperatura en el crecimiento y en la posterior producción de PHA también ha sido estudiado en Pseudomonas (HABA et al. 2006) mostrando que a diferentes temperaturas la composición monomérica del polímero puede ser modificada. 34 3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION Los plásticos se han convertido en un material de uso cotidiano en la sociedad. Estas sustancias son de origen petroquímico y han sido producidos desde hace más de 100 años. Debido a la sobrepoblación humana la demanda de estos se ha incrementado en los últimos años y sumado a los altos costos del petróleo los cuales rondan los US$110 por barril[ http://www.opec.org/home/basket.aspx consultado agosto 2008], hacen que muchas investigaciones se dirijan a desarrollar nuevas tecnologías productoras de materiales con características similares a los productos petroquímicos y a la vez no tenga un impacto negativo en el medio ambiente. Millones de toneladas de residuos son producidos diariamente por las actividades humanas, entre los cuales, los plásticos aportan un gran porcentaje de estos desechos. En el caso de Bogotá, se producen diariamente 23 mil toneladas de basura, de las cuales, el 30% corresponden a residuos plásticos. Diversos programas de reciclaje están en funcionamiento aliviando de cierta manera este problema, pero, debido a la gran cantidad de desechos producidos, estos esquemas parecen no dar abasto, además de no ser totalmente limpios, debido a que generan una cantidad considerable de nuevas emisiones nocivas a la atmósfera. Tomando en cuenta esto, los biopolímeros, en especial los PHA aparecen como una de las opciones más viables, debido a su alta tasa de biodegradabilidad y a su generación a partir de sustancias naturales, productos de la agricultura, en general, de productos renovables. Sin embargo, la producción y el precio de los bioplásticos sigue siendo demasiado altos como para poder desplazar a los plásticos tradicionales, debido a que la infraestructura de producción es completamente nueva y específica para este producto. 35 El uso de sustratos baratos y de fácil adquisición como los aceites de origen vegetal, los cuales confieren monómeros de diferentes conformaciones, como insaturaciones y radicales acilos que poseen mayor numero de átomos de carbono, que pueden ser incorporados a la estructura de los PHA para así, proporcionarles nuevas características y así permitir que las insaturaciones puedan ser blanco para nuevas modificaciones. El estudio de los genes involucrados en la degradación de los ácidos grasos permite modular la composición de los monómeros constituyentes de los PHAMCL, y así, pensar una producción de polímeros hechos a la medida. 36 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo General Evaluar la incorporación de monómeros insaturados a PHAMCL producidos por mutantes de Pseudomonas putida IPT 046 afectados en el crecimiento en ácido 4pentenóico, así como los genes afectados en estos mutantes. 4.2 Objetivos específicos Determinar la composición de los PHA producidos por los mutantes de P. putida IPT 046 incapaces de crecer en acido 4-pentenoico utilizando como fuente de carbono ácido linoléico. Evaluar el efecto de la sobreexpresión del gen fadH1 en Pseudomonas putida IPT 046. Evaluar el efecto de la complementación de los mutantes obtenidos a partir de Pseudomonas putida IPT 046 con el gen fadH1; Evaluar los genes afectados en estos mutantes 37 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Microorganismos y Plásmidos Las cepas utilizadas y plásmidos que fueron utilizados están descritos en las tablas 4 y5 Tabla 4. Microorganismos utilizados Microorganismos Escherichia coli XL1-Blue Escherichia. coli S17-1 Caracteristicas PHA-, Lac-, Gms, Kans PHA-, F- 80dlacZ M15 (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1hsdR17(rk-, mk+) phoAsupE44 -thi-1 gyrA96 relA1 (SIMON et al., 1983) Pseudomonas putida IPT 046 Glu+, PHA+, Lin+, Val+, 4Pen+, Gms, Kans (GOMEZ, 1996) Pseudomonas putida AG46,AK1, Pseudomonas putida IPT 046, mutantes obtenidos con el plásmido BG45, BJ5, CF12, CN25, DG45, pUTKm2 conteniendo transposon mini-Tn5 Glu+, PHA+, Lin+, Val+, DM26, DR52, DW4, DX38 4Pen+, Gms, Kanr (SILVA-QUEIROZ, 2007) Pseudomonas putida AM1, CM29, Pseudomonas putida IPT 046, mutantes obtenidos con el plásmido CM51, CR4, DU54, EB50 pUTKm2 conteniendo transposon mini-Tn5 Glu+, PHA+, Lin+, Val+, 4Pen, Gms, Kanr (SILVA-QUEIROZ, 2007) Tabla 5. Plásmidos utilizados Plásmido Características pGEM:fadH1 pGEM conteniendo el gen fadH1 (SILVA-QUEIROZ, 2007) pBBR1MCS-5 Gmr lac POZ, MCS, Mob (KOVACH et al. 1995) 5.2 Medios de cultivo Los medios de cultivo fueron esterilizados en autoclave durante 20 minutos a 121° C, 1 atm. En la preparación de los medios minerales, la fuente de carbono y el agar-agar fueron esterilizados y adicionados después de la esterilización de la solución de sales. 38 5.3.1Medio LB (Luria-Bertani) (SAMBROOK et al., 1989) Triptona 10,0 g/L Extracto de Levadura 5,0 g/L Cloruro de Sodio (NaCl) 5,0 g/L Agar-Agar 20,0 g/L Las siguientes denominaciones fueron dadas a los diferentes medios LB con diferentes antibióticos: LBA: medio LB con ampicilina LBGm: medio LB con gentamicina 5.2.2 Medio Mineral (RAMSAY et al. 1990) (NH4)2SO4 1,00 g/L Na2HPO4 3,50 g/L KH2PO4 1,50 g/L MgSO4.7H2O 0,20 g/L CaCl2.2H2O 0,01 g/L Citrato férrico amoniacal 0,06 g/L Solución de elementos traza 1,00 mL/L Cada litro de solución de elementos traza contiene: H3BO3 0,30 g CoCl2.6H2O 0,20 g ZnSO4.7H2O 0,10 g MnCl2.4H2O 0,03 g NaMoO4.2H2O 0,03 g NiCl2.6H2O 0,02 g CuSO4.5H2O 0,01 g Las siguientes denominaciones fueron dadas a los diferentes medios minerales con diferentes fuentes de carbono: 39 MMGGm: Medio mineral con glucosa (1g/L) y gentamicina (15µL/mL) MM4P: Medio mineral con ácido 4-pentenóico (1g/L) MM4PGm: Medio mineral con con ácido 4-pentenóico (1g/L) y gentamicina (15µL/mL) MMV: Medio mineral con ácido valérico (1g/L) MML: Medio Mineral con ácido linoléico (2,5g/L) MMLGm: Medio Mineral con ácido linoléico (2,5g/L) y gentamicina (15µL/mL) 5.3. Condiciones de cultivo Las bacterias del género Pseudomonas fueron reactivadas en medio LB durante 24 horas, 30°C 150rpm. Luego fueron sembradas en agar LB durante 24 horas a 30°C. Posteriormente fueron sembradas en agar MMGGm, MM4P, MM4PGm, MMV durante 72 horas a 30° C. También se cultivó P. putida IPT 046 en MML y MMLGm. Escherichia coli fue cultivada en medio LB suplementado con antibiótico, durante 24 horas a 37° C, 150 rpm. Los antibióticos fueron preparados de acuerdo a SAMBROOK et al. (1989), esterilizados mediante filtración por membrana de 0.22µm (Millipore®) y posteriormente adicionados a los medios de cultivo en las concentraciones indicadas en la tabla 5. Tabla 6. Antibióticos y concentraciones utilizadas Solución Stock Concentración final Antibiótico (mg/mL) (µg/mL) Ampicilina 100 (en H20) 100 Gentamicina 15 (en H20) 15 40 5.4 Manipulación de ADN 5.4.1 Extracción de ADN plasmídico Fueron utilizados para la extracción de ADN plasmídico los siguiente kits, siguiendo las recomendaciones del fabricante: - DNA plasmídico: Quick Plasmid Miniprep (Invitrogen Corp. ) y Qiaprep® Spin Miniprep (Qiagen). También fue utilizado el método BIRBOIM & DOLY (1979), modificado. E. coli cargando el plásmido de interés fue cultivada “overnight” en 25mL de LB con el antibiótico al cual es resistente. El cultivo celular fue centrifugado en alícuotas de 1,5mL por 5 minutos a 13000 rpm. El sobrenadante fue descartado y las células fueron resuspendidas en 100µL de solución GETL [Lisozima 4mg/mL; Glucosa 50mM; EDTA de calcio y sodio (etileno diamino tetracetato) 10mM; Tris/HCL (hidrocloruro de hidroximetil aminometa) 25mM; pH 8,0] enfriado previamente, agitadas vigorosamente e incubadas en baño de hielo durante 5 minutos. Se adicionaron 200µL de SDS en NaOH 0,2M, se mezcló por inversión y se incubó durante 5 minutos en baño de hielo. Para la precipitación de ADN cromosómico y proteínas, se adicionaron 150µL de solución de acetato de potasio (Acetato de potasio 60mL; Ácido acético 11.5mL; H2O 8.5mL) enfriado previamente y nuevamente incubada durante 5 minutos en baño de hielo. Después de esto, la solución fue centrifugada durante 10 minutos, 6000rpm, 4° C. El sobrenadante, conteniendo el ADN plasmidial fue transferido para un nuevo tubo, donde se realizó la extracción con fenol/cloroformo (250µL de fenol y 250µL de cloroformo), luego se centrifugó durante 10 minutos, 13000rpm, 4° C. En seguida fue hecha la precipitación con etanol absoluto (750µL), se incubó durante 15-30 minutos en baño de hielo para luego centrifugar durante 20 minutos, 13000rpm, 4° C. Posteriormente se realizó un lavado con etanol 70% para luego centrifugar durante 10 minutos, 13000 rpm, 4° C y el “pellet” fue secado en incubadora a 65° C hasta que todo el 41 etanol remanente se evaporara. El “pellet” fue resuspendido en 30µL de solución TE (Tris 10Mm, EDTA 1Mm, pH 7.5) para luego ser almacenado a -20° C. 5.4.2 Digestión de ADN con enzimas de restricción Para la digestión de ADN fue utilizada la enzima ApaI, siguiendo las indicaciones del fabricante (Invitrogen Corp.) Después del tiempo indicado, la enzima fue inactivada a 65° C durante 10 minutos. 5.4.3 Ligación de ADN Las reacciones de ligación fueron realizadas usando la enzima T4 DNA ligasa (Fermentas Inc.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. 5.4.4 Preparación de células competentes Las cepas de E.coli XL1-Blue y/o E.coli S17-1 fueron inoculadas en 25mL de medio LB, conteniendo MgCl2 10mM, MgSO4 10mM, e incubadas en agitador rotativo a 37° C hasta lograr una DO650= 0.3-0.5. En tubos estériles fueron centrifugados 8mL de cultivo por 15min, 5000rpm, 4° C. El “pellet” obtenido fue resuspendido en un tampón de transformación (Tris 10mM; CaCl2 50mM; MgCl2 10mM; MgSO4 10mM; pH 8,0) Las células se mantuvieron durante 15 minutos en hielo y nuevamente fueron centrifugadas. Para la obtención de las células competentes, el “pellet” obtenido fue nuevamente resuspendido en 0,8mL de tampón de transformación, y posteriormente fue dividido en alícuotas de 200µL y mantenido en hielo. Las células fueron usadas de inmediato. 5.4.5 Transformación Bacteriana Para cada 200µL de células competentes, se adicionaron 10µL de ADN, se incubaron en baño de hielo durante 30 minutos, posteriormente esta solución fue sometida a un choque térmico a 42° C durante 90 segundos y enfriada inmediatamente en hielo. Se adicionaron 600µL de medio LB y se incubaron durante 1 hora a 37° C. Los clones transformados fueron seleccionados en medios de cultivo con el antibiótico apropiado. Los reactivos IPTG (isopropilβ-D-tio-galactósido) e X-Gal (5-bromo-4- 42 cloro-3-indolil-β-D-galactósido) fueron adicionados para diferenciar los clones recombinantes conteniendo el fragmento de interés. 5.4.6 Electroforesis en gel de agarosa Para el análisis de ADN se utilizó gel de agarosa 0.8 % (m/v) con bromuro de etidio 0.01% (v/v). Se usó solución TAE [Tris-base 242g; Ácido Acetico Glacial 57.1mL; EDTA de calcio y sodio (etileno diamino tetracetato) 0.5M (100mL); H2O 1000mL] como tampón de corrida. Las muestras de ADN fueron aplicadas en los geles con 1/10 del volumen del colorante de corrida Blue Green Loading Dye I (LCG Biotecnolgia). Las corridas electroforéticas fueron realizadas a 90V, 80mA, 80W durante 1 hora. El marcador de corrida fue GeneRuler 1Kb DNA ladder Plus 0,5µg/µL (Fermentas Inc.). Los geles fueron observados bajo Luz UV (254nm) en transiluminador (Ultralum 100) 5.4.7 Purificacion de ADN a partir del gel de agarosa Para la purificación de ADN del gel de agarosa fue utilizado el kit de purificación QIAquick® Gel extraction kit (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante 5.5 Construcción del plásmido por inserción del fragmento purificado a partir del gel de agarosa El plásmido pBBR1MCS-5 fue digerido con la enzima de restricción ApaI y ligado al fragmento fadH1 purificado utilizando la enzima de ligación T4 DNA ligasa (Fermentas Inc.). El plásmido fue transferido por transformación para E. coli S17-1 y XL1-Blue 5.6 Complementación E.coli S17-1::pBBR1MCS-5::fadH1 fue sembrada en LBGm mientras que P. putida IPT046 y los mutantes mini-Tn5, fueron sembradas en LB. Colonias aisladas fueron inoculadas en 25mL de medio LBGm para el caso de E. coli y en 25mL de medio LB para el caso de Pseudomonas. Después de 24 horas de cultivo a 37° C, 150rpm las células (25mL) fueron centrifugadas durante 10 minutos, 5000 rpm. Cada uno de los “pellets” obtenidos fueron resuspendidos en 10mL de solución salina (SS) y 43 centrifugados de nuevo durante 10 minutos, 5000 rpm. Estos “pellets” fueron nuevamente resuspendidos en 1mL de SS. Fueron sembrados 100µL de E.coli S17-1 en agar MMGGm y homogenizados utilizando espátula de Drigalski. Una vez seca esta capa, fueron sembrados 100µL de suspensión celular de P. putida IPT046 y los mutantes en cada una de las cajas e incubadas a 30° C durante 24 horas. Las colonias crecidas fueron repicadas en una nueva caja con MMGGm e incubadas durante 24 horas, 30° C. Después de este periodo, las colonias aisladas fueron sembradas en MMGGm, MM4P, MM4PGm y MMV para evaluar el crecimiento. 5.7 Ensayos de acumulación de polímero a partir de ácido linoléico Células de Pseudomonas putida IPT 046 y de los mutantes fueron sembradas en placas con agar LB. Colonias aisladas de estas placas fueron inoculadas en 25mL de medio LB en agitación continua 30° C, 24h, 150rpm. Una alícuota de este cultivo (6%) fue transferida para 50mL de MM con glucosa (5g/L), en agitación 30° C, 24h, 150rpm. Después de este tiempo, las células fueron lavadas y resuspendidas en solución salina. Esta suspensión fue utilizada para inocular 50mL de MM sin fuente de nitrógeno y con ácido linoleico (2.5 g/L) como fuente de carbono. Después de 48 horas de cultivo fueron analizados: masa seca celular, pH y composición de PHA. 5.7.1 Determinación de Masa seca celular (MSC) 10 mL de suspensión celular fueron centrifugados (10000rpm, 10 min, 4° C). El “pellet” obtenido fue resuspendido en solución tween 80 a 0,1% (v/v) y nuevamente centrifugado. Fue resuspendido en SS y filtrado a través de membranas de poro 0.45µm (Millipore®). La membrana con las células fue secada en un horno durante 4 horas a 100° C. Luego de este tiempo, las membranas fueron colocadas en un desecador durante 20 minutos a temperatura ambiente. Pasado este periodo, fue determinada la masa celular con la siguiente ecuación: MS= [(MMC – MM + HM)/VOL] X 1000 Donde: 44 MMC= masa de la membrana y células después del secado MM= masa de la membrana HM= humedad relativa media del lote de membranas VOL= volumen de suspensión centrifugado 5.7.2 pH El pH fue determinado a partir del sobrenadante obtenido de la centrifugación, en un potenciómetro (Mettler modelo Delta 350) utlizando patrones de pH de 4,0; 7,0 y 9,0 (Ingold – Mettler Toledo Int. Inc.). 5.7.3 Cantidad y composición de PHA Para determinar la cantidad y la composición de PHA, fue el método de propanólisis descrito por Riis y Mai (1988), en donde se tomaron 20mg de células liofilizadas, se adicionaron 2mL de solución de ácido clorhídrico (HCl) 0,1N en propanol (1:4) v/v, 2mL de 1,2-dicloroetano y 200μL de solución de 40g/L de ácido benzoico en propanol, como patrón interno. Los tubos fueron cerrados, agitados y sometidos por o 3 horas a 100 C en baño de María, agitándolos después de los primeros 30 minutos. Se enfriaron a temperatura ambiente y se les adicionó 4mL de agua Milli-Q, agitando vigorosamente por 30seg. La fase acuosa (superior) se descartó y la fase orgánica (inferior) que contiene los propil-ésteres fue analizada en cromatógrafo de gases HP6890 Series GC System equipado con una columna HP-5 (5% fenil- metilsiloxano, 30m de alto; 0,25 mm de diámetro; 0,25 µm de espesor del filme). El análisis fue llevado a cabo bajo las siguientes condiciones: Gas de arrastre: Helio (0,8 ml/min), temperatura del inyector: 250 ºC, temperatura del detector: 300 ºC, sistema de detección: Ionización de llama (FID), programa de temperatura: 100ºC por 1 minuto, aumento de la temperatura hasta 185ºC a 8 ºC por min y 185 ºC por 15 minutos. Fue usado ácido benzóico como patrón interno y polímeros producidos por P. oleovorans fueron utilizados como patrones externos. Para el análisis de monómeros conteniendo insaturaciones, especialmente en la región de 12 carbonos, 45 se usó el mismo factor de respuesta del componente saturado con 12 carbonos, es decir, el 3HDd. 46 6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1 Evaluación en la producción de PHA por mutantes deficientes en la utilización de ácidos grasos insaturados Este ensayo se realizó seleccionando 5 mutantes que presentaron, en una evaluación pasada (SILVA-QUEIROZ, 2007) mayor incorporación de monómeros insaturados (3HDd∆6) en comparación con Pseudomonas putida IPT046 y usando como fuente de carbono ácido linoléico (Tabla 6). Todos los mutantes evaluados mostraban un crecimiento mínimo en ácido 4-pentenóico. Tabla 6. Composición monomérica de PHA acumulados por P. putida IPT 046, AG46, BJ5, CF12, CN25 Y DU54, cultivadas en ácido linoléico* Cepas bacterianas MSC PHA (mol%) pH (g/L) PHA 3HHx 3HO 3HD 3HDd 3HDd∆6 (%MSC) IPT 046 0,77 6.72 12,73 31.06 32,75 2,95 20,49 26.11 AG46 0,72 6,70 10,36 30,10 32,75 4,93 21,86 24,21 BJ5 0,87 6,98 8,67 25,78 33,57 4,35 27,6 25,43 CF12 0,83 6,87 10,62 27,59 34,95 3,38 23,42 30,74 CN25 0,67 6,65 10,84 26,67 31,85 4,72 21,75 27,49 DU54 0,93 6,94 9,70 26,20 34,51 4,61 24,95 42,70 *Los resultados corresponden al valor medio de dos replicas La cepa salvaje (IPT 046) acumuló cerca de un 26% de biomasa en forma de PHA. 3HD y 3HO fueron, respectivamente, los monómeros producidos en mayor porcentaje. Si bien se conoce que a partir de la β-oxidación del ácido linoléico no se produce 3HDd, este monómero fue detectado en proporciones mínimas en todos los microorganismos evaluados. La producción de este compuesto probablemente se da debido a la biosíntesis de ácidos grasos, en donde, moléculas de Acetil-CoA producidas a partir del metabolismo del ácido linoléico son condensadas hasta formar compuestos de mayor peso molecular. La fracción molar de 3HDd∆6 producida por IPT046 fue de 20,49mol %. 47 Los mutantes AG46 y CN25 mostraron una gran similitud en cuanto a la producción de 3HDd∆6, presentando valores de 21,86 mol% y 21, 75 mol% respectivamente. Estos valores no difieren mucho de los mostrados por la cepa salvaje IPT 046. Los mutantes CF12 y DU54 presentaron una fracción molar de 3HDd∆6 correspondiente a 23,42% y 24,95% respectivamente, mostrando valores mayores a los producidos por la cepa salvaje. Por otro lado, el mutante DU54 acumuló cerca del 42% de masa seca en forma de PHA, además de producir 34,5 mol % de 3HD. El mutante BJ5 mostró la mayor incorporación de 3HDd∆6 con respecto a la cepa salvaje, con un valor de 27,6 mol %, sugiriendo algún cambio en el metabolismo de ácidos grasos, en relación a las enzimas involucradas en reducir los dobles enlaces de las insaturaciones que se extienden de un carbono par hacia un impar, presentada en el ácido linoléico. 6.2 Clonación del gen fadH1 en pBBR1MCS-5 En 2007, SILVA-QUEIROZ utilizó la secuencia del gen fadH de E. coli y buscó por secuencias similares en los genomas de Pseudomonas que han sido secuenciadas y encontró en todas al menos un gen fadH. En Pseudomonas aeruginosa se identificaron dos genes, denominados fadH1 y fadH2. Gracias a la elaboración de un dendograma, logró clasificar estos genes en dos grupos: fadH1 presentes en todas las Pseudomonas y fadH2 presente solamente en P. aeruginosa. Mediante el alineamiento de las secuencias del gen fadH1 de diferentes subespecies de P. putida, fueron diseñados iniciadores para la amplificación de este. ADN genómico de Pseudomonas putida KT2440 y Pseudomonas putida IPT O46 fueron usados como molde para realizar esta amplificación, obteniendo amplicones de 2,6Kb del genoma de Pseudomonas putida KT2440, mientras que, a partir del genoma de Pseudomonas putida IPT O46 no obtuvo ninguno, sugiriendo una diferencia en esa región del genoma. Esta hipótesis se fundamenta en el estudio de nuevos genomas secuenciados de diferentes sub-especies de Pseudomonas putida, los cuales muestran 48 que en regiones adyacentes al gen fadH1 se encuentran diferencias significativas (Fig. 8), por lo cual, es recomendable rediseñar los iniciadores para la amplificación de esta región genómica de P. putida IPT046. El producto de esta amplificación fue ligado al vector de clonación pGEM T-Easy® (ver Anexo I) y transferido para E. coli XL1-Blue mediante transformación (SILVA-QUEIROZ, 2007). Figura 8. Regiones del genoma de diferentes subespecies Pseudomonas putida donde se encuetra el gen fadH1 A partir de esto, uno de los objetivos de este trabajo fue la construcción del plásmido pBBR1MCS-5::fadH1, con el fin de expresar el gen fadH1 en P. putida y los mutantes obtenidos a partir de esta. La construcción de este plásmido se llevo a cabo en dos etapas. La primera consistió en la obtención del fragmento de DNA de interés (fadH1) el cual estaba inserido en el vector de clonación pGEM T-Easy® (SILVA-QUEIROZ, 2007). Luego de realizar una comparación de los sitios de restricción donde actuaban diferentes endonucleasas dentro del pGEM T-Easy® y la secuencia amplificada del 49 gen fadH1 (Figura 9), se determinó que todas las enzimas tenían sitio de corte dentro de la región codificadora, y por tanto no eran adecuadas para la clonación. La única excepción fue la enzima ApaI, la cual presenta un sitio de corte dentro del amplicón pero no en la región codificadora. Asi ApaI fue seleccionada para realizar la clonación del gen fadH. Para la clonación del gen fadH1 se realizó la extracción del plásmido y posteriormente se utilizó la enzima de restricción ApaI para separar el gen fadH del resto del plásmido TGTCCCATCCTTTTGTCAGCATGAGCGAACCCTCCGGGCGCACTGAGTAGGCGCCACGTTCCATGGGTGGATGAT CAAACGTGCTTGAAGAGTCTGGCAGAGCCGCGTTGTCTGGCAAATGCGCGGGGAGACTGTTTGGCGATCAAGCCA GGCGAACCTTATAGCGCTGAAGTTCTGGAGCCTTCCCGACAGTCGCTGCCTCTGCTGTTCATCACGATCATTAAC TTGTCAGTTTTGATCATTGAGGCAATTCAAACGGCTGTTTAATGTCGCAGGCAGACAAACGACGGGGCCCGCCAC CCAGTGAGGTGCCCGCATTCCGTGATCACGCCATCAGGGGACCTTTCCATGGCCGCCGACCGCTACCCGCACCTG CTTGCTCCGCTGGACCTGGGCTTTACCACCTTGCGCAACCGCACCCTGATGGGCTCGATGCACACCGGCCTCGAA GAGCGCCCCGGCGGCTTCGAGCGCATGGCAGCTTACTTTGCCGAGCGCGCCCGGGGCGGCGTTGGCCTGATGGTC ACGGGCGGCATTGCGCCCAATGATGAAGGCGGGGTGTATTCCGGTGCGGCAAAGCTCAGCACCGAGGAAGAGGCC GACAAGCACCGCATCGTCACCGAGGCGGTGCACGCTGCCGGTGGCAAGATCTGCCTGCAGATACTGCATGCCGGG CGCTACGCCTACAGCCCACGGCAGGTGGCACCTAGCGCGATCCAGGCGCCGATCAACCCGTTCAAGCCCAAAGAG CTGGATGAGGCGGGCATCGAGAAGCAGATCGCCGACTTCGTCAATTGTGCCGTGCTGGCTCAGCGTGCCGGTTAC GACGGCGTCGAAATCATGGGTTCGGAAGGCTACTTCATCAACCAGTTCCTGGCCGCCCACACCAACCACCGCACC GACCGCTGGGGCGGCAGTTATGAAAACCGCATGCGCCTGGCAGTGGAAATCGTCAGCCGGGTGCGTGGCGCGGTA GGGCCGAACTTCATCATCATCTTCCGCCTGTCGATGCTCGACCTGGTCGAGGGTGGCAGCACCTGGGACGAGATC GAGCTGCTGGCCAAGGCCATCGAGCAGGCCGGCGCGACCTTGATCAACACCGGAATCGGTTGGCACGAGGCGCGT ATTCCGACCATCGCCACCAAAGTGCCGCGTGCGGCCTTCAGCAAAGTCACCGCCAAGTTGCGCGGCGTGGTGAGC ATTCCGCTGATCACCACCAACCGCATCAACACCCCGGAAGTGGCCGAGGCAGTGCTGGCCGAGGGCGATGCGGAC ATGGTCTCGATGGCGCGACCGTTTCTCGCCGACCCGGACTTCGTCAACAAGGCCGCTGCCGGTCGTGCGGATGAA ATCAACACCTGCATCGGCTGCAACCAGGCCTGCCTGGACCATACCTTCGGCGGCAAGCTGACCAGTTGCCTGGTC AACCCGCGGGCCTGCCACGAGACCGAACTCAACTACTTGCCTGTACGTACGGTGAAACGCATTGCCGTGGTCGGC GCCGGCCCGGCTGGCCTGGCGGCGGCCACCGTGGCGGCCGAGCGGGGCCACGCGGTGACCCTGTTTGACGCCGCC AGCGAAATCGGTGGCCAGTTCAACGTGGCCAAGCGGGTGCCGGGCAAGGAAGAATTCTTCGAAACGCTGCGTTAC TTCCGCAACAAGGTCAAAAGCACGGGCGTCGACCTGCGCCTGAATACCCGCGTGGATGTGCAGGCACTGGTGGGC GGCGGCTTTGATGAAGTCATCCTGGCTACCGGCATCGCCCCGCGTACCCCGGACATCGCGGGCGTGGAGCATGCC AAGGTGCTCAGCTACCTGGACGTGCTGCTCGAGCGCAAGCCGGTGGGCAAGTCGGTGGCCGTGATTGGCGCGGGA GGTATCGGCTTCGATGTGTCCGAGTACCTGGTGCATCAGGGCGTGGCCACCAGTCAGGACCGAGCGGCATTCTGG AAAGAGTGGGGCATCGATACCCATCTTCAGGCGCGAGGTGGTGTGGCCGGGATCAAGGCCGAGCCGCATGCTCCG GCGCGGCAGGTGTACCTGTTGCAGCGCAAGAAATCCAAGGTGGGCGACGGGCTCGGCAAGACGACCGGCTGGATT CACCGCACCGGGTTGAAGAACAAGGGGGTGCAGATGCTCAACAGTGTCGAGTATCTGGGTATCGACGATGCCGGC CTGCACATTCGTGTGGACGGCGGCGAGCCCCAGGTGCTGGCGGTGGATAACGTGGTGATCTGTGCCGGGCAAGAT CCGCTGCGCGAGCTGCAGGAAGGGCTGGTGGCGGCGGGGCAGTCGGTGCACCTGATCGGCGGCGCGGATGTGGCG GCCGAGCTGGATGCCAAGCGGGCGATCAACCAAGGCTCGCGGTTGGCGGCTGAGCTCTGAGGTTGTCGGGGCTGC GTGAGCCCGACACCTGCACGCGTGGGAGCGGGCATGCCCGCGAAACAGGTGACGCGGTGGATGGCACCGGCATTG CCGGTGTTCGCGGGTGAACCCGCTCCTACGACGGGCTGTGCCGGGGCATCGATGCCTGTGTCGAGCCACCCTGGC ACTGTGATGCCTCGGCGGGGGCGGGTCATCGATTACAAGCGCTTGCGGGATTACCCTGTAAACTGCGATCCATG Figura 9 Secuencia de la región del amplicón conteniendo el gen fadH1.En rojo están señalados los sitios reconocidos por endonucleasas 50 El plásmido pGEM T-Easy ® fue digerido con la enzima de restricción ApaI y el fragmento de 2,6Kb fue purificado a partir del gel de agarosa después de la electroforesis. El vector pBBR1MCS-5 fue también digerido con la endonucleasa ApaI . y enseguida ligado al fragmento previamente purificado utilizando utilizando la enzima T4 DNA Ligasa. El producto de ligación fue transferido por transformación para E. coli XL1-Blue Los clones transformantes fueron seleccionados en cajas de Petri con agar LBGm, IPTG y X-Gal. Varias colonias blancas fueron seleccionadas y fueron sembradas en una caja de Petri con agar LBGm, IPTG y X-Gal utilizando palitos de madera. (Figura 10) Figura 10. Cajas con LBGm, IPTG y X-Gal mostrando colonias transformadas posiblemente con pBBR1MCS-5::fadH1 Se seleccionaron 10 colonias que presentaron un color blanco debido a que estas colonias recombinantes no producen β-galactosidasa, con lo cual no pueden degradar X-Gal, por lo tanto no presentan coloración azul. Se realizó extracción de ADN plasmídico de estas colonias. Posteriormente se realizó una digestión con enzima de restricción ApaI y seguido a esto una electroforesis en gel de agarosa permitió ver que en los pozos 5,7 y 8, habian 2 bandas, una de 5Kb aproximadamente, la cual corresponde al plásmido pBBR1MCS-5 y otra banda de 2,6 Kb, correspondiente al gen fadH1 (Figura 11) 51 Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa. 1. 1Kb ladder; 2-11. ADN plasmidial digerido con ApaI La figura 12 muestra electroforesis en gel de agarosa donde se resumen los principales pasos de la clonación del gen fadH1 en el vector pBBR1MCS-5. Las corridas 2, 3 y 5 corresponden respectivamente al plásmido pGEM T-easy®, pBBR1MCS-5::fadH1 y pGEM::fadH1 digeridos con endonucleasa ApaI. Las corridas 4 y 6 muestras los vectores pGEM::fadH1 y pBBR1MCS-5::fadH1. Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa. 1. 1Kb ladder; 2. pGEM; 3. pBBR1MCS-5::fadH1 digerido con Apa1; 4. pGEM:fadH1; 5. pGEM::fadH1 digerido con ApaI; 6. pBBR1MCS-5::fadH1 52 6.3 Complementación de Pseudomonas putida IPT 046 y los mutantes deficientes en crecimiento en ácido 4-pentenoico con el gen fadH1. Para la complementación de P. putida IPT 046 y los mutantes, inóculos de estos y de E. coli S17-1:pBBR1MCS-5::fadH1 fueron sometidas a conjugación en medio mineral con glucosa como fuente de carbono y gentamicina, que es una marca de resistencia del plásmido pBBR1MCS-5. Cada una de las cepas no podría crecer en este medio, porque E. coli S17-1 no crece en medio mínimo con glucosa como fuente de carbono y P. putida IPT 046 junto con los mutantes, no crece en medio con gentamicina, por lo cual, en este medio de cultivo solo podrían crecer bacterias del género Pseudomonas que hubieran recibido el plásmido mediante conjugación. Después de esto, las bacterias recombinantes fueron repicadas en un nuevo MMGGm con el fin de aislar el clon recombinante y descartar cualquier interferencia de las cepas utilizadas para la conjugación. Luego de esto, colonias aisladas de cada uno de los microorganismos fueron repicadas en MMGGm, MMV y MM4P, con el objetivo de evaluar el crecimiento en ácido graso insaturado. (Ver Tabla 8) Tabla 8. Perfil de crecimiento de IPT 046 y los mutantes frente a las cepas complementadas con pBBR::fadH1 en MMGGm, MMV y MM4P IPT 046 AG46 AK1 AM1 BG45 BJ5 CF12 CM29 CM51 CN25 CR4 DG45 DM26 DR52 DU54 Sin plásmido MMGGm MMV +++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ MM4P +++ + + + ++ + + ++ + + + ++ ++ 53 pBBR1MCS-5::fadH1 MMGGm MMV MM4P +++ +++ +++ ++ + ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ +/++ ++ ++ ++ +/++ ++ + ++ + ++ + ++ +/++ + + ++ + + - DW4 DX38 EB50 ++ ++ ++ + + + ++ ++ ++ + + + +/+ + Esta tabla muestra una comparación del crecimiento en MMGGm, MMV y MM4P de P. putida IPT 046 y los mutantes cuando están complementados con pBBR1MCS-5::fadH1 y cuando no poseen el plásmido. En el caso de la cepa salvaje y los mutantes sin complementar, no presentaron crecimiento en MMGGm, mientras que las cepas que si poseen el plásmido con la resistencia a gentamicina crecieron normalmente en este medio. Cuando se cultivaron los microorganismos en MMV, estos presentaron un crecimiento variable. AM1 y AM1::pBBR1MCS-5::fadH1 no mostraron ningún tipo de crecimiento (ver Fig. 11), sugiriendo que la mutación generada por la inserción del transposon mini-Tn5 afectó algún gen del metabolismo de los ácidos grasos. En el caso de IPT 046 y de los mutantes, presentaron un crecimiento acorde con los resultados de SILVA-QUEIROZ en 2007. Los microorganismos conteniendo el plásmido presentaron unos resultados, los cuales mostraron que la tasa de crecimiento en MMV disminuía AG46::pBBR1MCS-5::fadH1 y BG45::pBBR1MCS-5::fadH1(Ver DG45::pBBR1MCS-5::fadH1, o se inhibía, como en el BJ5::pBBR1MCS-5::fadH1(Ver Fig.14), caso de Fig.13), CR4::pBBR1MCS-5::fadH1, DM26::pBBR1MCS-5::fadH1 (Ver Fig.15) y DR52::pBBR1MCS-5::fadH1, DU54::pBBR1MCS-5::fadH1, DW4::pBBR1MCS5::fadH1, DX38::pBBR1MCS-5::fadH1, EB50::pBBR1MCS-5::fadH1 (Ver Fig. 16). Estos resultados sugieren que de alguna manera, la presencia del plásmido altera el metabolismo normal de ácidos grasos, lo cual no se puede comprobar hasta realizar una prueba, teniendo como control, estos microorganismos conteniendo el plásmido pBBR1MCS-5. La evaluación de crecimiento en MM4P mostró que la cepa salvaje y la cepa salvaje complementada con pBBR1MCS-5::fadH1 crecieron normalmente en este sustrato. 54 Algunos mutantes mostraron un crecimiento regular en MM4P, tal es el caso de CN25 (Ver Fig.14) DR52 y DU54 (Ver Fig.16) mientras que otros mutantes mostraron un crecimiento mínimo, como es el caso de AG46, AK1 (Ver Fig.13) BG45, CF12, CM29, CM51 (Ver Fig.14) CR4, DG45, DM26 (Ver Fig.15) DW4, DX38 y EB50 (Ver Fig.16). Dos mutantes (AM1 y BJ5) no mostraron ningún crecimiento en este medio. Los mutantes complementados con el gen fadH1 y cultivados en MM4P, mostraron un crecimiento menor en comparación a IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, con excepción de las cepas AM1::pBBR1MCS-5::fadH1, BJ5::pBBR1MCS-5::fadH1 y CM29::pBBR1MCS-5::fadH1, los cuales no presentaron crecimiento. Figura 13. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO NO. “1”. 1. IPT 046, 2. AG46, 3. AK1, 4. AM1, 5. BJ5, 6. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, 7. AG46::pBBR1MCS-5::fadH1, 8. AK1::pBBR1MCS-5::fadH1, 9. AM1::pBBR1MCS-5::fadH1, 10. BJ5::pBBR1MCS-5::fadH1 55 Figura 14.EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO NO. “2”. 1. IPT 046, 2. BG45, 3. CF12, 4. CM29, 5. CM51, 6. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, 7. BG45::pBBR1MCS-5::fadH1, 8. CF12::pBBR1MCS-5::fadH1, 9. CM29::pBBR1MCS-5::fadH1 y 10. CM51::pBBR1MCS-5::fadH1 Figura 15. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “3”. 1. IPT 046, 2. CN25, 3. CR4, 4. DG45, 5. DM26, 6. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, 7. CN25::pBBR1MCS-5::fadH1, 8. CR4::pBBR1MCS-5::fadH1, 9.DG45::pBBR1MCS-5::fadH1, 10. DM26::pBBR1MCS-5::fadH1 Figura 16. EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO No. “4” 1.IPT 046, 2. DR52, 3.DU54, 4. DW4, 5. DX38, 6. EB50, 7. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1, 8. DR52::pBBR1MCS-5::fadH1, 9. DU54::pBBR1MCS5::fadH1, 10. DW4::pBBR1MCS-5::fadH1, 11. DX38::pBBR1MCS-5::fadH1, 12. EB50::pBBR1MCS5::fadH1. 56 Seguido de esto, el paso siguiente fue evaluar el crecimiento de los mutantes complementados con el plásmido pBBR1MCS-5::fadH1 en MM4PGm, con el fin de evidenciar una posible expresión de este gen. (Tabla 9) (Fig. 17) Una vez que sin la presión selectiva del antibiótico para mantener el plásmido en la célula, la no complementación de los mutantes podría resultar de la pérdida del plásmido y no de la incapacidad del gen fadH1 para complementar el mutante. Tabla 9. Perfil de crecimiento de los mutantes recombinantes en MM4PGm Microorganismo recombinante AG46::pBBR1MCS-5::fadH1 AK1::pBBR1MCS-5::fadH1 AM1::pBBR1MCS-5::fadH1 BJ5::pBBR1MCS-5::fadH1 BG45::pBBR1MCS-5::fadH1 CF12::pBBR1MCS-5::fadH1 CM29::pBBR1MCS-5::fadH1 CM51::pBBR1MCS-5::fadH1 CN25::pBBR1MCS-5::fadH1 CR4::pBBR1MCS-5::fadH1 DG45::pBBR1MCS-5::fadH1 DM26::pBBR1MCS-5::fadH1 DR52::pBBR1MCS-5::fadH1 DU54::pBBR1MCS-5::fadH1 DW4::pBBR1MCS-5::fadH1 DX38::pBBR1MCS-5::fadH1 EB50::pBBR1MCS-5::fadH1 57 MM4PGm +++ +++ +++ +++ +++ - Figura 17. Evaluación de crecimiento de los mutantes complementados en MM4PGm. 1. AG46::pBBR1MCS-5::fadH1, 2. BG45::pBBR1MCS-5::fadH1, 3. CR4::pBBR1MCS-5::fadH1, 4. DG45::pBBR1MCS-5::fadH1 y 5. DW4::pBBR1MCS-5::fadH1 Después de 72 horas de incubación, las cepas que presentaron un crecimiento mayor fueron AG46::pBBR1MCS-5::fadH1, BG45::pBBR1MCS-5::fadH1, CR4::pBBR1MCS-5::fadH1, DG45::pBBR1MCS-5::fadH1 y DW4::pBBR1MCS5::fadH1. Estos mutantes presentaban un crecimiento menor que IPT 046 cuando eran cultivados en MM4P (SILVA-QUEIROZ, 2007). A partir de estos resultados, se comparó el crecimiento en MM4PGm de IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1 con los mutantes complementados que crecieron en MM4PGm (Fig. 18 y 19). A B Figura 18. Evaluación de crecimiento entre IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1 y mutantes complementados en MM4PGm. Cajas A y B. 1,3,5. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1; 2. AG46::pBBR1MCS-5::fadH1; 4. BG45::fadH1 58 B A Figura 19. Evaluación de crecimiento entre IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1 y mutantes complementados en MM4PGm. Cajas A y B. 1,3,5. IPT 046::pBBR1MCS-5::fadH1; 2. CR4::pBBR1MCS-5::fadH1; 4. DG45::pBBR1MCS-5::fadH1; 6. DW4::pBBR1MCS-5::fadH1 En estas cajas se observó que existía una tasa de crecimiento muy similar entre las cepas recombinantes, resaltando que las colonias que están en los extremos de las cajas crecieron más debido a la disponibilidad de sustrato. Por otro lado, las colonias que se encuentran en el interior de la caja mostraron un crecimiento uniforme. Estos resultados son compatibles con una mutación en el gen fadH en estos mutantes, pues el fenotipo salvaje es restablecido. Además de eso, una vez que los mutantes presentaron algún crecimiento en ácido 4-pentenóico, están parcialmente afectados, lo que sugiere la existencia de más de un gen fadH en P. putida. Por otro lado, no hubo crecimiento de los demás mutantes complementados en MM4PGm. Esto sugiere que la mutación generada por la inserción del transposon mini-Tn5 afectó otro gen del metabolismo de ácidos grasos. Inicialmente se creía que el gen fadH debería codificar para la enzima mas importante en la metabolización de ácidos grasos con insaturaciones extendiéndose desde carbono par hacia impar y que, mutantes afectados en este gen, deberían presentar una mayor incorporación de 3HDd∆6 . Entre tanto, el mutante BJ5, presentó una mayor producción de 3HDd∆6 (Ver Tabla 6) pero no fue complementado con el gen fadH1, lo cual sugiere la existencia de otros genes involucrados específicamente en el metabolismo de estos ácidos grasos. 59 7. CONCLUSIONES Los ensayos de producción de polímero de los mutantes de Pseudomonas putida IPT 046, utilizando ácido linoléico (99% de pureza) como fuente de carbono demostraron un mayor porcentaje de incorporación de 3HDd∆6 por parte del mutante BJ5 demostrando que es posible alterar la incorporación de monómeros insaturados por mutaciones en genes relacionados con el metabolismo de ácidos grasos insaturados. Los oligonucleótidos diseñados a partir del alineamiento de secuencias del genoma de P. putida KT2440 para la amplificación del gen fadH1 no son los indicados para utilizarlos en P. putida IPT046 debido a que se encontraron diferencias en las regiones adyacentes al gen de interés en varios genomas que fueron evaluados. Los mutantes afectados parcialmente en el crecimiento en ácido 4-pentenóico que fueron complementados con el gen fadH1 sugieren la existencia de más de un gen fadH en P. putida. encargado de la reducción de las insaturaciones que se extienden de un carbono par hacia impar en los ácidos grasos. Los ensayos de producción de polímero y de complementación indican la existencia de otros genes que pueden estar involucrados en el metabolismo de ácidos grasos insaturados, ya que los mutantes que presentaron mayor incorporación de monómeros insaturados no fueron complementados con el gen fadH1. 60 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Almeida, A.; Ruiz, J.; Lopez, N.; Pettinari, J. 2004 Bioplásticos: uma alternativa ecológica. Revista QuimicaViva, n3, año3, abril 2004, http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v3n3/pettinari.pdf [Recurso Electronico] [Consulta Agosto 2008] Amara, A. A.; Rehm, B. H. A. 2003. 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