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RELACIONES FILOGENÉTICAS DE LA SUBFAMILIA LATRODECTINAE
(ARANEAE: THERIDIIDAE), INFERIDA DESDE GENES NUCLEARES Y
MITOCONDRIALES
Milenko A. Aguilera y María E. Casanueva. Laboratorio de Aracnología, Departamento de Zoología, Facultad de
Ciencias Naturales y Oceanográficas, Universidad de Concepción, Casilla 160-C, Concepción, Chile. E-mail:
[email protected]
RESUMEN. La subfamilia Latrodectinae es conformada por los géneros Steatoda, Latrodectus y Crustulina. Cada uno de estos
géneros son considerados monofiléticos, pero diversos autores no han establecido claramente las relaciones filogenéticas internas
de cada uno de estos taxas. Por ello en este estudio se pone a prueba la monofilia de los géneros de la subfamilia Latrodectinae. Se
utilizan los genes Citocromo Oxidasa I, 18S y 28S, y de la glándula de seda; de 28 especies de Latrodectinae. Como grupo
externo se utiliza a Argiope argentata. Se realizan análisis de parsimonia y bayesiano mediante TNT y Mr. Bayes
respectivamente. A partir de estos resultados preliminares es posible observar que el género Latrodectus es parafilético con
respecto a Steatoda. Asimismo la baja divergencia genética entre ambos géneros daría evidencias de la cercanía de ellos. Sin
embargo, se hace necesario análisis más profundos en donde se incorpore un número mayor de especies de esta subfamilia.
Palabras claves: araña del trigo, viudas negras, filogenia, marcadores moleculares.
ABSTRACT. The subfamily Latrodectinae is comprised by genera Steatoda, Latrodectus and Crustulina. Each of these genera is
considered monophyletic, but some authors have not clearly established relationships within each of these taxa. Therefore the
generic monophyly into the subfamily Latrodectinae is tested in this study. The genes cytochrome oxidase I, 18S and 28S, and the
silk gland of 28 species of Latridectinae were used for the analysis.. Argiope argentata is used as the outgroup. Parsimony
analysis was performed using TNT and Bayesian analysis with Mr. Bayes. From these preliminary results can be seen that the
genus Latrodectus is paraphyletic to Steatoda. Likewise, the low genetic divergence between these genera would evidence the
closeness of them. However, deeper analysis whith a greater number of species of this subfamily are necessary
Keyword: black widows, phylogenia, molecular markers
Introducción
La familia Theridiidae, constituye una de los taxones de mayor riqueza, con alrededor de
2384 especies, en 119 géneros (Platnick 2011). En la última década se han realizado algunos
estudios filogenéticos de esta familia, en donde se puede mencionar a Agnarsson (2004), con un
estudio filogenético morfológico y a Arnedo et al. (2004), con análisis filogenéticos moleculares.
Aunque en estos estudios se llega a un consenso en términos generales dentro de la familia, se
pueden observar relaciones aún no resueltas en categorías taxonómicas inferiores. En ambos
estudios se reconoce la subfamilia Latrodectinae, denominación ya utilizada por Petrunkevitch
(1928)que de acuerdo con Agnarsson (2004), la subfamilia se define filogenéticamente por varias
sinapomorfías, e.g., la forma de los conductos espermáticos de la hembra, la base lobulada del
émbolo del macho, cefalotórax densamente hirsuto, entre otras. Ahora bien, los soportes del nodo
Latrodectinae para las hipótesis filogéneticas con caracteres morfológicos y moleculares son
suficientemente robustos en ambos estudios (Agnarsson 2004, Arnedo et al. 2004).
Latrodectinae incluye los géneros Latrodectus Walckenaer, 1805, Steatoda Sundevall,
1833 y Crustulina Menge, 1868. Conforme a estudios basados en caracteres morfológicos,
Steatoda es el grupo hermano de Crustulina, y Latrodectus es el clado externo a CrustulinaSteatoda dentro de Latrodectinae. Alternativamente, los caracteres moleculares agrupan a los
miembros de esta subfamilia como un clado monofilético, pero sin resolución de las relaciones
entre sus elementos o con bajos soportes. Cabe destacar que con los escasos estudios sistemáticos
en cada uno de los géneros (con excepción de Latrodectus), esto se hace más complejo. Por lo
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tanto, se hace necesario realizar estudios filogenéticos profundos incorporando el mayor número
de especies que conforman esta subfamilia y así generar una hipótesis filogenética robusta de los
distintos grupos, con el fin de entender cómo diferentes rasgos de las especies que conforman la
subfamilia han evolucionado. Por lo tanto un contexto filogenético es esencial para comprender
los patrones de diversificación de linajes específicos, y los principales atributos que pueden estar
involucrados en la generación de estos procesos.
Este estudio provee la primera hipótesis filogenética para las relaciones intragenéricas de
la subfamilia Latrodectinae, basada en datos moleculares mitocondriales, ribosomales y
nucleares, considerando además, la utilidad comparativa de diferentes marcadores moleculares en
la resolución de la filogenia de este grupo de arañas.
Materiales y Método
Especímenes: Para los análisis filogenéticos de la subfamilia Latrodectiinae se utilizaron
fragmentos del genoma mitocondrial Citocromo Oxidasa I (COI), fragmentos del genoma
ribosomal 18 S y 28 S y el gen nuclear de la glándula de la seda tubuliforme (Tubul).
Los análisis para el gen COI incluyeron secuencias de 48 especímenes que representan 25
especies. De estas siete fueron obtenidas en este estudio: Steatoda triangulosa C. A. Walckenaer,
1802, S. grossa (C. L. Koch, 1838), Latrodectus thoracicus Nicolet, 1849, L. geometricus C. L.
Koch, 1841, L. variolus Walckenaer, 1837, L. mirabilis (Holmberg, 1876), L. hesperus
Chamberlin y Ivie, 1935.
Para el gen 18S y 28S incluyeron 21 individuos correspondientes a 12 especies y
finalmente para el gen Tubul se utilizaron 13 individuos de 7 especies. Las secuencias fueron
obtenidas desde BOLD (Barcode of Life Data) y GenBank en abril del 2011.
Extracción de ADN: Se extrajo ADN genómico a partir de la musculatura de las patas de
arañas mediante el kit comercial Qiagen DNeasy Tissue Kit. Para amplificar un fragmento del
Gen COI, se usaron los partidores LCOI 1498 y HCO 2198 (Folmer et al. 1994).
La amplificación se realizó con una mezcla maestra conteniendo Taq polimerasa KAPA.
El perfil térmico de PCR utilizado fue: 1) denaturación inicial, 90 a 9 C; 2)
ciclos de
denaturación durante 0 a 9 , alineamiento 0 a
, y extensión
a 2 ; ) extensión
final 10 a 2 . Del producto amplificado se utilizaron 1 μl para visualizar el producto en un gel
de agarosa. El volumen restante del producto fue enviado a Macrogen Inc. Korea, para la
purificación y secuenciación.
Análisis de datos: El alineamiento fue realizado con Clustal X (Thompson et al. 1997),
usando los valores por defecto en todos los parámetros de alineamiento.
El cladograma de genes fue inferido por Máxima Parsimonia (MP) (Farris 1983), usando
TNT (Goloboff et al. 2003.), con los caracteres tratados como no ordenados y sin peso. La
estrategia de exploración consistió en encontrar en forma independiente y por 20 veces el
resultado óptimo, usando valores por defecto de “xmult”, y además 10 ciclos de “tree-drifting”
(Goloboff 1999). El árbol de consenso se calculó a través de “TBR-colapsado”. El soporte de los
grupos fue calculado por el índice de Bremer, mediante TBR con intercambio de los árboles
encontrados (Goloboff y Farris 2001). Adicionalmente se realizó un remuestreo simétrico
(Goloboff et al. 2003), con 100 réplicas, analizando cada set de datos con una adición de
secuencias al azar y se colapsaron los árboles resultantes con TBR (Goloboff y Farris, 2001).
La inferencia Bayesiana se realizó usando el programa Topali (Milne et al. 2004). Los modelos
evolutivos más adecuados para los genes fueron: COI, modelo GTR+Γ+I; para las secuencias 18
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S, 28 S y Tubulifrons, modelo HKY+Γ. Bajo esta metodología se obtiene una muestra de árboles
equivalentemente probables usando MCMC (Huelsenbeck y Ronquist 2001, Ronquinst y
Huelsenbeck 2003). El análisis se realizó cuatro veces (Nylander et al. 2004), cada uno
empezando en un árbol diferente seleccionado al azar; se corrieron cuatro cadenas calientes
simultáneas por 5 x 106 generaciones con muestreo cada 1000 generaciones. Se descartaron todas
las generaciones existentes antes de alcanzar la estabilización (de manera conservativa los
primeros 150 de 5001 árboles) y se compararon las probabilidades posteriores de los análisis
independientes para evaluar congruencia entre las corridas (Huelsenbeck et al. 2002, Nylander et
al. 2004). Los valores de distancia genética y tasas evolutivas se estiman con MEGA4 (Tamura et
al. 2007) y DAMBE (Xia y Xie 2001). Para cada uno de los análisis como grupo externo se
utilizó Argiope argentata (Fabricius, 1775).
Resultados
Gen COI: Para el análisis de MP, de los 1278 caracteres utilizados, 785 fueron constantes
y 340 parsimoniosamente informativos. El resultado del análisis mostró 18262 cladogramas
igualmente parsimoniosos (Longitud = 1414 pasos; IC = 0,427; IR = 0,694). El árbol de consenso
está parcialmente resuelto (Fig. 1).
Con el análisis bayesiano se recuperó a los representantes de la subfamilia Latrodectinae
como un grupo monofilético (Clado L; probabilidad a posteriori = 76). Este clado, está
conformado por dos grupos recíprocamente monofiléticos. Estos son el clado I, el que incluye a
las especies L. geometricus y L. rhodesiensis y el clado II compuesto por los clados CS y clado
III. El clado CS, está formado por las especies de Steatoda y Crustulina, mientras que el clado III
está compuesto por las demás especies de Latrodectus (clado mactans). Dentro del clado III,
podemos reconocer dos clados que incluyen a L. tredecimguttatus y L. renivulvatus, y a
continuación se puede observar el clado IV, politómico, que incluye a los clados V, especies de
Latrodectus de Chile, Argentina y Paraguay; el clado VI, con especies de América del Norte; y el
clado VII que incluye a las especies de Nueva Zelanda (Fig. 2).
Gen 18 y 28 S: En el análisis de MP, de los 1761 caracteres utilizados, 939 fueron
constantes y 615 parsimoniosamente informativos. El resultado del análisis mostró 4 cladogramas
igualmente parsimoniosos (Longitud = 1097 pasos; IC = 0,932; IR = 0,977). El árbol de consenso
muestra una politomia basal (Fig. 3). El análisis bayesiano se muestra en la Figura 4. Es
destacable la presencia de los clados I-a y CS, similares a los hallados con COI.
Gen de glándula de la seda Tubuliforme: De los 1309 caracteres utilizados en al
análisis de MP, 692 fueron constantes y 383 parsimoniosamente informativos. El resultado del
análisis mostró 2 cladogramas igualmente parsimoniosos (Longitud = 1044 pasos; IC = 0,843; IR
= 0,851). El árbol de consenso está parcialmente resuelto (Fig. 5). La inferencia bayesiana (Fig.
6) muestra una topología similar a la de MP. Aun cuando para este gen solo fue posible incluir
una especie del género Steatoda, esta se relacionó de manera parafilética con las especies de
Latrodectus. El análisis de las tasas evolutivas muestran para el gen COI y el gen Tubul una tasa
constante de mutación, mientras que para el gen 18S-28S presenta una tasa variable (Fig. 7).
Discusión
A partir del gen COI es posible observar que los géneros de la subfamilia Latrodectinae se
agruparon de forma monofilética. Además se encontraron algunas topologías ya descritas con
anterioridad por Garb et al. (2004), e.g., el clado III que es mencionado como el clado mactans,
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A
D
B
E
C
F
Figuras: 1: A-C) Consenso estricto del análisis de Máxima Parsimonia. Los valores sobre los nodos corresponden al
soporte estimado con Bootstrap. A) COI: L = 1414, IC = 0,427, IR = 0,694. B)18S y 28S: L = 1761, IC = 0,932, IR
= 0,977. C) Tubul: L = 1044, IC = 0,843, IR =0,851. D-F) Filogenias por análisis Bayesiano. Los valores en cada
nodo se refieren a la probabilidad posterior. D) COI. E) 18S y 28S. F) Tubul.
con un fuerte soporte. Los clados internos al clado mactans, incluye a linajes marcados por su
distribución, diferenciando las especies distribuidas en el cono sur de América, de las de
Norteamérica, Nueva Zelanda y Australia. Igualmente cada uno de estos clados siempre mostró
altos valores de apoyo.
Por otro lado el clado CS reúne a especies del género Steatoda y Crustulina, las que se
relacionan de manera polifilética entre sí, lo que se mejoraría incorporando mas especies del
género Crustulina.
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El clado CS, formada por Crustulina y Steatoda es el grupo hermano del clado mactans
(clado III), mientras que el clado geometricus se dispone como grupo hermano de los anteriores
(clado CS y clado III), lo que relacionaría al género Latrodectus de manera parafilética con el
clado CS. Arnedo et al. (2004), evidencia someramente esta situación, relacionando a las
especies de la subfamilia de forma polifilética, pero solo utiliza tres especies de esta subfamilia,
con lo que se hace imposible establecer de manera robusta las relaciones entre ellas.
Por otra parte, los genes 18 S y 28 S, recuperan el clado CS, parcialmente el clado
mactans, y al igual que el el gen COI L. geometricus queda como grupo hermano de el clado CS
y de las demás especies de Latrodectus, agrupando así a los linajes de Latrodectus de forma
parafilética.
Se debe agregar que el gen de la glándula de la seda tubuliforme (Tubul), se utilizó para
establecer las relaciones filogenéticas de S. grossa. Dicha especie se agrupa con las especies de
Latrodectus, relacionando a esta especie de manera parafilética.
En todos los análisis se recupera la monofilia de la subfamilia, pero las relaciones internas
de esta se debe reevaluar considerando una mayor cantidad de especies de los géneros Steatoda y
Crustulina. L. geometricus tiende a comportarse como grupo basal del Latrodectinae. Además es
necesario realizar una profunda revisión de los caracteres morfológicos que sustentan, sobre todo
a las especies conflictivas. En tal caso, si esta revisión amerita efectuar cambios en el estatus
taxonómico de las especies en cuestión, deberá ser realizado una vez se hallan examinados los
especímenes y corroborado su correcta identificación, lo que por el momento, aun no se ha tenido
la oportunidad de materializar.
A
B
C
Figura 2: Distancia pareada de bases nucleotídicas calculadas independientemente para
cada gen. A) COI. B) 18S y 28S. C) Tubul.
Agradecimientos
Proyecto DIUC N° 210.113.078-1.0
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