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___________________________________________________________________________ Máster Universitario en Biodiversidad en Áreas Tropicales y su Conservación FILOGENIA Y BIOGEOGRAFÍA DEL GÉNERO Distichia Nees & Meyen (JUNCACEAE) EN LOS ANDES TROPICALES Tesis presentada por: Dámaso Wilfredo Ramirez Huaroto Para optar al título de Máster Tutoras: Dra. Nora Oleas Dra. Elisa Bonaccorso Co–tutor: Mg. Asunción Cano Curso académico 2011–2012 AGRADECIMIENTOS Al Programa de Máster Oficial “Biodiversidad en Áreas Tropicales y su Conservación”, impartido en la ciudad de Quito, por otorgarme la beca para realizar la maestría, y a sus instituciones auspiciantes: el Consejo Superior de Investigaciones Científicas, la Universidad Internacional Menéndez Pelayo y la Universidad Tecnológica Indoámerica del Ecuador. A los herbarios QCA (Ecuador), LPB (Bolivia) y USM (Perú) y a sus directores por los permisos concedidos para el uso de especímenes en el presente estudio. A mis tutoras, Nora Oleas y Elisa Bonaccorso, por asesorarme constantemente durante la realización del presente trabajo y ayudarme en la comprensión de la biología sistemática de sus herramientas y metodologías. Agradezco su buen criterio, su apoyo e ilusión. A mi co–tutor, Asunción Cano, por asesorarme constantemente desde el pregrado y apoyarme en el camino de la investigación. A Jesús Muñoz por apoyarme en el financiamiento de las salidas de campo y compartir sus conocimientos conmigo. A Javier, Jaime, Alina, Zamir, Mariela por ayudarme durante las salidas de campo. A Diana Flores, por ayudarme constantemente durante la etapa de laboratorio. A todos muchas gracias…!!! RESUMEN Objetivo. Se analizaron las relaciones filogenéticas del género Distichia (Juncaceae), mediante el uso de datos moleculares: secuencias nucleares (ITS) y regiones intergenéricas del cloroplasto trnL–trnF y psbA–trnH. Así mismo, se reconstruyó la historia biogeográfica del género y se analizó su relación con la orogenia de los Andes. Localización. Andes de Ecuador, Perú y Bolivia Métodos. Se realizaron análisis filogenéticos de máxima parsimonia, máxima verosimilitud e inferencia bayesiana. Estos análisis incluyeron a especies de Distichia, Patosia y Oxychloe, géneros endémicos a los Andes. También se realizó un análisis de estimación de tiempos de divergencia, basado en el método bayesiano del reloj molecular relajado. Finalmente, se realizó una reconstrucción biogeográfica del género en base a su filogenia y su distribución en el presente. Resultados. Los análisis filogenéticos de los diferentes genomas revelaron una incongruencia en la monofilia del género. Los genes cloroplásticos apoyan la monofilia de Distichia, mientras que el gen nuclear lo relaciona con Patosia, y genera una baja resolución del árbol. El análisis de los genes combinados muestra un clado monofilético para Distichia con un apoyo moderado de bootstrap y significativo para inferencia bayesiana. La filogenia de los genes combinados agrupa a las especies de Distichia en cuatro clados definidos: D. acicularis, (Clado A); D. muscoides + D. filamentosa (Clado B); D. sp. nov. (Clado C); y un cuarto clado con relaciones ambiguas que agrupa a D. muscoides, D. filamentosa, D. acicularis, D. sp.nov (Clado D). Se muestra que D. 2 muscoides es una especie parafilética con dos linajes independientes. El análisis de tiempos de divergencia sugiere un origen reciente del género entre el final del Plioceno e inicio del Pleistoceno (2.82–1.09 Ma). Conclusiones principales. El análisis filogenético de Distichia, sugiere que es un grupo monofilético. La incongruencia filogenética entre los genes del cloroplasto y el nuclear dirigen a procesos evolutivos de ‘’separación incompleta de linajes’’ o ‘’evolución reticulada’’ dentro del grupo. Las relaciones filogenéticas no revelan claramente las relaciones taxonómicas entre las especies, especialmente para D. filamentosa, Distichia muscoides muestra ser una especie parafilética y Distichia sp. nov muestra parcialmente a sus ejemplares en un clado, al igual que D. acicularis. La topología de la filogenia y la distribución actual de las especies sugieren al altiplano de los Andes Centrales como posible centro de origen, después del levantamiento de los Andes. Se muestra un patrón de especiación direccionado a los Andes del Norte, mediante un probable proceso de dispersión progresiva. El patrón de especiación no sigue estrictamente la hipótesis de diversificación sur–norte en relación a la orogenia de los Andes propuesta por estudios previos. Palabras clave: Andes, páramo, puna, filogenia, dispersión, Neotrópico. 3 INTRODUCCIÓN Los Andes tropicales son considerados un “hotspot” de biodiversidad y poseen aproximadamente unas 45.000 especies de plantas, de las cuales el 44% (20.000) son endémicas (Myers et al., 2000). El alto grado de endemismo ha sido relacionado con procesos ocurridos en el Pleistoceno y a la especialización edáfica (Beck et al., 2007). Este endemismo llega a su máximo valor en el ecosistema del páramo en los Andes del Norte, alcanzando hasta un 60% de la flora (Luteyn, 1999). Debido a estos procesos históricos y geográficos, algunos géneros como Espeletia, Niphogeton, Orithrophium, Isoetes y Distichia se encuentran restringidos a las regiones más altas de los Andes (Luteyn, 1999; León et al., 2007). Distichia Nees & Meyen es un género con una distribución en las zonas altas de los Andes tropicales y conforma un grupo pequeño de plantas almohadilladas que incluye tres especies: D. muscoides, D. acicularis y D. filamentosa (Balslev, 1996; Kirschner et al., 2002; Balslev & Zuluaga, 2009). Estas especies suelen crecer en lugares pantanosos, arroyos y bordes de lagunas en la vegetación de los páramos y puna de los Andes (Balslev, 1996). Este grupo se encuentra dentro de la familia Juncaceae, la cual está conformada por siete géneros y 440 especies (Kirschner et al., 2002) que habitan las regiones árticas y templadas en ambos hemisferios, pero son raros en los trópicos (Drábková et al., 2006). Los géneros más diversos y cosmopolita son Juncus L. (315 especies) y Luzula DC. (115 especies); los otros cinco géneros tienen pocas especies (Balslev, 1996; Kirschner et al., 2002). Tres de ellos, Oxychloe Philippi (5 especies), Patosia Buchenau (1 especie) y Distichia Nees & Meyen (3 especies) están restringidas a las zonas de mayor elevación 4 (3000–5000 m) de los Andes. Los dos restantes, Marsippospermum Desv. (4) y Rostkovia Desv. (2), se encuentran en Sudamérica y Nueva Zelanda; Rostkovia tiene una distribución disyunta en los Andes del Sur, Andes del Norte, isla de Magallanes, isla Tristan da Cunha y las islas del Atlántico sur. El principal centro de diversificación de la familia Juncaceae se encuentra en Sudamérica (Drábková et al., 2006). El género Distichia Nees & Meyen presenta una amplia distribución en los Andes, desde Colombia hasta el norte de Chile y Argentina, con rangos altitudinales de 3000– 5200 m (Balslev, 1996; Kirschner et al., 2002; Buffen et al., 2009). Distichia muscoides Nees & Meyen es la especie con más amplia distribución desde Colombia hasta el norte de Argentina, con un rango altitudinal de 3600–5200 m (Balslev, 1996; Buffen et al., 2009). En las turberas altoandinas ‘’bofedales u oconales’’ esta especie suele ser dominante y muy característica por su capacidad de producir la turba, formando grandes almohadillas sobre suelos hidromórficos, muchas veces colonizando y colmatando cuerpos de agua (Tovar, 1973; Tovar, 1993; Rivas–Martinez & Tovar, 1982; Young et al., 1997; Salvador & Cano, 2002). Estudios filogenéticos realizado por Gould et al, (2010) en una comunidad vegetal descubierta por el retroceso de una capa de hielo en Quelccaya (Andes del sur-este de Perú), permitió identificar un humedal altoandino a 5200 m, con especímenes de Distichia muscoides de hace 5000 años aproximadamente. Distichia acicularis Balslev & Lægaard es la especie con una distribución más restringida a los Andes del Norte; crece en los páramos y aunque actualmente es considerado endémica para Ecuador (León–Yánez et al., 2011), ya ha sido registrada en la zona norte de Perú (Cooper et al., 2010) y existe un ejemplar en el herbario USM, 5 proveniente de Cajamarca. Distichia filamentosa Buchenau es una especie restringida a la puna; anteriormente era considerada endémica para Bolivia, pero hace unos años fue registrada en Chile y sur de Perú (Kirschner et al., 2002). Actualmente se ha registrado una especie de Distichia cuyos caracteres morfológicos no coinciden con ninguna de la especies descritas para el género y está restringida a la zona central del Perú en límite de páramo a puna (Ramirez, datos no publicados). Estudios filogenéticos previos han resuelto la posición de Distichia en la filogenia de las de las Juncaceae, ubicándolo en un clado con los géneros altoandinos, Patosia y Oxychloe (Drábková & Vicek, 2007). Así mismo, este grupo de géneros altoandinos se encuentra incluido en un clado mayor denominado “clado del hemisferio sur’’ junto con otros géneros cercanamente emparentados como Rostkovia y Marsippospermum (Drábková et al., 2003; Drábková & Vicek, 2007). Sin embargo hasta el presente, no se han realizado estudios que muestren las relaciones filogenéticas entre las especies de Distichia, y su historia biogeográfica es escasamente conocida. Hipótesis Biogeográfica de Especiación Sur–Norte en los Andes Tropicales Se han propuesto hipótesis de especiación direccionada de sur a norte para la flora y fauna distribuida a lo largo de la cordillera de los Andes (Doan, 2003; Chacón et al., 2006; Meudt & Simpson, 2006; Chaves et al., 2011). Esta hipótesis está basada en la disponibilidad de hábitats altoandinos conforme ocurría el levantamiento geológico de la cordillera, los cuales serían ocupados por los taxones siguiendo la orogenia de los Andes (Doan, 2003). El género Distichia es endémico de los Andes de Sudamérica y con un pobre conocimiento de su historia evolutiva y biogeográfica. Por esta razón el presente estudio 6 intenta responder a las siguientes preguntas según la hipótesis propuesta por Doan (2003); (1) ¿El género Distichia pudo haber tenido un origen en los Andes Centrales y seguir un patrón de dispersión de sur a norte, según la orogenia d elos Andes?; y (2) ¿Cómo afectaron las barreras biogeográficas a la historia evolutiva de Distichia? El presente estudio analiza las relaciones filogenéticas entre las especies del género Distichia y sus grupos hermanos con el objetivo de comprobar su monofilia, con base en secuencias nucleares (ITS) y regiones intergenéricas del cloroplasto (trnL–trnF; psbA– trnH). Así mismo, mediante la estimación de tiempos de divergencia, se analizan los escenarios de especiación y la historia evolutiva del género en relación a la orogenia de los Andes. Finalmente se discuten los procesos biogeográficos que permitieron su especiación y los factores responsables de su patrón de distribución. 7 MATERIALES Y MÉTODOS Taxones Muestreados Se analizaron un total de 40 especímenes que representan a ocho especies: tres taxones reconocidos y un taxón no descrito del género Distichia, una especie del género Patosia, una especie de Oxychloe, una de Rostkovia y una de Juncus. Los especímenes fueron obtenidos de ejemplares del Herbario de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (USM), Herbario de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador (QCA) y Herbario Nacional de Bolivia (LPB). Además se obtuvieron muestras colectadas en campo en turberas o bofedales altoandinos de páramo y puna de Ecuador, Perú y Bolivia entre el 2011–2012, estos muestras serán depositadas en los herbarios USM, QCA y HUTI. Las especies fueron identificadas o verificadas por el autor siguiendo las revisiones taxonómicas de Balslev (1996) y Kirschner et al. (2002). Los especímenes estudiados fueron una muestra representativa de la distribución geográfica, variación poblacional y hábitats de las especies en los Andes tropicales (Fig. 1). Como grupo externo se utilizaron especies de Rostkovia y Juncus, las secuencias de este último se obtuvieron del GenBank. Estos grupos han mostrado que se encuentran filogenéticamente cercanos a los taxones estudiados (Drábková & Vicek, 2007). La información del ejemplar, herbario y procedencia de los especímenes se muestra en la Tabla 1. Un aporte importante de la revisión de especímenes y el muestreo en campo fue el encontrar un primer registro del género Patosia para el Perú, además de corroborar la independencia taxonómica de un taxón no descrito (Distichia sp. nov) para el género (Fig. 2). 8 Figura 1. Mapa de distribución de las especies de Distichia. 9 A B C D Figura 2. Guía fotográfica de las especies de Distichia. A= Distichia muscoides, B= Distichia sp. nov, C= Distichia filamentosa, D= Distichia acicularis. 10 Extracción de ADN, PCR y Secuenciamiento El ADN vegetal fue extraído de muestras secadas en silica gel y de material de herbario, utilizando un protocolo basado en el uso de tiocianato de guanidina como agente lítico y precipitación con isopropanol frío (Fujita, no publicado). Se secuenciaron dos regiones del ADN cloroplástico: la región trnL–F, conformada por el intron trnL + el espaciador intergenérico trnL–trnF y el espaciador intergenerico psbA–trnH; ambas regiones fueron secuenciadas usando cebadores publicados anteriormente Sang et al. (1997) y Taberlet et al. (1991), respectivamente. El ADN nuclear fue secuenciado para el gen ITS (región espaciadora transcrita interna) usando cebadores ITS5i e ITS4i (Roalson et al., 2001), ver (Anexo I). Los genes seleccionados han sido muy útiles en estudios filogenéticos de Juncaceae (Drábková et al., 2003; Roalson, 2005; Drábková & Vicek, 2007). La reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) fue realizada siguiendo los procedimientos descritos por Gravendeel et al. (2001) para los genes ITS y psbA–trnH; para la región trnL–F se siguió el protocolo de PCR de Taberlet et al. (1991). Para los tres genes se hizo una optimización a los procedimientos mencionados, principalmente para las muestras de herbarios (Drábková et al. 2002), ya que no amplificaban siguiendo los protocolos estándar (Anexo II). Las secuencias de ADN obtenidas fueron editadas y sometidas a un consenso usando el programa Genious 5.4.3 (http://www.geneious.com/). Luego fueron alineadas automáticamente con el programa Clustal X v.2.1. (Larkin et al., 2007). Finalmente, se realizó una alineación manual con el programa Mac Clade 4.07 (Maddison & Maddison, 2005) con el fin de corregir las bases mal alineadas. 11 Tabla 1. Lista de especies, información del ejemplar, herbario y localidad de los taxones usados en el presente estudio. También se muestran los números de acceso de GenBank. (*) Muestras que serán depositadas en los respectivos herbarios. Especies Código Localidad Voucher Herbario ITS psbA–trnH trnL–F Distichia acicularis EC_099 ECUADOR; Cotopaxi, Quevedo– Latacunga S. Laegaard, 70786 QCA ˗ ˗ ˗ Distichia acicularis EC_101 ECUADOR; Chimborazo, Lag. Patacocha Carate, D. et al., 714 QCA ˗ ˗ ˗ Distichia acicularis EC_102 ECUADOR; Azuay, P.N. Cajas, Lag Toreadora C. Ulloa et al., 2135 QCA ˗ ˗ ˗ Distichia acicularis EC_061 Ecuador; Azuay, P.N.Cajas B. León et al., 2655 QCA* ˗ ˗ ˗ Distichia filamentosa PE_033 PERÚ; Cusco, Abra Malga S. Castillo, 1240 USM* ˗ ˗ ˗ Distichia filamentosa BO_064 BOLIVIA; La Paz, Franz Tamayo, Queara A. Fuentes et al 12731 LPB ˗ ˗ ˗ Distichia filamentosa BO_065 BOLIVIA; La Paz, Murillo, Unduavi St. G. Beck, 30101 LPB ˗ ˗ ˗ Distichia filamentosa BO_066 BOLIVIA; La Paz, Los Andes, Lag. de Hichucota St. G. Beck, 24643 LPB ˗ ˗ ˗ Distichia filamentosa PE_126 PERÚ; Arequipa, Caylloma, cumbre chucura St. G. Beck, 26450 LPB ˗ ˗ ˗ Distichia filamentosa PE_015 PERÚ; Arequipa, Chivay W. Ramirez, 754 USM* ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides PE_009 PERÚ; Arequipa, Chivay W. Ramirez, 746 USM* ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides PE_023 PERÚ; Puno, Minera Minsur W. Ramirez, 747 USM* ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides PE_030 PERÚ; Cusco, Cochapampa W. Ramirez, 748 USM* ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides PE_032 PERÚ; Lima E. Navarro, 1098 USM* ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides PE_035 PERÚ; Huancavelica M. Acuña, 1061 USM* ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides BO_045 BOLIVIA; La Paz, Murillo, Pampalarama W. Ramirez, 750 USM* ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides EC_071 ECUADOR; Chimborazo, Volcán Chimborazo W. Ramirez, 751 QCA* ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides EC_072 ECUADOR; Napo, R.E. Cayambe Coca W. Ramirez, 752 QCA* ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides BO_073 BOLIVIA; Cochabamba, Quillacollo J.R.I. Wood, 9230 LPB ˗ ˗ ˗ 12 Distichia muscoides BO_074 BOLIVIA; Potosí, Sud Lipez, Quetana chico St. G. Beck, 32474 LPB ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides PE_081 PERÚ; La Libertad, Pataz, Valle tres lagunas B. León et al 5518 USM ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides PE_084 PERÚ; Ancash, Bolognesi, Pucarrajo M. Chocce et al., 4244 USM ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides EC_110 ECUADOR; Carchi, Páramo el Angel S. Leon, 1100 QCA ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides EC_111 ECUADOR; Azuay, Páramo de las Cajas S. Laegaard, 52855 QCA ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides EC_114 ECUADOR; Cotopaxi, Páramo de Quispicacha P. Sklenar, 9120 QCA ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides BO_049 Bolivia; La paz, Murillo, Pampalarama W. Ramirez, 753 USM* ˗ ˗ ˗ Distichia muscoides EC_001 ECUADOR; Pichincha, Volcán Cayambe W. Ramirez, 743 QCA* ˗ ˗ ˗ Distichia sp. nov PE_026 PERÚ; Ancash, Huari A. Cano, 20875 USM* ˗ ˗ ˗ Distichia sp. nov PE_027 PERÚ; Ancash, Huaraz, Quicayhuanca A. Cano, 21383 USM* ˗ ˗ ˗ Distichia sp. nov PE_129 PERÚ; Ancash, Recuay, Lag. Conococha W. Ramirez, 131 USM* ˗ ˗ ˗ Oxychloe andina PE_005 PERÚ; Arequipa, Chivay W. Ramirez, 745 USM* ˗ ˗ ˗ Oxychloe andina BO_044 BOLIVIA; La Paz, Murillo, Pampalarama W. Ramirez, 749 USM* ˗ ˗ ˗ Patosia clandestina BO_067 BOLIVIA; La Paz, Comanche, Cerro Miriquiri C. Kobele, 475 LPB ˗ ˗ ˗ Patosia clandestina PE_090 PERÚ; Moquegua, Gral Sánchez Cerro D. Montesinos, 3040 USM ˗ ˗ ˗ Patosia clandestina BO_116 BOLIVIA; Tarija, Pampas de Tajzara St. G. Beck, 27103 LPB ˗ ˗ ˗ Patosia clandestina BO_069 BOLIVIA; Cochabamba, Arque km 86 P. Rojas, 856 LPB ˗ ˗ ˗ Patosia clandestina PE_004 PERÚ; Arequipa, Chivay W. Ramirez, 744 USM* ˗ ˗ ˗ Rostkovia magellanica EC_113 ECUADOR; Loja, E Amaluza S. Laegaard, 19293 QCA ˗ ˗ ˗ Rostkovia magellanica EC_119 ECUADOR; Carchi LPB ˗ ˗ ˗ Juncus effusus – – – D.A. Simpson, 2665 TCD AY973509 GQ434956 AY344156 13 Análisis Filogenéticos Los análisis filogenéticos fueron realizados para; (1) los genes cloroplástico, trnL–F y psbA–trnH; (2) para el gen nuclear ITS; y (3) para los tres genes concatenados. Se hizo un Análisis de máxima parsimonia (MP), con el programa PAUP*4.0a122 (Swofford, 2002), aplicando una búsqueda heurística con adición aleatoria de taxones e intercambio de ramas con el método de Bisección y Reconexión del Árbol (TBR). Con base en los árboles más parsimoniosos, se obtuvieron los índices de consistencia (CI), homoplasia (HI) y consistencia re–escalada (CR) para los árboles de cada genoma y para el árbol consenso. Los apoyos del árbol se estimaron con un bootstrap de 1000 réplicas, colapsando los clados con menos del 50% de apoyo. Valores de bootstrap mayores o iguales a 70% fueron considerados mediana a altamente sustentados estadísticamente (Hillis & Bull, 1993). También se realizo un test de homogeneidad de particiones (ILD) en el programa PAUP, el test fue realizado usando 100 replicas de bootstrap, con el objetivo de detectar incongruencia entre la matriz de datos del gen nuclear y cloroplásticos. Para los análisis basados en modelos se estimó cuales eran los modelos de susbstitución nucleotídica que mejor se ajustaba a cada gen, mediante el programa jModelTest (Posada, 2008). Se obtuvo un modelo para cada gen por separado, basado en el criterio de Akaike (AIC). Luego, se realizó un Análisis de máxima verosimilitud (ML) con el programa GARLI v.2.0 (Genetic Algorithm for Rapid Likelihood Inference; Zwickl, 2006). El apoyo del árbol se estimó haciendo un bootstrap de 100 réplicas, colapsando los clados con menos del 50% de soporte. Finalmente se realizó un Análisis de Inferencia Bayesiana (IB) con el programa Mrbayes v.3.2. (Ronquist et al., 2012), aplicando el 14 modelo de substitución obtenido del jModelTest (Posada, 2008). Las Cadenas de Markov y Monte Carlo (MCMC) fueron corridas simultáneamente para 10 millones de generaciones; para asegurar que el análisis no quedara en un óptimo local, se corrieron las cuatro cadenas independientes, una “fría” y tres “calientes’’. Los árboles fueron muestreados cada 1000 generaciones, seguidas de un período de eliminación de los primeros 1000 árboles (burn–in del 10%). Los árboles restantes (90%) fueron usados para construir el árbol filogenético consenso (50% majority rule) estimando una probabilidad a posteriori bayesiana, la cual indica la proporción de veces que un clado individual es encontrado en las generaciones sucesivas (Meudt & Simpson, 2006). Se consideraron significativos los valores de la probabilidad a posteriori mayores o iguales a 0.95 para el apoyo final del árbol. Estimación de Tiempos de Divergencia Para estimar los tiempos de divergencia de los diferentes clados se realizó un análisis de coalescencia mediante el programa BEAST v.1.6.2. (Drummond & Rambaut, 2007). La estimación temporal se basó en el método bayesiano del reloj molecular relajado con tasas de variación no correlacionadas y distribución ‘’lognormal’’ (Kishino et al., 2001). Se utilizaron las Cadenas de Markov y Monte Carlo (MCMC) para estimar la probabilidad a posteriori de la edad de los nodos. Se corrieron 50 millones de generaciones, con 100 repeticiones y registros promedios cada 5.000. El análisis se hizo aplicando el modelo de substitución obtenido para cada gen del jModelTest (Posada, 2008), con un modelo de distribución gamma, con 4 categorías y con especiación de un proceso de nacimiento y muerte (Speciation: Birth–Death Process). 15 Las suposiciones a priori utilizadas para determinar el punto de calibración y contraste de la filogenia se basaron en la tasa media de substitución de cada gen. Para el ADN cloroplástico (genes trnL–F y psbA–trnH), se utilizó una tasa de sustitución promedio del genoma del cloroplasto, 2.00 × 10–9 (1.00–3.00 × 10–9) sustituciones/sitios/años (Wolfe et al., 1987). Para el ADN nuclear (ITS) se utilizó una tasa de sustitución de 4.13 × 10–9 sustituciones/sitios/anos estimada para hierbas y basada en una revisión bibliográfica (Kay et al., 2006). Puntos de Calibración Se ha documentado que la datación filogenética implica muchos errores (Sanderson, 1998; Sanderson & Doyle 2001). Probablemente la mayor incertidumbre de la datación es en referencia a los fósiles (Bremer, 2002). La calibración basada en fósiles, tiende a sobre– estimar una tasa de sustitución, mientras que un evento geológico o climático tiende a sub– estimar la tasa; estos sesgos no parecen afectar la datación en gran medida cuando se utilizan varios fósiles o eventos biogeográficos (Kay et al., 2006). La familia Juncaceae no presenta un registro fósil para Sudamérica, por lo cual un evento geológico como el levantamiento de los Andes se puede usar para contrastar la datación obtenida. Según estudios geológicos los hábitats altoandinos de los Andes Centrales (>4000 m) no estuvieron disponibles hasta antes de los 8–10 Ma, tiempo en el cual alcanzaron su elevación más importante, finales del Mioceno–Plioceno (Gubbels et al., 1993; Allmendinger et al., 1997; Hartley 2003). Así mismo, los Andes del Norte no presentaron hábitats alpinos disponibles para la colonización (>3000 m) antes de 5–3.5 Ma, finales del Plioceno tardío (Simpson, 1983; van der Hammen, 1974; van der Hammen & Cleef, 1986; 16 Kennan, 2000). Bajo estas dataciones geológicas se puede presumir entonces que los ancestros de los taxones actuales no pudieron colonizar las zonas altoandinas antes de los tiempos establecidos del levantamiento de los Andes. RESULTADOS Modelos Evolutivos De acuerdo al criterio de Akaike (AIC), Modeltest seleccionó el mejor modelo para cada gen, GTR + G para el gen ITS y trn L–F, TIM3 para el gen psbA–trnH. Los valores de los parámetros estimados para los mejores modelos de cada gen se muestran en la Tabla 2. Tabla 2. Taxones muestreados por cada gen, mejor modelo seleccionado para cada gen según el Criterio de Información de Akaike. I = Proporción de sitios variables, G = distribución gamma. Gen ITS psbA–trnH trnL–F Taxa 40 40 40 Mejor Modelo GTR + G TIM3 GTR + G Valor AIC 3168.9518 3022.0526 4187.0032 ln Likelihood 1497.4759 1427.0263 2004.5016 I 0 0 0 G 0,579 0,000 0,914 Filogenia Los análisis de máxima parsimonia (MP), máxima verosimilitud (ML) e inferencia Bayesiana (IB), mostraron una topología diferente para los genes cloroplásticos (psbA– trnH, trnL–F) y el gen nuclear (ITS). En los análisis combinados prevaleció la topología de los genes del cloroplasto. 17 El test ILD mostro que la matriz de datos de los genes cloroplásticos (trnL-F, psbAtrnH) y el gen nuclear (ITS) son homogeneos entre si (P = 0.17). No se realizo el test para decidir si la matriz de genes pueden ser combinados o no (Nixon & Carpenter, 1996; Drábková & Vlcek, 2010). Genes del cloroplasto (trnL–F, psbA–trnH). La matriz de los genes cloroplásticos incluye un total de 1699 caracteres, de los cuales 1486 fueron constantes, 92 fueron variables pero no informativos y 121 (8.1%) fueron caracteres variables e informativos. Más de 1000 árboles igualmente parsimoniosos (231 pasos), mostraron las siguientes características de consistencia y homoplasia de caracteres: CI = 0.987, IH = 0.013 y RC = 0.975. Los análisis de esta matriz dieron como resultado una topología muy congruente para los tres métodos (MP, ML e IB), los cuales muestran las relaciones evolutivas muy claras a nivel de la monofilia del género estudiado y sus grupos hermanos. Los valores de probabilidad posterior de IB y bootstrap de ML y MP (i.e.,1/78/83) apoyan la monofilia del género Distichia, localizando como grupos hermanos a Patosia y Oxychloe. Los tres géneros restringidos a los Andes, Distichia, Patosia y Oxychloe, forman clados monofiléticos e independientes, fuertemente sustentados (Fig. 3). Dentro del género Distichia se obtuvieron clados bien apoyados para los ejemplares de D. acicularis (1/76/84) y para D. sp. nov (1/64/87). Por otra parte, las poblaciones de D. muscoides de Ecuador y D. filamentosa de Perú se encuentran en un mismo clado, con un apoyo moderado (0.96/51/60). Finalmente, un cuarto clado, con una aparente politomía y con apoyos medios (0.97/51/53), incluyen a los ejemplares de D. muscoides y D filiamnetosa de Perú y Bolivia más un individuo de D. acicularis y otro de D. sp. nov. 18 Figura 3. Filogenia del cloroplasto (trnL–H, psbA–trnH) basado en máxima parsimonia (MP), máxima verosimilitud e inferencia bayesiana (IB). Los valores sobre las ramas indican el soporte de probabilidad a posterior de IB, bootstrat de ML, bootstrat de MP; (IB/ML/MP). 19 Gen nuclear (ITS). Las secuencias del gen nuclear ITS produjeron una matriz de 594 caracteres, de los cuales 473 son constantes, 53 son variables pero no informativos y 68 (11%) son variables e informativos. Más de 1000 árboles igualmente parsimoniosos tuvieron 143 pasos, con las siguientes características: CI = 0.923, IH = 0.0769 y RC = 0.872. Los análisis filogenéticos (MP, ML e IB) muestran que el ITS fue un gen muy limitado en su poder de resolución (Figura 4). La topología y los valores de apoyo del marcador no muestran una monofilia para el género Distichia, sino que éste forma con Patosia un mismo clado, con valores de probabilidad posterior (IB) y bootstrap (MP y ML) moderados. El análisis indica que los tres géneros, Distichia, Patosia y Oxychloe, forman un clado monofilético bien apoyado (1/100/100). A diferencia del gen nuclear, la topología obtenida de los genes cloroplásticos es congruente con la topología final de los tres genes concatenados, diferenciándose en los valores más altos de probabilidad a posterior y soportes bootstrat para Distichia. Rostkovia y Juncus se mantienen como grupo hermano externo a los tres géneros andinos. Dentro del clado Distichia–Patosia, el ITS resuelve a ejemplares de Distichia sp. nov en un clado con apoyo alto (1/95/97). Un segundo clado se encuentra conformado por las poblaciones de D. muscoides y D. acicularis de Ecuador más algunos individuos de D. filamentoa de Perú. Finalmente, un tercer clado incluye poblaciones de D. muscoides y D. filamentosa de Perú y Bolivia, e individuos aislados de D. acicualris y Distichia sp. nov. En este clado se encuentra Patosia clandestina, que forma una politomía con valores de apoyo moderados. 20 Figura 4. Filogenia del gen nuclear (ITS) basado en máxima parsimonia (MP), máxima verosimilitud (ML) e inferecnia bayesiana (IB). Los valores sobre las ramas indican el soporte de probabilidad a posterior de IB, bootstrat de ML, bootstrat de MP; (IB/ML/MP). 21 Análisis combinado (trnL–F, psbA–trnH, ITS); La matriz combinada de los tres genes consistió de 2293 caracteres, de los cuales 1959 fueron constantes y 334 variables. De estos últimos 145 fueron autopomorfías y 189 potencialmente informativos. Más de 1000 árboles igualmente parsimoniosos tuvieron 373 pasos (CI = 0,96, IH = 0,035 y CR = 0,93). Los análisis de los genes combinados mostraron la misma topología para el análisis de IB y ML. La topología de MP mostró ser ligeramente distinta. Los valores de probabilidad a posteriori y soportes bootstrap fueron para la mayoría de los clados > 0,95 y > 60%, esto representó un buen soporte para el análisis bayesiano y un soporte moderado para los análisis de ML y MP. En la Figura 5 se muestra el mejor árbol de ML con longitudes de ramas, sobre el cual se colocaron los valores de probabilidad a posterior y soportes de bootstrap. El análisis filogenético de los genes concatenados mostraron al género Distichia en un clado monofilético con un valor alto de probabilidad a posterior IB (0,95) y un apoyo moderado de bootstrap ML (57%), está relación no fue recuperada por el análisis de MP (no mostrado). Tanto los valores de sustento como la topología final son el resultado de la unión de los genes cloroplásticos y nuclear, los cuales mostraron una topología diferente. Los genes cloroplásticos ofrecen nodos fuertemente soportados y respaldan la monofília de Distichia y de sus grupos hermanos, mientras que el gen nuclear ofrece una baja resolución para la diferenciación de los géneros de Juncaceae andinas. Esto revela una incongruencia en la señal filogenética, lo cual indica probablemente que cada de genoma está mostrando procesos evolutivos diferentes. 22 El análisis interno del género Distichia muestra cuatro clados con apoyos buenos a moderados. Clado A, con un soporte alto de IB/ML/MP (1/83/85), incluye a ejemplares de D. acicularis, este clado respalda su identidad taxonómica como especie. El Clado B, con un soporte alto a moderado (0.96/69/62), esta formado por ejemplares de D. muscoides de Ecuador y dos individuos de D. filamentosa de Perú. El Clado C, con un apoyo alto (1/98/100), agrupa a ejemplares de Distichia sp. nov., lo que sugiere su identidad taxonómica diferenciada. El Clado D, que forma una politomía con un apoyo alto a moderado (0.96/67/55), incluyen a los ejemplares de D. muscoides de Perú y Bolivia, y ejemplares de D. filamentosa de Bolivia, más un individuo remanente de D. acicularis. Dentro de este clado se encuentra ramificado un grupo pequeño (4 indv) con un apoyo alto, que incluye a D. muscoides, D. filamentosa y Distichia sp. nov., todos ellos restringidos al norte y centro de los Andes de Perú. Los clados A, B y C forman un grupo fuertemente apoyado (1/97/94) en los análisis, y que se diferencian claramente del Clado D. Desde el punto de vista geográfico, la filogenia muestra que Distichia se encuentran separado en dos grandes grupos, un primer grupo (I) formado por los clados A y B, con ejemplares en los Andes del Norte, y un segundo grupo formado por los clado C y D, de los Andes Centrales. 23 Figura 5. Filogenia de la matriz combinada (ITS; trnL–F, psbA–trnH) basado en máxima parsimonia (MP), máxima verosimilitud (ML) e inferencia bayesiana (IB). Con valores respectivos indicado sobre las ramas (IB/ML/MP). Outgroups = R. magellanica, J. effusus. 24 Por otro lado Patosia, género uniespecifico (Patosia clandestina) y grupo hermano de Distichia, forma un clado monofilético altamente apoyado (1/100/100). Dentro de este grupo se observa a los individuos de Perú en un clado ramificado (0.99/57/–) y separado de los individuos de Bolivia. A nivel de géneros, Distchia y Patosia se encuentra en un clado bien apoyado para ML y MP (84/84) y con un valor moderado para IB (0,9), diferenciándose de Oxychloe. Finalmente los tres géneros de Juncaceae endémicos a los Andes, Distichia, Patosia y Oxychloe, forman un clado fuertemente apoyado (1/100/100) en los análisis de IB, ML y MP. La topología del árbol delimita claramente a los géneros exclusivamente andinos con respecto a Rostkovia y Juncus. Estimación de Tiempos de Divergencia Los resultados del filograma localizan el origen de Distichia después del más reciente levantamiento de los Andes durante el Plioceno, separándose de un ancestro común con Patosia al final del Plioceno e inicio del Pleistoceno (2,82–1,09 millones de años ‘’Ma’’) (Fig. 6). La diversificación de los cuatro linajes de Distichia (A, B, C, D) habría ocurrido entre el inicio y el final del Pleistoceno (1,79–0,16 Ma). De acuerdo con la topología del filograma, la primera cladogénesis del género resulto en la separación del clado D (Nodo I: 95% HPD: 1,79– 0,62 Ma) de los otros filogrupos (clado A, B, C). Este clado incluye principalmente a poblaciones de D. muscoides y D. filamentosa de Perú y Bolivia en los Andes Centrales y representaría a la primera población del género, hermana al resto de especies. Los otros tres clados divergieron rápidamente entre 1,10 y 0,16 Ma. Una segunda bifurcación alrededor de 0,65 Ma dio origen al clado C (Nodo II: 95% HPD: 25 1,10–0,29 Ma) que incluye las poblaciones de Distichia sp. nov. del centro de Perú, inicio de los Andes Centrales. Finalmente, una tercera separación alrededor de 0,41 Ma (Nodo III: 95% HPD: 0,76–0,16 Ma) al final del Pleistoceno, dio origen al linaje A y B. El clado A está formado por poblaciones de D. acicularis, y restringido a la cordillera occidental del centro y sur de Ecuador en los Andes del Norte. El clado B, a su vez, se encuentra formado principalmente por ejemplares de D. muscoides de Ecuador y unos individuos de D. filamentosa y D. muscoides de Perú. Estos resultados de estimación de tiempos de divergencia sugieren un patrón de especiación de una primera población de Distichia que apareció inicialmente en los Andes Centrales (clado D) y luego un segundo origen de otra población que se desarrollo y especió (clado A, B) en los Andes del Norte. El Clado C muestra un proceso de especiación con el clado A y B, pero diferenciándose geográficamente a los Andes del Centro. 26 Figura 6. Estimación de tiempos de divergencia y escenarios para Distichia, basado en el análisis de coalescencia de Beast, para los tres genes combinados. Las barras (moradas) representan 95% de intervalo de credibilidad. La escala se muestra en millones de años (Ma). La barra gris en el árbol representa la fase de tiempo en la cual ocurrió la diversificación de Distichia. 27 DISCUSIÓN Filogenia de Distichia Ya que ningún gen es determinante en la filogenia de las especies, se deben confrontar historias de diferentes genomas. El análisis filogenético de Distichia basado en los genes cloroplásticos apoya fuertemente la monofília del género, mientras que el gen nuclear lo relaciona con Patosia, con quien forma, un grupo monofilético. La combinación de los genes cloroplásticos y nuclear da como resultado un clado monofilético para Distichia, pero con apoyos moderados de bootstrap y significativo para IB. Si bien el análisis bayesiano da un valor alto para la monofilia, probablemente debido a su mayor sensibilidad a la señal filogenética (Wilcox et al., 2002; Alfaro et al., 2003). Otros estudios han propuesto tomarse con precaución este análisis, especialmente cuando se tienen ramas cortas y resultados inconsistentes con otros análisis (Alfaro et al., 2003; Simmoms et al., 2004). Finalmente, como un resultado importante de este trabajo se sostiene la hipótesis de la monofilia del género Distichia, a pesar de no alcanzar un apoyo alto de bootstrap para los genes combinados. El origen de este patrón es probablemente un conflicto en la señal filogenética de los genes cloroplásticos y el nuclear. Si la señal de los genes cloroplásticos reflejara la historia de las especies, el nuclear estaría oscureciendo las relaciones filogenéticas. Bajo este escenario se consideraría a Distichia como un grupo natural con alta probabilidad de ser monofilético. 28 En un estudio realizado por Drábková & Vicek, (2007) basado en una filogenia de caracteres morfológicos, se encontró que Distichia forma un clado monofilético bien sustentado, siendo hermana de Patosia dentro del “clado de Oxychloe’’. A nivel taxonómico el género se diferencia claramente por la disposición de hojas dísticas y la presencia de un ginóforo, mientras que Patosia presenta hojas en disposición espiralada y flores con una bractéola (Balslev, 1996). Estos elementos muestran una concordancia entre los resultados moleculares, morfológicos y taxonómicos, respaldando la monofília del género Distichia. Otro resultado importante del estudio es el reconocimiento de ejemplares de Distichia sp. nov., en el centro del Perú, en un clado diferenciado, lo cual, apoya su singularidad taxonómica. Esta especie se diferencia de los otros taxones por la longitud de sus hojas (6–8 cm) que son gradualmente agudas, el mayor tamaño de sus flores y por una forma de crecimiento principalmente cespitosa. Incongruencia entre filogenias de genes nucleares y cloroplásticos se han reportado de varios estudios de plantas (Sang et al., 1997; Hardig et al., 2000; Klak et al., 2003). Dentro de la familia Juncaceae Drábková & Vicek (2010) reportan una incongruencia entre el gen nuclear y el cloroplasto para Luzula. Así mismo, Drábková & Vicek (2007) en un estudio de Oxychloe, género hermano de Distichia, muestran igualmente un conflicto entre ambos genomas. Recientemente se ha registrado este conflicto para grupos de plantas andinas como Puya (Schmidt Jabaily & Sytsma, 2010) y helechos (Sánchez–Baracaldo, 2004). En el presente estudio las incongruencias filogenéticas de los genes se dan a diferentes niveles. El primer conflicto entre los genomas se refiere a la ubicación de 29 Patosia, que deacuerdo con el ITS estaría dentro de Distichia, formando una politomía con D. muscoides, D. filamentosa D. acicularis y Distichia sp. nov. El segundo conflicto se refiere a la posición de D. acicularis; el ITS lo ubica en un clado formando una politomía con poblaciones de D. muscoides de Ecuador y D. filamentosa de Perú, a diferencia de los genes cloroplásticos que lo recuperan en un clado bien apoyado. Ambos genomas juntan a D. muscoides con D. filamentosa y mantienen un clado bien apoyado para poblaciones de Distichia sp. nov. En el análisis de los genes combinados prevalece la toplogía del ADN cloroplástico, pero se pierde resolución en la hipótesis de la monofília de Distichia, obteniendo un apoyo moderado. A nivel de los géneros de origen andino, Distichia, Patosia y Oxychloe, ambos genomas lo recuperan en un clado fuertemente apoyado. Un resultado importante dentro de la filogenia de Distichia es la división de las especies en cuatro clados definidos. Clado A: contiene poblaciones de D. acicularis, Clado C: incluye poblaciones de Distichia sp. nov. El clado B y D, con una politomía, presenta a poblaciones de D. muscoides, separadas geográficamente en Andes del norte y sur. Esto indicaría que D. muscoides es una especie parafilética. Durante la identificación de los especímenes de ambos lugares no mostraron una marcada diferencia en su morfología. Hipótesis de incongruencia entre genomas Se han propuesto que los conflictos entre los genomas pueden deberse a procesos evolutivos de introgresión, duplicación de genes, transferencia horizontal y de separación de linajes “lineage sorting’’ (Doyle, 1992; Brower, 1996; Maddison, 1997; Feliner & Roselló, 2007; Drábková & Vicek, 2010). Sin embargo, no es posible distinguir claramente cuál es el proceso que lleva al conflicto (Brower, 1996). La introgresión es un proceso de 30 hibridación interespecífica a nivel del cloroplasto, que resulta en la transferencia de genes a través de barreras reproductivas, entre especies muy relacionadas (Doyle, 1992). La duplicación de genes es el proceso de generación de múltiples genes que coexisten en un linaje de especies (Page, 1993), estos genes existen en copias duplicadas en el genoma nuclear y se les denomina parálogos, en contraposición a los ortólogos que son producidos por especiación (Doyle, 1992). La separación de linajes (“lineage sorting’’), también denominado coalescencia profunda, es un proceso basado en polimorfismos ancestrales cuyos alelos son retenidos en los linajes descendientes por azar (Doyle, 1992; Maddison, 1997). También hay un proceso relacionado al anterior pero en una escala temporal menor, denominado separación incompleta de linajes “incomplete lineage sorting’’; este término se refiere a la persistencia y retención de polimorfismos ancestrales por eventos de especiación basado en un origen reciente (Avise, 2000). Por otro lado, la hibridación entre especies y generación de híbridos es un mecanismo bastante frecuente en la especiación y evolución de las plantas (McDade, 1990; Rieseberg, 1997; Hegarty & Hiscock, 2004). Se proponen dos escenarios para explicar la incongruencia entre los genomas y sus repercusiones en el establecimiento de las especies. Estas hipótesis se apoyan en los procesos evolutivos explicados anteriormente y en la filogenia representativa que se tiene de la distribución geográfica de las poblaciones del género Distichia y Patosia. Un primer escenario (I) se basa en un mecanismo de evolución reticulada del género Distichia, mediante el cual pueden haber ocurrido procesos de introgresión y duplicación de genes. La captura del cloroplasto entre especies cercanas son procesos bien conocidos en plantas cuando existen conflictos a nivel del genoma del cloroplasto (Schmidt Jabaily & Sytsma, 2010). El hecho que los individuos remanentes de D. acicularis y Distichia sp. nov. se 31 encuentren en el clado D, con D. muscoides, podría ser explicado por procesos de introgresión unidireccional del genoma del cloroplasto de D. muscoides en poblaciones periféricas de las otras especies, luego de haber ocurrido ya un proceso de especiación. La distribución geográfica de las especies muestra que D. muscoides es el taxón con distribución más amplia y llega a estar en simpatría con las otras especies, incluyendo Distichia sp. nov. Así mismo, las distribuciónes geográficas de las restantes especies del género no se solapan. Por otro lado, el hecho que el análisis del gen nuclear ITS incluya a Patosia dentro de Distichia puede deberse a genes parálogos o a un origen reciente del genoma nuclear (Feliner & Roselló, 2007) de Distichia y Patosia, por lo cual todavía no se han diferenciado. La filogenia del ITS muestra que Patosia se junta con las poblaciones basales de D. muscoides restringidas a los Andes Centrales de Perú y Bolivia, lo cual coincide con la distribución geográfica de Patosia. Un segundo escenario (II) se basa en un origen reciente y rápida diversificación de Distichia bajo un proceso evolutivo de separación incompleta de linajes “incomplete lineage sorting’’ (Avise, 2000). Este proceso ha recibido menos atención para explicar incongruencia en estudios filogenéticos en plantas (Doyle, 1992; Comes & Abbot, 2001). Sin mebrago ha sido propuesto recientemente para explicar incongruencias filogenéticas entre genes nucleares y del cloroplasto en el género Luzula (Drábková & Vicek, 2010). Mediante este proceso evolutivo se propone que el ancestro del género Distichia presentó polimorfismos ancestrales con persistencia de estos haplotipos en los linajes descendientes. Bajo este escenario, las poblaciones de las especies actuales de Distichia, habrían retenido los polimorfismos ancestrales a través de eventos de especiación en un tiempo muy corto que no ha sido suficiente para que estos polimorfismos se pierdan. En este caso, el hecho 32 que se junten individuos de D. acicularis y Distichia sp. nov con las poblaciones de D. muscoides en el clado D sería una consecuencia de poblaciones polimórficas para el genoma nuclear o cloroplástico, retenidos de un ancestro común con D. muscoides. La ubicación conflictiva de Patosia en el análisis del gen nuclear, podría ser explicada por una rápida diversificación de los géneros, los cuales no han sido acompañados por una rápida evolución de los genes nucleares. Esto llevaría a proponer que parte del genoma nuclear del ancestro de Distichia y Patosia está todavía conservado y aún no diferenciado en las poblaciones actuales de ambos géneros, más aún dentro de las poblaciones de Distichia. Finalmente estas hipótesis representan escenarios de especiación muy complicados para Distichia, que puede estar incluyendo uno o varios procesos evolutivos, los cuales son difíciles de distinguir a través de los genes analizados en este estudio. Por otra parte, los ejemplares de D. filamentosa no aparecen agrupados en un clado independiente en las filogenias de ambos genes. Probablemente esto también podría deberse al proceso de separación incompleta de linajes. Sin embargo, los datos taxonómicos, muestran que el sapoyo de esta especie es muy débil en comparación con los otros taxones. La diagnosis original de esta especie (Buchenau, 1879) es muy corta como para distinguir D. filamentosa de D. muscoides. A nivel morfológico es muy similar a D. muscoides, y solo se diferencia por su menor rigidez y la presencia de un filamento en el ápice de las hojas (Balslev, 1996). A nivel ecológico estas especies también son muy similares (Balslev, 1996). Durante el muestreo de campo se observó que D. filamentosa siempre se encuentra acompañada de D. muscoides, mientras que el resto de especies se encuentran siempre en poblaciones independientes. 33 Biogeografía de Distichia El análisis de coalescencia mostró que Distichia tuvo un origen reciente y un periodo de diversificación relativamente rápido. La baja tasa de secuencias divergentes en Distichia refleja una relación cercana entre sus especies y una posible radiación reciente. El género se originó aproximadamente entre la última etapa del Plioceno e inicio del Pleistoceno (2,82–1,09 Ma), diferenciándose inicialmente de Patosia. Luego sufrió un proceso de diversificación durante el Pleistoceno (1,79–0,16 Ma). Esta fase de tiempo corresponde con fluctuaciones climáticas a elevadas altitudes (Hooghiemstra & van der Hammen 2004), por lo cual los eventos climáticos del Pleistoceno pueden haber desempeñado una función importante en los procesos de especiación de Distichia. Hipótesis de especiación Sur–Norte en Distichia Según el origen geológico de los Andes, los hábitats altoandinos de los Andes Centrales (>4000 m) no estuvieron disponibles hasta antes de los 8–10 Ma (Mioceno– Plioceno), tiempo en el cual alcanzaron su elevación más importante (Gubbels et al., 1993; Allmendinger et al., 1997; Hartley 2003). Dado que la estimación de tiempos de divergencia se hizo en base a tasas de sustitución, se puede entonces analizar de manera independiente si la aparición y diversificación de Distichia corresponde con el proceso de levantamiento de los Andes. El análisis de coalescencia muestra que la diversificación de Distichia comenzó después de la formación de los Andes Centrales, con la aparición de un ancestro alrededor de 1,14 (1,79–0,62 Ma) que dio origen a poblaciones D. muscoides y D. filamentosa (Clado D) restringidas a la región de los Andes de Perú y Bolivia. La aparición de Distichia sp. nov. a mediados del Pleistoceno (0,65 Ma), en lo que actualmente es 34 considerado una puna húmeda en los Andes de Perú, muestra que los primeros linajes en diversificarse se encuentran en los Andes Centrales. Por otra parte, los Andes del Norte no presentaron hábitats alpinos disponibles para la colonización (>3000 m) antes de 5–3,5 Ma (Simpson, 1983; van der Hammen, 1974; van der Hammen & Cleef, 1986) coincidiendo con finales del Plioceno tardío (Kennan, 2000). Esto lleva a suponer que los linajes de Distichia que se diversificaron en este ambiente deben ser de origen más recientes que los linajes de los Andes Centrales. El análisis de divergencia mostró este patrón, un ancestro alrededor de 0,41 Ma dio origen a un segundo linaje de D. muscoides y más tarde a un linaje de D. acicularis, ambas poblaciones restringidas geográficamente a los Andes del Norte. Estos resultados muestran que la diversificación de Distichia ocurrió probablemente cuando ya los Andes Centrales y del Norte habían alcanzado sus elevaciones actuales (>3000 m). Así mismo, el análisis de coalescencia muestra que D. muscoides sería la especie más antigua del género con una primera población en los Andes del centro–sur de Perú y Bolivia. Esta región corresponde actualmente al altiplano andino, una gran meseta que se elevó de los 2500 m a 4000 m durante un proceso que comenzó aproximadamente hace 10 Ma, durante el Mioceno–Plioceno (Gubbels et al., 1993; Gregory–Wodzicki, 2000; Hartley, 2003). En cuanto a los condiciones paleoclimáticas que existían, datos sedimentológicos indican que en los Andes Centrales prevaleció hace 15–4 Ma, un clima árido a semiárido (Hartley, 2003). Probablemente en esta fase de tiempo las condiciones abióticas para el origen y establecimiento de especies andinas como Distichia no existían aun. 35 Finalmente, en base al tiempo de divergencia y distribución de una primera población (Clado D) del género, más la presencia de una meseta andina y mejores condiciones climáticas después de 4 Ma, se sugiere como probable centro de origen (aprox. hace 1,14 Mya) de Distichia, al altiplano andino Peruano–Boliviano. Es posible que luego, por eventos de dispersión, hayan llegado primero a ambientes andinos del norte de Chile y Argentina, para luego comenzar su migración y especiación hacia los Andes del Norte de Ecuador y Colombia, pasando por Perú. Esta primera población de Distichia, presente en los Andes Centrales, coincide con la distribución de Patosia, lo cual indicaría que ambos géneros podrían tener el mismo centro de origen. Siendo D. muscoides probablemente la especie más antigua y D. acicularis la especie más reciente, se observa un patrón de especiación geográfico que sigue una direccionalidad de los Andes centrales a los Andes del norte. Sin embargo, el marco temporal de la orogenia de los Andes es mucho más antiguo que la diversificación de Distichia. Es probable que la diversificación de las especies se haya dado por un evento de dispersión progresiva en la medida que los ancestros ocuparan hábitats disponibles, desde ambientes xéricos (puna) hasta muy húmedos (páramos) sufriendo procesos de especiación por variaciones climáticas durante el Pleistoceno. Este patrón de especiación no sigue estrictamente la hipótesis de especiación direccionados de sur a norte para un grupo de flora y fauna diversificado en los Andes (Doan, 2003; Chacón et al., 2006; Meudt & Simpson, 2006; Chaves et al., 2011) 36 Patrones de distribución y barreras biogeográficas Los géneros de Juncaceae andinas Distichia, Patosia y Oxychloe, son anemófilas, es decir adaptadas a la polinización por viento (Balslev, 1996). Este mecanismo de dispersión les ha servido probablemente para colonizar de manera rápida los hábitats de turberas altoandinas disponibles. Dado que D. muscoides es probablemente la especie más antigua y con más amplia distribución en el presente, es probable que haya tenido muchos hábitats disponibles en los cuales el viento puede haber ayudado a su colonización. Sin embargo otro agente que pueden haber ayudado a la distribución del género son las aves, especialmente aquellas con rutas migratorias que incluyen humedales altoandinos, en donde fácilmente el viento ha podido ser un vector para llevar las semillas o el polen a las aves. Un caso de dispersión a larga distancia mediado por aves ha sido propuesto para Rostkovia magellanica (Balslev, 1979), un género de Juncaceae que inicialmente era considerado de la Patagonia, así como de islas de Nueva Zelanda. Actualmente esta especie tiene una distribución disyunta con una población registrada en Ecuador. Eventualmente, las especies de Distichia están restringidas a la presencia de humedales altoandinos, por lo cual su distribución estaría altamente influenciada por la hidrología de los Andes. Teniendo como mecanismo de dispersión el viento y como probable agente dispersor a las aves, las barreras geográficas como las montañas o los valles profundos, incluyendo la depresión de Huancabamba, no representarían realmente un obstáculo para la dispersión del género. 37 CONCLUSIONES El análisis filogenético del género Distichia, sugiere que es un grupo monofilético. Sin embargo se encuentran relaciones conflictivas entre los genes del cloroplasto y el nuclear con respecto a la monofilia del género. Esto sugiere procesos evolutivos de ‘’evolución reticulada’’ o ‘’separación incompleta de linajes’’ dentro del grupo, basados en un origen reciente y una rápida diversificación. Se muestra que D. muscoides es una especie parafilética con dos linajes independientes uno en los Andes Centrales y otro en los Andes del Norte. La filogenia mostró a ejemplares de Distichia sp. nov., en un clado por lo cual se respalda su identidad taxonómica como especie nueva para el género. Las relaciones filogenéticas no revelan claramente las relaciones taxonómicas entre las especies, especialmente para D. filamentosa. Se sugiere un posible origen de Distichia en el altiplano de los Andes centrales, entre el final del Plioceno e inicio del Pleistoceno. El patrón de especiación no sigue estrictamente la hipótesis de diversificación sur–norte en relación a la orogenia de los Andes. RECOMENDACIONES Estudios a nivel de biología reproductiva, búsqueda de genes más sensitivos y estudios de poblaciones con microsatélites ayudarían a entender mejor los procesos de especiación en Distichia. 38 BIBLIOGRAFÍA Alfaro, M.E., Zoller, S. & Lutzoni, F. (2003) Bayes or bootstrap? A simulation study comparing the performance of Bayesian Markov chain Monte Carlo sampling and bootstrapping in assessing phylogenetic confidence. Molecular Biology and Evolution, 20, 255–266. Allmendinger, R.W., Jordan, T.E., Kay, S.M., & Isacks, B.L. 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Gen trnL–trnF* F R psbA–trnH F R ITS F R Cebadores Secuencia del cebador (5'–3') Fuente trnL_c trnL_f CGAAATCGGTAGACGCTACG ATTTGAACTGGTGACACGAG Taberlet et al., (1991) psbA trnH GTTATGCATGAACGTAATGCTC CGCGCATGGTGGATTCACAATCC Sang et al., (1997) ITS5i ITS4i AGGTGACCTGCGGAAGGATCATT GGTAGTCCCGCCTGACCTGG Roalson et al., (2001) Anexo 2. Genes y protocolos de amplificación de la PCR utilizados en el presente estudio. Gen trnL–trnF* Protocolo de amplificación 35 Ciclos: 3 min 94 ⁰C, 1 min 94 ⁰C, 1 min 50–55 ⁰C, 2 min 72 ⁰C, 7 min 72 ⁰C; 35 Ciclos: 3 min 94 ⁰C, 1 min 94 ⁰C, 1 min 48 ⁰C, 2 min 72 ⁰C, 7 min 72 ⁰C; psbA–trnH 35 Ciclos: 3 min 94 ⁰C, 30 s 94 ⁰C, 45 s 50 ⁰C, 2 min 72 ⁰C, 10 min 72 ⁰C; 35 Ciclos: 3 min 94 ⁰C, 30 s 94 ⁰C, 45 s 53–55 ⁰C, 2 min 72 ⁰C, 12 min 72 ⁰C; ITS 28 Ciclos: 3 min 94 ⁰C, 30 s 94 ⁰C, 30 s 48 ⁰C, 1 min 72 ⁰C, 7 min 72 ⁰; 25 Ciclos: 3 min 94 ⁰C, 30 s 94 ⁰C, 30 s 60 ⁰C, 1 min 72 ⁰C, 7 min 72 ⁰C; 35 Ciclos: 3 min 94 ⁰C, 30 s 94 ⁰C, 45 s 55 ⁰C, 2 min 72 ⁰C, 15 min 72 ⁰C; 49 Anexo 3. Clave taxonómica para géneros Neotropicales de Juncaceae (Adaptado de Balslev, 1996). 1. Flores solitarias, anteras mucronadas. Aurículas nunca laceradas. 2. Plantas sin desarrollo de almohadillados; tallos erectos, desnudos, 10–25 cm de largo, flores perfectas, terminal sobre los tallos, cubiertas por dos brácteas herbáceas, una sobrepasa en longitud a la flor y la otra casi tan largo como la flor……………….Rostkovia 2’. Plantas formando almohadillados; Tallos no desarrollados, flores generalmente unisexual sobre pedicelos delgados de posición axilar o subapicales, con 1–4 bractéolas menbranáceas, que son más cortas que la flor. 3. Hojas de disposición dísticas; capsula levantada sobre un ginóforo en la maduración……………….........................................................................................Distichia 3’. Hojas dispuestas en espiral; capsula sin ginóforo en la maduración. 4. Flores con una bractéola; ápice de hoja agudo pero no duro ni espinoso………..Patosia 4’. Flores con dos bractéolas; ápice de la hoja agudo y espinoso…....................Oxychloe 1’. Flores en inflorescencia de varias flores o muy raramente de pocas flores; anteras no mucronadas. 5. Vainas de las hojas cerradas; hojas con márgenes pilosos; capsula con tres semillas…....................................................................................................................Luzula 5’. Vainas de las hojas abiertas, hojas glabras; capsula con muchas semillas (hasta 120)…………………………………………………………………………………...Juncus 50
